DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

ÎN NEOPLASMELE MIELOPROLIFERATIVE

BCR-ABL1 NEGATIVE

DR. CRISTINA MAMBET

 FENOTIPURI CLASICE NMP

■ PV - eritrocitoză asociată frecvent cu trombocitoză și/sau leucocitoză

Criterii OMS 2016: Hb >16 g/dL (femei), Hb>16.5 (bărbați)

Ht > (femei) Ht >49% (bărbați)

JAK2 V617F – prevalență 95-97%

JAK2 exon 12
EPO serică ↓ - > 85% din cazuri

- debut: asimptomatic/ semne de afectare a microcirculației/disconfort

abdominal/episoade trombotice

BMO: panmieloză (hiperplazie trilineală)

- evaluarea gradului de fibroză

Evoluție: progresie către MF secundară (10-30%)

conversie în LAMs (2-5%)
PV – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
PV – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ
 FENOTIPURI CLASICE NMP
■ TE – trombocitoză PLT > 450 000/µL

- Excluderea trombocitozei reactive

JAK2 V617F
CALR exon 9
MPL exon 10
TE “triplu negativă”

- Debut frecvent asimptomatic

- Risc mai scăzut de complicații trombotice comparativ cu PV
- Trombocitoza marcată – risc ↑ de boală von Willebrand dobândită

BMO: hiperplazie megakariocitară

- Fibroză de obicei absentă

Evoluție: progresie către MF secundară (5-20%)

conversie în LAMs (1%)
TE – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
TE – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ
 FENOTIPURI CLASICE NMP

■ MFP – fenotipul NMP cel mai sever

- afecțiune heterogenă: mieloproliferare clonală, expresie anormală de

citokine, fibroză a măduvei osoase, anemie, splenomegalie,
hematopoieză extramedulară, simptome constituționale și o durată
de supraviețuire mai mică comparativ cu TE și PV

JAK2 V617F
CALR exon 9
MPL exon 10
MFP “triplu negativă”

- Debut frecvent simptomatic

- Progresie către grade avansate de MF și osteoscleroză
- Conversie în LAMs (10%)
 FENOTIPURI CLASICE NMP

■ pre- MFP – MFP în stadiu prefibrotic

- Se confundă adesea cu TE!
- Prognostic mai puțin favorabil comparativ cu TE

BMO: - proliferare și atipie megakariocitară

- celularitate MO ↑
- proliferare granulocitară ↑
- adesea, eritropoieză ↓
- fibroză MF-0 sau MF-1

■ MFP în stadiu fibrotic - tablou leucoeritroblastic, LDH ↑

- pancitopenie

BMO: - proliferare și atipie megakariocitară

- fibroză MF ≥ 2
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
MFP – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
MFP – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ
MFP – BIOPSIE DE MĂDUVĂ OSOASĂ
PROGRESIA CĂTRE MIELOFIBROZĂ (MF) SECUNDARĂ
■ MF post TE - risc cumulativ de 0.7-3% la 10 ani, 4-11% la 15 ani și
19.9% la 20 ani

- fibroză MF ≥ 2
- ↓ cu ≥ 2 g/dL din valoarea inițială a Hb
- tablou leucoeritroblastic în sângele periferic
- splenomegalie de novo sau o ↑ a dimensiunilor splinei cu ≥ 5 cm
- ↑ LDH
- semne constituționale

■ MF post-PV – risc cumulativ de MF post-PV 4.9-6% la 10 ani, 6-14%

la 15 ani și 26% la 20 ani

- fibroză MF ≥ 2
- ↓ cu ≥ 2 g/dL din valoarea inițială a Hb
- tablou leucoeritroblastic în sângele periferic
- splenomegalie de novo sau o ↑ a dimensiunilor splinei cu ≥ 5 cm
- ↑ LDH
- semne constituționale
 PROGRESIA CĂTRE LAMs

■ LAM post-TE - risc 1% la 10 ani

■ LAM post-PV – risc cumulativ de 2.3% la 10 ani și

5.5% la 15 ani

■ LAM post-MFP – risc 10%

PROFILUL MOLECULAR AL NMP BCR-ABL1 NEGATIVE

■ MUTAȚII „NMP-driver” → mieloproliferarea clonală

MUTAȚII JAK2 - exonul 14: JAK2 V617F; exonul 12

MUTAȚII MPL - exonul 10

MUTAȚII CALR - exonul 9

■ MUTAȚII „non-NMP-driver” → modificarea evoluției bolii

- în principal, mutații ale factorilor de control epigenetic

- întâlnite și în alte neoplazii mieloide (SMD, LAM)
ELEMENT PATOGENIC CENTRAL ÎN NMP:
ACTIVAREA CONSTITUTIVĂ JAK-STAT
 MUTAȚIILE JAK2
MUTAȚIA JAK2 V617F

→ mutație somatică de tip „activator” întâlnită în toate cele 3 fenotipuri NMP :

>95% din PV și 50 - 60% din TE și MFP

→ se mai poate asocia cu ARSI-T și rar cu LMMC și LAM

→ a mai fost identificată în pacienți cu tromboză de vv splahnice și sindromul Budd-Chiari,

precum și la cei cu tromboze de vv cerebrale, în absența unui NMP clinic manifest

→ a fost descrisă și în populația generală (0.1-0.2%)

→ întâlnită și în CHIP (hematopoieza clonală cu potențial nedeterminat)

→ frecvența alelei mutante variază în funcție de subtipul NMP: scăzută în TE (în jur de
25%), mai mare în PV (frecvent >50%, status homozigot) și apropiată de 100% în MF
secundară TE și PV

MUTAȚIILE JAK2 exon 12

→ inserții, deleții mici, de obicei heterozigote, asociate cu majoritatea cazurilor de PV JAK2

V617F negative
 MUTAȚIILE MPL

- Mutații de tip activator întâlnite exclusiv în TE (2-3%) și MFP (3-5%)

- 2 categorii de mutații:
● W515 L/K/R/A – predominante, de obicei heterozigote
● S505N – poate fi și ereditară
 MUTAȚIILE CALR

- Responsabile de cele mai multe cazuri de TE și MFP negative pentru mutațiile

JAK2 și MPL
- Conferă o funcție neomorfică proteinei CALR mutante →rezultat activarea MPL
- Decalează cu 1 pb cadrul de citire
- Peste 50 mutații diferite
- 2 variante predominante: del52 (tip 1) și ins5 (tip2)
- Restul sunt variante „tip 1-like” și „tip 2-like”
DETECȚIA JAK2 V617F PRIN ARMS-PCR
 CUANTFICAREA ALELEI MUTANTE JAK2 V617F
- Un amestec de primeri specifici și o sondă oligonucleotidică dublu marcată pentru
fiecare alelă JAK2 → 2 reacții PCR separate
- Cuantificare: 4 standarde, sub forma unor plasmide în diluții succesive (50, 500,
5000, 50 000 copii alelice/μL), pentru fiecare tip de alelă JAK2
- 2 curbe standard: se calculeaza nr. copii pentru alelă
- V617F% = nr. copii alelă mutantă /nr. total copii JAK2 (alela mutantă + alelă WT)
 DETECȚIA MUTAȚIILOR MPL W515K/L PRIN REAL-TIME PCR

- Se utilizează 2 sonde dublu marcate R, Q – pentru alela mutantă și alela WT

- Fiecare sondă este marcată cu un fluorocrom diferit – FAM și VIC
- Se va calcula raportul semnalelor fluorescente emise de fluorocromii FAM și VIC
- Valoarea raportului va fi comparată cu cea a standardului de 1.5% alelă mutantă
- Valorile > valoarea standardului sunt considerate pozitive
- Grafic de discriminare alelică
 DETECȚIE MUTAȚII CALR PRIN SECVENȚIERE SANGER

Cromatogramă cu secvență CALR del52 (I) aliniată la secvența de referință (II)

Cromatogramă cu secvențe CALR ins5 (II, III) aliniate la secvența de referință (I)
 LEUCEMIA CRONICĂ CU NEUTROFILE

- NMP BCR-ABL1 negativ rar

- Leucocitoza peste 25 000/µl

- Proliferare persistentă a neutrofilelor mature – nesegmentate și segmentate

(>80%)

- Precursori neutrofilici < 10%, blaști f rari

- Absența bazofiliei, monocitozei

- BMO: hiperplazie granulocitară

- Splenomegalie

- Mutații oncogenice ale genei CSF3R (predominant CSF3R T618I)

 SECVENȚIEREA DE NOUĂ GENERAȚIE (NGS)

- Secvențiere paralelă masivă – milioane de reacții de secvențiere în paralel!

- Comparativ cu secvențierea Sanger: este posibilă multiplexarea – sunt secvențiate

simultan mai multe gene (NGS țintită), întregul exom (WES) sau întregul genom
(WGS)

- Sunt secvențiate matrițe ADN amplificate clonal (dintr-un singur fragment)

- Dezavantaj: sunt generate milioane de secvențe ADN (citiri, reads) scurte (45-150
pb) comparativ cu secvențierea Sanger (400- 1000 pb) ce vor trebui asamblate

- Amplificarea de mai multe ori a unei regiuni țintă cu generarea unei secvenții de
consens pentru a crește acuratețea citirilor individuale

- Pentru analiza datelor NGS este nevoie de un număr adecvat de citiri care se
suprapun

- Pot fi detectate variante nucleotidice unice (SNV), inserții/deleții mici

 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

1. Pregătirea „bibliotecilor” de ADN

- fragmentarea aleatorie a probei de ADN genomic
- ligarea unor adaptori specializați la ambele capete ale fragmentelor
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

2. Generarea „clusterelor”

- Încărcarea bibliotecii ADN pe o

micromatrice de sticlă ce conține
sute de mii de oligonucleotide
complementare cu adaptorii ligați,
capabile să capteze
fragmentele de ADN

- Ambele capete ale fragmentelor

ADN pot hibridiza, astfel că fiecare
fragment legat va fi amplificat
„în punte” într-un cluster clonal
(mii de copii ale unui fragment ADN)
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

3. Secvențierea prin sinteză

- metodă reversibilă ciclică de terminare a lanțului ce detectează individual bazele

marcate fluorescent, pe măsură ce acestea sunt încorporate în catena nou formată
pe baza secvenței de ADN țintă
- vor fi secvențiate ambele capete ale fragmentelor de ADN dintr-o bibliotecă („pair-
end” sequencing) și vor fi înregistrate ciclic emisiile fluorescente ale fiecărui cluster.
 ETAPELE NGS PE PLAFORMA ILLUMINA

4. Alinierea și analiza bioinformatică a datelor

- secvențele citite vor fi aliniate la genomul de referință și analizate cu ajutorul unor

software-uri specializate.
 NGS ÎN NEOPLAZIILE MIELOIDE

- Diverse paneluri ținitite (25-120 gene) în neoplaziile mieloide

● mutații somatice inactivatoare în gene implicate în controlul epigenetic cu impact

asupra metilării ADN-ului (TET2, DNMT3A, IDH1/2), histonelor și structurii
cromatinei (ASXl1, EZH2)
● mutații somatice ale moleculelor de semnalizare (NF1, NRAS, CBL, PTPN11,
FLT3, SH2B3)
● mutații în gene ce codifică factori de transcripție (TP53, CUX1, IKZF1, ETV6,
RUNX1)
● mutații somatice ale componentelor spliceosom-ului ce afectează procesarea
ARNm (SRSF2, SF3B1, U2AF1)

- LAM: mutații somatice recurente în majoritatea cazurilor

- SMD: mutații somatice la aprox. 90% din pacienți

 NGS ÎN NMP
- TE si PV: majoritatea pacienților prezintă doar mutația „NMP-driver”

- MFP: 1-3 mutații somatice – element de prognostic nefavorabil

- NMP „triplu-negative”: mutații somatice sau de linie germinală în genele JAK2 și

MPL – mutații non-canonice

- Factorii de risc pentru transformarea TE în MF secundară: CALR de tip 1, mutații

somatice SH2B3, IDH2, SF3B1, U2AF1, EZH2, TP53

- Factorii de risc pentru transformarea PV în MF secundară: JAK2 V617F > 50%,

mutații somatice ASXL1, SRSF2, IDH2

- Aceleași mutații somatice „non-NMP driver” asociate cu progresia către MF

secundară prezintă valoare predictivă și pentru transformarea leucemică în ET și
PV

- MFP: mutațiile ASXL1, SRSF2, EZH2, IDH1/2 conferă un prognostic rezervat,

independent de scorul DIPSS-plus → stratificarea pacienților în funcție de risc

- NGS poate identifica candidați pentru terapii țintite

 INTERPRETAREA REZULTATELOR NGS

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de polimorfisme sau

mutații pasagere

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de mutații ale liniei

germinale patogene

- Discriminarea mutațiilor somatice driver de mutații asociate

CHIP

- Discriminarea alterărilor genetice veritabile de artefacte PCR,

post-PCR și secvențiere

Utilizarea bazelor de date: COSMIC, dbSNP, CliniVar