DIAGNOSTICUL MOLECULAR ÎN AFECȚIUNILE

HEMATOLOGICE

DR. CRISTINA MAMBET

MEDIC PRIMAR HEMATOLOGIE

 BENEFICIILE TESTĂRII MOLECULARE ÎN
HEMATOLOGIA ONCOLOGICĂ
▪ Stabilirea sau confirmarea diagnosticului

▪ Evaluarea prognosticului și stratificarea pacienților

în funcție de risc

▪ Monitorizarea eficacității terapiei

▪ Monitorizarea bolii minime reziduale

▪ Administrarea unei terapii țintite în funcție de

anomaliile moleculare detectate
 TEHNICI MOLECULARE ABORDATE

▪ REVERSTRANSCRIEREA (RT-PCR)

▪ ANALIZA FRAGMENTELOR ADN

▪ MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

▪ SECVENȚIEREA ADN CLASICĂ (SANGER)

▪ SECVENȚIEREA DE NOUĂ GENERAȚIE

(Next-generation sequencing, NGS)
 REVERSTRANSCRIEREA (RT-PCR)

Variantă PCR care

porneşte de la ARN.

Utilizează la început o
revers transcriptază
care copiază ARN
într-un ADN
complementar (ADNc).

Urmează o reacţie PCR

clasică folosind drept
matriţă ADNc.
 APLICAȚII RT-PCR ÎN HEMATOLOGIE

DETECTAREA FUZIUNILOR GENICE

▪ Rezultă în urma rearanjărilor cromozomiale (translocații)

▪ Anomalii recurente, mutual exclusive în majoritatea cazurilor

▪ Generează oncoproteine responsabile de transformarea celulară

▪ Markeri moleculari pentru diagnostic, clasificare, evaluarea

riscului, terapia țintită și monitorizarea bolii minime reziduale

(MRD) în leucemiile acute

▪ Prin RT-PCR sunt detectați transcripții de fuziune

 TRANSCRIPȚII DE FUZIUNE PML-RARA

- Amplificare cu primeri specifici

pentru detectarea a 3 transcripți
de fuziune PML-RARA
corespunzători translocatiei
t(15;17) (q24;q21): bcr1 (L),
bcr2 (V) și bcr3 (S)

- Amplificarea unei secvente a

genei de referință ABL1
(137 pb)

- Anomalie caracteristică pentru

leucemia acută promielocitară
(aprox. 5-10% din LAM)

- Prognostic favorabil

PML = gena leucemiei promielocitare

RARA = gena receptorului alfa pentru acidul retinoic
LEUCEMIA ACUTĂ PROMIELOCITARĂ –
forma hipergranulară
 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification)
▪ Variantă PCR – amplificarea mai multor ținte (până la 60) cu o singură
pereche de primeri marcați fluorescent
▪ Nu sunt amplificate secvenţe ADN ţintă ale probei analizate ci sondele
oligonucleotidice care hibridizează specific la acestea
▪ Amplificarea sondelor prin PCR depinde de prezenţa în probă a
secvenţelor ţintă din sondă
▪ Fiecare sondă (probe) este alcătuită din două oligonucleotide care hibridizează la
situsuri adiacente ale secvenţei ţintă:
- stângă, conţine secvenţa recunoscută de primerul sens (forward, F)
- dreaptă, conţine secvenţa recunoscută de primerul antisens (reverse, R)
ETAPELE REACȚIEI MLPA
 APLICAȚII MLPA
- Detectează deleţiile/duplicațiile mari (exonice, multiexonice şi ale întregii
gene) care nu sunt depistate prin secvenţiere
- Produșii PCR sunt separați prin electroforeză capilară
- Peak-urile indică nivelul produsului amplificat corespunzător fiecare sonde
- Absența peak-urilor sau amplificarea redusă a sondelor specifice → deleție
- Peak-urile înalte → duplicații
- Detectează amplificări genice – copii multiple ale unei gene

Deleții
exoni
MLPA ÎN LEUCEMIA ACUTĂ LIMFOBLASTICĂ

Deleții la nivelul
genelor PAX5 și
CDKN2A

Deleții la nivelul
genelor TP53 și
PMP22
Amplificare genă
MGMT

CONTROL
 ANALIZA FRAGMENTELOR ADN

- Realizată în instrumente cu electroforeză capilară

- Fragmentele ADN marcate fluoresecent sunt separate prin

electroforeză capilară și dimensiunile acestora sunt comparate
cu un standard intern

- Comparativ cu secvențierea Sanger: permite cuantificarea

relativă (prin măsurarea intensității peak-urilor)

- Este posibilă multiplexarea

- Aplicații: detectarea și cuantificarea inserțiilor, delețiilor

FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) – receptor tirozinkinazic cu rol crucial în hematopoieză
 DETECTAREA MOLECULARĂ FLT3-ITD
PRIN ANALIZA FRAGMENTELOR

Electroforeza capilară pentru analiza produșilor PCR (electroforegramă)

Peak WT – 330 pb Peak ITD – 366 pb

Fracția alelică FLT3-ITD/FLT3-WT = 0.7 (calculată ca raport al intensității

fluoresecenței ITD/WT)

Fracția alelică “high” > 0.5 – prognostic nefavorabil în leucemiile acute mieloide –
indicație de terapie personalizată cu inhibitori FLT3
 DETECTAREA SIMULTANĂ A MUTAȚIILOR NPM1
și FLT3-ITD PRIN ANALIZA FRAGMENTELOR

Electroforeza capilară pentru analiza

produșilor PCR (electroforegramă)

a. NPM1 WT (albastru)
FLT3 WT (verde)

b. NPM1 mutant heterozigot (albastru) –

peak dublu la 349 și 353
FLT3–ITD (verde)

Noguera NI et al, Leukemia 2005

 SECVENȚIEREA ADN-ului

- Tehnică de stabilire a succesiunii de nucleotide (dNTPs) într-un fragment

ADN
- Ordinea în care se succed cele 4 baze azotate într-o moleculă ADN:

Adenină (A) Guanină (G) Citozină (C) Timină

 SECVENȚIEREA BIDIRECȚIONALĂ SANGER

- Descoperită de Frederick Sanger în 1977

- Denumită și “metoda de stopare a lanțului” (“chain termination method”)
- Amplificarea PCR a secvenței ADN țintă
- Utilizează nucleotide modificate - dideoxinucleotide (ddNTPs: ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP) alături de nucleotidele normale (dNTPs), cu raport
ddNTPs/dNTPs scăzut
- Atunci când ADN polimeraza introduce în catena ADN nou sintetizată o
dideoxinucleotidă, în locul unei deoxinucleotide normale, extensia lanțului de ADN
va fi stopată → produși de extensie de mărimi diferite, care au la capătul 3’ o
dideoxinucleotidă, ce vor fi separați electroforetic
 SECVENȚIEREA SANGER CLASICĂ

- 4 reacții PCR diferite

 SECVENȚIEREA SANGER AUTOMATĂ

- Utlizează ddNTPs marcate cu fluorocromi

- Electroforeza capilară separă fragmentele ADN de dimensiuni diferite
- Detectorul de fluorescență discriminează fluorocromii atașați de ddNTs
- Cromatograma: peak-uri alternative colorate ce corespund succesiunii bazelor în
secvența ADN analizată
 ETAPELE SECVENȚIERII SANGER
- Reacția PCR de amplificare a secvenței ADN țintă

- Electroforeza în gel de agaroză pentru vizualizarea și eventual

extracția din gel a ampliconilor

- Reacția de secvențiere propriu-zisă (2 reacții separate de

amplificare cu primerul F și respectiv primerul R)

- Purificarea produșilor de secvențiere

- Separarea fragmentelor ADN prin electroforeză capilară și

detecția emisiei fluorocromilor

- Analiza bioinformatică a secvențelor obținute

 APLICAȚII ALE SECVENȚIERII SANGER ÎN
HEMATOLOGIE

- Identificarea de mutații somatice cunoscute sau noi în gene

implicate în neoplazii hematologice: variante uninucleotidice
(SNVs), deleții, inserții mici la nivelul exonilor cu frecvență
alelică de >15%

- Identificarea de mutații ale liniei germinale cu valoare

diagnostică în afecțiuni hematologice ereditare: talasemii,
hemofilii, siclemii, neutropenia congenitală, trombocitopenii
ereditare, etc

- Identificarea unor variante ale liniei germinale ce conferă

predispoziție pentru anumite neoplazii hematologice
 DETECȚIA DELEȚIILOR/INSERȚIILOR (INDELs)

Ins 5 pb Alela WT
Del 52 pb

Electroforeză ampliconi CALR (gena calreticulinei)

 DETECȚIE MUTAȚII CALR PRIN SECVENȚIERE SANGER

Cromatogramă cu secvență CALR del52 (I) aliniată la secvența de referință (II)

Cromatogramă cu secvențe CALR ins5 (II, III) aliniate la secvența de referință (I)
Cromatogramă cu evidențierea mutației MPL W515L (A) comparativ cu MPL WT (B)
 SECVENȚIEREA DE NOUĂ GENERAȚIE (NGS)

- Secvențiere paralelă masivă – milioane de reacții de secvențiere în paralel!

- Comparativ cu secvențierea Sanger: este posibilă multiplexarea – sunt secvențiate

simultan mai multe gene (NGS țintită), întregul exom (WES) sau întregul genom
(WGS); pot fi detectate mutații somatice cu frecvență alelică redusă (1-5%)

- Sunt secvențiate matrițe ADN amplificate clonal (dintr-un singur fragment)

- Dezavantaj: sunt generate milioane de secvențe ADN (citiri, reads) scurte (45-150
pb) comparativ cu secvențierea Sanger (400- 1000 pb) ce vor trebui asamblate

- Amplificarea de mai multe ori a unei regiuni țintă cu generarea unei secvenții de
consens pentru a crește acuratețea citirilor individuale

- Pentru analiza datelor NGS este nevoie de un număr adecvat de citiri care se
suprapun

- Pot fi detectate variante nucleotidice unice (SNV), inserții/deleții mici

 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

1. Pregătirea „bibliotecilor” de ADN

- fragmentarea aleatorie a probei de ADN genomic
- ligarea unor adaptori specializați la ambele capete ale fragmentelor
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

2. Generarea „clusterelor”

- Încărcarea bibliotecii ADN pe o

micromatrice de sticlă ce conține
sute de mii de oligonucleotide
complementare cu adaptorii ligați,
capabile să capteze
fragmentele de ADN

- Ambele capete ale fragmentelor

ADN pot hibridiza, astfel că fiecare
fragment legat va fi amplificat
„în punte” într-un cluster clonal
(mii de copii ale unui fragment ADN)
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

3. Secvențierea prin sinteză

- metodă reversibilă ciclică de terminare a lanțului ce detectează individual bazele

marcate fluorescent, pe măsură ce acestea sunt încorporate în catena nou formată
pe baza secvenței de ADN țintă
- vor fi secvențiate ambele capete ale fragmentelor de ADN dintr-o bibliotecă
(„pair-end” sequencing) și vor fi înregistrate ciclic emisiile fluorescente ale fiecărui
cluster.
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

4. Alinierea și analiza bioinformatică a datelor

- secvențele citite vor fi aliniate la genomul de referință și analizate cu ajutorul unor

software-uri specializate.
 NGS ÎN NEOPLAZIILE MIELOIDE

- Diverse paneluri ținitite (25-120 gene) în neoplaziile mieloide

● mutații somatice inactivatoare în gene implicate în controlul epigenetic cu impact

asupra metilării ADN-ului (TET2, DNMT3A, IDH1/2), histonelor și structurii
cromatinei (ASXl1, EZH2)
● mutații somatice ale moleculelor de semnalizare (NF1, NRAS, CBL, PTPN11,
FLT3, SH2B3)
● mutații în gene ce codifică factori de transcripție (TP53, CUX1, IKZF1, ETV6,
RUNX1)
● mutații somatice ale componentelor spliceosom-ului ce afectează procesarea
ARNm (SRSF2, SF3B1, U2AF1)

- Leucemia acută mieloidă (LAM): mutații somatice recurente în majoritatea

cazurilor

- Sindroame mielodisplazice (SMD): mutații somatice la aprox. 90% din pacienți

 INTERPRETAREA REZULTATELOR NGS

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de polimorfisme sau

mutații pasagere

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de mutații ale liniei

germinale patogene

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de mutații asociate

hematopoiezei clonale de semnificatie neprecizata (CHIP)

- Discriminarea alterărilor genetice veritabile de artefacte PCR,

post-PCR și secvențiere

Utilizarea bazelor de date: COSMIC, dbSNP, CliniVar