Sonda Marcata

Sonda ADN este o secventa de ADN marcata fluorescent

sau radioactiv ce este folosita pentru identificarea unei
gene.

Poate fi vizualizata cu ajutorul microscopului cu

florescenta , ce absoarbe lumina cu o anumita lungime de
unda si emite lumina cu o lungime de unda mai mare decat
cea absorbita.Daca un astfel de component este iluminat
cu o lumina pe care o absoarbe , apoi vizualizat utilizand un
filtru ce permite doar trecerea luminii emise, acesta lumina
va starlucii pe un camp intunecat , astfel ca si o cantitate
infima este detectata.

Tehnica PCR

Astfel PCR cantitativ utilizeaz ageni chimici fluorescenti ce pot fi

mpriti n dou tipuri: sonde fluorescente i colorani fluorescenti.
Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:
1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94C, ADN-ul
tinta este separat (denaturat) in 2 catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70C,
primerii se vor atasa complementar la capetele 3 ale celor 2 catene;
3. Elongatia: la temperatura de 72C, ADN polimeraza termostabila in
prezenta Mn2+ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina,
deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primerii atasati in
lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta
automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35),
la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN.

Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a

produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). In
ultimii ani, tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor
de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR).
Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea
conventionala:
- acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se
realizeaza in faza de crestere exponentiala a amplificarii, comparativ cu
tehnica PCR conventional, unde detectia are loc in faza de platou, dupa
ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze)
- domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale
probelor);
- limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati
mai mici ale ADN-ului tinta, avantaj esential, spre exemplu, in evaluarea
raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C.

Cele 2 metode PCR se aplica la efectuarea urmatoarelor teste:

- Real-time PCR: determinarea cantitativa a viremiei la pacientii infectati cu virusurile hepatice B sau C;
analiza mutatiei factorului V Leiden si a mutatei protrombinei;
- PCR conventional: detectia calitativa a tipurilor oncogene ale virusului papilomatozei umane (HPV).

Determinarea cantitativa a viremiei are la baza 2 procese majore:

- pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB;
- amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu detectia simultana a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate
specifice tintei.

Hibrizitatea fluorescenta

Hibridizarea fluorescenta in situ (FISH) este o tehnic de

citogenetic molecular utilizat n scopul identificrii
anomaliilor cromozomiale, numerice i structurale.
Principiul acestei metode const n ataarea la
secvena-int a unei sonde de ADN monocatenar
marcat fluorescent, pe baza complementaritii, de o
secven-int a unui cromozom. Hibridizarea sondei cu
ADN-ul celular este vizualizat la microscopul cu
fluorescen echipat cu filtre de excitaie i emisie, ceea
ce permite citirea semnalelor specifice zonei-int. Se
numr i se analizeaz semnalele prezente n o sut
de celule (de ex., trei semnale fluorescente specifice
pentru cromozomul 21 indic sindromul Down).

Mai multe sindroame dismorfice (sindromul Williams, Prader

Willi, Angelman, Di George) produse de microdeleii sau
microduplicaii, suspectate clinic, imposibil de observat prin
tehnicile citogenetice convenionale, pot fi evideniate prin
FISH metafazic. ntruct aceast metod presupune ca
prim etap de lucru obinerea unor culturi celulare
(limfocite din snge periferic sau amniocite recoltate prin
amniocentez n sptmnile 15-17 de sarcin), rezultatul
investigaiei este obinut n dou sptmni.

Intrebari