Volumul 3: Ghidul Serviciilor Medicale Al Laboratoarelor Synevo

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
CUPRINS
AL LABORATOARELOR SYNEVO
VOLUMUL 3
17.7 Teste pentru evaluarea sistemului complementului................................................... 5
17.7.1 Complement hemolitic total (CH100)................................................................... 5
17.7.2 C1 inhibitor esteraza (dozare proteină)................................................................ 8
17.7.3 C1 inhibitor esteraza (activitate)........................................................................... 9
17.7.4 Mannose-binding-lectin (MBL) în ser..................................................................11
17.8 Citokine......................................................................................................................... 15
17.8.1 Interleukinele (IL)............................................................................................... 15
17.8.2 Interleukina 1β (IL-1β)....................................................................................... 16
17.8.3 Interleukina 6 (IL-6)............................................................................................ 19
17.8.4 Interleukina 8 (IL-8)............................................................................................ 21
17.8.5 Interleukina 10 (IL-10)........................................................................................ 23
17.8.6 Receptorul solubil pentru interleukina-2............................................................. 25
17.8.7 Interferon gamma (IFNγ).................................................................................... 26
17.8.8 Factor de necroză tumorală alfa (TNF-α)........................................................... 28
17.9 Teste de imunofenotipare limfocitară......................................................................... 31
17.9.1 Imunofenotipare limfocitară - profil imun de bază.............................................. 31
17.9.2 Imunofenotipare limfocitară - imunitate antitumorală......................................... 41
17.9.3 Imunofenotipare limfocitară - profil autoimun..................................................... 47
17.9.4 Imunofenotipare limfocitară - profil infecţii cronice............................................. 52
17.9.5 Imunofenotipare limfocitară - sindroame limfoproliferative................................. 54
17.9.6 Anexă - modificările înregistrate de principalele populaţii
limfocitare în diverse condiţii patologice........................................................................ 72
17.10 Alte teste..................................................................................................................... 74
17.10.1 Activitatea diaminoxidazei – intoleranţa la histamină....................................... 74
17.10.2 Imunoglobulina IgG (subclase 1-4).................................................................. 77
17.10.3 Neopterin.......................................................................................................... 80
17.10.4 QuantiFERON-TB Gold Test............................................................................ 83
18. TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ................................................................................ 87
18.1 Teste de genetică umană............................................................................................. 87
18.1.1 Afecţiuni hematologice......................................................................................... 88
18.1.1.1 Mutaţia factorului V Leiden – detecţie şi genotipare....................................... 88
18.1.1.2 Mutaţia factorului II (protrombinei) - detecţie şi genotipare............................. 90
18.1.1.3 Gena MTHFR (mutaţii C677T; A1298C) - risc trombofilie............................... 92
18.1.1.4 Mutaţia factorului XIII (G102T) - risc trombofilie.............................................. 94
18.1.1.5 Gena PAI-1 (polimorfism 675 4G/5G) - risc trombofilie................................... 96
18.1.1.6 Alfa – talasemia: testare genetică .................................................................. 98
18.1.1.7 Beta- talasemia: testare genetică HBB......................................................... 103
18.1.1.8 Delta-beta talasemia şi persistenţa ereditară de hemoglobină fetală............110
18.1.1.9 Hemoglobinopatia Lepore..............................................................................111
18.1.1.10 Hemofilia A – testare genetică.....................................................................113
18.1.1.11 Hemofilia B – testare genetică......................................................................118
18.1.1.12 Boala vonWillebrand – testare genetică...................................................... 122
18.1.1.13 Gena de fuziune BCR-ABL1 – detecţie calitativă şi
cantitativă a produşilor de transcripţie.......................................................................... 129
18.1.1.14 Mutaţia JAK2V617F şi mutaţiile exonului 12............................................... 136
18.1.1.15 Mastocitoza sistemică - mutaţia c-Kit D816V.............................................. 144
18.1.2 Afecţiuni oncologice.......................................................................................... 151
1
CUPRINS
18.1.2.1 Polipoza adenomatoasă familială................................................................. 151

18.1.2.2 Cancerul colorectal nonpolipozic ereditar (HNPCC) .................................... 154
18.1.2.3 Cancerul gastric difuz ereditar (HDGC)......................................................... 161
18.1.2.4 Cancerul de prostată (ELAC2, RNASEL, BRCA2, SRD5A2)........................ 164
18.1.2.5 Mutaţii BRCA1, BRCA2 - cancer ereditar sân/ovar...................................... 170
18.1.2.6 Mutaţii KRAS în tumori de colon................................................................... 175
18.1.2.7 Neoplazia endocrină multiplă de tip 1 – testare genetică.............................. 179
18.1.2.8 Neoplazia endocrină multiplă de tip 2 – testare genetică.............................. 183
18.1.3 Afecţiuni endocrine, digestive şi metabolice ................................................. 189
18.1.3.1 Microdeleţii ale cromozomului Y................................................................... 189
18.1.3.2 Sindromul adrenogenital............................................................................... 197
18.1.3.3 Fibroza chistică............................................................................................. 205
18.1.3.4 Hemocromatoza ereditară (mutaţii HFE: C282Y; H63D; S65C)................... 214
18.1.3.5 Pancreatita ereditară (testare genetică PRSS1 şi SPINK1).......................... 218
18.1.3.6 Boala Gaucher ............................................................................................. 223
18.1.3.7 Diagnosticul genetic al diabetului zaharat MODY......................................... 230
18.1.3.8 Galactozemia................................................................................................ 232
18.1.3.9 Gena colagen 1A1 (mutaţia G2046T)........................................................... 237
18.1.3.10 Gena receptorului vitaminei D (polimorfism B/b; Fok1)............................... 239
18.1.3.11 Hipercolesterolemia familială....................................................................... 241
18.1.3.12 Intoleranţa ereditară la fructoză (mutaţii ale genei aldolazei B).................. 247
18.1.3.13 Intoleranţa la lactoză (test genetic) .......................................................... 250
18.1.4 Boli asociate cu sistemul HLA .......................................................................... 254
18.1.4.1 Sistemul HLA şi asocierea cu diverse boli..................................................... 254
18.1.4.2 HLA DR4/DR1 - shared epitope . ................................................................. 264
18.1.4.3 HLA-B27........................................................................................................ 268
18.1.4.4 Predispoziţie genetică boala celiacă (tipaj HLA-DQ)..................................... 270
18.1.5 Afecţiuni neurologice......................................................................................... 276
18.1.5.1 Atrofia musculară spinală.............................................................................. 276
18.1.5.2 Boala Alzheimer (testare genetică)............................................................... 281
18.1.5.3 Boala Parkinson (testare genetică)............................................................... 287
18.1.5.4 Coreea Huntington........................................................................................ 294
18.1.5.5 Distrofia neuroaxonală infantilă..................................................................... 298
18.2 Teste de farmacogenetică.......................................................................................... 301
18.2.1 Genotipare DPD (toxicitate 5-fluorouracil)....................................................... 301
18.2.2 Genotipare TPMT (toxicitate 6-mercaptopurină, azatioprină).......................... 303
18.2.3 Genotipare CYP2C19 ..................................................................................... 305
18.2.4 Genotipare CYP2D6 (tratament cu tamoxifen)................................................ 308
18.2.5 Gena VKORC1 (analiză polimorfism genetic)...................................................311
18.2.6 Variante enzimatice CYP2C9 (analiză polimorfism genetic)............................ 314
18.2.7 Polimorfismul genei KIF6 (tratamentul cu statine)............................................ 317
18.3 Teste moleculare pentru diagnosticul infecţiilor..................................................... 321
18.3.1 Borrelia burgdorferi - ADN . .............................................................................. 321
18.3.2 Chlamydia (Chlamydophila) pneumoniae - ADN............................................... 323
18.3.3 Chlamydia trachomatis - ADN........................................................................... 325
18.3.4 Citomegalovirus (CMV) - ADN ........................................................................ 327
18.3.5 Enterovirusuri - ARN ........................................................................................ 330
2
CUPRINS
18.3.6 ADN viral hepatita B (cantitativ)........................................................................ 332

18.3.7 Virusul hepatitei B (HBV) – genotipare.............................................................. 334
18.3.8 Testarea rezistenţei virusului hepatitei B la antivirale........................................ 338
18.3.9 ARN viral hepatita D (cantitativ)........................................................................ 345
18.3.10 ARN viral hepatită C (cantitativ)...................................................................... 348
18.3.11 Virusul hepatitei C (VHC) - genotipare............................................................ 351
18.3.12 HIV-1 ARN....................................................................................................... 354
18.3.13 ADN HPV - detecţie tipuri oncogene............................................................... 359
18.3.14 HPV (Papiloma Virus Uman) ADN - genotipare.............................................. 363
18.3.15 HPV (Papiloma Virus Uman) E6/E7 ARNm.................................................... 365
18.3.16 Identificarea germenilor asociaţi parodontitei (teste micro-IDent A,
micro-IDent B).................................................................................................. 368
18.3.17 Mycobacterium tuberculosis complex - ADN.................................................. 373
18.3.18 Mycoplasma pneumoniae - ADN................................................................... 378
18.3.19 Neisseria gonorrhoeae - ADN........................................................................ 380
18.3.20 Parvovirus B19 (B19V) – ADN....................................................................... 383
18.3.21 Polyomavirus BK - ADN ................................................................................ 384
18.3.22 Polyomavirus JC – ADN................................................................................. 386
18.3.23 Toxoplasma gondii – ADN.............................................................................. 388
18.3.24 Treponema pallidum - ADN........................................................................... 392
18.3.25 Virus Epstein-Barr – ADN calitativ în sânge şi LCR....................................... 394
18.3.26 Epstein-Barr-Virus (EBV) ADN în sânge (cantitativ)...................................... 396
18.3.27 Virus herpetic uman tip 6 (HHV-6) – ADN...................................................... 398
18.3.28 Virus herpetic uman tip 7 (HHV-7) - ADN . .................................................... 401
18.3.29 Virus herpetic uman tip 8 (HHV-8) – ADN...................................................... 402
18.3.30 Virus herpes simplex 1/2 (HSV) - ADN ......................................................... 406
18.3.31 Virus varicelo-zosterian (VZV) - ADN . .......................................................... 410
18.3.32 Virusul rubeolei - ARN . ................................................................................. 412
19. TESTE DE CITOGENETICĂ............................................................................................... 415
19.1 Analiză cromozomială în sânge (cariotip constituţional sau postnatal)................ 416
19.2 Analiză cromozomială (cariotip) în lichid amniotic................................................ 429
19.3 Citogenetică tumorală.......................................................................................... 432
20. TESTE DE TOXICOLOGIE................................................................................................. 444
20.1 Alcool şi droguri......................................................................................................... 445
20.1.1 Alcoolemie........................................................................................................ 445
20.1.2 Depistare droguri în urină (screening).............................................................. 446
20.2 Metale grele................................................................................................................ 453
20.2.1 Aluminiu în sânge . .......................................................................................... 453
20.2.2 Argint în ser....................................................................................................... 455
20.2.3 Arseniu în sânge şi urină.................................................................................. 456
20.2.4 Cadmiu în sânge şi urină ................................................................................ 458
20.2.5 Crom în sânge şi urină .................................................................................... 459
20.2.6 Cupru în plasmă şi urină.................................................................................. 461
20.2.7 Mangan în ser şi urină...................................................................................... 463
20.2.8 Mercur în sânge şi urină................................................................................... 464
20.2.9 Nichel în sânge şi urină.................................................................................... 466
20.2.10 Plumb în sânge şi urină.................................................................................. 467
3
CUPRINS
20.2.11 Titan în ser...................................................................................................... 468

20.2.12 Zinc în plasmă şi urină................................................................................... 470
20.3 Monitorizare terapeutică a medicamentelor........................................................... 472
21. TESTE DE MICROBIOLOGIE............................................................................................. 491
21.1 Sfera ORL................................................................................................................... 492
21.1.1 Antigen Streptococ betahemolitic grup A în exsudatul faringian...................... 492
21.1.2 Examen microscopic al exsudatului faringian pentru fusospirili....................... 493
21.1.3 Examenul bacteriologic al exsudatului faringian.............................................. 494
21.1.4 Examenul bacteriologic al exsudatului nazal................................................... 498
21.1.5 Examenul bacteriologic al secreţiei auriculare................................................. 500
21.2 Sfera oftalmologică................................................................................................... 503
21.2.1 Cultură din secreţie oculară............................................................................. 503
21.3 Tract respirator inferior............................................................................................. 506
21.3.1 Examenul bacteriologic al sputei...................................................................... 506
21.4 Tract gastrointestinal................................................................................................ 510
21.4.1 Amprenta anală................................................................................................ 510
21.4.2 Antigen Giardia.................................................................................................511
21.4.3 Antigen Helicobacter pylori în materii fecale.................................................... 513
21.4.4 Antigen Rotavirus şi Adenovirus în materiile fecale......................................... 514
21.4.5 Clostridium difficile - toxine A/B . ..................................................................... 516
21.4.6 Coprocitograma................................................................................................ 519
21.4.7 Coprocultură..................................................................................................... 520
21.4.8 Examen coproparazitologic.............................................................................. 522
21.4.9 Examen coproparazitologic (direct + examinare în strat gros)......................... 541
21.5 Tract urogenital........................................................................................................... 543
21.5.1 Antigen Chlamydia trachomatis....................................................................... 543
21.5.2 Antigen Neisseria gonorrhoeae în secreţii urogenitale.................................... 545
21.5.3 Cultură şi identificare Mycoplasma hominis şi Ureaplasma urealyticum.......... 546
21.5.4 Examenul bacteriologic al secreţiei uretrale . .................................................. 549
21.5.5 Examen microscopic preparat prospăt şi colorat şi cultură din
secreţie vaginală.......................................................................................................... 552
21.5.6 Cultură secreţie genitală pentru Streptococ grup B
(Streptococcus agalactiae)........................................................................................... 558
21.5.7 Spermograma.................................................................................................. 559
21.5.8 Urocultura......................................................................................................... 562
21.6 Micologie..................................................................................................................... 566
21.6.1 Cultură şi identificare fungi............................................................................... 566
21.6.2 Identificare dermatofiţi (examen microscopic direct şi cultură)......................... 569
21.7 Sânge şi lichide de puncţie....................................................................................... 572
21.7.1 Hemocultură..................................................................................................... 572
21.7.2 Examenul bacteriologic al lichidului cefalo-rahidian......................................... 579
21.7.3 Examenul bacteriologic al lichidelor de puncţie............................................... 584
21.8 Colecţii purulente....................................................................................................... 586
22. EXAMEN CITOLOGIC CERVICO-VAGINAL....................................................................... 589
22.1 Examen citologic cervico-vaginal (test Papanicolaou)......................................... 590
22.2 Anexa: Formular utlizat la recoltarea probelor şi raportarea rezultatelor............. 602
4
TESTE SPECIALIZATE DE
ALERGOLOGIE ŞI IMUNOLOGIE 17
17.7 TESTE PENTRU EVALUAREA SISTEMULUI COMPLEMENTULUI
17.7.1 Complement hemolitic total (CH100)
Sinonime – CH100, CH50, complement seric total6.

Informaţii generale
Complementul este un sistem de aproximativ 20 de proteine şi glicoproteine plasmatice (10% din
totalul globulinelor serice), ce produce un răspuns rapid şi mult amplificat la un stimul declanşator, prin
activarea în cascadă a componentelor sale. În urma clivajului proteolitic se produc multiplii mediatori
ai inflamaţiei cu rol în reglarea sistemului imun. Componentele complementului se activează prin 3
căi: calea clasică, calea alternă şi calea lectinelor ce foloseşte o proteină serică denumită mannose-
binding lectin (MBL).
Calea clasică a complementului este compusă dintr-o serie de proteine care sunt activate ca răspuns
la prezenţa de complexe imune ce conţin IgM, IgG1, IgG2 sau IgG3. O serie de molecule, cum ar
fi: proteina C reactivă, β amiloidul, heparina, unele bacterii Gram negative, virusuri, mycoplasme,
protozoare, componente celulare (ADN, membrană mitocondrială, filamente de citoschelet) au de
asemenea capacitatea de a activa complementul pe calea clasică prin interacţiunea directă cu
componenta C1q.
Componenta C1 este un complex proteic format din 3 molecule: C1q, C1r şi C1s asociate necovalent
împreună cu ioni de Ca2+. C1q este o proteină de 400 kD formată din 18 catene polipeptidice, cu regiuni
în triplu helix şi regiuni globulare, la nivelul cărora se găsesc situsurile de legare cu imunoglobulinele.
C1q interacţionează prin domeniul său globular cu domenii specifice ale IgG şi IgM numai dacă
acestea formează complexe imune. C1q nu are activitate proteazică şi se asociază cu 2 molecule C1r
şi 2 C1s, în prezenţa Ca2+. În mod normal, activarea spontană a complexului C1s – C1r este stopată
de un factor inhibitor – C1 inh (inhibitor de serin protează). În urma ataşării complexului antigen –
anticorp, C1q suferă o modificare conformaţională care duce la eliberarea C1 – inh şi la activarea
autocatalitică a unei molecule de C1r.
Fragmentul C1r are activitate serin-proteazică şi activează C1s. Acesta are activitate esterazică şi
clivează componenta C4 în două fragmente: unul mic, C4a (o anafilatoxină eliberată în ser), şi unul
mare, C4b, ce rămâne ataşat de activatorul său. În prezenţa ionilor de Mg2+, C4b leagă C2 care este
clivat, la rândul său, în două fragmente: cel mare, C2a, rămâne legat pe C4b şi constituie complexul
C4b2a, denumit convertaza C3, iar cel mic, C2b, este eliberat în plasmă.
Clivarea lui C3 este evenimentul central al fixării complementului, pe calea clasică sau alternă. C4b2a
(convertaza lui C3), prin componenta sa enzimatică C2a, formează două peptide: C3a, anafilatoxina,
şi C3b, principala opsonină a serului. Fiecare unitate C1qrs4b2a (convertaza C3) poate ataşa şi cliva
sute de molecule C3, deoarece C3 are o concentraţie plasmatică crescută. Majoritatea moleculelor de
C3b rămân în plasmă şi au rol opsonizant. Restul se leagă la complexul C4b2a şi formează următoarea
unitate catalitică, C4b2a3b, convertaza C5. Această enzimă clivează substratul în două subunităţi:
C5a şi C5b. Fragmentul mare C5b se fixează pe membrana celulară, ataşează C6 şi iniţiază formarea
complexului de atac membranar. În prezenţa lui C7 se formează complexul C5b67, cu proprietăţi
amfifile, care se leagă de fosfolipidele membranare. La acesta se adaugă compomentele C8 şi C9
constituindu-se astfel un complex macromolecular C5b6789, asemănător unui canal, cu suprafaţa
5
17 TESTE SPECIALIZATE DE
ALERGOLOGIE ŞI IMUNOLOGIE
externă hidrofobă şi un ax central hidrofil. Rezultatul final al cascadei de activare este formarea
unui complex de liză membranară (MAC), care permite intrarea rapidă a cationilor (Ca2+, Na+) şi a
apei, distrugerea celulară cu eliberarea de histamină prin degranularea mastocitelor şi plachetelor,
creşterea permeabilităţii vasculare, contracţia muşchilor netezi şi liza unor virusuri.
Complexele imune nu sunt capabile să activeze cascada complementului în absenţa unor componente
ale complementului cum ar fi C1, C2, C3, C4. Pacienţii cu deficienţe de C5, C6, C7, C8 şi C9 nu pot
forma MAC şi au o sensibilitate crescută la infecţiile bacteriene.
Determinarea CH100 este un test screening pentru bolile asociate cu hipocomplementemie; evaluează
în principal calea clasică a complementului şi cuantifică complementul seric funcţional total1;2;4;5;6.
Recomandări pentru determinarea CH100 – primul test screening pentru evaluarea deficienţelor
congenitale ale componentelor complementului; evaluarea şi monitorizarea LES (lupus eritematos
sistemic); evaluarea activităţii complementului în cazul bolilor cu complexe imune: vasculite
generalizate, glomerulonefrite, artrită reumatoidă, crioglobulinemie4;5,6.
Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate)3.
Specimen recoltat - sânge venos3.
Recipient de recoltare - vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator3.
Prelucrare necesară după recoltare - se separă serul prin centrifugare3.
Cantitate recoltată - 1 mL3.
Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat/lipemic/contaminat bacterian3.
Stabilitate probă – complementul se deteriorează la temperatura camerei; dacă proba nu se poate
lucra imediat (2h), plasma separată şi păstrată în tuburi închise ermetic va fi congelată la -70ºC până
se efectuează testul3.
Metodă – imunoenzimatică (EIA)3.
Valori de referinţă - 40 - 200 U/ml 3.
Interpretarea rezultatelor
Un nivel normal de CH50 indică faptul că toate componentele de la C1 la C9 sunt prezente, dar, cu
toate acestea, chiar şi în prezenţa unei concentraţii normale, valorilor absolute ale unor componente
(de exemplu, C3 şi C4) pot fi semnificativ (50 - 80%) mai mici decât nivelele de referinţă, fără a afecta
însă activitatea complementului. Acest lucru se datorează faptului că, în mod normal, în ser există
concentraţii în exces de C3 şi C4.
Nivele nedetectabile se găsesc la pacienţii cu diferite deficienţe ale componentelor complementului.
Aceştia nu pot genera peptide chemotactice şi prezintă risc crescut de infecţii bacteriene recurente
cu microorganisme încapsulate. De asemenea pot prezenta simptome care sugerează o boală
autoimună.
Concentraţii scăzute se întâlnesc în boli infecţioase şi autoimune datorită consumului complementului
ca urmare a procesului de fixare. Astfel, persoanele cu afecţiuni reumatismale, în special cele cu forme
active şi complexe imune circulante prezente, au concentraţii plasmatice reduse de complement.
Nivelul scăzut în ser al complementului hemolitic total, dar şi al fracţiunilor C1q, C3 şi C4 sunt
semnalate la o parte semnificativă a bolnavilor cu LES în puseu şi atunci când există o afectare renală.
Hipocomplementemia severă este considerată un indicator precoce al unui puseu de LES.
Proteinele complementului pot creşte tranzitoriu ca urmare a răspunsului de fază acută la inflamaţie
sau infecţie, valorile revenind la normal după încetarea procesului patologic1;4;6.
6
Limite şi interferenţe
CH50 poate fi utilizat pentru evaluarea integrităţii căii clasice (prezenţa componentele C1-C9), dar
pentru monitorizarea specifică a modificărilor concentraţiilor componentelor complementului sunt
necesare determinări suplimentare de C3 şi C4.
Factorii căii alternative nu pot fi detectaţi şi din acest motiv este necesară efectuarea unor teste
specifice de determinare a nivelelor individuale de componente ale complementului.
Deoarece acesta este un test funcţional, rezultatele sunt dependente de modul de transport şi
depozitare a probei4;6.
Bibliografie
1. Frances Fischbach, Total hemolytic complement (CH50). In A Manual of Laboratory and

Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 7 Ed., 2009, 617-621.
2. H. Davis Massey, Richard A. McPherson. Mediators of Inflammation: Complement, Cytokines,
and Adhesion Molecules. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 849-852.
3. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Complement,
Total, Serum Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
5. Lothar Thomas. The complement system. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and
Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main,
Germany, 1 Ed., 1998, 794-805.
6. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Test Catalog. Complement,
Total, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
7
17.7.2 C1 inhibitor esteraza (dozare proteină)
C1 inhibitor esteraza (C1-INH) este o proteină polimorfă înalt glicozilată care aparţine familiei
inhibitorilor de serin proteaze numiţi serpine. Conţine un singur lanţ polipeptidic cu 478 aminoacizi şi
are o masă moleculară de ~105 KDa.
C1-INH este un inhibitor major al factorului XII activat, de asemenea inactivează plasmina, factorul
XI şi kalicreina şi constituie singurul inhibitor al componentelor complementului C1r şi C1s. Astfel,
această proteină controlează nivelul activării C3 prin împiedicarea formării C3 convertazei (C4bC2a).
Pe de altă parte, C1-INH reprezintă un reactant de fază acută, producţia sa fiind stimulată de
interleukina-6, interferonul-α şi interferonul-γ1.
Deficitul de C1-INH conduce la o activare inadecvată a fracţiunii C1 şi la eliberarea consecutivă din C2
a unui peptid cu activitate asemănătoare kininei care creşte permeabilitatea vasculară. Acest deficit se
traduce clinic prin apariţia angioedemului (ereditar sau dobândit)4.
Angioedemul ereditar este o afecţiune cu transmitere autozomal-dominantă. Cea mai obişnuită formă
de boală (tipul I, 85% dintre pacienţi) este caracterizată printr-o sinteză redusă de C1-INH (cu 70-
95% faţă de valorile normale) asociată cu scăderea fracţiunilor C4 şi C2. În tipul II de boală, mai rar,
se sintetizează o variantă de proteină anormală, astfel că activitatea C1-INH este redusă, însă la
determinarea antigenului (proteinei) se obţin valori în intervalul de referinţă sau chiar crescute; C2 şi
C4 sunt de asemenea scăzute. Conform unor studii mai noi, bradikinina ar fi principalul mediator al
angioedemului6.
Din punct de vedere clinic nu se poate face o distincţie între cele 2 tipuri. Boala debutează în copilărie
sau adolescenţă cu episoade recurente de tumefieri subcutanate şi/sau submucoase, nedureroase,
nepruriginoase şi necomprimabile. Episoadele sunt autolimitate; se remit de obicei în decurs de 2-5 zile.
Atacurile sunt variabile ca frecvenţă, severitate, durată, localizare; factorii declanşatori sunt insuficient
cunoscuţi. Cel mai frecvent sunt afectate extremităţile, faţa, organele genitale, tracturile respirator
şi gastrointestinal. Atacurile intestinale sunt adesea asociate cu vomă şi diaree; cele laringiene pot
conduce la obstrucţii respiratorii cu potenţial letal. Atacurile recurente se produc continuu în decursul
vieţii şi pot afecta zone multiple sau pot progresa de la o zonă la alta. Terapia de lungă durată a
angioedemului ereditar include administrarea de androgeni atenuaţi de tipul danazolului şi stanozolului
care cresc concentraţiile serice de C1-INH normal în ambele tipuri de boală3;6.
Există şi forme dobândite de angioedem asociate cu deficit de C1-INH descrise mai ales la pacienţi
vârstnici cu boli limfoproliferative, boli autoimune (în special lupus eritematos sistemic şi hipereozinofilie),
diverse neoplazii, caracterizate prin dezvoltarea de anticorpi anti-C1-INH. Uneori episoadele de
angioedem pot preceda apariţia bolilor limfoproliferative. Alte forme de angioedem dobândit sunt:
angioedemul alergic (mediat de histamina mastocitară eliberată în urma unui mecanism ce implică
IgE), angioedemul indus de inhibitorii enzimei de conversie (frecvenţă 0.1-0.5% la pacienţii hipertensivi
trataţi cu aceste preparate care cresc nivelul seric de bradikinină), angioedemul pseudoalergic (indus
de inhibitorii de ciclooxigenază) şi angioedemul idiopatic (diagnostic de excludere; de exemplu
angioedemul ce însoţeşte uneori urticaria cronică)3;5;6.
Recomandări pentru determinarea C1- INH (dozare proteină) - diagnosticul angioedemului
ereditar asociat cu deficit cantitativ; monitorizarea nivelurilor de C1-INH ca răspuns la terapie.
8
Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate) sau postprandial2.

Recipient de recoltare - vacutainer fără anticoagulant, cu/fără gel separator2.
Cantitate recoltată - minim 2 mL ser2.
Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat, icteric, lipemic sau contaminat bacterian;
probe care nu au sosit la laborator congelate2.
Prelucrare necesară după recoltare - se separă serul prin centrifugare cât mai repede după formarea
completă a cheagului, iar proba va fi imediat congelată la -20°C; probele recoltate în afara punctelor
laboratorului vor fi transportate în recipientul destinat probelor congelate2.
Stabilitate probă - serul este stabil 1 lună la -20°C; nu decongelaţi/recongelaţi2.
Metodă – nefelometrică2.
Valori de referinţă - 210 -390 mg/L2.
Obţinerea unor valori scăzute este sugestivă pentru angioedemul ereditar tip I. Pacienţii cu angioedem
dobândit vor asocia la nivelul redus de C1-INH o valoare scăzută de C1q 4.
Studiile efectuate pe copii au arătat că nivelele de C1-INH întâlnite la adult sunt atinse după vârsta
de 6 luni.
Un procent de 15% dintre pacienţii cu angioedem ereditar prezintă nivele de C1-INH normale sau
crescute. În aceste cazuri diagnosticul se stabileşte prin efectuarea testului de activitate C1-INH4.
Bibliografie
1. Francesco Dati & Erwin Metzmann. The Complement System. In Proteins Laboratory Testing and
Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005, 29.
2. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Complement C1
Esterase Inhibitor, Serum. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Test Catalog: C1 Esterase
(C1ES) Inhibitor Antigen, Serum. Ref type: Internet Communication.
5. Mihai Pătrăşescu. Angioedemul ereditar – o problemă medicală potenţial severă. În Stetoscop
nr.68, 2007.
6. Terry W. Du Clos, Carolyne Mold. Complement and complement deficiencies. In Clinical
Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 318-319.
17.7.3 C1 inhibitor esteraza (activitate)
C1 inhibitor esteraza (C1-INH) este o proteină polimorfă înalt glicozilată care aparţine familiei
inhibitorilor de serin proteaze numiţi serpine. Conţine un singur lanţ polipeptidic cu 478 aminoacizi şi
9
are o masă moleculară de ~105 KDa.

C1-INH este un inhibitor major al factorului XII activat, de asemenea inactivează plasmina, factorul
XI şi kalicreina şi constituie singurul inhibitor al componentelor complementului C1r şi C1s. Astfel,
această proteină controlează nivelul activării C3 prin împiedicarea formării C3 convertazei (C4bC2a).
Pe de altă parte, C1-INH reprezintă un reactant de fază acută, producţia sa fiind stimulată de
interleukina-6, interferonul-α şi interferonul-γ1.
Deficitul de C1-INH conduce la o activare inadecvată a fracţiunii C1 şi la eliberarea consecutivă din C2
a unui peptid cu activitate asemănătoare kininei care creşte permeabilitatea vasculară. Acest deficit se
traduce clinic prin apariţia angioedemului (ereditar sau dobândit)4.
Angioedemul ereditar este o afecţiune cu transmitere autozomal-dominantă. Cea mai obişnuită formă
de boală (tipul I, 85% dintre pacienţi) este caracterizată printr-o sinteză redusă de C1-INH (cu 70-
95% faţă de valorile normale) asociată cu scăderea fracţiunilor C4 şi C2. În tipul II de boală, mai rar,
se sintetizează o variantă de proteină anormală, astfel că activitatea C1-INH este redusă, însă la
determinarea antigenului (proteinei) se obţin valori în intervalul de referinţă sau chiar crescute; C2 şi
C4 sunt de asemenea scăzute. Conform unor studii mai noi, bradikinina ar fi principalul mediator al
angioedemului6.
Din punct de vedere clinic nu se poate face o distincţie între cele 2 tipuri. Boala debutează în copilărie
sau adolescenţă cu episoade recurente de tumefieri subcutanate şi/sau submucoase, nedureroase,
nepruriginoase şi necomprimabile. Episoadele sunt autolimitate; se remit de obicei în decurs de 2-5
zile. Atacurile sunt variabile ca frecvenţă, severitate, durată, localizare; factorii declanşatori sunt
insufucient cunoscuţi. Cel mai frecvent sunt afectate extremităţile, faţa, organele genitale, tracturile
respirator şi gastrointestinal. Atacurile intestinale sunt adesea asociate cu vomă şi diaree; cele
laringiene pot conduce la obstrucţii respiratorii cu potenţial letal. Atacurile recurente se produc continuu
în decursul vieţii şi pot afecta zone multiple sau pot progresa de la o zonă la alta. Terapia de lungă
durată a angioedemului ereditar include administrarea de androgeni atenuaţi de tipul danazolului şi
stanozolului care cresc concentraţiile serice de C1-INH normal în ambele tipuri de boală3;6.
Există şi forme dobândite de angioedem asociate cu deficit de C1-INH descrise mai ales la pacienţi
vârstnici cu boli limfoproliferative, boli autoimune (în special lupus eritematos sistemic şi hipereozinofilie),
diverse neoplazii, caracterizate prin dezvoltarea de anticorpi anti-C1-INH. Uneori episoadele de
angioedem pot preceda apariţia bolilor limfoproliferative. Alte forme de angioedem dobândit sunt:
angioedemul alergic (mediat de histamina mastocitară eliberată în urma unui mecanism ce implică
IgE), angioedemul indus de inhibitorii enzimei de conversie (frecvenţă 0.1-0.5% la pacienţii hipertensivi
trataţi cu aceste preparate care cresc nivelul seric de bradikinină), angioedemul pseudoalergic (indus
de inhibitorii de ciclooxigenază) şi angioedemul idiopatic (diagnostic de excludere; de exemplu
angioedemul ce însoţeşte uneori urticaria cronică)3;5;6.
Recomandări pentru determinarea C1- INH (activitate) - diagnosticul şi monitorizarea
angioedemului ereditar4.
Recipient de recoltare - vacutainer cu citrat de Na 0.105 M (1/9) (capac bleu/verde)2.
Cantitate recoltată - cât permite vacuumul 2.
Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat, coagulat sau un vacutainer care nu este
10
plin; probe care nu au sosit la laborator congelate2.

Prelucrare necesară după recoltare - se separă plasma prin centrifugare cât mai repede după
recoltare, iar proba va fi imediat congelată la -20°C; probele recoltate în afara punctelor laboratorului
vor fi transportate în recipientul destinat probelor congelate2.
Stabilitate probă - plasma este stabilă 1 lună la -20°C; nu decongelaţi/recongelaţi2.
Metodă - cromogenă2.
Valori de referinţă - 70-130%2.
Obţinerea unor valori scăzute (<10-35%) este sugestivă pentru angioedemul ereditar (ambele forme).
Pacienţii cu angioedem dobândit vor asocia la nivelul redus de C1-INH o valoare scăzută de C1q 4.
Bibliografie
1. Francesco Dati & Erwin Metzmann. The Complement System. In Proteins Laboratory Testing
and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005, 29.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Complement
C1 Esterase Inhibitor, Functional. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Test Catalog: C1 Esterase
(C1ES) Inhibitor Functional Assay, Serum. Ref type: Internet Communication.
5. Mihai Pătrăşescu. Angioedemul ereditar – o problemă medicală potenţial severă. În Stetoscop
nr.68, 2007.
Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 318-319.
17.7.4 Mannose-binding-lectin (MBL) în ser
Mannose binding lectin (MBL) este o glicoproteină polimorfă care activează complementul după
legarea specifică, dependentă de calciu, a manozei şi a N-acetil glucozaminei1. Este implicată în cea
de a treia cale de activare a complementului, recent descrisă sub denumirea de calea lectinelor2.
MBL face parte din familia colectinelor, proteine ce sunt caracterizate prin prezenţa în aceeaşi
subunitate atât a unor structuri colagenice cât şi a unor domenii de lectine.
Este sintetizată în ficat şi este asemănătoare din punct de vedere structural cu fracţiunea C1q. Forma
circulantă (funcţională) este alcătuită din oligomeri ai unor subunităţi care sunt asociate cu o serin
protează (MASP); sunt descrise 2 serin proteaze care leagă MBL şi care sunt similare din punct de
vedere structural şi funcţional cu C1r şi C1s3;4.
11
MBL are o afinitate crescută pentru structuri repetitive de carbohidraţi ce conţin manoză (carbohidraţi
„patogenici”) de pe suprafaţa a numeroase microorganisme; în acelaşi timp proteina nu recunoaşte
carbohidraţi cum ar fi galactoza şi acidul sialic ce reprezintă zaharuri terminale exprimate pe
glicoproteinele mamiferelor. Datorită acestor proprietăţi, MBL este capabilă să discrimineze self-ul
de non-self. Studiile au raportat că MBL reacţionează cu o varietate largă de bacterii Gram pozitive şi
Gram negative acapsulare, virusuri, levuri, mycobacterii, paraziţi şi protozoare2;3.
După recunoaşterea carbohidratului ligand MBL adoptă o modificare conformaţională care conduce la
activarea celor două serin-proteaze MASP-1 şi MASP-2. După activare, MASP-2 clivează C4 pentru
a genera aceeaşi C3 convertază (C4b2a) din calea clasică. MASP-1 are capacitatea de a cliva C3,
sugerând că ar putea provoca direct activarea căii alterne. După formarea C3 convertazei, activarea
complementului decurge în acelaşi fel ca pe calea clasică, cu posibila recrutare şi a căii alterne2;5.
Legarea MBL de agenţii patogeni şi activarea complementului conduce la liza microorganismelor şi
la eliminarea rapidă a acestora prin celulele fagocitare ale sistemului imun (granulocite, monocite/
macrofage). A fost descrisă o interacţiune între MBL legată de membranele ţintă şi un receptor specific
de pe suprafaţa acestor celule care facilitează îndepărtarea microorganismelor (opsonizare) 2;3.
Calea lectinelor mai poate fi activată de către unele complexe antigen-anticorp. Astfel, s-a demonstrat
că o fracţiune a moleculelor IgG căreia îi lipsesc reziduurile de galactoză terminală (IgG-G0), cum este
cea întâlnită în plasma pacienţilor cu poliartrită reumatoidă, are proprietatea de a interacţiona cu MBL
şi activa complementul.
Se pare că reglarea căii lectinelor este mediată de către C1 inhibitor şi alfa2-macroglobulină2.Recent a
fost depistată şi a o activitate anti-tumorală a MBP denumită citotoxicitate mediată celular dependentă
de mannose-binding lectin (MDCC). Această activitate nu necesită activarea complementului ci
implicarea unor celule imune. S-a demonstrat de asemenea că MBP este exprimată selectiv la nivelul
celulelor epiteliale din intestinul subţire, fapt ce sugerează că această proteină deţine un rol important
de apărare locală a gazdei1.
Deoarece MBL aparţine celor mai importante componente ale răspunsului imun, un deficit al acestei
proteine de fază acută este asociat cu o activitate opsonofagocitică redusă şi în consecinţă cu o
predispoziţie crescută pentru infecţii recurente rezistente la tratament.
Nivelurile serice scăzute de MBL sunt condiţionate genetic3.
Gena care codifică MBL este situată pe cromozomul 10, conţine 4 exoni şi prezintă 4 alele (variante
genetice) care influenţează semnificativ concentraţia serică de MBL: tipul MBL sălbatic denumit
alela A şi 3 forme mutante B, C, D. Formele B, C, D rezultă ca urmare a unor mutaţii punctiforme
inactivatoare la nivelul exonului 1 al genei MBL; proteinele formează mai greu oligomeri şi astfel
prezintă o activitate redusă de activare a complementului. O treime din populaţia Europei Centrale
este heterozigotă pentru cel puţin una din aceste mutaţii, ceea ce se poate corela cu o predispoziţie
crescută la infecţii. Defectele homozigote (BB, CC, DD) apar la 0,3% din populaţia europeană şi au
drept consecinţă un deficit aproape complet de MBL. Au mai fost descrise 2 polimorfisme în zona
reglatoare a promotorului genei MBL care de asemenea cauzează un nivel seric scăzut de MBL şi
sunt responsabile de efectele clinice3;4.
MBL induce şi fagocitoza materialului celular apoptotic şi a complexelor imune. În deficitul de MBL
resturile celulare nefagocitate se acumulează şi sunt o sursă de autoantigene. În plus se acceptă
faptul că pacienţii cu deficit de MBL pot fi infectaţi cu agenţi patogeni care joacă rol în patogeneza
12
bolilor autoimune induse de aceştia. La pacienţii cu lupus eritematos sistemic, artrită reumatoidă sau
sindrom Sjögren s-au găsit niveluri scăzute de MBL şi aceşti pacienţi sunt mai frecvent purtători de
mutaţii în gena MBL.
Doar nivelurile scăzute de MBL sunt relevante pentru un defect de imunitate; concentraţiile crescute
indică o infecţie activă. Tratamentele de substituţie cu concentrate de MBL recombinate sau obţinute
din plasmă se află încă în stadiul de testare clinică. Pacienţii cu niveluri scăzute de MBL ar trebui
să primească vaccinări profilactice, mai ales faţă de virusurile gripale, Haemophilus influenzae şi
Streptococcus pneumoniae3.
Recomandări pentru determinarea MBL - evaluarea pacienţilor (copii sau adulţi) cu istoric de
infecţii recurente, mai ales în prezenţa unui status imun aparent normal (formulă leucocitară normală,
imunoglobuline serice normale) 3;4.
Pregătire pacient - à jeun3.
Cantitate recoltată - minim 0.5 mL ser3.
Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat, icteric, lipemic sau contaminat
bacterian3.
Prelucrare necesară după recoltare - se separă serul prin centrifugare şi se transportă în condiţii
de refrigerare3.
Stabilitate probă - serul este stabil 1 săptămână la 4-8°C3.
Metodă - ELISA3.
Valori de referinţă - >450 ng/mL3.
Un nivel scăzut de MBL în ser (<450 ng/mL) se asociază cu o predispoziţie crescută pentru infecţii cu
bacterii şi fungi (mai ales Candida albicans) datorită defectelor funcţionale ale complementului.
Un defect MBL poate fi de asemenea cauza unei eliminări virale scăzute sau prelungite (de exemplu
în cazul infecţiilor cu virus herpetic tip 2).
Spre deosebire de defectele homozigote clinic evidente (MBL în ser <50 ng/mL), cele heterozigote
se exprimă clinic numai în contextul unor boli de bază sau tratamente (infecţii cronice, radioterapie,
chimioterapie, terapie imunosupresoare) sau în asociere cu alte anomalii înnăscute ale sistemului
imun (deficit de imunoglobuline sau de subclase IgG, alele C4 nule). Tablourile clinice tipice sunt
candidoza recidivantă sau infecţiile bacteriene, ca de exemplu infecţiile agresive cu pneumococ sau
infecţiile recurente de căi respiratorii3.
MBL este o proteină de fază acută indusă în cursul unei infecţii; dacă testarea se efectuează în
această situaţie este posibil ca un deficit latent de MBL să fie mascat. De aceea, în cazul unui rezultat
normal sau aflat în zona de graniţă (450-1500 ng/mL), în prezenţa unei suspiciuni clinice de deficit
se recomandă testarea genetică pentru MBL deoarece aceasta nu este influenţată de activitatea
imună3.
Identificarea unui deficit MBL nu exclude alte etiologii care ar predispune la o susceptibilitate crescută
la infecţii4.
13
Bibliografie
1. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Complement System. In Proteins Laboratory Testing and
Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005, 29-30.
2. H. Davis Massey, Richard A. McPherson. Mediators of Inflammation: Complement, Cytokines,
and Adhesion Molecules. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 852.
3. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories.Test Catalogs and Guides. Mannose-Binding Lectin,
Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 308.
14
17.8 CITOKINE
17.8.1 Interleukinele (IL)

Citokine şi chemokine
Termenul de interleukină (IL) este utilizat pentru o serie de polipeptide cu rol principal în comunicarea
dintre leucocite în cursul medierii răspunsului imun şi inflamator al organismului. Ele au fost
descoperite, studiate şi descrise în domenii medicale conexe: imunologie, hematologie, virusologie.
Deoarece aceste IL au deopotrivă, atât ca origine cât şi ca ţintă, nu doar celule hematopoietice, cum
se considerase iniţial, ci şi diverse alte tipuri celulare, se preferă în prezent termenul generic de
citokine.
Citokinele se definesc ca polipeptide (proteine solubile) secretate în special de către leucocite (mai
ales limfocite T şi macrofage) ce acţionează în principal asupra celulelor hematopoietice, cu efecte
modulatorii asupra răspunsului imun şi inflamator4.
Acţiunea biologică a fiecărei citokine este dependentă de celula secretantă, precum şi de celula ţintă,
respectiv de receptorii ei membranari. Citokinele pot avea fie funcţii specifice, unice (dacă receptorii
lor au în mod tipic subunităţi specifice), fie efecte pleiotrope (se pot lega de mai mulţi receptori), fie
efecte redundante (receptori diferiţi folosesc în comun unele subunităţi structurale şi funcţionale)4.
Clasificările citokinelor în funcţie de aceşti receptori membranari au devenit tot mai utilizate (în
detrimentul celor bazate doar pe structură şi/sau rol) datorită importanţei crescânde a acestor receptori
în diagnosticul şi tratamentul bolilor în care citokinele joacă un rol cheie. De exemplu, un nou set de
agenţi bioterapeutici au fost dezvoltaţi utilizând anticorpi monoclonali şi antagonişti ai citokinelor sau
ai receptorilor lor membranari2. Adiţional, detectarea şi măsurarea acestor citokine au început să intre
în rutina laboratoarelor clinice3.
În prezent sunt definite 5 superfamilii de citokine în funcţie de următoarele clase de receptori
membranari:
- superfamilia receptorilor citokinici (de tip hematopoietic şi de tip interferon);
- superfamilia receptorilor de tip TNF;
- familia receptorilor de tip IL-1/Toll-like receptor;
- familia receptorilor tirozin-kinazici;
- familia receptorilor serin-kinazici, TGF-β4.
Chemokinele formează o superfamilie aparte de cele 5 familii enumerate anterior deoarece
chemokinele sunt citokine chemoatractante, cu o serie de caracteristici structurale şi funcţionale
specifice.
Chemokinele sunt polipeptide de 8-10 kDa al căror rol fundamental este de a regla fin fluxurile de
leucocite din organism, în principal în cursul homeostaziei (chemokine homeostatice) şi inflamaţiei
(chemokine inflamatorii).
Chemokinele homeostatice sunt produse de ţesuturile sănătoase, cu scopul de a direcţiona leucocitele
către zonele anatomic corecte în cadrul embriogenezei, hematopoiezei şi a apărării imune. În schimb,
chemokinele inflamatorii sunt produse în cursul răspunsului inflamator de către celule rezidente
tisulare activate sau lezate şi/sau de către leucocitele activate, atrăgând către zona inflamată celulele
15
adecvate răspunsului inflamator2.

S-au descris circa 50 chemokine ce interacţionează cu aproximativ 20 receptori chemokinici. În
ansamblu, toate chemokinele au o structură minimală comună (o zonă plană tip β sheet, un lanţ
α helix în domeniul lor C terminal şi legături bisulfidice între reziduurile lor cisteinice). În schimb se
descriu 3 tipuri de receptori: receptori cu 7 domenii transmembranare, receptori sensibili la toxina
pertussis şi receptori cuplaţi cu proteina G.
Clasificarea şi definirea membrilor celor 4 familii de chemokine este realizată în funcţie de aranjamentul
primelor 2 reziduuri cisteinice N-terminale din cadrul secvenţei lor de aminoacizi:
- familia α sau CXC (doar un singur aminoacid se află între cele 2 reziduuri de referinţă) include
IL-8 (CXCL8) cu rol în recrutarea neutrofilelor, IP-10 (CXCL10) cu rol în recrutarea limfocitelor;
- familia β sau CC (cele 2 reziduuri de referinţă sunt adiacente) este cea mai mare familie;
- familia δ sau CX3C (3 aminoacizi se află între cele 2 reziduuri de referinţă) are un singur membru,
fractalkina sau neurotactin (CX3CL1);
- familia γ sau C (există doar un singur reziduu cisteinic la capătul N terminal) are un singur
membru, limfotactina (XCL1)2;3.
Recomandări pentru determinarea interleukinelor
Titrurile interleukinelor determinate în diverse lichide biologice pot fi utilizate în diagnosticarea unor
afecţiuni imune şi în monitorizarea tratamentelor doar în corelaţie cu date clinice şi paraclinice
complementare1.
Bibliografie
1. Florence Allantaz, D. Chaussabel, J. Banchereau, et al, “Microarray-based identification of novel

biomarkers in IL-1 mediated diseases”, In Curr Opin Immunol, 2007 December, 19(6): 623–632.
2. N. Franklin Adkinson JR, Bruce S. Bocher. Cytokines in allergic inflammation. In Middleton’s
Allergy, Principles and Practice – Mosby Elsevier 7th-Ed 2008, 165.
3. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Immunology and immunopathology. In Henry’s
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21st-Ed 2007,
861.
4. Robert R. Rich, Thomas A. Fleisher. Cytokines and cytokines receptors. In Clinical Immunology,
Principles and Practice – Mosby Elsevier 3rd-Ed 2008, 139.
17.8.2 Interleukina 1β (IL-1β)
Principalele roluri ale interleukinelor de tip 1 (IL-1), considerate cel mai important reglator al răspunsului
imun şi inflamator al organismului, se referă la inducerea unor evenimente asociate, precum sinteza
reactanţilor de fază acută, caşexia şi febra. Pentru descrierea mecanismelor de modulare a acestor
funcţii sunt vizate în principal cele 3 interleukine de tip 1 care se pot lega de 2 tipuri de receptori:
citokinele IL-1α, IL-1β şi IL-1RA (din familia receptorilor de tip IL-1/Toll-like receptor) şi receptorii
16
IL-1RI şi IL-1RII. Caracteristicile funcţionale ale acestor citokine şi receptori diferă, determinând
consecinţe variate, necesare modulării efectelor, astfel:
- IL-1α şi IL-1β sunt citokinele active biologic, cu structuri şi roluri similare, reglate însă
diferit;
- IL-1RA (engl. IL-1 receptor antagonist) este, în fapt, un antagonist natural al receptorului
pentru IL-1;
- IL-1α se poate lega doar de IL-1RI, iar IL-1β şi IL-1RA se pot lega de ambii receptori;
- receptorul IL-1RII (67 kDa), care nu transmite semnale intracelulare, este considerat un
receptor „capcană” (engl. „decoy”). De IL-1RII se pot lega doar IL-1β şi IL-1RA;
- doar receptorul IL-1RI (80 kDa) transmite semnale intracelulare. De receptorul IL-1RI se
pot lega toate cele 3 citokine IL-1 şi transmite semnale intracelulare primite de la IL-1α sau
IL-1β7;8;9.
Ataşarea IL-1α sau IL-1β de IL-1RI determină asocierea receptorului cu o proteină accesorie (IL-1RI
RAcP), critică pentru inducerea semnalului ce determină activarea factorilor nucleari de transcripţie,
prin intermediul unor proteine MAP (engl, macrotubule associate proteins) asociate căii kinazice8.
Receptorul activ, IL-1RI, este larg răspândit, spre deosebire de IL-1RII care se află pe suprafaţa
doar a câtorva tipuri celulare (neutrofile, monocite, celule B). Prin captarea şi sechestrarea celor 2
citokine active (IL-1β şi IL-1RA) receptorul IL-1RII are rol antiinflamator7. Ambii receptori pot fi clivaţi,
cu apariţia rapidă în circulaţie a receptorilor proteici solubili (un alt mecanism tampon al semnalizării
induse de citokinele IL-1)9.
Ambele citokine active biologic (IL-1α sau IL-1β) sunt sintetizate sub formă de precursori proteici,
activi doar în cazul pre-IL-1α; precursorul pre-IL-1β rămâne în citoplasmă până la clivarea sa de către
caspaza 1 (engl. IL-1β converting enzyme, ICE)7;9.
Sursa majoră a citokinelor IL-1 este reprezentată de linia celulelor fagocitare mononucleare (macrofage),
deşi pot fi sintetizate de asemenea în multe alte celule (celule endoteliale, keratinocite, osteoblaste,
neutrofile, celule gliale). Agenţii stimulanţi ai secreţiei de IL-1 sunt reprezentaţi de endotoxine, alte
citokine, microorganisme, antigene variate7.
Producţia de IL-1 în cursul răspunsului imun este responsabilă de spectrul manifestărilor clinice
asociate „stării de boală”, precum febra, letargia, somnolenţa şi anorexia (urmare a acţiunii IL-1
asupra sistemului nervos central)7;8.
La nivelul hepatocitului, IL-1 stimulează, ca şi IL-6, producţia reactanţilor de fază acută (peptidul
amiloid, proteina C reactivă, complementul), pe baza sechestrării locale a altor proteine (scade în
special eliberarea serică a albuminei)7;8. Pentru a obţine aminoacizii necesari sintezei masive a
acestor noi polipeptide, IL-1 favorizează de asemenea distrucţia proteinelor musculare, resimţită ca
mialgia ce acompaniază unele boli7;8;9.
Citokinele IL-1 stimulează răspunsurile imune de tip celular şi umoral acţionând atât asupra limfocitelor
T, via IL-2 (IL-1 stimulează producţia de IL-2 şi creşterea expresiei receptorului pentru IL-2), cât şi
asupra limfocitelor B (IL-1 stimulează proliferarea limfocitelor B şi producţia de imunoglobuline)8.
De asemenea este favorizată acumularea locală de leucocite prin creşterea expresiei moleculelor de
adeziune la nivelul endoteliului vascular8.
Rolul proinflamator al citokinelor IL-1 este dat de stimularea metabolismului acidului arahidonic, cu
producţia şi eliberarea consecutivă a altor citokine (mai ales IL6 şi chemokine). De asemenea, IL-1 are
17
efecte procoagulante9 şi de stimulare a hematopoiezei (efect sinergic cu factori de creştere locali)8;9.

Citokinei IL-1 i se atribuie, pe de o parte, un rol în promovarea şi proliferarea unor linii celulare
leucemice, iar pe de altă parte, efecte citotoxice directe asupra unor celule infectate viral şi asupra
unor celule tumorale8.
Inducerea sintezei de NO (monoxid de azot) de către celulele endoteliale reprezintă mecanismul prin
care IL-1 contribuie la vasodilataţia şi hipotensiunea arterială din şocul septic şi cel cardiogen7;8.
La nivelul spaţiului intraarticular, IL-1 promovează proliferarea sinoviocitelor, formarea depozitelor de
colagen, resorbţia cartilajului şi a ţesutului osos, condiţii asociate artritei reumatoide8.
De asemenea există dovezi privind contribuţia IL-1β la destrucţia celulelor β pancreatice în ambele
tipuri de diabet zaharat3;6.
Recomandări pentru determinarea IL-1β
complementare.
completă a coagulului, iar proba va fi imediat congelată la -20°C; probele recoltate în afara punctelor
Metodă – metodă imunoenzimatică EIA5.
Valori de referinţă - < 5 pg/mL5.
Niveluri crescute ale marker-ului se întâlnesc în:
-boli febrile de cauză non-infecţioasă3;
-artrită reumatoidă2;3;
-diabet zaharat3;10;
-vasculite, inclusiv cea asociată crioglobulinemiei din hepatita C1;3;
-boala Alzheimer4;
-tuberculoza pulmonară11.
Bibliografie
1. Antonelli A, Ferri C, Ferrari SM et al, “Serum concentrations of interleukin 1beta, CXCL10,
and interferon-gamma in mixed cryoglobulinemia associated with hepatitis C infection”. In J
Rheumatol. 2010 Jan;37(1):91-7.
2. Fionula M. Brennan and I. B. McInnes, “Evidence that cytokines play a role in rheumatoid
arthritis”. In J Clin Invest. 2008; Nov, 118(11): 3537–3545.
18
3. Florence Allantaz, D. Chaussabel, J. Banchereau, et al, “Microarray-based identification of novel

biomarkers in IL-1 mediated diseases”. In Curr Opin Immunol, 2007 December, 19(6): 623–632.
4. Forlenza OV, Diniz BS, Talib LL et al, “Increased serum IL-1beta level in Alzheimer’s disease
and mild cognitive impairment”. In Dement Geriatr Cogn Disord. 2009;28(6):507-12.
6. Maedler K, Dharmadhikari G, Schumann DM et al, “Interleukin-1 beta targeted therapy for type 2
diabetes”. In Expert Opin Biol Ther. 2009 Sep;9(9):1177-88.
862.
Principles and Practice – Mosby Elsevier 3rd-Ed 2008, 143-165.
10. Ruotsalainen E, Vauhkonen I, Salmenniemi U et al, “Markers of endothelial dysfunction
and low-grade inflammation are associated in the offspring of type 2 diabetic subjects”. In
Atherosclerosis, 2008 Mar;197(1):271-7.
11. Su WL, Perng WC, Huang CH et al, “Association of reduced tumor necrosis factor alpha,
gamma interferon, and interleukin-1beta (IL-1beta) but increased IL-10 expression with improved
chest radiography in patients with pulmonary tuberculosis”. In Clin Vaccine Immunol. 2010
Feb;17(2):223-31.
17.8.3 Interleukina 6 (IL-6)
Principalele acţiuni ale interleukinei 6 (IL-6) asupra celulelor limfoide şi nelimfoide reprezintă
mecanisme modulatoare ale răspunsurilor imun şi inflamator al organismului. Deşi multe dintre aceste
funcţii se suprapun peste cele ale interleukinelor de tip 1 (IL-1), precum sinteza reactanţilor de fază
acută şi febra, IL-6 are şi efecte antiinflamatorii5.
Receptorul specific pentru IL-6 (IL-6R) aparţine superfamiliei receptorilor citokinici (de tip
hematopoietic). IL-6R este un complex proteic membranar compus din 2 subunităţi structurale şi
funcţionale: o subunitate ligant specifică, IL-6Rα (un lanţ α de 80 kDa) şi o subunitate semnalizatoare,
gp130 (un lanţ β, componentă comună mai multor tipuri de receptori, precum cei de care se leagă
IL-11, IL-27, IL-31)6;7.
Citokina IL-6 este secretată ca polipeptid format din 184 aminoacizi, cu o greutate moleculară de
aproximativ 21 kDa, în funcţie de gradul glicozilării6.
Asemănător IL-1, sursa cea mai importantă a IL-6 este reprezentată de macrofage, fiind sintetizată
şi de limfocitele T şi B, de fibroblaste şi celule endoteliale, de keratinocite, sinoviocite, condrocite,
celule epiteliale5;6;7. Astfel, IL-6 este produsă ca răspuns la infecţii bacteriene şi virale, inflamaţii sau
traumatisme, ajungând rapid la nivele plasmatice detectabile, spre deosebire de multe alte citokine7.
19
Citokina IL-6 este considerată cel mai important inductor al producţiei hepatice a reactanţilor de fază
acută: fibrinogen, amiloid seric A, haptoglobina, proteina C reactivă, complementul. Ca urmare a
expunerii la IL-6, ficatul scade sinteza de albumină şi transferină, iniţiind în schimb procesele de
regenerare hepatocitară5;7.
Citokina IL-6 stimulează răspunsurile imune de tip umoral şi celular acţionând atât asupra limfocitelor
B, cât şi a limfocitelor T. IL-6 acţionează ca important factor de creştere şi diferenţiere a celulelor
B şi stimulează producţia lor de imunoglobuline. De asemenea promovează activarea, creşterea şi
diferenţierea celulelor T5;6;7. Este implicată în patogenia mielomului multiplu, fiind utilizat ca factor de
prognostic al bolii2;6;7.
IL-6 stimulează hematopoieza (acţionează sinergic cu IL-3), induce secreţia de ACTH şi alţi hormoni
pituitari (prolactină, hormon de creştere, hormon luteinizant)7.
Pe lângă acţiunile proinflamatorii, IL-6 mediază şi o serie de efecte antiinflamatorii: în timp ce IL-1 şi
TNF îşi induc reciproc sinteza, precum şi pe cea de IL-6, IL-6 finalizează această cascadă inflamatorie
deoarece inhibă sinteza de IL-1 şi TNF, concomitent cu stimularea sintezei de IL-1RA5.
La nivelul ţesutului osos, IL-6 stimulează formarea osteoclastelor, favorizând osteoporoza6;7. Anomalii
ale producţiei de IL-6 s-au observat la pacienţi cu artrită reumatoidă1;7 (creşteri în lichidul sinovial a
nivelelor de IL-6 şi IgG) şi la cei cu glomerulonefrită membranară proliferativă din lupusul eritematos
sistemic6.
Recomandări pentru determinarea IL-6
complementare.
Valori de referinţă - < 9.7 pg/mL4.
- artrita reumatoidă1;3;6;7;
- mielom multiplu: factor de prognostic2;6;7;
- boli autoimune3;7;
- limfoame3;
- sepsis3;
- SIDA3;
- afectare hepatică etanolică3;
20
- infecţii virale3;
- rejetul transplantului3;
- preeclampsie severă8.
Bibliografie
1. Fionula M. Brennan and I. B. McInnes, “Evidence that cytokines play a role in rheumatoid
arthritis”, In J Clin Invest. 2008; Nov, 118(11): 3537–3545.
2. Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B. Hematologic malignancies.
In Wintrobe`s Clinical Hematology, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 2156-2157,
2409.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Interleukin-6,
www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
6. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Immunology and immunopathology. In Henry’s Clinical
Diagnosis and Management by Laboratory Methods - Sauders Elsevier 21st-Ed 2007, 863.
8. Tosun M, Celik H, Avci B et al, “Maternal and umbilical serum levels of interleukin-6,
interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in normal pregnancies and in pregnancies
complicated by preeclampsia”, In J Matern Fetal Neonatal Med. 2010 May 4.
Rolul major al interleukinei 8 (IL-8) în cadrul răspunsului inflamator al organismului este cel de a
induce acumularea neutrofilelor în regiunile lezate.
Citokina chemoatractantă IL-8 aparţine familiei α (sau CXC) de chemokine, fiind denumită, în
consecinţă, şi CXCL83;4.
Ambii receptori specifici ai IL-8, IL-8RA şi IL-8RB, sunt de tipul receptorilor cu 7 domenii
transmembranare. IL-8RA are specificitate şi afinitate mai mare pentru IL-8 decât IL-8RB, în timp ce
IL-8RB se pare că poate lega şi alte proteine conexe chemokinei IL-84.
Chemokina IL-8 este secretată ca peptid mic (monomer, 8 kDa, 72 aminoacizi) de către câteva tipuri
celulare (celule endoteliale, celule epiteliale, fibroblaste, neutrofile, monocite, macrofage, limfocite
T) şi este eliberată ca răspuns la stimuli variaţi, de tipul lipopolizaharidelor (LPZ) şi leucotrienelor.
Deşi IL-8 poate exista şi sub formă de homodimer (legătură necovalentă), acţiunea chemoatractantă
maximală o are în forma sa monomerică4.
Chemokina IL-8 a fost descoperită iniţial ca fiind factor de activare a neutrofilelor, ulterior evidenţiindu-
se rolul său în recrutarea şi acumularea neutrofilelor la nivelul zonelor inflamate. Acţiunile chemotactice
21
se adresează secundar şi altor celule, precum bazofilele şi un subset de limfocite T (CD4/CD8)3;4.

Expresia IL-8 este crescută la nivelul celulelor endoteliale din vecinătatea situsului inflamator. Fiind o
proteină solubilă, IL-8 formează un gradient chemotactic în interiorul ţesuturilor, ghidând leucocitele
activate extravazate către zonele inflamate. Traversarea endoteliului de către leucocitele activate este
facilitată de IL-8 care alterează expresia integrinelor4.
Deşi IL-8 are rolul principal de chemoatractant, nivelele crescute sanguine de IL-8 se asociază cu
o acumulare scăzută de neutrofile în zonele inflamate şi cu neutrofilie sistemică. Chemokinele pot
promova progresia bolilor, studiile relevând rolul IL-8 în variate circumstanţe inflamatorii, de la artrita
cronică la sepsis4.
În cazul sepsisului, IL-8 are rolul central în acumularea neutrofilelor în diverse organe şi în progresia
către stadiile finale ale bolii. Măsurarea IL-8 concomitent cu proteina C reactivă la nou-născuţi permite
identificarea cazurilor reale de sepsis neonatal precoce, reducând în consecinţă administrările ne-
necesare de antibiotice4.
complementare.
Valori de referinţă - < 15 pg/mL1.
- boli coronariene (în discuţie valoarea predictivă)2;
- sepsis neonatal4;
- preeclampsie severă6.
Bibliografie
2. Pål Aukrust, Bente Halvorsen, Arne Yndestad et al, „Chemokines and Cardiovascular Risk”, In
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008;28:1909-1919.
22
Principles and Practice– Mosby Elsevier 3rd-Ed 2008, 143-165.
6. Tosun M, Celik H, Avci B et al, “Maternal and umbilical serum levels of interleukin-6,
interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in normal pregnancies and in pregnancies
complicated by preeclampsia”, In J Matern Fetal Neonatal Med. 2010 May 4.

Funcţia majoră a interleukinei 10 (IL-10) este de a servi ca principal antiinflamator şi imunosupresor în
cadrul mecanismelor de modulare a răspunsului organismului la diverşi factori patogeni3;4.
Receptorul specific pentru IL-10 (IL-10R) aparţine superfamiliei receptorilor citokinici (de tip
interferon). Acesta se află în special pe suprafaţa celulelor hematopoietice (macrofage, celule
mastocitare), expresia sa la nivelul celulelor nehematopoietice fiind inductibilă de către stimuli precum
lipopolizaharide4.
Citokina IL-10 este o proteină formată din 160 aminoacizi, cu o greutate moleculară de 18.5 kDa şi,
spre deosebire de IL din aceeaşi familie, este un dimer bi-sulfidic3;4.
Citokina IL-10 este produsă de numeroase celule: limfocite T helper de tip 1 şi 2 (Th1 şi Th2), limfocite
T citotoxice, celule B activate, monocite, macrofage, keratinocite, celule epiteliale bronşice2;3;4.
Lipopolizaharidele, TNFα şi alte citokine sunt inductori ai IL-102;4.
Deoarece IL-10 poate fi produsă într-o manieră autocrină, reglându-şi producţia prin intermediul unei
bucle de feed-back negativ, IL-10 poate regla răspunsul imun din interiorul focarului inflamator.
Rolul modulator al IL-10 este complex: pe de o parte, IL-10 inhibă sinteza citokinelor asociate imunităţii
celulare şi inflamaţiei de tip alergic, iar pe de altă parte, stimulează răspunsurile imune citotoxic şi
umoral3.
Citokina IL-10 este considerată un puternic inhibitor al producţiei de citokine provenite din variate tipuri
celulare. Astfel, IL-10 induce scăderea producţiei de: IFNγ şi IL-2 (din limfocitele Th1), IL-4 şi IL-5
(din limfocitele Th2), IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12 şi TNF-α (din fagocitele mononucleare), IFNγ şi TNF-α
(din celulele NK, engl. natural killer)2;3;4. De asemenea IL-10 inhibă expresia moleculelor MHC clasa
II, CD23, ICAM-1, CD80 şi CD86 de la nivelul celulelor dentritice şi a altor celule prezentatoare de
antigen (APC, engl, antigen presenting cells). Scăderea producţiei de citokine de către limfocitele Th1
şi Th2 este mediată de acest efect al IL-10 asupra expresiei CD80 şi CD862;4.
Citokina IL-10 inhibă eliberarea radicalilor liberi de oxigen precum şi activitatea bactericidă dependentă
de oxidul nitric (NO) a macrofagelor3.
La nivelul tractului respirator, IL-10 deţine un rol central în inducţia şi menţinerea toleranţei la alergenii
din atmosferă, consecinţă a expresiei constituţionale a IL-10 la nivelul celulelor dendritice imature
şi al fagocitelor mononucleare. Condiţii patologice precum astmul şi rinita alergică sunt asociate cu
o diminuare a expresiei IL-10, ceea ce permite dezvoltarea unui mediu inflamator şi crearea unei
ambianţe permisive expresiei celulelor dendritice mature2.
În plus, IL-10 inhibă sinteza mediată de IL-4 a imunoglobulinelor E (IgE) şi scade timpul de viaţă al
23
eozinofilelor, reducerea nivelului său fiind implicată în patogeneza bolilor alergice2;3.

IL-10 participă la apariţia şi progresia lupusului eritematos sistemic (LES), activitatea bolii corelându-se
cu titrurile de IL-10 (paradoxal, titrurile de IL-10 sunt ridicate la aceşti pacienţi, iar nivelele de IL-10
sunt corelate cu producţia de anticorpi)3,4.
IL-10 pare a fi implicată într-o serie mai largă de boli autoimune (miastenia gravis, boala Graves,
sindrom Sjögren, polimiozită, psoriazis, scleroză sistemică, pemfigus vulgaris, boala Kawasaki)3
precum şi în imunosupresia din lepra lepromatoasă şi infestări parazitare1.
complementare.
Metodă – imunoenzimatică (EIA1.
Valori de referinţă - < 9.1 pg/mL1.
- LES3,4;
- diabet zaharat5;
- tuberculoza pulmonară (factor de predicţie a evoluţiei favorabile)6.
Bibliografie
Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21st-Ed 2007, 864.
5. Ruotsalainen E, Vauhkonen I, Salmenniemi U et al, “Markers of endothelial dysfunction
and low-grade inflammation are associated in the offspring of type 2 diabetic subjects”, In
Atherosclerosis. 2008 Mar;197(1):271-7.
6. Su WL, Perng WC, Huang CH et al, “Association of reduced tumor necrosis factor alpha,
gamma interferon, and interleukin-1beta (IL-1beta) but increased IL-10 expression with improved
chest radiography in patients with pulmonary tuberculosis”, In Clin Vaccine Immunol. 2010
Feb;17(2):223-31.
24
17.8.6 Receptorul solubil pentru interleukina-2
Receptorul pentru IL-2 deţine un rol important în reglarea răspunsului imun. Prin legarea interleukinei-2
de acest receptor pe suprafaţa limfocitelor T, se transmit în interiorul celulelor o serie de semnale care
au ca rezultat activarea şi proliferarea limfocitelor. Sunt generate astfel limfocitele T helper, T supresor
şi T citotoxic care mediază reacţiile imune.
Receptorul pentru IL-2 este un complex proteic membranar compus din 3 subunităţi: α, β, γ. Există trei
forme celulare ale acestui receptor:
- un complex cu afinitate crescută pentru interleukina-2 compus din toate cele trei subunităţi
α, β, γ;
- un complex cu afinitate intermediară compus din subunităţile β şi γ;
- o formă cu afinitate scăzută reprezentată numai de subunitatea α1.
Subunitatea α prezintă o formă solubilă care apare în ser în paralel cu creşterea expresiei celulare
a receptorului. Creşterea nivelului seric al formei solubile se corelează astfel cu creşterea activităţii
limfocitelor T şi / sau B.
Niveluri crescute ale receptorului solubil pentru interleukina-2 pot fi întâlnite în următoarele condiţii
clinice: sindromul imunodeficienţei dobândite, boli autoimune, sarcoidoza, unele tipuri de limfoame şi
leucemii, rejetul de transplant2;3.
Recomandări pentru determinarea receptorului solubil pentru interleukina-2
- monitorizarea sarcoidozei, atât în formele pulmonare cât şi în cele extrapulmonare (marker seric
al inflamaţiei);
- limfoame maligne non-Hodgkin, limfoame nediferenţiate (factor de prognostic pe termen lung)²;³.
- la pacienţii HIV pozitivi (niveluri crescute ale receptorului sunt întâlnite atât în faza asimptomatică
cât şi în fazele de limfadenopatie generalizată persistentă şi simptomatică şi pot fi corelate cu
activitatea limfocitelor T)3.
completă a coagulului iar proba va fi imediat congelată la -20°C; probele recoltate în afara punctelor
Metodă - ELISA1.
Valori de referinţă - < 710 U/mL1.
- afecţiuni hematologice maligne (limfoame, leucemia cu celule T, leucemia cu celule păroase) şi
se corelează cu cantitatea de celule tumorale si cu răspunsul la terapie2;3.
25
- boli autoimune (LES, vasculită autoimună, colita ulcerativă) unde se corelează cu gradul de
activitate a afecţiunilor5.
- boli infecţioase cu afectare severă a statusului imunologic (infecţie HIV)2.
- sarcoidoză2;3.
Bibliografie
2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Interleukin-2
Soluble Receptor Alfa, www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
3. www.mayomedicallaboratories.com. Test Catalog: Interleukin-2 Receptor (IL-2R), ELISA. Ref
Type: Internet Communication.
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 862.
5. Scandinavian Journal of Rheumatology vol 22, Issue 5, 1993, 215-219. Serum levels of soluble
interleukin-2 receptor in pacients with SLE and systemic idiopathic vasculitis.
17.8.7 Interferon gamma (IFNγ)
Interferonul gamma (IFNγ), considerat principala citokină responsabilă de imunitatea mediată celular,
este un activator major al macrofagelor7;10.
Receptorul specific pentru IFNγ se află în special pe suprafaţa macrofagelor, celulelor NK (engl.
natural killer)10. Din punct de vedere structural, acest receptor aparţine superfamiliei receptorilor
citokinici (de tip interferon); este un heterodimer compus din 2 subunităţi, IFNGR1 şi IFNGR2 (sau
IFNγRα şi IFNγRβ). Mutaţii ale genelor ce codifică subunităţile IFNGR1 şi IFNGR2 sunt responsabile
de susceptibilitatea crescută la infecţii cu mycobacterii şi Salmonella10.
Citokina IFNγ este o proteină homodimerică formată din 143 aminoacizi, cu o greutate moleculară de
40-70 kDa9.
IFNγ este produs în principal de către limfocitele T helper de tip 1 (ca răspuns la stimularea antigenică şi
mitogenă), de celulele NK (consecutiv acţiunii IL-2, anticorpilor anti-CD16 şi în prezenţa macrofagelor)
şi de celulele T citotoxice7;9;10.
IFNγ mediază creşterea expresiei moleculelor de histocompatibilitate (MHC) de clasă I şi II. IFNγ
stimulează în principal prezentarea antigenului şi producţia de citokine a monocitelor, precum şi celelalte
funcţii efectoare ale acestor celule: aderenţa, fagocitoza, secreţia, arderile respiratorii şi producţia
de NO (monoxid de azot). Astfel, IFNγ favorizează acumularea macrofagelor la nivelul situsului
răspunsului imun celular precum şi abilitatea acestora de a distruge microorganismele intracelulare7;9;10.
De asemenea IFNγ stimulează şi capacitatea altor celule de a distruge microorganisme, precum
26
a celulelor NK şi a neutrofilelor7. Asemănător celorlalţi interferoni (în special INFα şi IFNβ) inhibă
replicarea virală7;10.
Recomandări pentru determinarea IFNγ
Nivelele cantitative ale IFNγ determinate în diverse lichide biologice pot fi utilizate în diagnosticarea
unor afecţiuni imune şi în monitorizarea tratamentelor doar în corelaţie cu date clinice şi paraclinice
complementare. Deocamdată nu sunt suficiente informaţii de ordin statistic necesare stabilirii
indicaţiilor specifice ale determinărilor serice ale IFNγ.
Metodă – EIA6.
Valori de referinţă - < 0.1 UI/mL6.
- artrita idiopatică juvenilă8;
- hepatita cronică cu virus hepatic C (VHC), constatându-se valori mai mari în cazul asocierii
consumului de alcool4;
- rejetul de grefă (faza acută)2;
- boala celiacă3;
- boala Wilson5;
- diabet zaharat de tip I (evolutiv)1.
Bibliografie
1. Alizadeh B. Z., Hanifi-Moghaddam P., Eerligh P. et al, “Association of interferong and interleukin
10 genotypes and serum levels with partial clinical remission in type 1 diabetes”, In Clinical and
Experimental Immunology. 2006; 145: 480–484.
2. Atalar K, Afzali B, Lord G et al, “Relative roles of Th1 and Th17 effector cells in allograft rejection”,
In Curr Opin Organ Transplant. 2009 Feb;14(1):23-9.
3. Bergamaschi G., Markopoulos K., Albertini R. et al, “Anemia of chronic disease and defective
erythropoietin production in patients with celiac disease“, In Haematologica. 2008; 93(12): 1785-
91.
4. Castellano-Higuera Ana, Gonzalez -Reimers E., Aleman-Valls M. R. et al, “Cytokines and lipid
peroxidation in alcoholics with chronic hepatitis C virus infection”, In Alcohol & Alcoholism. 2008;
43 (2):137–142.
27
5. Goyal M. K., Sinha S., Patil S. A. et al, “Do cytokines have any role in Wilson’s disease?”, In
Clinical and Experimental Immunology. 2008; 154: 74–79.
8. Prahalad S., Martins T. B., Tebo Anne E, “Elevated serum levels of soluble CD154 in children with
juvenile idiopathic arthritis”, In Pediatric Rheumatology. 2008, 6:8.
17.8.8 Factor de necroză tumorală alfa (TNF-α)
Informaţii generale şi recomandări pentru determinarea TNF-α

TNF (tumor necrosis factor) este o citokină proinflamatorie al cărui nume derivă din capacitatea de a
distruge celulele tumorale şi de a induce necroză hemoragică în tumorile transplantate la şoarece5.
TNF-α (caşectina) şi TNF-β (limfotoxina) au fost descrise iniţial ca factori citotoxici produşi de
macrofage şi respectiv de limfocite; ulterior s-a descoperit că TNF-α şi TNF-β sunt două proteine care
prezintă omologie la 34% din secvenţele de aminoacizi3;5. Ambii mediatori acţionează asupra celulelor
ţintă prin aceeaşi receptori şi din acest motiv au efecte biologice similare, dar nu identice.
Gena pentru TNF-α este localizată pe cromozomul 6. În condiţii de denaturare TNF-α este o proteină
de 17 kDa, neglicozilată. Forma biologic activă a TNF-α este cea de trimer. Pe lângă această formă
solubilă există şi o formă legată de membrană (28 kDa), situată pe suprafaţa celulelor producătoare
de TNF-α şi care serveşte drept pool pentru forma solubilă, generată prin clivare proteolitică3.
TNF-α este produs nu numai de macrofage şi monocite, ci şi de limfocite, mastocite, neutrofile,
keratinocite, astrocite, microglii, celule musculare netede şi unele linii celulare tumorale5. Cantităţi
mari de TNF sunt eliberate la contactul macrofagelor, limfocitelor T CD4+ şi a celulelor natural-killer
(NK) cu lipopolizaharidele, produşii bacterieni şi interleukina 13.
TNF-α acţionează direct prin doi receptori de suprafaţă distincţi, denumiţi TNFR I şi TNFR II, având
greutăţi moleculare diferite3;4;5. Aceşti receptori pot fi identificaţi pe toate tipurile de celule, cu excepţia
eritrocitelor. Porţiuni ale acestor receptori sunt clivate de către proteaze şi ajung în mediul extracelular
formând receptori solubili; aceştia acţionează ca inhibitori endogeni de TNF-α şi reglează astfel nivelul
de TNF-α extracelular4.
Legarea TNF-α de receptor determină modificări conformaţionale în structura receptorului, care
conduc la activarea în cascadă a transcripţiei altor proteine implicate în proliferarea celulară,
răspunsul inflamator şi apoptoza celulară. TNF-α poate avea o acţiune locală paracrină (creşterea
locală a concentraţiei TNF poate cauza semnele cardinale ale inflamaţiei: roşeaţă, durere, căldură
şi tumefacţie) sau poate acţiona la distanţă, asemenea hormonilor endocrini5. Datorită prezenţei
28
receptorilor săi în majoritatea ţesuturilor, TNF-α exercită o varietate largă de efecte biologice:
• efecte citolitice şi citostatice asupra celulelor tumorale;
• efect chemotactic asupra neutrofilelor3;
• creşte permeabilitatea la nivelul celulelor endoteliale din regiunea cu inflamaţie;
acestea nu determină numai acumularea de celule imune ci are impact şi asupra
procesului de coagulare;
• activează diverse procese metabolice din celulele musculare şi adipocite pentru a
furniza energia necesară reacţiei inflamatorii1;
• la nivelul macrofagelor stimulează fagocitoza şi producerea de prostaglandină E2;
• la nivelul altor ţesuturi creşte rezistenţa la insulină;
• activează osteoclastele, deci stimulează resorbţia osoasă;
• este factor de creştere pentru fibroblaşti şi stimulează sinteza de colagenază;
• intensifică proliferarea limfocitelor T după stimularea cu interleukina 23;
• determină anorexie şi febră, acţionând ca un pirogen endogen1;
• este responsabil pentru sindromul de caşexie asociat cu procesele maligne şi cu
majoritatea infestărilor parazitare5.
Determinarea nivelului seric de TNF-α constituie un marker pentru răspunsul inflamator sistemic
(SIRS) asociat cu sepsisul, traumatismele şi insuficienţa cardiacă. Anumite studii au indicat asocierea
concentraţiei de TNF-α în lichidul cefalorahidian cu gradul de activitate în scleroza multiplă; pe de
altă parte, determinarea TNF-α ar putea fi utilă în diferenţierea meningitei bacteriene de alte cauze
de meningită1.
Studiile efectuate pe animale au arătat că TNF-α este implicat în patogenia poliartritei reumatoide
şi a bolilor inflamatorii intestinale, datorită efectul proinflamator exercitat prin activarea celulelor
endoteliale şi inducerea chemotaxiei neutrofilelor. Din acest motiv, tratamentul acestor afecţiuni include
şi inhibitori ai TNF-α: fie anticorpi monoclonali anti-TNF-α (infliximab, adalimubab), fie proteine de
fuziune anticorp-receptor, respectiv TNFRII-IgG1 (etanercept)5.
Nivelul TNF-α poate fi utilizat în diagnosticarea unor afecţiuni imune şi în monitorizarea tratamentelor
doar în corelaţie cu date clinice şi paraclinice complementare2.
Metodă – metodă imunoenzimatică EIA2.
Valori de referinţă1 – < 8.1 pg/ml2.
Niveluri crescute de TNF-α se înregistrează în sepsis, traumatisme, boli autoimune şi inflamatorii
29
cronice (artrita reumatoidă, spondilita ankilopoetică, boala Crohn, psoriazis), boli infecţioase şi rejetul
de grefă2.
Bibliografie
1. Hans D. Volk, Gernot Keyser, Gerd R. Burmester. Cytokines and Cytokine Receptors. In Clinical
Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas.
TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 764-772.
2. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Tumor
Necrosis Factor-α. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
4. Magda Negru. Inflamaţia. În Esentialul în Reumatologie. Editura Amaltea, 2007, 56.
867.

30
17.9 TESTE DE IMUNOFENOTIPARE LIMFOCITARĂ
17.9.1 Imunofenotipare limfocitară - profil imun de bază
Informaţii generale despre sistemul imun

Funcţia primară a sistemului imun este aceea de a lupta împotriva agenţilor patogeni microbieni
(bacterii, paraziţi, fungi, virusuri). Sistemul imun îndeplineşte această funcţie în două moduri: în primul
rând, prin generarea unui răspuns imun specific împotriva agentului patogen invadant şi controlul
infecţiei; şi în al doilea rând, prin reamintirea acestui prim “conflict” şi declanşarea unui răspuns imun
accelerat în urma reexpunerii la acelaşi agent patogen microbian3.
Sistemul imun este constituit dintr-o reţea complexă de celule, ţesuturi şi organe care participă
împreună la apărarea organismului uman.
Cunoaşterea structurii şi funcţiei complexe a sistemului imun ajută la înţelegerea fundamentului
deficienţelor immune congenitale sau dobândite (infecţia HIV) şi la perceperea căilor potenţiale prin
care sistemul imun poate fi modulat în cazul unor boli specifice3;9.
Organele limfoide ale sistemului imun sunt: măduva osoasă hematogenă (situsul hematopoiezei),
timusul (centrul “instructajului timic”, de maturare a protimocitelor în celule T mature), splina („filtrul”
imunologic al sângelui), nodulii limfatici (centrul imunologic al limfei), ţesutul limfoid asociat mucoaselor
(MALT) şi ţesutul limfoid asociat tractului digestiv (GALT)9;11. Într-o manieră similară, macrofagele
şi celulele dendritice de la nivelul splinei şi nodulilor limfatici capturează antigenele şi le prezintă
limfocitelor B şi T, declanşând astfel răspunsul imun.
Celulele sistemului imun sunt: limfocitele T, limfocitele B, celulele NK, granulocitele, macrofagele/
monocitele, fibrobaştii, celulele epiteliale, celulele dendritice3;9.
Majoritatea agenţilor patogeni au o capacitate de proliferare foarte ridicată, iar prevenirea infecţiilor
sistemice necesită răspunsuri adecvate şi rapide din partea sistemului imun înnăscut şi a sistemului
imun dobândit11.
Imunitatea nespecifică/înnăscută asigură prima linie de apărare împotriva agenţilor microbieni
patogeni11.
Se caracterizează prin răspunsuri imune nespecifice, rapide şi la fel de intense, indiferent de tipul
agentului patogen, care destul de rar sunt suficiente pentru a elimina în totalitate infecţiile microbiene
celulare şi prin lipsa memoriei imunologice sau a unei imunităţi protective de durată. Este asigurată
prin intermediul barierelor anatomice (tegumente, membrane, mucoase), barierelor fiziologice
(temperatură, pH), factorilor chimici (interferoni, sistemul complement), celulelor cu activitate fagocitară
(macrofage/monocite, celule dendritice, neutrofile, fibroblaşti, celule epiteliale), citotoxicităţii mediate
celular (celulele NK)3;9.
Prin producţia de mediatori (citokine, chemokine, interferoni), răspunsurile imune nespecifice stabilesc
“scena“ pentru declanşarea răspunsurilor imune specifice11.
Imunitatea specifică/dobândită/adaptativă este acea funcţie a sistemului imun de a recunoaşte
specific antigenele şi de a dezvolta o imunitate mediată umoral, o imunitate mediată celular sau
ambele, principalii “ jucători” fiind anticorpii, limfocitele B, limfocitele T şi celulele prezentatoare de
antigen. Acest tip de imunitate poate fi dobândită activ (organismul gazdă produce propriile anticorpi/
limfocite imunologic active, iar imunitatea este de lungă durată) sau pasiv (organismul primeşte
31
anticorpi/limfocite imunologic active produse în timpul unui răspuns imunologic activ în alt organism,
iar imunitatea este de scurtă durată). Indiferent că este vorba despre o imunitate activă sau pasivă,
aceasta poate fi dobândită natural (anticorpii sunt produşi în organismul gazdă sau primiţi prin transfer
placentar/alăptare) sau artificial (prin vaccinare)9.
O carateristică importantă a acestui tip de imunitate este memoria imunologică.
Răspunsurile imune adaptative sunt larg extinse prin stimulare antigenică, ceea ce conduce la
expansiunea clonală, diferenţierea şi maturarea a diverse clone de celule B antigen specifice, pentru
a produce anticorpi circulanţi (răspuns imun umoral), şi prin activarea celulelor T, derivate din timus,
la răspunsuri imune celulare antigen specifice. Practic, imunitatea adaptativă depinde de reţeaua de
interacţiuni foarte complexe şi intricate dintre diferitele tipuri celulare şi subseturile lor, reglate prin
producţia lor de mediatori (citokine, chemokine şi interferoni tip I,II )11.
Celulele sistemului imun înnăscut constituie o rezervă celulară uniformă fără specificitate antigenică;
pot fi recrutate în număr remarcabil de mare; sunt primele care ajung la locul infecţiei; modelul de
migrare este unidirecţional, iar odată exercitată funcţia lor, celulele vor fi eliminate. În cazul celulelor
specifice sistemului imun dobândit (limfocitele), acestea sunt prezente într-un număr scăzut pentru un
anumit antigen şi, pentru a contrabalansa acest dezavantaj, ele urmează un mod complex de migrare,
strâns dependent de statusul lor de activare şi memorie imunologică. Prezintă deci capacitatea de a
recircula: reintră în circulaţia sangvină de la nivelul ţesuturilor limfoide şi migrează către un situs la
distanţă. Migrarea limfocitelor este bine organizată pentru a asigura o expunere eficientă a acestora
la antigenele lor înrudite de la nivelul organelor limfoide secundare. Mai mult, clonele limfocitare care
prezintă anumite caracteristici relevante, cum ar fi receptorii care recunosc epitopii antigenici, nu sunt
pierdute după implicarea în răspunsul imun, în schimb sunt rezervate ca “celule cu memorie” pentru
a asigura răspunsuri imune specifice mai rapide şi mai puternice, în cazul reinfecţiei cu acelaşi agent
patogen11.
Celulele prezentatoare de antigen (APC) reprezintă un grup de celule heterogen din punct de
vedere morfologic şi funcţional, provin din precursori medulari şi sunt specializate în a prezenta
antigenele limfocitelor, în special celulelor T. Aceste celule profesionale prezentatoare de antigen
includ monocite (prezente în sângele periferic), macrofage (monocite tisulare), celule rezidente de la
nivelul organelor limfoide ale sistemului imun (celule dendritice) şi constituenţi ai sistemului monocit-
macrofag din alte organe solide. Limfocitele B, care captează antigenul prin intermediul receptorilor
de tip mIg (imunoglobuline de membrană), pot de asemenea să funcţioneze eficient ca APC pentru
limfocitele T, prin prezentarea antigenului degradat (oligopeptid) legat de moleculele complexului major
de histocompatibilitate (MHC); limfocitele T activate vor secreta citokine care vor dirija diferenţierea
limfocitelor B şi producţia de anticorpi a acestora. Caracteristica definitorie a acestor celule este
exprimarea moleculelor MHC I şi II pe suprafaţa lor, precum şi a moleculelor accesorii necesare pentru
activarea limfocitelor T: CD86 şi CD80. Imediat după activare, APC pot să secrete citokine care induc
funcţii specifice în celulele cărora le prezintă antigenul. Monocitele şi macrofagele sunt fagocitic active,
exercitând această funcţie în special asupra antigenelor acoperite de anticorpi sau de componente ale
sistemului complement care se leagă de receptorii de suprafaţă pentru Fcγ şi C3b11;12.
Moleculele de legare a antigenelor, prin capacitatea lor de a lega antigenele străine organismului
uman, sunt responsabile de specificitatea răspunsului imun dobândit. Există trei seturi de astfel de
molecule: imunoglobuline (Ig), receptorul celulelor T (TCR) şi moleculele MHC, toate aceste molecule
facând parte din superfamilia de imunoglobuline (IgSF). Ig sunt alcătuite dintr-un lanţ polipetidic greu
32
(H) şi un lanţ uşor (L), de tip kappa sau lambda; acestea sunt exprimate pe suprafaţa limfocitelor B şi
secretate ca anticorpi în cadrul răspunsului imun umoral. TCR se prezintă sub forma unui heterodimer
alcătuit din 2 lanţuri polipeptidice H - αβ/γδ; majoritatea limfocitelor T exprimă αβ-TCR. Genele HLA
situate pe cromozomul 6 codifică moleculele complexului major de histocompatibilitate MHC I şi II.
Moleculele MHC I sunt formate dintr-un singur lanţ H (HLA-A, B, C), spre deosebire de moleculele
MHC II care sunt alcătuite din două lanţuri H - α şi β (HLA-DQ, DR, DP). Limfocitele T care exprimă
pe suprafaţa lor receptori αβ-TCR pot fi divizate în două subpopulaţii majore. Această împărţire este
bazată pe clasa de molecule MHC recunoscută de receptorii αβ-TCR şi de expresia moleculelor
CD4 sau CD8, care prin ataşarea de moleculele MCH contribuie la completarea legăturii moleculare
intercelulare. În timp ce limfocitele CD4 recunosc antigenul legat de moleculele MHC I, limfocitele
CD8 recunosc antigenul legat de moleculele MCH II; raportul limfocitelor CD4/CD8 în sângele periferic
este aproximativ 2:1 (0.8:1-3:1). Toate celulele nucleate exprimă molecule MHC I şi sunt APC non-
profesionale, APC profesionale exprimând molecule MHC II. Interacţiunea dintre complexul MHC-
peptidul antigenic şi TCR deţine un rol esenţial în protecţia imună, deoarece un răspuns imun complet
necesită intervenţia celulelor T antigen specifice. Acesta reprezintă practic un mecanism de siguranţă
pentru a minimaliza posibila auto-reactivitate (reactivitate împotriva self-ului), astfel încât un limfocit T
devine activat numai pentru că a întâlnit un antigen străin (non-self).
Limfocitele B provin din celulele stem hematopietice care, în mod succesiv, populează splahnopleura
embrionară paraaortică, ficatul fetal şi măduva osoasă hematogenă. Celulele stem fiice dau naştere
progenitorilor limfoizi multipotenţi (PLM), care generează celulele mieloide sau limfoide. Astfel, PLM
pot produce precursorii limfoizi comuni (PLC), iar aceştia pot genera limfocitele T, limfocitele B,
celulele NK şi un subset special de celule dendritice. Diferenţierea finală spre celulele B necesită ca
celulele fiice PLC să fie expuse unor micromedii specializate, aşa cum sunt cele prezente în ficatul
fetal şi măduva osoasă. Trecerea de la ficatul fetal la măduva osoasă începe la mijlocul vieţii fetale şi
se termină chiar înainte de naştere; celulele B continuă să fie produse în măduva osoasă pe parcursul
întregii vieţi. Diferenţierea celulelor B are loc în două stadii, diferite din punct de vedere anatomic şi
funcţional; astfel, primul stadiu are loc în măduva osoasă şi este antigen independent, iar cel de-al
doilea stadiu are loc în organele limfoide periferice şi este antigen dependent9;11.
Limfocitele B imature, care exprimă pe suprafaţa lor mIgM (imunoglobulină de membrană) şi BCR
(receptorul celulei B), părăsesc măduva osoasă după un proces de selecţie negativă a celulelor
B auto-reactive şi pătrund în periferie (sânge şi organe limfoide secundare) unde îşi completează
diferenţierea în celule B mature care exprimă pe suprafaţa lor mIgM şi mIgD şi pot fi activate prin
legarea de antigen11.
Celulele B imature auto-reactive, ce exprimă mIgM self-reactiv, urmează un proces cunoscut ca “receptor
editing“, în care un rearanjament la nivelul genelor care codifică lanţul greu al imunoglobulinelor (IgH)
modifică specificitatea antigenică a receptorului. Dacă acest proces eşuează, celulele B imature auto-
reactive devin anergice sau vor suferi apoptoză în urma contactului cu antigenul. Aceasta contrastează
cu abilitatea celulelor B mature de a deveni activate în urma contactului antigenic12.
BCR este un complex format dintr-o mIg şi două molecule citoplasmatice Igα/CD79a şi Igβ/CD79b.
Cu ajutorul acestui receptor limfocitele B recunosc antigenul şi devin astfel activate. Implicarea BCR
iniţiază o serie de evenimente care culminează cu diferenţierea celulelor B în plasmocite capabile să
secrete imunoglobuline. Limfocitele B vor prezenta antigenul, recunoscut cu ajutorul BCR, limfocitelor
T helper CD4 care au fost activate anterior de acelaşi antigen, limfocitele T helper fiind selectate
33
din pool-ul de limfocite T naive de către celulele dendritice prezentatoare de antigen. Acest proces
de activare a limfocitelor B, dependent de limfocitele T, are loc prin interacţiunea dintre CD40 de pe
suprafaţa celulelor B şi ligandul său, CD145, de pe suprafaţa celulelor T helper şi prin secreţia de
interleukină-4 (IL-4) de către celulele helper. Ambele semnale servesc la promovarea şi menţinerea
activării iniţiate de BCR11.
La nivelul organelor limfoide secundare - în zonele bogate în celule T - celulele B naive, după
stimularea antigenică, urmează o expansiune clonală şi formează grupuri de celule B activate (focare
extrafoliculare). Acestea se pot diferenţia în plasmocite de scurtă durată (secretoare de anticorpi cu
afinitate joasă) sau migrează înapoi în foliculi şi iniţiază formarea unui centru germinativ.
După proliferare şi maturaţie, celulele B din centrul germinativ se pot diferenţia în plasmocite de lungă
durată şi celule B de memorie. Majoritatea plasmocitelor de lungă durată migrează în măduva osoasă
şi sunt răspunzătoare de menţinerea nivelului seric de anticorpi (anticorpi de înaltă afinitate); celulele
B de memorie pot rămâne pentru o lungă perioadă de timp la nivelul organelor limfoide secundare
sau pot migra şi habita în măduva osoasă11;12. În urma contactului antigenic, celulele B de memorie
răspund printr-o proliferare rapidă şi diferenţiere în plasmocite, refăcând astfel rezerva de celule B de
memorie şi plasmocite.
Prin dezvoltarea tehnologiei anticorpilor monoclonali, analiza anumitor molecule de pe suprafaţa
celulelor B (CD = “cluster determinants”) a ajutat la definirea stadiilor care se succed pe parcursul
întregului proces de diferenţiere şi maturaţie a celulelor B (vezi tabelul 17.9.1.1):
Celule Celule Celule Celule Celule

Celule Celule Celule Plasmo-
pre-B B B B B de
Stem Pro-B Pre-B cite
late imature mature activate memorie
CD34 ++ ++
CD10 ++ ++ ++ ++ ++
CD19 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
CD20 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
CD21 + + + + ++ ++ ++
CD24 ++ ++ ++ ++ ++ + +
CD38 ++ ++ ++ ++ ++
CD27 ++ ++
Tabel 17.9.1.1 Markeri pentru diferenţierea celulelor B

Limfocitele T citotoxice (CTL) şi celulele NK
Aceste două tipuri celulare, distincte din punct de vedere fenotipic, dar strâns legate prin funcţia
lor citolitică (“killer”), sunt importante atât în controlul infecţiilor, cât şi în identificarea şi eliminarea
celulelor tumorale. Celulele CTL sunt limfocite T CD8+ care îşi îndeplinesc funcţia de “killer“ prin două
căi majore: liza mediată de perforine şi granzime ce sunt eliberate din lizozomi şi apoptoza receptor
indusă (TNFR), ambele căi necesitând un contact apropriat între celula litică şi ţinta sa, în special
34
prin interacţiunea dintre TCR şi moleculele MHC I. Răspunsul CTL la o infecţie acută are loc în trei
faze: prima constă în activarea iniţială şi proliferarea CTL; a doua în contracţia celulelor T efectoare în
celule T de memorie; iar a treia fază se referă la menţinerea de lungă durată a pool-ului de celule T de
memorie. Celulele CTL se dezvoltă la nivelului timusului, părăsesc acest organ limfoid în stare naivă,
circulă între organele limfoide secundare (splina şi ganglionii limfatici) pe calea sistemului arterial,
respectiv limfatic, şi în cursul acestui pasaj întâlnesc antigenul nonself. Antigenul este adus la nivelul
organelor limfoide secundare prin sistemul limfatic de către celula dendritică (APC); aceasta devine
matură după achiziţia antigenului nonself la nivelul ţesuturilor non-limfoide. Deşi celula dendritică este
cel mai important APC profesional, macrofagele şi celulele B sunt de asemenea capabile să prezinte
antigenul. Procesul infecţios conduce la o creştere dramatică a CTL patogen/antigen specifice, iar
magnitudinea acestui proces depinde de natura infecţiei şi de inoculul/doza de antigen. Această
expansiune este urmată de contracţia CTL efectoare în celule T de memorie. Un procent de 5%
din populaţia celulelor efectoare expansionate supravieţuieşte sub forma celulelor de memorie de
lungă durată. Este prevenită astfel afectarea tisulară nespecifică ce se poate produce prin activitatea
citolitică şi eliberarea necontrolată de citokine şi este asigurată flexibilitatea CTL de a răspunde la noi
infecţii.
Producţia de celule de memorie antigen independentă de lungă durată este esenţială pentru un
răspuns rapid în cazul unei reinfecţii. CTL de memorie asigură un răspuns mult mai intens decât
celulele CTL naive activate primar, atât din punct de vedere cantitativ cât şi calitativ. Deoarece în
cursul infecţiei primare CTL suferă o expansiune clonală importantă, numărul de precursori CTL
antigen specifici este mult mai mare la indivizii imunizaţi comparativ cu cei naivi, ceea ce permite un
răspuns imun mai puternic. CTL de memorie prezintă o eficienţă extraordinară în elaborarea funcţiilor
efectoare prin producţia rapidă de gamma-interferon (IFNγ).
Compartimentul CTL de memorie este compus din două tipuri celulare: CTL de memorie-efectoare
(Tem) şi CTL de memorie-centrale (Tcm), acestea din urmă fiind capabile de o auto-reînnoire antigen-
independentă homeostatică prelungită. La întâlnirea cu antigenul, aceste celule dobândesc rapid
funcţia efectoare şi fenotipul celulelor Tem. Celulele CD4 şi citokinele IL-15, IL-7, IL-2 şi GM-CSF
(factorul de stimulare al coloniilor pentru granulocite şi monocite) au un rol important în supravieţuirea
şi menţinerea rezervei de CTL de memorie (vezi tabelul 17.9.1.2).
În final, activitatea citotoxică a CTL are loc prin două mecanisme:
• citolitic: dependent de producţia de granzime (A, B) şi perforine;
• non-citolitic: dependent de producţia de citokine (IFNγ şi TNF-α) care au capacitatea de a inhiba
proliferarea agenţilor patogeni intracelulari11;12.
MARKER CTL naive Tem Tcm

CD44 + +++ +++
Distribuţia Ganglioni limfatici, Ţesuturile non-limfoide Ganglioni limfatici,
tisulară principală splină, sânge (plămân, ficat), splină splină, sânge
Funcţia citotoxică - ++ -
IFNγ - +++ +
Tabel 17.9.1.2 Proprietăţile CTL
35
Celulele NK aparţin liniei celulare limfoide şi sunt implicate în răspunsul imun înnăscut. În comparaţie
cu CTL, celulele NK sunt de talie relativ mare, granulare şi nu necesită pre-activare pentru a recunoaşte
şi a liza celule tumorale sau aberante. De asemenea nu au nevoie de prezenţa moleculelor MHC I.
Aceste celule sunt capabile să producă cantităţi importante de citokine şi chemokine, care le permit să
moduleze răspunsul imun. IL-15 este necesară pentru a menţine nivelul homeostatic al celulelor NK în
organism, activitatea de „killer” fiind exercitată în acelaşi mod ca şi în cazul CTL.
Receptorii celulelor NK sunt clasificaţi în activatori şi inhibitori şi apartin la două familii importante
de receptori: killer cell immunoglobulin-like (KIR) şi lectin-like. Prin receptorii inhibitori celulele NK
recunosc moleculele MHC I de pe suprafaţa celulei ţintă şi primesc astfel un semnal inhibitor - no-
killing; prin receptorii activatori recunosc liganzi celulari, virali sau induşi de stres, care transmit un
semnal activator - pro-killing. În cazul în care o celulă ţintă nu exprimă moleculele MHC I pentru a evita
acţiunea citolitică a CTL, aceasta va fi distrusă de către celula NK.
Celulele NK se află într-un număr relativ redus la nivelul măduvei osoase şi splinei (<2%) şi reprezintă
aproximativ 15% din numărul total de limfocite din sânge. NK sunt de obicei definite prin intermediul
unei combinaţii de markeri de suprafaţă celulară (CD): CD3-, CD16+, CD56+. Astfel pot fi clasificate
în două subseturi, în funcţie de exprimarea CD16 şi CD56:
• NKCD56dimCD16bright reprezintă >90% din NK din sângele periferic, exprimă nivele mari de KIR
şi activitate citotoxică/citolitică mare (secreţie crescută de perforine/granzime);
• NKCD56brightCD16dim se caracterizează printr-o producţie mai mare de citokine, potenţial
proliferativ mai înalt şi reprezintă principala populaţie celulară NK de la nivelul organelor limfoide
secundare11;12.
Celulele T helper-CD4, în mod similar celulelor TCR+, se diferenţiază la nivelul timusului din celulele
progenitoare comune limfoide, în cea mai mare parte în timpul vieţii fetale şi imediat după naştere.
Iniţial, celulele T nu exprimă TCR şi sunt CD3-/CD4-/CD8- (triplu negative). Etapele de diferenţiere
timică includ stadiile:
• preTCR CD3+/CD4-/CD8- (dublu negative);
• TCR CD3+/CD4+/CD8+ (dublu pozitive);
• în ultima etapă, celulele T al căror TCR recunoaşte antigenul prezentat de moleculele MHC II devin
TCR CD3+/CD4+, iar cele al căror TCR recunoaşte antigenul prezentat de moleculele MHC I devin
TCR CD3+/CD8+.
Celulele T naive, pozitive pentru un singur CD (CD4 sau CD8) părăsesc timusul şi recirculă din sânge
în ariile timus-dependente (TDA) ale organelor limfoide secundare. În majoritatea răspunsurilor imune,
activarea celulelor T CD4+ are loc în TDA ale organelor limfoide secundare, iar celulele prezentatoare
de antigen sunt reprezentate de celulele dendritice. Prezentarea eficientă a antigenului non-self
stimulează activarea, proliferarea şi diferenţierea limfocitelor CD4+ în trei categorii funcţionale: celule
CD4+ cu activitate proinflamatorie, celule CD4+ cu activitate reglatoare/antiinflamatorie şi celule
CD4+ ce funcţionează ca celule de memorie. Diferenţierea dintre celulele T naive, efectoare şi de
memorie se face baza moleculelor exprimate pe suprafaţa lor (vezi tabelul 17.9.1.3).
Celulele CD4+ efectoare sunt cele care susţin procesele inflamatorii prin eliberarea de citokine, fiind
divizate în trei categorii: Th1 , Th2, Th1711;12.
Celulele T reglatoare (Treg)
Pentru a preveni răspunsurile imune auto-distructive şi a permite cele protective împotriva antigenelor
non-self, sistemul imun a dezvoltat o serie de mecanisme reglatoare care au rolul de a inhiba
36
generarea de limfocite T şi B self-reactive potenţial dăunătoare - toleranţa imună centrală - şi de a

scădea activarea celulară şi expansiunea limfocitelor atunci când acestea întâlnesc antigene self -
toleranţa imună periferică.
Au fost descrise mai multe tipuri de celule T cu activitate reglatoare: celule T TCRγδ +, celule NK,
limfocite T CD8+ şi limfocite T CD4+.
Celulele T CD4+ reg pot fi divizate în două categorii: celulele Treg care apar natural (generate în
timus) şi celulele Treg induse (Treg 1 care secretă IL-10, Th3 care secretă TGFβ), diferenţiate din
celulele T naive. Celulele T CD4+ reg derivate din timus sunt CD25+ şi se găsesc într-un procent
de 30%, însă doar 2-4% din celule Treg CD25high+ au proprietăţi supresive. Un alt marker important
este factorul de transcripţie FOXP3 care este exprimat în mod specific la nivelul celulele Treg timic
derivate. Majoritatea celulelor FOXP3 + sunt celule CD4+CD25 bright+ şi doar câteva sunt celule
CD25- şi CD25 low+11.
Celulele T de memorie
Nivelul protecţiei imune se corelează cu numărul de celule T de memorie antigen specifice. În cursul
infecţiei primare există o expansiune importantă a rezervei de celule T CD4+ şi celule T CD8+ specifice
antigenului patogen. Numeroase studii demonstrează faptul că mărimea rezervei de celule T de
memorie depinde de mărimea „exploziei” de celule T antigen specifice din timpul fazei de expansiune.
Celulele T de memorie pot fi clasificate în: celule T centrale de memorie şi celule T efectoare de
memorie.
Trebuie reţinut că celulele T de memorie pot prolifera şi produce citokine ca răspuns la o stimulare cu
o cantitate mai mică de antigen, cu o costimulare mai slabă şi mult mai rapid comparativ cu celulele T
naive. În plus, ele pot promova şi intensifica funcţia APC şi accelera activitatea celulelor T naive.
În absenţa stimulării antigenice, celule T de memorie pot suferi o proliferare homeostatică pentru a
îşi reface rezerva. Celulele T de memorie CD4+ şi CD8+ îşi pot păstra responsivitatea lor rapidă în
absenţa stimulului antigenic şi sunt capabile să confere o imunitate protectivă11;12.
MARKER Celule T naive Celule T efectoare Celule T de memorie

CD62L H L H/L
CCR7 H L H/L
CD45RA H L H/L
CD45RO L H L/H
Tabel 17.9.1.3 Markeri pentru diferenţierea celulelor T

H = exprimare marcată; L= exprimare slabă
Infecţia HIV
Virusul imunodeficienţei umane este un retrovirus şi celulele ţintă sunt limfocitele T helper CD4+.
Aceste celule reprezintă elementul central în răspunsul imun al gazdei faţă de infecţia HIV, intervin
în răspunsul imun umoral prin activarea limfocitelor B care vor secreta anticorpi împotriva peptidelor
virale HIV şi în răspunsul imun mediat celular prin activarea limfocitelor citotoxice7.
Înţelegerea relaţiei complexe care se stabileşte între fenotipul proteinei Env HIV (gp160), expresia
coreceptorilor de pe suprafaţa celulelor CD4+ (CCR5, CXCR4) şi dezvoltarea răspunsului imun
adaptativ ajută la înţelegerea patogenezei indusă de HIV. Prin clivarea GP160 rezultă GP120 şi GP41.
37
GP120 acţionează ca un ligand, ataşându-se de moleculele CD4 şi coreceptorii CCXR4 şi CCR5, iar
GP41 mediază procesul de fuziune dintre învelişul HIV şi membrana celulei gazdă.
Studii recente demonstrează afectarea timpurie în cadrul infecţei HIV a celulelor T cu memorie de
la nivelul ţesutului limfoid asociat tubului digestiv (GALT). Astfel, într-o perioadă scurtă de timp de
de la infecţie, 20% din celulele GALT CD4T sunt infectate şi, dintre acestea, 80% sunt distruse prin
citotoxicitate directă mediată de virus sau apoptoză Fas-mediată. În momentul atingerii nivelului
maxim de viremie ~ 60% din celulele T CD4 de memorie sunt infectate. Trebuie menţionat faptul că
majoritatea celulelor T CD4 rezidă la nivelul GALT, iar numărul acestor celule aflate în circulaţie nu
reflectă magnitudinea distrucţiei limfocitelor T la nivel digestiv. În lumina acestor date noi s-ar putea
presupune că acea creştere iniţială a încărcăturii virale reprezintă proliferarea exagerată şi infectarea
celulelor GALT CD4T, iar scăderea ulterioară a încărcăturii virale până la o anumită valoare de platou
indică depleţia majorităţii celulelor T CD4+ din organism2.
Evoluţia naturală a infecţiei HIV cunoaşte 4 stadii/faze (vezi figura 17.9.1.1):
1. Sindromul retroviral acut se întâlneşte pe o perioadă de câteva zile până la 6 săptămâni
de la infecţie şi se caracterizează printr-o viremie foarte mare (de exemplu, 10 milioane
copii/mL) şi scăderea rapidă a celulelor T CD4+ şi CD8+ din circulaţia periferică.
2. Stadiul asimptomatic se caracterizează prin scăderea viremiei până la o anumită valoare
de „platou’’ şi se consideră că acest nivel de platou reprezintă un echilibru între abilitatea
virusului de a se replica şi a distruge celulele CD4+ şi abilitatea răspunsului imun al
gazdei (celular şi umoral) de a suprima replicarea virală. În medie, perioada de latenţă
clinică care urmează infecţiei active durează 7–10 ani (T CD4 >500 celule/μL).
3. Stadiul simptomatic al infecţiei HIV - Pre SIDA (T CD4+ 500 - 200 celule/μL).
4. Stadiul final al infecţiei HIV – SIDA - se caracterizează prin scăderea celulelor T CD4+
<200 celule/μL (<14%).
În cursul terapiei HAART, creşterea celulelor T CD4+ are loc în primele 3–6 luni şi este rezultatul
scăderii activării imune şi a migrării consecutive a celulelor T de memorie (CD4+CD45RO+) în afara
organelor limfoide; o creştere mult mai accentuată are loc după 3–5 ani de terapie prin apariţia de
celule T naive noi (CD4+CD45RA+CD62L+) şi de memorie.
În concluzie, depleţia celulelor T CD4+ reprezintă principalul marker de afectare imunologică cauzată
de infecţia HIV şi de evoluţie spre stadiul SIDA11.
Log ARN HIV plasmă (copii/mL)
Număr absolut CD 4 (celule/μL)
(luni) (ani)
Perioada de timp de la infecţie
Fig. 17.9.1.1 Evoluţia naturală a infecţiei HIV (Adaptare după http://mcb.berkeley.edu/courses)10
38
Profilul imun de bază şi recomandări pentru efectuarea acestui test

În cadrul profilului de bază sunt determinate atât procentual cât şi în valoare absolută principalele
subseturi de limfocite implicate în răspunsul imun, prin identificarea markerilor de suprafaţă specifici
(moleculele CD):
- limfocitele T totale (CD3+);
- limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
- limfocitele T supresoare/citotoxice (CD3+/CD8+);
- raportul CD4+/CD8+;
- limfocitele T imature CD3+/CD8+/CD4+ ;
- limfocitele B (CD19+);
- celulele NK (CD3-/CD16+/CD56+);
- limfocitele T activate (HLA DR+/CD3+).
Profilul de bază este suficient pentru excluderea defectelor imune celulare cantitative5.
Determinarea subseturilor limfocitare este utilă atât pentru clasificarea şi diagnosticul imunodeficienţelor
primare cât şi pentru evaluarea şi monitorizarea pacienţilor cu infecţie HIV6;8.
Imunodeficienţele primare rezultă ca urmare a unor defecte congenitale ale sistemului imun. Acest test
stabileşte dacă anumite subseturi limfocitare sunt reduse sau absente pentru a susţine diagnosticul
de imunodeficienţă celulară numerică. Imunodeficienţele cauzate de disfuncţii celulare pot fi detectate
prin testul de transformare limfoblastică (LTT)6.
Imunodeficienţele datorate generării defectuoase a limfocitelor T (de exemplu, sindromul DiGeorge)
se caracterizează prin pierderea completă sau reducerea limfocitelor T CD3+.
Defectele genetice ale complexului major de histocompatibilitate MHC clasa II determină o stare de
imunodeficienţă gravă – deficitul MHC II (conform OMS). Mai este denumit şi sindromul limfocitelor
goale tip II şi se caracterizează prin absenţa expresiei moleculelor MHC II de pe suprafaţa celulară.
“Instructajul” timic şi selectarea limfocitelor T imature sunt compromise datorită lipsei de procesare a
antigenului de către moleculele MHC II. Cantitatea totală de limfocite B şi T în sânge este normală, însă
numărul limfocitelor CD4+ este redus ca urmare a absenţei unei procesări adecvate a antigenului.
Aceşti pacienţi nu pot răspunde la antigenele străine şi prezintă infecţii bacteriene, virale, fungice
şi parazitare recurente; nu răspund la testele cutanate, au o capacitate redusă de a răspunde la
reacţiile limfocitare mixte şi prezintă panhipogammaglobulinemie. Defectul nu este localizat la nivelul
genelor MHC II ci la una din cele patru gene care codifică factorii reglatori esenţiali pentru exprimarea
moleculelor MHC II4.
În cazul pacienţilor cu infecţie HIV determinarea limfocitelor T CD4+ este utilă pentru stadializarea
infecţiei HIV (conform CDC), stabilirea momentului începerii terapiei antiretrovirale precum şi a terapiei
împotriva infecţiilor oportuniste, pentru monitorizarea progresiei bolii şi a răspunsului la tratament.
Astfel, terapia antiretrovirală este adesa iniţiată în momentul în care numărul absolut de celule
CD4+ <500/μL; în cazul în care celulele CD4+ <200/μL se începe tratamentul profilactic împotriva
pneumoniei cu Pneumocistis jiroveci şi a altor oportunişti; în cazul în care celulele CD4+ <100/μL se
recomandă profilaxia infecţiilor produse de complexul Mycobacterium avium1.
Programele actuale recomandă monitorizarea nivelului celulelor CD4+ la un interval de 3-6 luni, pentru
toţi pacienţii cu infecţie HIV1;6;8.
39
Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant5.

Volum probă – 5 mL sânge3.
Stabilitate probă - sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează
testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea
probei5.
Cauze de respingere a probei - specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate
sau congelate5.
Metodă - citometrie în flux5.
Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor
Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei
pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute5.
Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populaţiilor limfocitare este influenţat de o serie de
factori biologici, inclusiv hormoni, temperatură şi mediul înconjurător. Studiile legate de variaţiile
circadiane au demonstrat o creştere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp
ce limfocitele CD8+ şi limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în
cursul după-amiezei. Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a populaţiilor
limfocitare se recomandă ca probele de sânge să se recolteze în acelaşi moment al zilei8.
Bibliografie
1. ARUP Laboratories. Test Directory: Lymphocyte Subset Panel 5 - Total Lymphocyte

Enumeration. www.aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
2. Christopher S. Baliga, Mary E. Paul, Javier Chinen, William T. Shearer. HIV Infection and
Acquired Immunodeficiency Syndrome. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby,
Elsevier, Third Edition, 2008, 571-582.
3. Kenneth Todar. Immune Defense against Bacterial Pathogens: Adaptive or Acquired Immunity.
In Todar’s Online Textbook of Bacteriology. www.textbookofbacteriology.net/adaptive. Reference
4. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical
Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 906-913.
6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. T- and
B-Lymphocyte Differential Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
7. Marie-Dominique Franco. Immunology, HIV and AIDS. http://www.biol.sc.edu/courses. Ref Type:
Internet Communication.
8. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow
Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
9. Paul A. Linnemeyer. The Immune System - An Overview, 2008. www.the body.com. Ref Type:
10. Prof. Schlissel. The Immunology of HIV Infection and AIDS. http://mcb.berkeley.edu/courses.
Ref Type: Internet Communication.
11. Robert R. Rich, Thomas A. Fleisher. William T. Shearer, Harry W. Schroeder, Anthony J. Frew,
40
Cornelia M. Weyand. Fundamental Principles of the Immune Response. In Clinical Immunology.

Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 3-127.
12. Shane Crotty, Rafi Ahmed. Immunological Memory. In Topley & Wilson Microbiology & Microbial
Infections, Immunology, Hodder Arnold, 10th Edition, 2005, 487-503.
17.9.2 Imunofenotipare limfocitară - imunitate antitumorală
Transformarea neoplazică a unei celule reprezintă prima etapă din istoria naturală a cancerului. Celula
tumorală odată apărută determină, prin diviziuni successive, formarea unei clone celulare şi în final
constituirea ţesutului tumoral, cu exprimarea principalelor caracteristici ale fenotipului malign şi anume
: proliferarea excesivă şi infinită, migrarea anormală şi instabilitatea genetică1.
La adult leziunea canceroasă reprezintă, în cele mai multe cazuri, stadiul final al unei inflamaţii cronice
(de exemplu, fumatul se asociază cu neoplasmul pulmonar, radiaţiile solare cu cancerul cutanat), pe
când la copil este rezultatul unei instabilităţi genomice progresive, înnăscută sau datorată unor leziuni
genetice dobândite. Tumorile pediatrice sunt sărace în celule ale imunităţii dobândite (celule T şi
celule dendritice mieloide)6.
Problema existenţei cu adevărat a imunovigilenţei în cazul tumorilor nu este încă rezolvată. În timp ce
în cazul bacteriilor şi a virusurilor, care exprimă o varietate de proteine străine, sistemul imun poate
recunoaşte şi controla efectiv infecţia, în cazul celulelor tumorale, care diferă foarte puţin de cele
normale, răspunsul imun nu mai are aceeaşi eficienţă2.
Antigenele tumorale
În mod ideal, pentru a fi recunoscute ca străine de către sistemul imun, ar trebui ca antigenele tumorale
să fie exprimate doar de celulele tumorale, nu şi de cele normale. În realitate majoritatea antigenelor
tumorale sunt puţin imunogene, fiind slab exprimate şi foarte heterogene. În acelaşi timp există şi
antigene supraexprimate la nivelul celulei tumorale dar care se găsesc de asemenea în cantităţi mici
în celulele normale2.
Antigenele tumorale recunoscute de limfocitele efectoare au fost clasificate astfel:
- antigene străine organismului (specific tumorale): molecule ce sunt expresia unor gene mutante,
oncogene virale, molecule ce prezintă modificări post-translaţionale anormale (de exemplu, MUC1-
underglycosylated mucin). În cazul acestor proteine mutante doar câteva peptide pot fi potenţial
recunoscute ca străine organismului.
- self-antigene: antigene testiculare, antigene de diferenţiere care se exprimă doar în anumite tipuri
de ţesuturi (de exemplu, antigenele de diferenţiere exprimate de melanocite şi celule melanomatoase
implicate în producerea de melanină), antigene supraexprimate de celulele tumorale comparativ cu
statusul lor normal (de exemplu, - tirozinaza exprimată în mod normal de toate melanocitele apare
în concentraţii crescute în celulele melanomatoase); celulele T cu specificitate pentru tirozinază,
ce recunosc şi distrug celulele tumorale, pot fi găsite în sângele unor pacienţi cu melanom; aceste
celule T sunt responsabile de depigmentarea pielii (vitiligo) la aceşti pacienţi, fapt ce se asociază
41
cu un prognostic bun; – antigenele fetale (AFP şi CEA) prezente în tumori ale ficatului, gonadelor
şi în diverse adenocarcinoame se găsesc în cantitaţi crescute în timpul dezvoltării fetale dar sunt
puţin exprimate în mod normal la adult; aceste oncogene fetale sunt folosite ca markeri de progresie
tumorală; - HER-2/neu , cunoscut ca şi c-Erb-2 (receptor tirozin-kinazic omolog cu receptorul factorului
de creştere epidermal). Răspunsul faţă de toate aceste antigene constă în celule efectoare CD4+ şi/
sau CD8+1;2.
Mecanisme de evaziune a apărării imune în cancer
Formaţiunile tumorale au proprietatea de a fi tolerate de sistemul imun prin exprimarea unor factori
care influenţează negativ răspunsul imun al organismului.
Există o serie de motive pentru absenţa unui răspuns imun eficace în cazul tumorilor. Fiecare proteină
autologă este degradată în citoplasmă până la peptide formate din 9-12 aminoacizi. Aceste peptide
sunt transportate de către un sistem numit „tranporter associated with antigen processing (TAP)” la
reticulul endoplasmic unde sunt legate de moleculele MCH clasa I şi prezentate celulelor T CD8+2.
În cazul tumorilor, peptidele nu se “potrivesc” mereu la locul de legare pe moleculele MCH
clasa I. Existenţa unui mecanism defectuos de procesare a antigenelor la nivelul celulei tumorale
(de exemplu, deficitul de TAP) face ca peptidele tumorale să nu fie transportate la nivelul reticulului
endoplasmic şi să nu fie prezentate la suprafaţa celulei. În multe cazuri diminuarea moleculelor MCH
clasa I şi II pe suprafaţa celulelor tumorale impiedică recunoaşterea acestora de către limfocitele T şi
astfel răspunsul imun nu poate fi declanşat2;6.
Celulele tumorale nu pot fi considerate adevărate celule prezentatoare de antigen, deoarece le lipsesc
molecule co-stimulatoare importante, CD80 şi CD86, necesare pentru activarea celulelor T. În absenţa
co-stimulării, prezentarea peptidelor via complex MCH/TCR, duce la anergia celulelor T şi toleranţă.
Unele celule tumorale sunt de asemenea capabile de a stopa producerea de antigene tumorale
evitând astfel răspunsul imun. De asemenea tumorile pot produce substanţe imunosupresive aşa
cum sunt IL-10, TGFβ (transforming growth factor beta), prostaglandine, iar în unele cazuri celulele
tumorale pot exprima molecule MCH I-like ce interacţionează cu liganzii inhibitori aflaţi pe celulele T,
ducând în final la anergia/apoptoza celulelor T2.
Asemănător virusurilor (HIV, HCV), tumorile solide sunt caracterizate prin instabilitate genomică ceea ce
conduce la generarea unor neoepitopi identificaţi potenţial de moleculele MCH clasa I şi II3.
În ultima decadă s-a observat un interes crescut faţă de mecanismul dominant de toleranţă mediat de
celulele T reglatoare - Tregs (CD4+CD25+), ce par să joace un rol important în autoreactivitate, alergii,
infecţii şi transplant, controlând atât răspunsul imun înnăscut cât şi pe cel dobândit, limitând astfel
autoimunitatea şi imunopatologia. Selecţia acestor celule are loc în mod natural în timus – natural T
regulatory cells (nTreg), dar pot fi induse şi în periferie – induced Treg cells (iTreg). Efectul supresor
al celulelor Treg asupra răspunsului imun tumoral este bine documentat. Astfel studiile efectuate pe
şoareci arată că îndepărtarea celulelor Treg favorizează rejetul celulelor tumorale putând chiar să
prevină dezvoltarea acestora in vivo, atât la şoarecii „predispuşi la cancer” cât şi după tratamentul cu
agenţi chimici. În studiile efectuate pe pacienţi cu cancer s-a observat prezenţa mult mai frecventă a
celulelor Treg în populaţia limfocitară periferică decât la persoanele sănatoase. Există de asemenea
rapoarte din care reiese faptul că nivelele crescute de Treg se corelează cu un stadiu avansat al
bolii, fiind implicate astfel în progresia cancerului. Infiltrarea cu celule T reglatorii este de asemenea
prezentă şi in staţiile ganglionare metastazate, nu şi în cele fără metastaze1;3.
42
Mecanisme efectoare ale imunităţii

La adult, răspunsul imun înnăscut are rolul de a recunoaşte celulele “stresate” sau conţinutul celular
nedigerat atunci când celulele devin nonapoptotice sau nonautofagocitice.
Răspunsul imun adaptativ (dobândit) joacă un rol crucial, fiind o sursă bogată de celule T efectoare
CD4 şi CD8 cu rol în recunoaşterea proteinelor aberante ce apar la nivelul tumorii, în acelaşi timp
reprezentând sursa unor celule regulatoare şi a unor factori cu rol important în limitarea abilităţii
celulelor NK şi a celulelor T de a media eradicarea cancerului6.
Modul în care diferitele tipuri de celule implicate în generarea răspunsului imun influenţează în sens
pozitiv sau negativ creşterea tumorală este prezentat în tabelul următor1:
Celule - Inhibarea creşterii tumorale Acţiunea supresivă a Referinţe legate de

efectoare - Favorizarea creşterii tumorale celulelor Treg asupra rolul celulelor Treg
celulelor efectoare
Celule T - citotoxice prin perforină/granzimă sau supresie prin TGFβ Piccirillo şi Shevach
CD8+ ligandul Fas/Fas (2001);
- secreţia de IFNγ,TNFα Somasundaram et al.
(2002);
Antony et al. (2005)
Chen et al. (2005)
Celule T - iniţiază activarea celulelor CD8+ cele mai multe Itoh et al. (1999)
CD4+ - citotoxice prin ligandul Fas/Fas teste funcţionale de şi multe alte studii
- ajută celulele B supresie utilizează ulterioare
- inhibă angiogeneza celulele CD4+
- activează macrofagele prin secreţia
de IFNγ
- recrutează eozinofilele prin secreţia
de IL-4
Celule γδ - citotoxice prin NKG2D nu a fost analizată
- activează celulele Tαβ pentru a
secreta IFNγ
Celule B - produc anticorpi antitumorali supresie directă Lim et al. (2005)
- prezintă antigenele tumorale asupra celulelor
- iniţiază creşterea tumorală cu B fără supresia
ajutorul factorului solubil celulelor Th
43
Celule NK - citotoxice prin granzime/perforine sau - suprimă activitatea Trzonkowski et al.

ligandul Fas/Fas citotoxică (2004)
- exprimă FcR pentru a media ADCC - există o corelaţie Romagnani et al.
(citotoxicitate celulară dependentă de inversă între (2005)
anticorpi) activarea NK şi Ghiringhelli et al.
numărul de celule (2005)
Treg la pacienţii cu Smyth et al. (2006)
neoplasme Simon et al. (2007)
Celule - produc citokine, stimulează celulele suprimă secreţia de Azuma et al. (2003)
NKT NK şi celulele CD8+ citokine şi activitatea Nishikawa et al.
- acţiune citotoxică citotoxică a celulelor (2003)
- inhibă celulele Th1 şi NKT La Cava et al. (2006)
T CD8+ prin lL-3
Celule Legătura între răspunsul imun reduce expresia DiPaolo et al. (2007)
dendritice înnăscut şi cel dobândit CD80 şi CD86 pe
- IDO+DC (celule dendritice celulele dendritice
secretoare de indol amin 2,3-
dioxigenază) inhibă proliferarea
celulelor T inducând toleranţa
Macrofage - exprimă FcR ce mediază ADCC sau la om, Treg suprimă Taams et al. (2005)
ADCP (fagocitoza) secreţia de citokine
- tipul M1 este citotoxic prin oxidul şi mecanismul
nitric de prezentare a
- tipul M2 secretă arginaza, antigenelor de către
favorizează angiogeneza, inflamaţia macrofage
şi creşterea tumorală
Neutrofile - exprimă FcR pentru a media ADCC inhibă radicalii Lewkowicz et al.
- citotoxice prin radicali liberi de liberi de oxigen (2006)
oxigen, proteaze etc. şi producerea de
- secreţia de citokine proinflamatorii citokine; induc
cum sunt IL1β, TNFα şi INF moartea neutrofilelor
Eozinofile - acţiune tumoricidă directă influenţează negativ Kearley et al. (2005)
- un număr crescut de eozinofile se funcţiile şi recrutarea
asociază cu un prognostic bun eozinofilelor (posibil
prin celulele Th2)
Imunofenotipare limfocitară - profil tumoral şi recomandări pentru efectuarea acestui test

În cadrul profilului tumoral sunt determinate atât procentual cât şi în valoare absolută următoarele
subseturi de limfocite, prin identificarea markerilor de suprafaţă specifici (moleculele CD):
44
• limfocitele T totale (CD3+);

• celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
• celule CD31+ (rezerva timică);
• limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
• celule Treg (CD25++/CD127-);
• celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice), celule T CD8+/CD28-
(reglatoare);
• raport CD4+/CD8+;
• celule T imature (CD4+/CD8+);
• celule T activate ( CD3+/HLA DR+ şi CD3+/CD25+);
• celule B (CD19+)
• celule NK (CD16+/CD56+) şi NK activate.
Testul este indicat pentru monitorizarea statusului imun la pacienţi cu diverse afecţiuni maligne, mai
ales dacă sunt aplicate tratamente de imunostimulare4.
În cursul evoluţiei neoplaziilor, se instalează constant un status de imunodeficienţă (ce trebuie urmărit
în dinamică) de intensitate diferită în funcţie de tipul tumorii, stadiul procesului malign şi mijloacele de
apărare ale organismului9.
Celulele T naive CD4+CD31+ reprezintă o subpopulaţie a celulelor T CD4+ naive recent eliberate
din timus.
Statusul „CD28” diferenţiază limfocitele CD8 cu proprietăţi citotoxice. Numărul celulelor T citotoxice nu
dă informaţii despre funcţia lor, acest lucru fiind posibil prin teste funcţionale (teste de citotoxicitate)4.
Celulele T CD8+ pot fi împărţite în funcţie de expresia pe suprafaţa lor a receptorului co-stimulator
CD28 în CD28+ ( aproximativ 50% din celulele CD8+) şi CD28-, fiecare din cele două populaţii
limfocitare având proprietăţi biologice şi secretoare diferite.
Populaţia de celule T CD28+ predomină la indivizii sănătoşi şi proliferează în timpul infecţiilor virale
primare.
S-a observat că celulele T reglatorii CD8+ CD28- sunt prezente aproape constant în infiltratul limfocitar
tumoral, fiind un potent factor supresor faţă de răspunsul imun, putând inhiba, prin intermediul IL 10,
atât proliferarea celulelor T cât şi citotoxicitatea specifică anti-tumorală3;8.
Celulele T CD8+ CD28- sunt prezente în procent mai mare în sângele periferic al bolnavilor de cancer
decât la voluntarii sănătoşi.
Superfamilia CD28 este formată din molecule receptoare cu acţiune co-stimulatoare (CD28 şi
costimulatorul inductibil - ICOS) sau inhibitoare (CTLA-4, PD-1 şi BTLA) asupra celulelor T. CD28 şi
CTLA-4 sunt receptori specifici ai celulelor T pe când BTLA şi PD-1 sunt exprimate şi pe celulele B, iar
ICOS pe celulele NK. Activarea sau inhibarea celulelor T ca răspuns la un stimul antigenic necesită
două semnale din partea celulelor prezentatoare de antigen (APC). Primul semnal este reprezentat
de antigenul exprimat de APC sub forma peptidelor legate de moleculele MCH, care se leagă de TCR.
Recunoaşterea antigenului de către receptorii celulei T asigură specificitatea răspunsului. Al doilea
semnal, co-stimulator sau inhibitor, este asigurat de interacţiunea unor anumiţi receptori ai celulelor
T cu liganzii corespunzători de la suprafaţa APC. CD28 este considerat prototipul receptorului co-
stimulator. Se consideră că CD28 este prezent pe aproape toate celulele T CD4+ şi doar pe jumătate
din celulele CD8+. În absenţa co-stimulării semnalele venite de la TCR pot induce anergia celulelor
45
T. În prezenţa celor două semnale are loc producerea de citokine (de ex. IL2) ca şi poliferarea,
diferenţierea şi supravieţuirea celulelor T.
De menţionat este faptul că atât CD28 cât şi CTLA-4 se leagă de aceeaşi liganzi (CD80 şi CD86) pe
suprafaţa APC. CTLA-4 inhibă producţia de IL2 şi proliferarea celulelor T, fiind implicat în inducţia şi
menţinerea toleranţei7.
probei4.
sau congelate4.
Valori de referinţă, comunicarea şi interpretarea rezultatelor
Orientativ, prezentăm câteva modele patologice de imunofenotipare associate unor afecţiuni
maligne:
- epiteliom al buzei (operabil): scăderea valorilor procentuale pentru celulele T totale (CD3+),
T activate ( CD3+/HLA DR+) şi NK ( CD16+/CD56+);
- adenocarcinom de col uterin (stadiul I – II) : scăderea proporţiei de celule T CD8+ (probabil T
citolitice) şi, inconstant, scăderea celulelor NK (CD16+/CD56+);
- adenocarcinom mamar (stadiul II): limfopenie, scăderea celulelor T totale (CD3+), B totale
(CD19+), scăderea raportului CD4+/CD8+, creşterea celulelor T CD8+ (probabil T supresoare);
- adenocarcinom pulmonar (operabil): limfopenie, scăderea celulelor T totale (CD3+), T activate
(CD3+/HLA DR+), inconstant scăderea celulelor B (CD19+)9.
Creşterea celulelor T reglatoare în cursul terapiei imunostimulatoare este nefavorabilă, datorită
proprietăţilor imunosupresoare ale acestora.
Gradul de activare celulară (numărul de celule T CD3+/HLA DR+ şi CD3+/CD25+) oferă singurul
indiciu privind capacitatea de reacţie a celulelor T. Astfel, măsurarea celulelor T este utilă în evaluarea
statusului imun din unele boli maligne, dar trebuie avut în vedere faptul că o parte a celulelor activate
părăseşte circulaţia pentru a ajunge la locul procesului tumoral4.
46
Bibliografie
1. AM Gallimore and AK Simon. Positive and negative influences of regulatory T cells on tumor
immunity. In Oncogene (2008) 27, 5886-5893.
2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto. Tumor Immunology. In Color Atlas of Immunology.
Thieme 2003, 150-154.
3. Gilberto Filaci et al. CD8+CD28-T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and
cytotoxic function infiltrate human cancers. In The Journal of Immunology,2007,179,4323 – 4334
Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
6. Michael T Lotze, Markus Y Mapara, Carl H June. Tumor immunology and immunotherapy. In
Clinical Immunology. Principles and Practice, , Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 1181-1199
7. Raul M.Torres,John Imboden,Harry W.Schroeder Jr. Antigen receptor genes, gene products, and
co-receptors. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition,
2008, 74-75.
8. Simona Fiorentini et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+T lzmphocytes with phenotype
and function of both naïve/memory and effector cells. The Journal of Immunology,2001,166, 900
- 907
9. Voiculescu C et al. Aplicaţiile imunofenotipării prin citometrie în flux în imunodiagnosticul şi
monitorizarea unor afecţiuni umane. În Citometria de flux în medicina clinică şi experimentală,
Ed Acad Rom, Buc, 1996, 109-113.
17.9.3 Imunofenotipare limfocitară – profil autoimun
Mecanismele autoimunităţii
Afecţiunile autoimune apar frecvent (afectează mai mult de 5% din indivizi), având un impact
semnificativ asupra morbidităţii şi mortalităţii în populaţia umană. Bolile autoimune sunt definite ca
afecţiuni în care răspunsul imun faţă de anumite autoantigene stă la baza afectării tisulare ce apare
în aceste situaţii.
Bolile autoimune pot fi atât specifice faţă de un anumit tip de ţesut (de exemplu, tiroida, celulele β
pancreatice), cât şi sistemice, afectând ţesuturi multiple. Complexitatea acestor afecţiuni este foarte
mare, acestea având implicaţii genetice, fenotipice şi kinetice. Adesea există o perioadă lungă de timp
(săptămâni sau luni) între debutul simptomelor şi apariţia fenotipului diagnostic, expresia bolii putând
varia în timp la acelaşi individ. În ciuda acestei complexităţi există o legătură strânsă între fenotipul
clinic şi ţintele răspunsului autoimun, ceea ce a făcut ca autoanticorpii să fie folosiţi pentru diagnostic
şi prognostic (de exemplu, anticorpii anti-tiroid peroxidază în tiroidita autoimună, anticorpii anti-Sm
47
pentru LES, anticorpii anti-topoizomeraza-1 în formele difuze de sclerodermie).

Răspunsul imun are caracterul imunităţii dobândite (care în mod normal este direcţionată împotriva
antigenelor exogene) la care ţinta este reprezentată de autoantigene. Substratul molecular este
reprezentat de afectarea discriminării între self si nonself, mecanism ce poate fi mediat atât de anticorpi
cât şi de celulele T, dar asocierea frecventă cu un anumit tip de HLA sugerează că în patogeneza
acestor afecţiuni este de obicei implicat mecanismul discriminării self/nonself mediat de celulele T.
Etapele dezvoltării autoimunitaţii
Caracteristicele autoanticorpilor în afecţiunile autoimune:
- unii anticorpi preced cu mult timp (ani) apariţia simptomelor (de exemplu, anticorpii antinucleari,
antifosfolipidici şi, în mai mică măsură, anti-DNA în LES, anticorpii anti-CCP în artrita reumatoidă);
- unii anticorpi apar cu puţin timp înainte de debutul manifestărilor bolii (de exemplu, anti-Sm şi anti-
RNP în LES);
- în anumite situaţii există o asociere strânsă între autoanticorpii specifici şi fenotipul clinic (de exemplu,
anticorpii anti-topoizomeraza-1 sunt asociaţi cu sclerodermia difuză şi boala pulmonară interstiţială).
Studiile efectuate cu privire la momentul apariţiei autoanticorpilor în LES faţă de debutul simptomelor
au dus la încadrarea lor în două grupe, astfel: markeri de iniţiere a bolii (cei cu apariţie precoce) şi
markeri de propagere a bolii (cei asociaţi cu boala clinică).
Ca urmare, se consideră că boala autoimună evoluează în patru etape:
1. Susceptibilitatea – apare înaintea bolii şi rezultă dintr-un complex de evenimente care vor permite
ulterior manifestarea autoreactivităţii, prin afectarea echilibrului imun. Susceptibilitatea presupune
următoarele mecanisme:
• inducţia incompletă a toleranţei în timus faţă de autoantigenele exprimate în periferie (de exemplu,
deficitul de AIRE – “autoimun regulator” – reprezintă cauza sindromului poliendocrin autoimun tip I);
• afectarea mecanismelor de clearance a celulelor apoptotice şi de producere a citokinelor anti-
inflamatorii ce au ca rezultat inducerea toleranţei (de exemplu, deficitul de C1q, C4, MFG-E8, Mer);
• producerea defectivă a celulelor Treg (deficitul de FOXP3);
• alterarea mecanismelor de semnalizare imună (de exemplu, polimorfismul CTLA-4, polimorfismul
PTPN22).
Susceptibilitatea poate fi ereditară sau dobândită (în multe afecţiuni se întâlnesc ambele situaţii),
permanentă sau tranzitorie.
2. Iniţierea – este marcată prin prezenţa răspunsului autoimun care precede diagnosticul fenotipic
clinic (de exemplu, anticorpii antifosfolipidici în LES). Se caracterizează prin concentraţie crescută
de autoantigene, prezenţa de structuri netolerate, existenţa unui context proimun (infecţii, malignităţi,
expunerea la adjuvanţi).
Mecanisme care pot altera procesarea antigenelor ducând la expunerea unor epitopi criptici:
- modificarea procesării autoantigenelor prin creşterea afinitaţii de legare faţă de un ligand sau un
anticorp;
- existenţa unor mecanisme proteolitice distincte în timus şi în periferie sau modificări diferenţiale ale
activităţii proteolitice;
- evenimente proteolitice noi care nu sunt prezente în mod normal la nivelul APC, de exemplu, clivaje
noi ce apar în cursul proceselor de distrucţie/afectare celulară sau în inflamaţie;
- forme noi de autoantigene rezultate prin mutaţii, trunchieri sau splitări, modificări ce apar în cursul
48
afecţiunilor maligne (de exemplu, asocierea melanom-vitiligo sau apariţia afecţiunilor neurologice
paraneoplazice autoimune).
Inducerea autoimunităţii prin mimetism molecular
Conform acestei ipoteze, un anumit antigen – viral sau bacterian – prezintă importante similarităţi
cu structurile endogene. În cazul unei infecţii cu un asemenea antigen, organismul va reacţiona atât
împotriva moleculelor străine cât şi a celor endogene.
3. Propagarea – corespunde cu debutul bolii clinice şi prezintă următoarele caracteristici: achiziţia
de proprietăţi adjuvante de către autoantigenele ţintă; creşterea expresiei autoantigenelor în ţesutul
afectat; căile efectoare ale imunităţii generează/expun autoantigene care întreţin mai departe
răspunsul imun (de exemplu, anti-Sm în LES).
4. Rezoluţia – în multe cazuri are loc activarea mecanismelor imunoreglatorii (încă din faza de
propagare a bolii) care vor stopa în mod natural evoluţia bolii în timp2.
Lupusul eritematos sistemic (LES)
LES este o afecţiune autoimună caracterizată prin producţia de autoanticorpi şi prin existenţa unui
spectru larg de manifestări clinice. Afectează mai ales femeile aflate în perioada fertilă.
Următoarele elemente pot contribui la apariţia autoimunităţii:
- factorii genetici;
- pierderea toleranţei periferice prin anomalii la nivelul limfocitelor B,T şi a celulelor dendritice;
- factori hormonali;
- factori de mediu.
Astfel, pe lângă modificările imunologice ce apar în LES, cum ar fi disfuncţii ale sistemului
complementului, modificările de interacţiune între limfocitele B şi T sau cele apărute în procesul de
fagocitoză, hiperactivitatea celulelor B reprezintă o trăsătură centrală a acestei boli. Prin urmare,
studierea anomaliilor ce apar în biologia celulelor B este esenţială pentru descifrarea patogenezei
în lupus. Au fost rapotate, de exemplu, secreţia spontană de imunoglobuline de către limfocitele
periferice; expresia aberantă a unor receptori sau activarea căilor de semnalizare ce controlează
diferenţierea şi proliferarea celulelor B, producţia de anticorpi şi apoptoza; expresia anormală a unor
factori - cum ar fi BAFF/BLyS, IL 10 şi factorul solubil CD154 - implicaţi în activarea şi diferenţierea
celulelor B ce au fost identificaţi atât la pacienţii cu LES cât şi pe modelele animale1.
Deoarece limfocitele joacă un rol impotant în răspunsul imun alterat din LES, determinarea diferitelor
subpopulaţii limfocitare este utilă în monitorizarea activităţii bolii.
Celulele B CD19+/CD27++
CD27 este un marker util pentru diferenţierea subseturilor de celule B din periferie. Astfel celulele B din
periferie pot fi împărţite în trei subgrupe: celule B naive (CD19+/CD27-), celule B de memorie (CD19+/
CD27+ sau CD19+/CD27 dim) şi plasmocite (CD19+/ CD 27++ sau CD19+/ CD27 high). Plasmocitele
prezintă nivele mai crescute ale CD27 decât celulele B de memorie. În mod special, procentul de
plasmocite (CD19+/CD27++) este crescut la pacienţii cu lupus, atât la copii cât şi la adulţi, corelându-
se pozitiv cu indexul de activitate al bolii (SLEDAI ≥ 8) şi cu titrul de anticorpi anti-ADN dublu catenar.
Cu toate acestea valori semnificativ crescute ale celulelor CD27high au fost observate şi la pacienţii
anti-ADN dublu catenar negativi dar care erau pozitivi pentru alţi autoanticorpi (anti-Sm, anti-La, anti-
Ro, antihistone). În acelaşi timp procentul de celule B naive şi celule B de memorie este scăzut. Ca
urmare a terapiei imunosupresoare convenţionale, celulele B naive CD27- şi plasmocitele CD27++
49
sunt marcat reduse, în schimb celulele B de memorie CD27+ nu sunt afectate. Acest lucru sugerează
că recăderile ar putea avea legătură cu retenţia de celule de memorie CD27+. Studiile au arătat că
subseturile de limfocite B circulante nu sunt influenţate de vârstă sau de sex, dar par a fi influenţate de
durata bolii (s-a observat creşterea numărului de celule CD27 high şi scăderea numărului de celule B
naive CD27- de-a lungul timpului)1;6;9.
Celulele B CD19+/CD5+
Populaţia de celule B din periferie poate fi împărţită în două compartimente (B1 şi B2) în funcţie
de expresia diferită a moleculelor de suprafaţă IgD, CD5, CD11b/CD18, CD23 şi CD45. Celulele B
convenţionale (celulele B2) exprimă pe suprafaţa lor nivele crescute de IgM şi IgD, pe când celulele
B1 prezintă o expresie minimă pe suprafaţa lor pentru IgD, CD45 şi virtual absentă pentru CD23. În
schimb, toate celulele B1 exprimă CD5 ARNm, dar nu toate prezintă pe suprafaţa lor CD5. Din acest
motiv, celulele B1 pot fi împărţite, în funcţie de expresia pe suprafaţa lor a moleculei CD5, în două
subpopulaţii: B1a (CD5+) şi B1b (CD5-). Se pare că celulele B1 derivă din progenitori distincţi faţă de
cei ai celulelor B2, ce reprezintă majoritatea celulelor B în timpul vieţii fetale. Astfel, toate celulele B
din ficatul fetal murin sunt de tip B1 pe când în splina fetală murină proporţia lor este de 40-60%. La
animalele adulte celulele B1 reprezintă mai puţin de 10% din celulele splenice B IgM+. Celulele B1 se
găsesc din abundenţă în cavitatea peritoneală.
Studiile au arătat faptul că la oameni aproximativ 20% din celulele B din sângele periferic sunt
CD5+, reprezentând astfel o componentă majoră a populaţiei de celule B. Celulele B1a produc
anticorpi naturali IgM polireactivi, cu specificitate atât faţă de antigenele bacteriene cât şi faţă de
autoantigene.
În anumite circumstanţe aceşti anticorpi sunt implicaţi în patogeneza bolilor autoimune3;8.
În lupus, celulele T contribuie la alterarea self-toleranţei prin facilitarea producţiei de autoanticorpi
de către celulele B autoreactive. Totodată aceste celule prezintă o creştere a expresiei markerilor de
activare. În mod normal, la menţinerea toleranţei faţă de self contribuie în parte şi acţiunea supresivă
a celulelor T reglatorii (Treg). Studiile au demonstrat că la pacienţii cu lupus în perioada activă există
o scădere a numărului de celule Treg (CD4+/CD25+) în periferie4.
Imunofenotipare limfocitară – profil autoimun şi recomandări pentru efectuarea acestui test
Profilul autoimun cuprinde următoarele celule exprimate în valoare procentuală şi absolută:
• numărul de leucocite, granulocite, limfocite, monocite;
• numărul total de celule T (CD3+);
• celule T helper (CD4+);
• celule Treg (CD25++/CD127-);
• celule T CD8+;
• celule T imature (CD4+/CD8+)
• celule B (CD19+), celule B imature (CD19+/CD5+), celule B CD19+/CD27++;
• celule NK (CD16+/CD56+);
• celule T activate (CD3+/HLA DR+).
Urmărirea tabloului imunofenotipic limfocitar este util în monitorizarea clinică a bolilor autoimune, în
corelaţie cu tipul şi stadiul afecţiunii cât şi cu tratamentul imunosupresiv administrat5.
50

probei5.
sau congelate5.
Citopeniile apar frecvent în LES, severitatea lor fiind influenţată de vârstă şi de etnie. Leucopenia cu
neutropenie şi limfopenie apare în 15–50 % din cazuri, neutropenia şi limfopenia reflectând activitatea
bolii şi predispoziţia la infecţii. Limfopenia are o incidenţă de 19–62% şi constă în reducerea numărului
de celule T CD4 circulante şi scăderea raportului CD4/CD84.
Bibliografie
1. Annet M.Jacobi et al. Correlation between circulating CD27high plasma cells and disease
activity in pacients with systemic lupus erythematosus. In Arthritis &Rheumatism, vol 48, no 5,
2003, 1332 – 1352.
2. Antony Rosen. Mechanism of autoimmunity. In Clinical Immunology. Principles and Practice,
Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 739 -749
3. Claudia Berek, Andreas Radbruch, Harry W. Schroeder Jr. B-cell development and
differentiation. In Clinical Immunology. Principles and Practice , Mosby, Elsevier, Third Edition,
2008, 121.
4. Cyntia Aranow, Betty Diamond, Meggan Mackay. Systemic lupus erythematous. In Clinical
Immunology. Principles and Practice. Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 749 -765.
6. Marcus Odendahl et al. Disturbed peripheral B lymphocyte homeostasis in systemic lupus
erythematosus . In The Journal of Immunology, 2000, 165: 5970 – 5979.
Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
8. Paolo Casali. Abner L Notkins . CD5+ B lymphocytes, polyreactive antibodies and human B –
cell repertoire. In Trends in Immunology, vol 10, 1989, 364 – 368.
9. T.Dorner, P.E. Lipsky. Correlation of circulating CD27high plasma cells and disease activity in
systemic lupus erythematous. In Lupus, vol 13,no 5, 2004, 283 – 289.
51
17.9.4 Imunofenotipare limfocitară – profil infecţii cronice
Multe infecţii virale persistă indefinit după faza acută şi pot avea consecinţe clinice considerabile.
Printre acestea se numără infecţiile HBV, HCV, HIV şi HTLV, ce sunt caracterizate prin niveluri
crescute ale antigenelor persistente, prin afectarea localizării tisulare a celulelor imune şi perturbarea
funcţiei celulelor T5.
Prin definiţie, infecţiile virale persistente nu sunt controlate în întregime de sistemul imun al gazdei.
Funcţia alterată a celulelor T este ierarhică şi pare să se coreleze direct cu nivelul antigenic; include
o producţie scăzută de citokine şi o capacitate proliferativă perturbată, până la “epuizarea” completă
a celulelor T implicate în răspunsul imun. Acest fenomen contrastează cu dezvoltarea normală a
celulelor T cu memorie care se produce în absenţa antigenului persistent2;5.
Procesul de “epuizare” a celulelor T, ca urmare a confruntării continue cu niveluri moderate sau
crescute de antigene virale exprimate pe numeroase celule, a fost descris iniţial la şoarecii infectaţi cu
virusul meningitei coriolimfocitare şi s-a constatat că se aplică şi la infecţiile HIV şi HCV la om. Până în
acest moment, nu există un răspuns definit la întrebarea dacă “epuizarea” celulelor T este consecinţa
expunerii continue la concentraţii crescute de antigen sau aceasta constituie cauza replicării virale
necontrolate şi deci a încărcării antigenice crescute.
La nivel molecular, “epuizarea” celulelor T este definită prin:
• alterarea căilor de semnalizare prin TCR şi citokine;
• exprimarea de receptori inhibitori (PD-1, LAG-3, Tim3 etc.);
• deficit metabolic şi energetic;
• alterarea maturaţiei/diferenţierii2.
Lipsa celulelor producătoare de IL-2 în cursul expunerii persistente la virusul HIV este o constatare
deosebit de importantă în lumina studiilor recente privind dezvoltarea celulelor T cu memorie.
Astfel, celulele de memorie CD4 şi CD8 pot fi împărţite în două subtipuri, după funcţiile efectoare
şi capacitatea de migrare: celule T de memorie centrale CD45RA- care exprimă markerii L-selectin
(CD62L) şi CCR7 şi celule T de memorie efectoare CD45RA- care nu exprimă aceşti markeri şi care
migrează către situsurile replicării virale din ţesuturi. În ceea ce priveşte producţia de citokine, celulele
T de memorie centrale produc în principal IL-2, în timp ce celulele T de memorie efectoare produc atât
IL-2 cât şi interferon gamma.
Persistenţa antigenului la persoanele infectate cu HIV în fază de viremie este asociată cu un număr
scăzut de celule CD4+ de memorie centrale virus-specifice în comparaţie cu persoanele ce au o
viremie suprimată. Constatări similare au fost raportate şi în infecţia cronică cu virus C. Aceste studii
arată că expunerea cronică la antigen conduce la alterarea funcţională a celulelor CD4 virus-specifice.
Astfel, prezenţa antigenului viral stimulează generarea de celule de memorie efectoare capabile să
producă interferon gamma dar care au o capacitate de proliferare redusă şi o durată de viaţă scurtă
in vivo; în acelaşi timp este perturbată dezvoltarea de celule de memorie centrale care au capacitate
proliferativă şi secretă IL-2; la rândul lor, celulele de memorie efectoare scad nivelurile de antigen1.
Studiile care descriu un defect funcţional în celulele CD4+ virus-specifice ar putea explica lipsa funcţiei
antivirale eficace a celulelor CD8+ în infecţia HIV. Pentru un răspuns susţinut al celulelor CD8+ se
pare că este necesar ca limfocitele CD4+ să furnizeze IL-2 (în cursul fazelor precoce ale infecţiei
52
cronice) şi IL-21 (în cursul fazelor tardive). Exprimarea moleculei costimulatoare CD28 pe suprafaţa
celulelor CD8+ antigen-specifice este posibil legată de producţia de IL-2 de către celulele CD4+. O
altă modalitate prin care celulele T CD4+ contribuie la răspunsul susţinut al celulelor CD8+ în cazul
infecţiilor persistente este inducţia continuă şi menţinerea producţiei de anticorpi neutralizanţi1;2.
Pe baza conceptului care prevede implicarea mai multor mecanisme în reducerea răspunsurilor celulelor
T CD8+ în cursul infecţiilor virale cronice, au apărut posibilităţi noi de intervenţii imunomodulatoare
care se află în curs de evaluare.
Unele comunicări au documentat reversarea in vitro a funcţiei celulelor T CD4+ izolate de la şoarecii
infectaţi cronic cu virusul coriomeningitei limfocitare, de la maimuţele infectate cu virusul SIV sau
de la oamenii infectaţi cu HIV sau HCV, prin blocarea unuia sau mai multor receptori inhibitori.
Această restaurare funcţională a fost dependentă de cultura in vitro prelungită în prezenţa anticorpilor
blocanţi respectivi şi a fost precedată de proliferarea celulelor T CD8+. Inducţia proliferării în prezenţa
anticorpilor blocanţi îndreptaţi împotriva PD-1 rezultă într-o apoptoză redusă precum şi într-o creştere
atât a lungimii telomerelor cât şi a activităţii telomerazei, ambele contribuind se pare la potenţialul
proliferativ crescut şi la recuperarea funcţiilor efectoare2.
Imunofenotipare limfocitară – profil infecţii cronice şi recomandări pentru efectuarea acestui
test
Profilul infecţii cronice cuprinde următoarele celule exprimate în valoare procentuală şi absolută:
• numărul de leucocite, granulocite, limfocite, monocite;
• numărul total de celule T(CD3+);
• celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
• celule T helper (CD4+);
• celulele T naive CD45RA+ raportate la numărul de celule CD4+;
• celule T CD31+;
• celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice), celule T CD8+/CD28- (reglatoare);
• celule T imature (CD4+/CD8+);
• celule B ( CD19+);
• celule NK (CD16+/CD56+);
• celule T activate (CD3+/HLA DR+).
Urmărirea tabloului imunofenotipal limfocitar este util în monitorizarea clinică a pacienţilor cu infecţii
cronice în corelaţie cu tratamentul administrat3.
probei3.
sau congelate3.
53
pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute3
În infecţiile cronice se înregistrează de obicei o granulocitopenie, o reducere a limfocitelor CD4+ şi o
inversare a raportului CD4/CD8.
Celulele T naive CD4+CD31+ reprezintă o subpopulaţie a celulelor T CD4+ naive recent eliberate
din timus. Determinarea rezervei timice prin celule T naive CD31+ este utilă în depistarea cauzei
unei limfopenii persistente. Aceasta poate fi datorată unui “consum”crescut (indiciu de infecţie
cronică) sau unei “producţii” scăzute. Cu cât proporţia de celule T CD31+ este mai mare cu atât
capacitatea de generare a limfocitelor T naive este mai mare.
Raportul dintre celulele T naive şi celulele T cu memorie scade în cursul vieţii, deoarece se generează
mereu noi celule cu memorie prin contactul cu antigenele. În infecţiile cronice apare creşterea
procentuală a celulelor T cu memorie CD45RA- ca urmare a activării imune cronice3.
Bibliografie
1. Cheryl L Day, Bruce D Walker. Progress in Defining CD4 Helper Cell Responses in Chronic Viral
Infections. In J Exp Med, Vol. 198, No.12, December 2003.
2. Helge Frebel, Kirsten Richter, Annette Oxenius. How chronic viral infections impact on antigen-
specific T-cell responses. In European Journal of Immunology, 2010.
Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. Scott N. Mueller, Barry T. Immune responses to viruses. In Clinical Immunology. Principles and
Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 426-427.
17.9.5 Imunofenotipare limfocitară - sindroame limfoproliferative
Imunofenotiparea prin citometrie în flux (IFCF) reprezintă un instrument indispensabil pentru
diagnosticul, clasificarea, stadializarea şi monitorizarea neoplaziilor hematologice.
La Conferinţa Internaţională de Consens din 2006 de la Bethesda, Maryland s-au emis recomandări
privind indicaţiile medicale ale testării prin citometrie în flux. Astfel, aceasta este indicată în următoarele
situaţii clinice:
- citopenii, în special bicitopenia şi pancitopenia;
- număr crescut de leucocite, incluzând limfocitoza, monocitoza şi eozinofilia;
54
- prezenţa de celule atipice sau blaşti în sângele periferic, măduva osoasă sau alte lichide ale
corpului;
- plasmocitoza sau gamopatia monoclonală;
- organomegalia şi masele tisulare.
În aceste situaţii imunofenotiparea poate constitui un screening sensibil pentru prezenţa/absenţa unei
neoplazii hematologice. În plus, citometria în flux este un instrument util în stadializarea unei neoplazii
limfoide diagnosticate anterior, în monitorizarea răspunsului la tratament incluzând detectarea
bolii minime reziduale, în documentarea recăderii sau progresiei şi în diagnosticul unei malignităţi
hematologice intercurente.
În malignităţile hematologice mai mulţi paşi sunt urmaţi în aplicarea şi interpretarea informaţiei
imunofenotipice:
1. identificarea celulelor din linii diferite şi determinarea dacă acestea sunt mature sau imature;
2. detectarea celulelor anormale prin identificarea expresiei antigenice care diferă semnificativ de
normal;
3. documentarea detaliată a fenotipului populaţiei celulare anormale (adică prezenţa sau absenţa
antigenelor) şi, prin comparaţie cu populaţia normală, documentarea unei creşteri sau scăderi a
intensităţii colorării cu anticorpi marcaţi cu fluorocromi;
4. evaluarea faptului dacă informaţiile obţinute sunt diagnostice pentru o anumită boală, iar dacă nu,
stabilirea unei liste de entităţi posibile cu sugerarea unor studii suplimentare ce pot avea valoare
diagnostică, cum ar fi imunohistochimie (IHC), citogenetică, FISH sau studii moleculare;
5. furnizarea de informaţii imunofenotipice ce pot avea valoare prognostică suplimentară, incluzând
identificarea de ţinte pentru o potenţială terapie ţintită.
Atunci când se primeşte o probă pentru testare prin citometrie în flux, se stabilesc liniile celulare şi
antigenele ce trebuie evaluate pe baza tipului de probă şi alte informaţii disponibile, cum ar fi: indicaţia
medicală pentru testare, istoricul clinic, elementele morfologice, testările anterioare prin citometrie
în flux, rezultatele altor teste de laborator, precum şi rezultatele unei eventuale testări preliminare
sceening prin citometrie în flux. Pentru indicaţiile medicale identificate de grupul Bethesda s-a stabilit
un consens privind liniile celulare care trebuie evaluate şi antigenele incluse în evaluarea primară a
fiecărei linii1.
Astfel reactivii de consens menţionaţi în tabelul 17.9.5.1, atunci când sunt evaluaţi în combinaţiile
potrivite, reprezintă minimul care permite evaluarea eficientă a liniilor celulare indicate pentru neoplazia
hematopoietică cu un grad acceptabil de sensibilitate2.
Tabel 17.9.5.1: Reactivii consens pentru evaluarea iniţială a neoplaziilor hematopoietice16

Linia celulară Reactivii primari
Celulele B CD5, CD10, CD19, CD20, CD45, Kappa, Lambda
Celulele T şi NK CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45, CD56
CD7, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33,
Celulele mielomonocitare
CD34, CD45, CD56, CD117, HLA-DR
Celulele mielomonocitare (panel limitat) CD13, CD33, CD34, CD45
Plasmocite CD19, CD38, CD45, CD56
55
Este furnizat de asemenea un set secundar de reactivi potrivit pentru caracterizarea în situaţii specifice,
dar numai un număr limitat dintre aceştia va fi utilizat într-un caz particular (vezi tabelul 17.9.5.2). De
menţionat faptul că în condiţii practice specifice poate fi necesară înlocuirea anumitor reactivi între
cele două paneluri pentru adaptarea la o anumită populaţie de pacienţi sau o anumită prevalenţă a
bolilor, dar numărul total al reactivilor utilizaţi trebuie să rămână acelaşi.
Tabel 17.9.5.2: Reactivi pentru evaluarea secundară a liniilor celulare hematopoietice specifice16
Linia celulară Reactivii secundari
Celulele B CD9, CD11c, CD15, CD22, cCD22, CD23, CD25, CD13, CD33,
CD34, CD38, CD43, CD58, cCD79a, CD79b, CD103, FMC7,
Bcl-2, cKappa, cLambda, TdT, ZAP-70, cIgM
Celulele T şi NK CD1a, cCD3, CD10, CD16, CD25, CD26, CD30, CD34, CD45RA,
CD45RO, CD57, αβ-TCR, γδ-TCR, cTIA-1, T-izoformele lanţului
beta, TdT
Celulele mielomonocitare CD2, CD4, CD25, CD36, CD38, CD41, CD61, cCD61, CD64,
CD71, cMPO, CD123, CD163, CD235a
Plasmocite CD10, CD117, CD138, cKappa, cLambda
În prezent imunofenotiparea limfocitelor din sângele periferic este utilizată în mod comun în evaluarea
pacienţilor cu limfocitoză susţinută pentru determinarea naturii sale reactive sau maligne3.
NEOPLAZIILE LIMFOIDE MATURE

Acestea includ leucemia limfocitară cronică şi limfoamele non-Hodgkin, recunoscute după un fenotip
care este similar celulelor limfoide mature normale (cum ar fi prezenţa Ig de suprafaţă pe celulele
B mature) şi lipsa trăsăturilor antigenice de imaturitate (cum ar fi expresia TdT, CD34 şi intensitate
scăzută a expresiei CD45). Prin identificarea antigenelor asociate liniei celulare, neoplaziile limfoide
mature pot fi împărţite în neoplazii ale liniei celulare B, T sau NK.
Neoplaziile limfoide cu celulă B matură
Citometria în flux este indispensabilă pentru diagnosticul neoplaziilor limfoide cu celulă B matură, prin
identificarea celulelor anormale fenotipic aparţinând liniei celulare B şi recunoaşterea fenotipurilor
caracteristice diferitelor entităţi2. Multe cazuri de posibil limfom cu celulă B sunt evaluate iniţial
prin imunofenotiparea sângelui periferic şi/sau aspiratului de măduvă osoasă înaintea efectuării
biopsiei tisulare. Limfoamele cu celulă B identificate astfel sunt adesea încadrate în spectrul larg al
bolilor limfoproliferative cronice cu celulă B (BLPC-B), această terminologie fiind utilizată deoarece
subclasificarea precisă utilizând criteriile OMS necesită corelarea cu histopatologia tisulară. În ciuda
acestei cerinţe, necesitatea unui diagnostic specific rapid, utilizând proceduri minim invazive, a dus la
creşterea tendinţei de subclasificare completă a BLPC-B care afectează sângele periferic şi măduva
osoasă în mare parte pe rezultatele IFCF sau în combinaţie cu histopatologia medulară. Această
tendinţă a fost impulsionată de studii ce au documentat identitatea fenotipică în neoplaziile cu celulă B
cu afectare concomitentă a sângelui periferic sau măduvei osoase şi ganglionilor limfatici13.
În plus citometria în flux poate fi utilizată pentru identificarea expresiei unor ţinte pentru terapia
cu anticorpi şi furnizarea de informaţii prognostice suplimentare. De asemenea, în urma terapiei,
56
citometria de flux constituie metoda stabilită pentru evaluarea bolii minime reziduale2.
Celulele limboide B mature neoplazice pot fi distinse de celulele normale prin identificarea a 2 tipuri
principale de anomalii fenotipice: restricţia clasei lanţurilor uşoare de Ig şi expresia aberantă de
antigene2;11.
Spre deosebire de majoritatea populaţiilor normale sau reactive, neoplaziile cu celulă B matură
reprezintă de obicei o singură clonă celulară care exprimă o singură clasă de lanţ uşor de Ig, adică
kappa sau lambda, reflectată printr-un raport anormal kappa-lambda. În mod tipic, leucemia limfocitară
cronică (CLL) prezintă o intensitate scăzută a colorării pentru Ig de suprafaţă. Unele celule B nu
prezintă Ig de suprafaţă, acestea incluzând limfoblaştii, plasmocitele şi celulele B timice, precum şi
corespondentele lor neoplazice: leucemia acută limfoblastică, neoplaziile plasmocitare şi limfomul cu
celulă B mediastinal primar. Rezultate fals negative pentru Ig de suprafaţă se pot datora interferenţei
Ac solubili cu legarea Ac de detecţie sau alterării/deleţiei epitopilor recunoscuţi, datorate de exemplu
mutaţiilor hipersomatice din limfomul folicular.
Prin IFCF se poate identifica expresia aberantă de antigene la nivelul celulelor B. Expresia CD5 la
nivelul celulelor B este în general raportată ca un fenotip aberant, dar există populaţii mici de celule
B normale mature CD5+, aflate de obicei în sângele periferic, dar şi la nivelul ganglionilor limfatici,
în special la pacienţii cu boli autoimune. Expresia CD5 a fost raportată şi la nivelul unor precursori
normali ai celulelor B din măduva osoasă. Astfel expresia CD5 trebuie interpretată în corelaţie cu
alte anomalii, incluzând restricţia lanţului uşor de Ig sau alterarea intensităţii colorării CD20, CD22 şi
CD79b. Un alt tip de aberaţie fenotipică este expresia de antigene care nu sunt în mod tipic prezente
într-un subset de celule B aparţinând unui compartiment biologic distinct (de exemplu expresia bcl-2
pe celulele B CD10+)2.
Într-un studiu, Morice şi colaboratorii au evaluat retrospectiv abilitatea IFCF a sângelui periferic şi
măduvei osoase de a prezice tipul de limfom cu celulă B într-un grup de 252 pacienţi cu IFCF pozitive
şi biopsii tisulare diagnostice, iar concluziile extrase din acest studiu corelativ sunt rezumate într-un
algoritm pentru clasificarea limfoamelor cu celulă B prin IFCF a sângelui periferic/măduvei osoase
(vezi figura 17.9.5.1)13.
Celule B restricĠionate (lanĠuri uúoare sIg)
CD5+ CD5-
CD5 uniform, sIg slab, CD10+

CD20 slab, CD23+ Posibil FL sau DLBCL**
Probabil CLL/SLL – B
CD5 uniform, sIg intens, CD11c úi CD22 intens,

CD20 intens, CD23-/parĠial CD103+
Probabil MCL* Probabil HCL***
CD5 uniform, sIg slab, CD5-, CD10-, CD103-

CD20 intens, CD23+/- Fenotip nespecific**
Posibil CLL sau MCL*
CD5 parĠial
Fenotip nespecific**
Fig. 17.9.5.1 Adaptare după Morice W G et al. Mayo Clin Proc. 2008; 83:776-785.
57
* Se recomandă ciclina D1 (FISH sau IHC)

** Este necesară corelarea cu biopsia de ţesut
*** Se recomandă confirmare prin TRAP şi/sau biopsie măduvă osoasă
Imunofenotiparea prin citometrie în flux este în mod particular utilă pentru subtiparea limfoamelor/
leucemiilor cu celulă B compuse predominant din celule mici (vezi tabelul 17.9.5.3)5.
Tabel 17.9.5.3
Antigenele de suprafaţă în limfoamele/leucemiile cu celulă B mică
NHL sIg CD5 CD10 CD23 CD11c CD103 CD25
CLL/SLL Slab + - ++/+ - - -
MCL + + -/+ -/+ - - -
Folicular + - + +/- - - -
LPL + - - - - - -
MZL + - - - +/- slab - -
SMZL + - - - +/- slab +/- slab -
Hairy cell + - -/+ - ++ + +
NHL = limfom non-Hodgkin, sIg = imunoglobuline de suprafaţă, CLL = leucemie limfocitară cronică,
SLL = limfom cu limfocite mici, LPL = limfom limfoplasmocitar, MCL = limfom/leucemie cu celulă a
mantalei, MZL = limfom de zonă marginală, SMZL = limfom de zonă marginală splenic
▪ Expresia aberantă a CD5 este caracteristică pentru CLL/SLL şi MCL, care prezintă manifestări
superpozabile. Coexpresia omogenă a CD5 şi CD23 de către o BLPC-B, atunci când este însoţită
de colorarea slabă atât pentru sIg cât şi pentru CD20, CD22, CD79b, iar FMC-7- prezice CLL/SLL
cu specificitate înaltă. Acest fenotip exclude MCL (în care de obicei CD23 este negativ), iar alte
limfoame similare fenotipic sunt relativ indolente, astfel încât efectele clinice ale clasificării unuia din
aceste cazuri în categoria CLL ar fi probabil minime. Totuşi acest diagnostic IFCF trebuie confirmat
prin corelarea cu date clinice, de laborator şi citologice, cu recomandarea de biopsie tisulară când
subclasificarea precisă rămâne neclară13.
Un fenotip caracterizat prin expresia intensă a sIg şi CD20, pozitivitate CD5 uniformă, iar expresia
CD23 fie absentă fie parţială şi FMC-7+ se asociază puternic cu MCL2;13.
În anumite cazuri IFCF prezintă aspecte care se suprapun între fenotipurile CLL şi MCL, expresia slab
pozitivă a CD23 putând fi întâlnită în ambele. Astfel, dat fiind comportamentul clinic relativ agresiv al
MCL, studii suplimentare, care includ imunohistochimie pentru supraexpresia ciclinei D1 sau examen
citogenetic pentru identificarea translocaţiei t(11;14)(q13;q32) sau FISH pentru gena de fuziune
CCND1/IGH, sunt necesare pentru diagnostic în toate cazurile de BLPC-B care prezintă expresia
uniformă a CD5 şi în care lipsesc alte atribute fenotipice tipice pentru CLL. Totuşi absenţa genei de
fuziune în aceste cazuri nu stabileşte diagnosticul definitiv de CLL, alte boli (LPL, SMZL) putând
prezenta un imunofenotip similar. De asemenea în cazurile cu IFCF tipică pentru MCL un FISH negativ
nu exclude complet diagnosticul, în cazuri rare alte tipuri de ciclină D putând fi supraexprimate2;5;13.
CD5 poate fi exprimat şi în alte BLPC-B, în mod particular LPL sau SMZL, în multe din aceste cazuri
expresia CD5 fiind parţială. Expresia parţială a CD5 nu exclude CLL sau MCL, iar pe de altă parte
58
nu prezice un anume tip de limfom13. Posibile aspecte distinctive includ absenţa expresiei CD23
în majoritatea MZL şi prezenţa diferenţierii plasmocitare într-un subset semnificativ din acestea
demonstrată de expresia CD138, expresia intensă a CD38 şi restricţia lanţului uşor de imunoglobuline
citoplasmatice (cIg). Totuşi şi alte subtipuri de neoplazii limfoide B pot demonstra diferenţiere
plasmocitară, în special LPL2. De aceea, în cazul unei BLPC-B detectată prin IFCF a sângelui periferic
sau măduvei osoase, cu expresia parţială a CD5, pentru un diagnostic precis se recomandă biopsia
tisulară2;13. Uneori studiile de genotipare pot susţine diagnosticul de MZL. Deşi unele anomalii genetice
pot fi întâlnite atât în CLL/SLL cât şi în MZL (de exemplu, trisomia 18), următoarele anomalii sunt mai
tipice pentru MZL: t(11;18)(q21;q21), t(1;14)(p22;q32), t(14;18)(q32;q21), precum şi deleţia 7q31 în
SMZL2.
Un mic subset din pacienţii cu leucemie prolimfocitară B (B-PLL) pare să fie CD5+. Unii dintre aceştia
au fost ulterior diagnosticaţi cu varianta blastoidă de MCL prin testarea pentru translocaţia t(11;14)
(q13;q32) sau rearanjamentele genei CCND1. Este dificil să se distingă între CLL cu număr crescut de
prolimfocite, transformarea prolimfocitoidă a CLL sau PLL de novo. Transformarea prolimfocitoidă se
caracterizează prin colorare scăzută pentru CD5, intensitate crescută a colorării pentru CD20 şi sIg şi
achiziţia FMC-7. Totuşi unii pacienţi cu transformare prolimfocitoidă demonstrează un fenotip identic
cu cel al CLL/SLL precedente. Fenotipul B-PLL de novo este variabil, incluzând unii pacienţi CD5+, dar
care, spre deosebire de CLL/SLL, de obicei sunt CD23- 2.
Este puţin probabil ca o BLPC cu celulă mică B CD5 negativă să reprezinte CLL, iar aceste cazuri sunt
clasificate mai potrivit ca NHL în fază leucemică.
▪ Expresia CD10 la IFCF se corelează puternic cu diagnosticul tisular de limfom folicular (FL) sau
limfom difuz cu celulă mare B (DLBCL), urmate de limfomul Burkitt (BL)2;13. Expresia CD10 în alte tipuri
de limfoame este neobişnuită, fiind foarte rară în LPL, MZL şi MCL. Pe de altă parte CD10 este în
mod normal exprimat de celulele B ale centrului folicular, leucemia/limfomul limfoblastic cu precursor
de celulă B, subseturi de celule T mature, limfoblaşti precursori ce celulă T, neutrofile şi unele celule
nonhematolimfoide.
Aproximativ 20-40% din toate DLBCL prezintă un fenotip CD10+, acestea putând fi dificil de diferenţiat
de BL sau de FL compus din multe celule mari. Astfel când un fenotip B matur CD10+ este identificat
prin IFCF, distincţia între aceste posibilităţi trebuie evaluată în continuare prin morfologie2.
BL al copilului este în general CD10+ şi CD5-. Deşi BL al adultului este de obicei CD10+, fenotipul în
aceste cazuri este mai variabil şi este mai dificil de diferenţiat de DLBCL, dar spre deosebire de unii
pacienţi cu DLBCL şi majoritatea pacienţilor cu FL, BL este de obicei bcl-2- 2.
▪ HCL are un fenotip distinctiv care permite diagnosticul şi detecţia unor niveluri scăzute de boală
ulterior terapiei: CD20 intens, CD22 intens, CD11c intens, CD25+, CD103+, sIg intermediar sau intens,
FMC-7+, CD23-, CD5-, CD10-. Acest fenotip este mai sensibil şi specific pentru diagnosticul de HCL
decât coloraţia pentru fosfataza acidă tartrat rezistentă (TRAP). CD103 este caracteristic exprimat în
HCL, alte boli CD103+ fiind rare şi nu răspund bine la acelaşi tip de terapie, acestea incluzând HCL
variantă (HCLv) şi limfomul pulpei roşii a splinei cu limfocite viloase (SRPL), care sunt frecvent CD103+,
precum şi rare cazuri de SMZL şi DLBCL. Coexpresia CD103 şi CD25 este considerată unul din cele
mai utile criterii de diagnostic pentru HCL. Ocazional HCL clasică deviază de la fenotipul caracteristic.
Un mic subset de HCL (10-26%) sunt CD10+, dar sunt morfologic similare HCL CD10- şi răspund
la terapia tipică. Astfel diagnosticul de HCL trebuie luat în considerare atunci când se identifică un
59
fenotip CD10+, CD5- asociat cu identificarea altor aspecte fenotipice caracteristice HCL. Alte variaţii
fenotipice raportate includ lipsa CD103 (foarte rar), lipsa CD25, expresia bcl-1 sau prezenţa colorării
pentru CD23. Cazurile CD25- au morfologie variabilă, de la HCLv şi SMZL la PLL şi DLBCL. Recent,
coloraţia histochimică pentru anexina A1 a fost arătat că distinge cu o sensibilitate şi specificitate de
100% între HCL şi alte BLPC-B, incluzând SMZL şi HCLv. HCLv se caracterizează prin număr mai
mare de leucocite, absenţa monocitopeniei, prezenţa de celule cu nucleoli proeminenţi, lipsa colorării
pentru TRAP, CD25-, dar în rest este similară fenotipic HCL clasice. Este importantă recunoaşterea
acestei HCL variante deoarece răspunsul la agenţii eficienţi în HCL clasică este de obicei slabă,
iar supravieţuirea mediană este semnificativ scurtată. Totuşi existenţa HCLv este dezbătută şi s-a
pus întrebarea dacă unele din aceste neoplasme nu reprezintă SMZL, cu care prezintă similitudini
morfologice. În clasificarea OMS 2008, HCLv şi SRPL au fost listate sub termenul de “limfom splenic
cu celula B, neclasificabil”, HCLv nemaifiind considerată legată biologic de HCL2;4;5.
▫ MZL prezintă de obicei un fenotip CD5-, CD10-, iar diagnosticul se bazează pe identificarea
trăsăturilor morfologice caracteristice şi excluderea altor neoplazii cu celulă mică B: FL CD10-, MCL
CD5- şi HCL. Distincţia de HCL este mai dificilă datorită fenotipurilor care se pot suprapune. MZL este
adesea CD11c+ şi poate fi pozitiv pentru CD103. Totuşi în MZL colorarea pentru CD11c este mai slabă,
lipseşte combinaţia CD103, CD11c şi CD25 şi lipseşte colorarea intensă pentru CD20 şi CD222.
▫ Aproximativ 60-80% din pacienţii cu LPL sunt raportaţi cu un fenotip CD5-, CD10-, CD23-;
mulţi pacienţi exprimă CD11c şi CD25, dar spre deosebire de HCL sunt CD103- 2.
▪ Neoplazii limfoide cu celulă B matură care să exprime atât CD5 cât şi CD10 sunt puţin comune.
Acest grup include, în ordinea incidenţei: DLBCL, FL, MCL, CLL/SLL, BL. Evaluarea morfologică şi
studii genetice (rearanjamentele genei BCL-2 în FL, tranlocaţia t(11;14)(q13;q32) sau rearanjamentele
genei CCND1 în MCL, translocaţiile MYC în BL) pot fi necesare pentru stabilirea diagnosticului2.
Expresia CD38 şi ZAP-70 a fost raportată că ar avea valoare prognostică în CLL/SLL. Deşi majoritatea
studiilor au utilizat un cut-off de 30% celule pozitive pentru a determina pozitivitatea expresiei CD38,
unele studii au demonstrat un prognostic advers pentru pacienţii cu expresia CD38 pe 20% sau chiar
mai puţine celule tumorale2. Expresia ZAP-70 a fost arătat că se corelează cu statusul mutaţional al
regiunii variabile a lanţului greu de Ig (IgVH), progresie mai rapidă a bolii şi supravieţuire mai mică5.
Există o serie de dificultăţi tehnice în determinarea statusului ZAP-70, legate de intensitatea relativ
slabă a colorării cu mulţi fluorocromi disponibili comercial, localizarea intracitoplasmatică a marker-
ului care face necesară folosirea de tehnici de permealizare care pot duce la scăderea intensităţii
colorării, prezenţa colorării nespecifice la nivelul celulelor B nonneoplazice, expresia labilă în timp şi
sensibilitatea la diferiţi anticoagulanţi (a fost recomandată utilizarea EDTA şi transportul în maxim 24
ore în laborator). Nu s-a ajuns la un consens în ceea ce priveşte metoda optimă de determinare a
căror celule ar trebui considerate pozitive pentru ZAP-70. Recent au fost propuse câteva sisteme de
calculare implicând media şi mediana intensităţii fluorescenţei ZAP-70 în celulele leucemice, celulele
T, NK şi celulele B normale2.
Neoplaziile limfoide cu celulă T şi NK matură

IFCF poate contribui la diagnosticul şi clasificarea neoplaziilor limfoide cu celulă T şi NK matură,
însă adesea celulele T sau NK anormale fenotipic sunt mai dificil de identificat în comparaţie cu
60
celulele B mature anormale. Pe de altă parte clasificarea neoplaziilor cu celulă T şi NK este mai puţin
bine stabilită decât cea a neoplaziilor cu celulă B şi multe neoplazii rămân în categoria limfomului
cu celulă T periferică, nespecificat (PTCL,U). Clasificarea conform schemei curente nu urmează un
algoritm simplu şi necesită adesea asimilarea de informaţii diverse, incluzând studii morfologice,
imunohistochimice, citometrie în flux, citogenetică, FISH şi teste moleculare2.
Neoplaziile cu celulă T/NK matură (periferică) sunt divizate în leucemice, cutanate şi extraganglionare
şi cele cu origine ganglionară. Majoritatea limfoamelor cu celulă T periferică (PTCL – PTCL,U, limfomul
T angioimunoblastic, limfomul cu celulă mare anaplazică) sunt malignităţi posttimice, care exprimă
TCR α/β, derivate aparent din sistemul imun adaptativ (antigen specific bazat pe receptor). Ele apar
în general în organele limfoide periferice din celule T naive, efectoare (reglatoare CD4+ şi citotoxice
CD8+) sau de memorie. Limfoamele cu celulă NK şi un număr mic de PTCL ce pot fi derivate extratimic
sunt legate de sistemul imun înnăscut (nerestricţionat MHC). PTCL din acest grup (limfomul cu celulă
T hepatosplenic, limfomul cu celulă T subcutanat panniculitis-like, limfomul cu celulă T tip enteropatie)
tind să apară în localizări mucoase şi cutanate, adesea exprimă TCR γ/δ, antigene asociate celulei
NK şi proteine asociate granulelor citotoxice11.
Neoplasmele cu celulă T şi NK matură pot fi identificate prin IFCF pe baza detecţiei expresiei antigenice
aberante, spre deosebire de celulele B neexistând un marker surogat de clonalitate la fel de fidel ca
expresia kappa şi lambda. În plus expresia antigenică aberantă trebuie distinsă de variaţiile fenotipice
normale observate între multiplele subseturi de celule nonneoplazice.
Ocazional expresia antigenică aberantă poate consta în lipsa completă a colorării pentru unul sau
mai multe antigene pan-celulă T, CD5 şi CD7 fiind antigenele cel mai frecvent pierdute. Celulele
neoplazice CD7- trebuie distinse de o populaţie mică de celule T normale CD7- din piele şi sânge care
pot creşte în dermatoze benigne şi alte condiţii reactive.
Mai frecvent neoplaziile T şi NK demonstrează o alterare mai subtilă a colorării pentru antigene decât
lipsa completă a acestora, cele mai frecvente fiind colorarea celulelor T mai intensă sau mai slabă
pentru CD3 sau CD5, colorarea mai slabă a celulelor NK pentru CD2, CD7, CD56 şi CD57, o expresie
intensă mai omogenă a CD8 şi CD16 de către celulele NK.
De asemenea populaţiile de celule T şi NK anormale pot fi recunoscute după expresia de antigene
care nu sunt în mod normal exprimate în aceste linii, spre exemplu antigenele mieloide CD15, CD13
şi CD33 au fost descrise în unele neoplazii cu celulă T matură, putând duce la confuzia cu leucemia
acută mieloidă; celulele NK pot achiziţiona CD5; expresia antigenului celulei B CD20 a fost descrisă
într-un procent mic de neoplazii cu celulă T şi poate fi de asemenea detectată într-un subset mic de
celule T normale.
Evaluarea prin IFCF a expresiei TCR V-β permite identificarea de populaţii restricţionate de celule
T, dar, spre deosebire de testele PCR pentru rearanjamentele genei TCR care pot fi efectuate atât
pe specimene proaspete cât şi îngheţate şi fixate, acest test este laborios şi necesită analizarea de
preferinţă în 24 ore de la recoltare.
Celulele NK nu prezintă expresia TCR, pentru demonstrarea clonalităţii celulelor NK fiind dezvoltată
analiza prin citometrie în flux a expresiei receptoruui NK (NKR), incluzând receptorii pentru Ig ai
celulelor killer (KIR) şi complexul CD94/NKG2, care pot fi de asemenea aplicate celulelor T citotoxice
de memorie din leucemia cu limfocite mari granulare (LGL) cu celule T.
Informaţiile imunofenotipice formează o parte importantă a clasificării neoplasmelor limfoide cu celulă
61
T şi NK matură, acestea putând fi efectuate fie prin citometrie în flux, fie prin imunohistochimie (IHC),
selectarea tehnicii optime depinzând de aspectul care este cercetat. Studiile de IFCF sunt superioare
IHC în distincţia între celulele T şi NK. Anticorpii utilizaţi de IFCF detectează de obicei întregul
complex TCR-CD3, prezent pe suprafaţa celulelor T şi absent de pe suprafaţa celulelor NK, spre
deosebire de IHC care detectează numai componenta epsilon a CD3, neputând distinge între celulele
T şi NK. Celulele CD3- trebuie evaluate în continuare pentru diferenţierea între celulele NK, celulele
T anormale cu lipsa aberantă a CD3 şi celulele T imature. Studiile moleculare care demonstrează
rearanjamentul clonal al genei TCR pot de asemenea confirma linia celulară T.
IFCF permite determinarea expresiei ambelor forme, α/β şi γ/δ, ale TCR, spre deosebire de IHC care
detectează numai forma α/β a receptorului, această distincţie fiind importantă deoarece limfoamele cu
celelă T γ/δ sunt mai agresive.
Expresia CD4 şi CD8 poate fi stabilită atât prin IFCF cât şi prin IHC, IFCF prezentând avantajul
identificării celulelor neoplazice pe baza expresiei aberante a altor antigene şi apoi izolarea lor pentru
caracterizarea în continuare a acestora.
Atât IHC cât şi IFCF pot fi utilizate pentru identificarea diferenţierii NK prin detecţia CD56 şi CD57,
IFCF fiind considerată o tehnică mai sensibilă. În plus IFCF poate detecta CD16 şi ar trebui utilizaţi mai
degrabă anticorpii pentru detecţia izoformei CD16A decât a izoformei 16B asociată granulocitelor.
Coloraţii pentru proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, care identifică majoritatea celulelor
T citotoxice, şi granzima B sau perforina, care indică un fenotip citotoxic activat, pot fi efectuate atât
prin IFCF, cât şi prin IHC. De asemenea coloraţii pentru CD30 şi proteina Alk-1 asociate cu limfomul
cu celulă mare anaplazică (ALCL) sunt mai frecvent efectuate prin IHC, dar sunt disponibile şi prin
IFCF.
CD103, exprimat de un subset de celule T intramucoase normale şi în limfomul cu celulă T asociat
enteropatiei (EATCL), este detectabil prin IFCF2.
Neoplaziile cu ceulă T matură
Expresia CD4 şi CD8 poate fi utilizată pentru formularea unei liste de posibilităţi diagnostice şi
determinarea informaţiilor necesare pentru subclasificarea acestora.
▪ Neoplaziile CD4+/CD8- includ sindromul Sézary/limfomul cu celulă T cutanat (CTCL); leucemia
prolimfocitară cu celulă T (T-PLL); leucemia/limfomul cu celulă T al adultului (ATLL); ALCL; limfomul
cu celulă T angioimunoblastic (AITCL); PTCL, U; rar LGL.
În primul rând vor fi luate în considerare bolile care afectează primar sângele, incluzând sindromul
Sézary/CTCL, ATLL şi T-PLL2.
▫ Sindromul Sézary/CTCL prezintă de obicei CD4+, CD26-, CD7-, cu prezenţa variabilă a
colorării şi intensitate variabilă a CD25, acest fenotip nefiind specific bolii2;5.
▫ ATLL are un fenotip similar sindromului Sézary/CTCL CD4+, CD7-, dar cu o colorare
intensă mai uniformă pentru markerul de activare CD25 (receptorul IL-2). De asemenea aceşti pacienţi
prezintă integrarea clonală a genomului HTLV-12;5;11 .
▫ T-PLL este cel mai frecvent CD4+ (60%), dar poate fi şi CD4+, CD8+ (25%) şi mai rar numai
CD8 (15%). Spre deosebire de CTCL şi ATLL, T-PLL este de obicei CD7+, CD25-, lipseşte pierderea
+
aberantă sau scăderea expresiei altor antigene T şi este de obicei negativ pentru antigene asociate NK
şi pentru proteinele asociate granulelor citotoxice. Diagnosticul trebuie să ia în considerare excluderea
cazurilor rare de LGL CD4+. Studiile citogenetice pot confirma diagnosticul, peste 80% din pacienţii cu
62
T-PLL având fie inv(14)(q11;q32), fie t(14;14)(q11;q32), implicând gena TCL1 şi locusul TCR α/δ2,6.
▫ ALCL afectează primar ganglionii limfatici şi pielea, dar în mod particular poate prezenta
afectarea sângelui periferic. Această entitate includea iniţial toate limfoamele compuse din celule
mari care exprimă uniform CD30 (Ki-1), însă clasificarea OMS curentă include acele cazuri care
exprimă un fenotip T sau nul, excluzând limfoamele cu celulă mare B CD30+. ALCL este de obicei
CD4+, poate exprima CD56, este cel mai frecvent CD2+, dar adesea lipsesc multe alte antigene T,
incluzand CD3, CD5 şi CD7 şi poate exprima antigene mieloide CD13, CD15, CD33, putând duce la
confuzia cu leucemia acută mieloidă. Un diagnostic definitiv poate fi stabilit la pacienţi care exprimă
proteina Alk-1 sau prezintă rearanjamentul genei ALK1 de pe cromozomul 2 la examenul citigenetic
clasic sau FISH2,11. Rearanjamentele ALK sunt prezente la 50-70% din ALCL CD30+, t(2;5) apărând la
aproximativ trei pătrimi din aceşti pacienţi. Expresia Alk subdivide ALCL în 3 subtipuri clinice: a) ALCL
sistemic Alk+, b) ALCL sistemic Alk- şi c) ALCL primar cutanat (de asemenea Alk-). ALCL Alk- poate
fi considerat ca ALCL secundar când urmează mycosis fungoides, papulozei limfomatoide sau bolii
Hodgkin6.
▫ AITCL este de obicei CD4+, CD2+, CD5+, prezintă adesea scăderea expresiei CD7 şi
uneori a CD3. Un subset de celule neoplazice pot fi CD10+, expresia CD10 de către celulele T putând
fi întâlnită şi în ALL cu precursor de celulă T, rar în alte neoplasme cu celulă T matură şi într-un subset
de celule T normale. Aproape toţi pacienţii prezintă celule B EBV pozitive, iar aproximativ o treime
prezintă de asemenea rearanjamente ale genei Ig2,6.
▫ Aşa cum este de aşteptat, fenotipul PTCL,U este heterogen, neoplasmele din această
categorie fiind de obicei CD4+ şi prezentând pierderea aberantă a expresiei CD7 şi CD5. Prin definiţie,
alte entităţi specificate trebuie excluse înaintea stabilirii diagnosticului de PTCL,U2;5. Expresia aberantă
a CD20 a fost raportată în PTCL,U, fiind propus că aceste celule ar putea reprezenta contrapartea
neoplazică a subpopulaţiei mici de celule T CD20+ prezente la persoanele sănătoase7.
▪ Cel mai frecvent neoplasm cu celulă T CD4-/CD8+ este T-LGL. În sângele periferic alte entităţi
care trebuie luate în considerare sunt PTCL,U CD8+, o mică proporţie din PLL şi rar CTCL/sindromul
Sézary. În splină şi alte situsuri extraganglionare diagnosticul diferenţial include şi limfomul cu celulă
T subcutanat panniculitis-like (SPTCL), rar limfomul cu celulă T hepatosplenic (HSTCL) şi limfomul cu
celulă T γ/δ nonhepatosplenic.
▫ T-LGL prezintă un fenotip CD8+, CD3+, frecvent cu scăderea intensităţii pentru CD5 şi
CD7 şi expresia de antigene asociate NK, majoritatea pacienţilor exprimând CD57, mulţi CD16 şi
câţiva sunt CD56+. În plus, sunt exprimate de obicei proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1,
granzima B şi perforina. Deşi majoritatea pacienţilor exprimă TCR α/β, au fost raportaţi şi pacienţi TCR
γ/δ. LGL cu un fenotip NK poate prezenta de asemenea un fenotip CD8+, CD4-, dar lipseşte expresia
complexului CD3-TCR, astfel neintrând în categoria neoplaziilor limfoide cu celulă T matură2,5,6.
▫ SPTCL este un limfom cu celulă T citotoxică rar, de obicei CD8+, prezintă expresia uneia
sau mai multor proteine asociate granulelor citotoxice, este numai focal pozitiv pentru CD56, este de
obicei EBV- şi cel mai frecvent TCR α/β2,11.
▫ HSTCL este de obicei CD4-, CD8-, rar fiind descrişi pacienţi CD8+, care pot fi dificil de
diferenţiat de LGL. În comun cu T-LGL, HSTCL afectează de obicei splina şi poate afecta sângele
periferic, este frecvent CD16+ şi exprimă un fenotip citotoxic nonactivat cu prezenţa TIA-1 şi absenţa
granzimei B şi perforinei, dar diferă de majoritatea LGL prin expresia CD56 şi lipsa CD57, demonstrează
63
absenţa completă a CD5 mai degrabă decât scăderea intensităţii acestuia, cel mai adesea exprimă
TCR γ/δ, exprimă receptori de celulă killer Ig-like (KIR), sugerând derivarea din celule T de memorie,
şi demonstrează frecvent la examenul citogenetic isocromozomul 7q2,11.
▫ Cazuri rare de limfom cu celulă T γ/δ nonhepatosplenic sunt CD8+, dar nu sunt confundate
cu LGL deoarece lipseşte afectarea splinei şi a sângelui periferic2.
▫ O proporţie mică din CTCL sunt CD8+ şi trebuie distinse de limfomul cu celulă T γ/δ
cutanat nonhepatosplenic mai agresiv. CTCL este de obicei negativ pentru proteinele asociate
granulelor citotoxice, dar acestea pot fi prezente în transformarea cu celulă mare a CTCL. Morfologia
şi aspectele clinice rămân criterii importante de diferenţiere2.
▪ Expresia duală CD4+/CD8+ este neobişnuită în limfoamele cu celulă T matură şi trebuie să ducă la
considerarea ALL cu precursor de celulă T.
Cel mai caracteristic neoplasm limfoid cu celulă T matură CD4+/CD8+ este T-PLL. Acesta exprimă
CD3 de suprafaţă şi un set complet de antigene T ca CD2, CD5 şi CD7, lipsesc markerii de imaturitate
CD34, CD10 şi TdT şi demonstrează inv(14)(q11;q32) sau t(14;14)(q11;q32).
Rar pacienţi cu ATLL, LGL şi PTCL,U coexprimă CD4 şi CD82.
▪ Categoria CD4-/CD8- include EATCL, HSTCL, limfomul cu celulă T γ/δ nonhepatosplenic, PTCL,U şi
rar limfomul cu celulă NK/T tip nazal.
▫ EATCL este de obicei negativ pentru CD4, CD8 şi CD5, exprimă CD3 şi CD7, TCR α/
β+, este pozitiv pentru proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B şi perforina, este
CD103+, poate fi CD56+ sau CD56- şi poate exprima CD30, iar aceste cazuri trebuie diferenţiate de
ALCL. Recent EATCL a fost asociat cu achiziţii în cromozomul 9q33-34 ce pot ajuta la confirmarea
diagnosticului. Limfocitele intramucoase din boala celiacă pot demonstra un fenotip similar ca şi
rearanjamente clonale al genei TCR, diagnosticul de EATCL necesitând prezenţa unui infiltrat
distructiv2,5,11.
▫ Limfomul cu celulă T γ/δ nonhepatosplenic demonstrează un fenotip similar HSTCL, dar
de obicei cu un fenotip citotoxic activat: CD4-, CD8-, CD2+, CD3+, CD5-, C56+, în principal CD57-,
TIA-1+, granzima B+, perforina+. Un număr semnificativ din limfoamele mucoase T γ/δ sunt asociate cu
EBV, în timp ce cele cutanate sunt de obicei EBV- 2.
Neoplaziile cu celulă NK matură includ limfomul extraganglionar cu celulă T/NK tip nazal (EN-NK/T-
NT), leucemia agresivă cu celulă NK şi un subset de LGL. Neoplaziile cu celulă NK pot fi localizate
sau diseminate în momentul examinării iniţiale şi majoritatea se comportă agresiv, dar este importantă
diferenţierea LGL cu celulă NK care prezintă un curs mai indolent. Spre deosebire de celelalte
neoplazii cu celulă NK aceasta exprimă adesea CD57 alături de CD56 şi este EBV-.
▫ Limfomul extraganglionar cu celulă T/NK tip nazal tipic este CD4-, CD8-, CD3s-, CD5-, CD2+,
C56 , iar spre deosebire de NK normale este de obicei CD7-, CD16-. Celulele tumorale exprimă lanţul
+
ε al CD3 în citoplasmă şi astfel se colorează pozitiv pentru CD3 la IHC. Celulele exprimă proteinele
asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B şi perforina, iar EBV este prezent în formă epizomală
clonală, respectiv EBER (EBV small encoded RNA) pozitiv, ceea ce implică rolul acestui virus în
patogeneză. Cazurile de EN-NK/T-NT care se prezintă cu alte localizări decât cea nazală clasică (cel
mai frecvent piele, tract gastrointestinal, testicul) , inclusiv ganglionară, dar sunt în rest tipice, sunt
încadrate în aceeaşi categorie2;5;7. EN-NK/T-NT apărut la nivelul pielii trebuie diferenţiat de mycosis
fungoides pleomorfic/transformat, PTCL,U şi neoplaziile hematodermice CD4+, C56+, iar cel apărut la
64
nivel intestinal trebuie diferenţiat de EATCL. Un subset bine recunoscut al EN-NK/T-NT are originea
într-o celulă T citotoxică NK-like, acestea exprimând CD3 de suprafaţă şi prezintă rearanjamente
clonale ale genei TCR. Rămâne problematică clasificarea cazurilor atipice în care lipseşte expresia
CD56 şi proteinelor asociate granulelor citotoxice, precum şi a formelor nonnazale în care lipseşte
dovada implicării EBV, fiind sugerată încadrarea ca limfom cu celulă NK neclasificabil. Clasificarea
OMS a EN-NK/T-NT solicită atât pozitivitatea EBV, cât şi a proteinelor asociate granulelor citotoxice7.
▫ Leucemia cu celulă NK agresivă şi limfomul extraganglionar cu celulă T/NK tip nazal au
un fenotip similar, diferenţierea fiind clinică, limfomul fiind localizat tisular, in timp ce leucemia se
prezintă cu afectare medulară, citopenii şi prezenţa de celule neoplazice circulante, simptome B,
hepatosplenomegalie, teste funcţionale hepatice crescute, însoţite uneori de sindrom hemofagocitic2.
Neoplaziile blastice limfoide includ leucemia acută şi limfomul limfoblastic. ALL şi LL au caracteristici
comune morfologice, imunofenotipice şi citogenetice, distincţia dintre ele fiind considerată de mulţi
arbitrară. Astfel în clasificarea OMS acestea sunt încadrate în categoria leucemie/limfom limfoblastic
cu precursor de celulă B şi T. Deşi unii pacienţi cu LL pot apărea la evaluarea clinică şi morfologică cu
boală localizată, studii sensibile de IFCF şi moleculare evidenţiază frecvent afectarea submicroscopică
a măduvei osoase sau sângelui periferic14. IFCF permite identificarea celulelor imature sau anormale,
distincţia lor de celulele imature prezente în mod normal în măduiva osoasă şi timus, diferenţierea
între ALL şi AML, identificarea liniei celulare B sau T, subtiparea acestora şi urmărirea răspunsului la
tratament, incluzând identificarea responder-ilor precoce şi detecţia bolii minime reziduale2;5.
Utilizarea unui plot CD45 versus lumina dispersată lateral este foarte utilă în identificarea blaştilor,
aceştia prezentând o intensitate scăzută a expresiei CD45 şi lumină dispersată lateral scăzută.
Aceasta permite distincţia de limfocite (CD45 intens), precursorii eritroizi (CD45 negativ), precursorii
neutrofilici şi eozinofilici (lumină dispersată lateral mai crescută) şi monocite (lumina dispersată lateral
mai crescută şi CD45 mai intens). Populaţia blastică este apoi izolată prin “gating” electronic pentru
analiza detaliată a expresiei antigenice. Blaştii neoplazici pot fi similari celulelor normale blocate în
maturaţie şi sunt recunoscute la diagnosticul prin IFCF prin numărul crescut comparativ cu celulele
normale care exprimă acelaşi fenotip dar şi prin expresia frecventă de pattern-uri anormale de
maturaţie, denumite pattern-uri imunofenotipice asociate leucemiei, ce pot fi clasificate în 4 tipuri:
1) expresia aberantă de markeri care nu sunt în mod normal prezenţi pe celulele liniei respective; 2)
expresia asincronă sau fenotipul conţine aspecte neaşteptate pentru stadiul de maturaţie respectiv,
cum ar fi expresia CD20 pe suprafaţa precursorilor de celulă B; 3) supraexpresia şi 4) lipsa expresiei
unor markeri1;2;5.
Distincţia între AML şi ALL este importantă pentru selecţia terapiei corespunzătoare. În ALL CD19 are
sensibilitatea şi specificitatea cele mai mari pentru detecţia liniei B, iar cCD3 pentru detecţia liniei T.
cCD22 sau cCD79a sunt de asemenea markeri sensibili şi specifici pentru linia B2.
Tabel 17.9.5.4: Markeri pentru diagnosticul leucemiei acute limfoblastice8
Linia celulară Antigene

ALL cu precursor de celulă B CD19, CD10, CD79a, TdT, cCD22, HLA-DR, cCD79a
ALL cu precursor de celulă T CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT, cCD3
Leucemia Burkitt CD19, CD10, CD20, CD22, CD79a, sIgG, CD45 intens
65
ALL demonstrează frecvent expresia a 1 sau 2 antigene mieloide, care contribuie la detecţia celulelor
anormale şi nu trebuie să ducă la diagnosticul de leucemie bifenotipică. Mai puţin de 5% din cazuri
prezintă heterogenitate lineală, fie leucemie bifenotipică (expresia de antigene de la mai mult de o linie
de către o singură populaţie de blaşti) sau leucemie bilineală (două populaţii de blaşti din linii diferite).
Atunci când o neoplazie blastică exprimă markeri de la mai mult de o linie, celulele leucemice trebuie
caracterizate complet morfologic, citochimic, imunofenotipic şi citogenetic, iar informaţiile trebuie
cântărite şi, de preferinţă, stabilit un diagnostic de AML sau ALL. Aceeaşi abordare este necesară la
pacienţii care exprimă foarte puţini markeri în încercarea de a minimiza numărul cazurilor din categoria
AL nediferenţiate2.
Este în dezbatere existenţa AL de linie NK, părând a exista un grup denumit leucemie NK/mieloidă,
ce poate avea afectare extramedulară şi poate exprima următorul imunofenotip: CD56+, CD7+, posibil
CD2+, CD13+, CD33+, MPO- şi CD3- (de suprafaţă şi citoplasmatic)2.
Studiile de imunofenotipare au evidenţiat diferenţe minore ale expresiei antigenice în LL cu precursor
de celulă B sau T şi ALL. LL este rar la adult, dar este comun la copii. Aproximativ 90% din LL sunt
de linie T, restul fiind de linie B, foarte rar putând avea originea într-o celulă NK. De obicei LL sunt
TdT pozitive, un marker care distinge acest tip de neoplazie de alte tipuri de limfoame. Un număr mic
de limfocite imature benigne TdT pozitive pot fi întâlnite în sânge şi ganglionii limfatici. CD34 este
de asemenea exprimat de multe LL, fiind util pentru diferenţierea acestora de limfomul Burkitt (BL).
De asemenea LL cu precursor de celulă T sau B poate exprima CD10 sau CALLA (common acute
lymphoblastic leukemia antigen), dar expresia CD10 în T-LL nu a fost asociată cu un prognostic
favorabil ca în T-ALL. LL cu precursor de celulă B, ca şi B-ALL, poate fi împărţit mai departe în 4
subtipuri, pre-B precoce, pre-B, pre-B tardiv (tranziţional) şi B matur, în funcţie de expresia lanţului
greu μ citoplasmatic şi de suprafaţă şi a lanţurilor uşoare de Ig. LL pre-B precoce exprimă CD10,
CD19, CD34 şi TdT. Stadiul de maturaţie pre-B este cel mai frecvent întâlnit şi exprimă CD20 şi lanţul
greu μ citoplasmatic fără Ig suprafaţă detectabile. Cazuri rare de LL cu precursor de celulă B pot
exprima Ig de suprafaţă fără TdT detectabil şi acestea trebuie diferenţiate de BL.
Tabel 17.9.5.5: Aspecte imunofenotipice în limfoamele limfoblastice cu precursor de celulă B şi T14
Subtip CD CD TdT CD CD CD CD CD CD CD CD Expresia Ig

45 34 3 5 7 19 20 22 79a 10
Pre-B + + + - - - + +/- + + + cIgμ-, sIgμ-, κ-, λ-
precoce
Pre-B + +/- + - - - + +/- + + + cIgμ+, sIgμ-, κ-, λ-
Pre-B tardiv + +/- +/- - - - + +/- + + + cIgμ+, sIgμ+, κ-, λ-

(tranziţional)
B matur + +/- +/- - - - + +/- + + + cIgμ+, sIgμ+, κ±, λ±
T + +/- +/- + +/- + - - - - +/-
66
Malignităţile limfoblastice cu precursor de celulă T pot fi de asemenea subdivizate corespunzător cu

stadiile de maturaţie timică normală a celulelor T: precoce (CD7+, cCD3+, CD5+/-, CD2+/-, CD1a-, CD4-,
CD8-), mijlociu (CD7+, CD5+, CD2+, cCD3+, sCD3+/-, CD1a+/-, CD4+/-, CD8+/-), şi tardiv (CD7+, CD5+,
CD2+, cCD3+, sCD3+, CD1a-, CD4+ sau CD8+). Majoritatea cazurilor de LL cu precursor de celulă
T corespund stadiului timic tardiv, ca şi timomul, de care trebuie diferenţiate. Majoritatea LL menţin
expresia antigenelor pan-T, în timp ce în limfoamele cu celulă mare T lipsesc unul sau mai multe din
aceste antigene5;14. Expresia mai frecventă a TCR αβ decât γδ a fost raportată în T-LL faţă de T-ALL.
Unele LL pot prezenta expresia aberantă de antigene mieloide, iar T-LL pot exprima ocazional CD56.
Toate recăderile T-LL trebuie restudiate imunologic deoarece un număr mic de cazuri pot prezenta o
comutare fenotipică la leucemie acută mieloidă14.
ALL la adult sunt în 70% din cazuri cu precursor de celulă B, 25% cu precursor de celulă T şi 5% cu
celulă B matură (celulă Burkitt). Există o incidenţă uşor mai mare a expresiei antigenelor mieloide în
ALL la adulţi decât la copii, comun fiind detectate CD13, CD15 şi CD33. Cazurile rare cu coexpresia
mai multor antigene mieloide şi limfoide pot fi considerate leucemii acute bifenotipice.
Unele aspecte imunofenotipice prezintă valoare prognostică în ALL. Pacienţii cu ALL cu celulă B matură,
caracterizată prin prin expresia lanţurilor uşoare de Ig de suprafaţă, κ sau λ, alături de alţi markeri
comuni ALL de linie B, incluzând CD10, CD19, CD20 şi CD22, răspund prost la terapia standard, în
aceste cazuri fiind stabilite programe de tratament cu doze intensificate ca terapie standard, ceea ce
a dus la o îmbunătăţire semnificativă a supravieţuirii la aceşti pacienţi. De asemenea ALL cu celulă T
era considerată anterior o formă cu prognostic nefavorabil, dar cu programele de tratament moderne,
imunofenotipul T a devenit cu prognostic favorabil. Prin analiza datelor imunofenotipice colectate
prospectiv, grupul de studiu german CALGB a idetificat un subset, caracterizat prin expresia a mai
puţin de 3 markeri de celulă T, cu prognostic nefavorabil. Blaştii leucemici ai acestor pacienţi exprimă
rar markeri de celulă T matură, ca CD1, CD2, CD3, CD4 şi CD8, corespunzând unui imunofenotip de
ALL cu celulă T precoce, de asemenea raportat ca nefavorabil.
Expresia CD34, mai frecventă la adult în ALL de linie B, a fost de asemenea raportată ca având
efect advers, dar aceasta se suprapune atât cu un număr crescut de leucocite, cât şi cu prezenţa
cromozomului Ph, caracterizate de asemenea printr-un efect nefavorabil9.
La copii, ALL cu celulă pre-B precoce cuprinde aproximativ două treimi din cazuri, se asociază cu un
prognostic favorabil, majoritatea fiind CALLA pozitive, expresia acestuia nepărând a avea semnificaţie
prognostică independentă15.
ALL cu celulă pre-B reprezintă ~20% din cazuri. Expresia cIg se asociază cu prezenţa anomaliei
citogenetice t(1;19)(q23;q13), identificată la 20-30% din pacienţii cu ALL cu celulă pre-B şi asociată
cu un prognostic advers la aceşti pacienţi. Restul pacienţilor prezintă rate de supravieţuire similare
ALL cu celulă pre-B precoce15.
ALL cu celulă B matură este rară, cuprinzând 1-2% din cazurile de ALL la copii, la fel ca BL fiind
caracterizată prin morfologie L3 FAB, un fenotip cu CD10, CD19, CD20, CD22, CD79a pozitive şi TdT
negativ, prezenţa t(8;14) sau a unei translocaţii înrudite şi supraexpresia oncogenei c-MYC. Aceşti
copii prezintă vârste mai mari, o incidenţă mai mare a afectării SNC şi răspuns prost la tratamentul
standard8;15.
ALL pre-B tranziţional, caracterizat prin expresia citoplasmatică şi de suprafaţă a lanţurilor grele fără
expresia lanţurilor uşoare de Ig, apare la ~1% din copiii cu ALL, nu se asociază cu morfologia L3 şi cu
67
translocaţiile caracteristice ALL cu celulă B matură şi prezintă o evoluţie favorabilă15.

Unele fenotipuri în ALL se asociază cu prezenţa unor anomalii citogenetice şi moleculare cu
semnificaţie prognostică. Astfel în B-ALL un fenotip CD9+, CD10+, CD19+, CD20- sau numai parţial,
CD34- este un marker sensibil pentru t(1;19)(q23;p13), dar este lipsit de specificitate1. Pe de altă
parte un fenotip CD10-, CD15+, CD24- se asociază cu t(4;11)(q21;q23), rearanjamente ale MLL şi un
prognostic prost2;5.
ALL cu celulă T reprezintă ~15% din cazurile de ALL la copii, asociată anterior cu un prognostic
nefavorabil, dar utilizarea regimurilor terapeutice intensive a rezultat într-o supravieţuire apropiată de
cea a ALL non-T. Celulele leucemice pot fi dublu pozitive pentru CD4 şi CD8. Majoritatea cazurilor de
ALL-T sunt HLA-DR negative. Dintre aceşti pacienţi, cei cu imunofenotipul cel mai puţin matur au o
evoluţie semnificativ mai proastă. Un subset caracterizat prin expresia CD7 şi absenţa CD4 şi CD8 se
asociază cu rezistenţă la chimioterapia convenţională, iar absenţa expresiei CD2 identifică un grup de
pacienţi cu evoluţie proastă.
Aproximativ 10-20% din copiii cu ALL exprimă antigene mieloide, ca CD13 şi CD33, care nu se
asociază cu semnificaţie prognostică adversă conform ultimelor trial-uri, dar pot furniza un element
convenabil pentru monitorizarea bolii minime reziduale8;15.
Expresia CD34 a fost asociată cu efect favorabil independent în ALL de linie B la copii, dar nu şi în
cea de linie T15.
Boala minimă reziduală (MRD)

În prezent majoritatea testelor de citometrie în flux pentru MRD ţintesc să detecteze populaţii
reprezentând 0.01% din evenimente, respectiv o celulă din 104, prin analiza a 500 mii până la 1
milion celule, cu scopul detectării a cel puţin 50-100 evenimente de interes, putând concura astfel
ca sensibilitate cu metodele PCR, citometria în flux prezentând avantajul discriminării între celulele
viabile şi cele moarte şi măsurarea directă a proporţiei celulelor pozitive. Provocarea pentru detecţia
MRD prin IFCF este separarea celulelor leucemice reziduale de celulele nonmaligne, mai ales în
stadiile de regenerare a măduvei osoase în care aceasta poate conţine mai multe forme de maturaţie
precoce. În 1997, Jennings şi Foon au arătat necesitatea utilizării unei prime “porţi” CD45 versus
lumina dispersată lateral (SSC) pentru diferenţierea subseturilor de celule şi, cel mai important, a
celulelor imature/blastice cu SSC şi expresia CD45 scăzute, atât la diagnostic cât şi pentru detecţia
MRD, printre celulele în maturare din măduva osoasă. În 1999, Campana şi Coustan Smith au estimat
că primele 4 combinaţii pentru detecţia MRD în AL la IFCF sunt: 1) CD19/CD34/CD10; 2) CD13/
CD33/CD34; 3) CD13/CD33/CD117; 1) CD13/CD34/CD117, ceea ce presupune că aceste aspecte
imunofenotipice trebuie urmărite la diagnostic. Fenotipul se poate schimba adesea odată cu trecerea
timpului şi în urma tratamentului, astfel testul pentru MRD nu trebuie să se bazeze pe potrivirea
exactă a fenotipului bolii reziduale şi cel al specimenului diagnostic original. Totuşi subsetul de celule
leucemice care persistă menţin aspectul clonal şi continuă să prezinte trăsături omogene. Aceste
celule reziduale apar la studiile prin IFCF ca un grup de celule îngust prezentând un fenotip “îngheţat”
printre celulele în maturare1;2.
Pentru leucemia acută există în general o diferenţă de 1 log între măduva osoasă şi sângele
periferic, cu nivelul cel mai mare de MRD în măduva osoasă. Astfel, ca şi în studiile bazate pe tehnici
moleculare, analiza măduvei osoase poate fi restricţionată la cazurile în care MRD este în mod repetat
68
nedetectabilă în sângele periferic2.

IFCF are un rol stabilit în detecţia MRD în ALL, un rol în actualitate în CLL/SLL şi un rol potenţial în
alte malignităţi hematopoietice şi limfoide.
Câteva studii au demonstrat că MRD detectată prin IFCF este un factor prognostic independent în
ALL pediatrică. Astfel, prezenţa MRD în măduva osoasă în absenţa evidenţei morfologice de boală,
se asociază cu risc mai mare de recădere, iar riscul creşte cu nivelul de boală detectată. Schemele
actuale de clasificare în ALL cu precursor de celulă B încorporează, în afara criteriilor de risc NCI/
Rome, elementele citogenetice, răspunsul precoce şi încărcătura MRD la sfârşitul inducţiei, La adult
datele sunt mai puţine, dar detecţia MRD pare să fie un factor de risc independent pentru recădere.
Aceste informaţii pot asista la identificarea unor pacienţi cu risc crescut care pot beneficia de terapie
adiţională. mai multe studii efectuate au arătat o bună corelaţie între datele obţinute prin IFCF şi
PCR1;2;15.
În ultimul timp, prin utilizarea schemelor de chimio-imunoterapie combinată, pot fi obţinute remisiuni
MRD- în CLL/SLL, iar studiile iniţiale au arătat o durată a răspunsului şi o supravieţuire mai lungi la
pacienţii fără MRD detectabilă. Studiile pentru MRD în CLL pot fi efectuate utilizând sânge periferic.
Totuşi există celule B normale ale sistemului imun înnăscut cu un fenotip asemănător celui al CLL-B.
Pe de altă parte se cunoaşte puţin despre soarta acestor celule normale în urma chimioterapiei pentru
CLL. O procedură de citometrie în flux multiparametrică standardizată publicată recent de Rawstron
et al a fost dezvoltată pentru detecţia MRD la un nivel similar PCR-ului convenţional (1x10-4 sau
0.01%). PCR-ul cantitativ cu oligonucleotide alelă-specifice este mai sensibil, dar necesită generarea
de primer-i specifici pentru pacient şi nu este general disponibil, iar la un nivel de 0.01% se corelează
cu rezultatele IFCF. Astfel IFCF multiparametrică standardizată a fost propusă ca metoda preferată
pentru detecţia MRD în CLL/SLL. Aceasta recomandă 3 combinaţii, respectiv asocierea CD5/CD19
cu CD20/CD38, CD81/CD22 şi CD79b/CD431;2.
Recomandări imunofenotipare sindroame limfoproliferative

• evaluarea limfocitozelor de etiologie neprecizată, la pacienţi care prezintă adenopatii,
transpiraţii nocturne, febră, scădere ponderală, oboseală, infecţii, anemie, tendinţă la
sângerare;
• distincţia între limfocitozele policlonale (reactive, cel mai adesea virale) şi limfocitozele
monoclonale;
• identificarea afecţiunilor limfoproliferative cu celulă B sau T;
• subclasificarea fenotipică a bolilor limfoproliferative cronice;
• distincţia între leucemia limfoblastică acută (LAL) şi leucemia mieloidă acută (LAM);
• subtiparea imunologică a LAL;
• distincţia dintre limfomul malign şi leucemia acută;
• monitorizarea tratamentului;
• depistarea precoce a recidivelor10,12.
Volum probă - 5 mL sânge10.
69

probei10.
sau congelate10.
• Restricţia clasei lanţurilor uşoare de Ig a fost raportată rar în populaţii de celule B reactive non-
clonale, spre exemplu populaţii ce prezintă restricţia lanţului uşor lambda au fost identificate
în boala Castleman multicentrică. Astfel restricţia lanţului uşor de Ig nu este sinonimă cu
monoclonalitatea. De asemenea unele populaţii care prezintă restricţia lanţului uşor şi sunt
monoclonale nu sunt neoplazice, identificate de exemplu în hiperplazia foliculară floridă,
incluzând-o pe cea observată la pacienţii cu HIV. Astfel, rezultatele imunofenotipării trebuie
interpretate în conjuncţie cu alte date clinice, morfologice şi uneori genotipice2.
• La pacienţii fără un diagnostic anterior de neoplazie limfoidă identificarea unei populaţii mici
de celule B anormale fenotipic (mai puţin de 5% din toate celulele analizate) nu trebuie să
ducă la stabilirea unui diagnostic nou decât în corelaţie cu datele clinice, morfologice sau alte
modificări2;11.
• În AL, procentul celulelor imature determinate prin IFCF poate diferi de numărul blaştilor pe
frotiurile din aspiratul medular, aceasta putând avea diferite explicaţii, cum ar fi: diluţia mai mare
cu sânge periferic decât partea utilizată pentru frotiuri, includerea unor precursori imaturi normali
(hamatogonii) la numărătoarea manuală, utilizarea unui numărător diferit pentru determinarea
procentului de blaşti, la numărătoarea manuală aceştia fiind determinaţi ca procent din toate
celulele nucleate, în timp ce la IFCF aceştia sunt determinaţi ca procent din toate celulele analizate
sau din celulele noneritroide (etapa de liză utilizată pentru îndepărtarea celulelor roşii anucleate
îndepărtează de asemenea un număr variabil de precursori eritroizi nucleaţi). De asemenea blaştii
pot fi dificil de recunoscut la numărătoarea manuală sau pot fi distruşi la efectuarea frotiurilor. În
plus celulele mieloide hipogranulare pot avea o lumină dispersată lateral scăzută şi pot intra în
regiunea blaştilor în plot-ul CD45 versus dispersia laterală2.
Bibliografie
1. Béné M, Kaeda J. „How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia:
a review from WP10 and WP12 of the European Leukemia Net”. In Haematologica 2009; 94(8):
1135-50.
2. Craig F, Foon K. „Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms”. In Blood
2008; 111(8): 3941-67.
3. Dillman R. „Immunophenotyping of Chronic Lymphoid Leukemias”. In J Clin Oncol 2008; 26(8):
1193-94.
4. Dong H, Weisberger J, Liu Z, Tugulea S. „Immunophenotypic Analysis of CD103+
70
B-Lymphoproliferative Disorders. Hairy Cell Leukemia and Its Mimics”. In Am J Clin Pathol 2009;
131(4): 586-95.
5. Dunphy C. „Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to Diagnostic
Hematopathology”. In Arch Pathol lab Med 2004; 128(9): 1004-1022.
6. Greer J, Williams M. “Non-Hodgkin Lymphoma in Adults”. In Wintrobe`s Clinical Hematology,
Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams &
Wilkins, 2004, 2164-70.
7. Hasserjian R, Harris N. „NK-Cell Lymphomas and Leukemias”. In Am J Clin Pathol 2007; 127:
860-8.
8. Head D. „Diagnosis and Classification of the Acute Leukemias and Myelodisplastic Syndrome”. In
Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader
B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1811-14.
9. Itakura H, Coutre S. „Acute Lymphoblastic Leukemia in Adults”. In Wintrobe`s Clinical Hematology,
Wilkins, 2004, 1823-24.
10. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.
11. Macon W, McCurley T, Kurtin P, Dogan A. „Systemic Mastocytosis”. In Wintrobe`s Clinical
Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott
Williams & Wilkins, 2004, 2071-95.
12. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care
Organizations. “Leukemia/Lymphoma Immunophenotyping by Flow Cytometry”. www.
mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
13. Morice W, Kurtin P, Hodnefield J, Shanefelt T, Hoyer J, Remstein E, Hanson C. „Predictive Value
of Blood and Bone Marrow Flow Cytometry in B-Cell Lymphoma Classification: Comparative
Analysis of Flow Cytometry and Tissue Biopsy in 252 Patients”. Mayo Clin Proc. 2008; 83(7): 776-
85.
14. Sandlund J, Behm F. „Non-Hodgkin Lymphoma in Children”. In Wintrobe`s Clinical Hematology,
Wilkins, 2004, 2196-97.
15. Whitlock J, Gaynon P. „Acute Lymphoblastic Leukemia in Adults”. In Wintrobe`s Clinical
Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott
Williams & Wilkins, 2004, 2071-95.
16. Wood B et al. „2006 Bethesda International Consensus Recommendations on the Immunophenotypic
Analysis of Hematolimphoid Neoplasia by Flow Cytometry: Optimal Reagents and Reporting for
the Flow cytometric Diagnosis of Hematopoietic Neoplasia”. In Cytometry B Clin Cytom. 2007; 72
Suppl 1: S14-22.
71
17.9.6 ANEXĂ
MODIFICĂRILE ÎNREGISTRATE DE PRINCIPALELE POPULAŢII LIMFOCITARE

ÎN DIVERSE CONDIŢII PATOLOGICE
Creşteri Scăderi
Limfocite T • reactiv la activarea sistemului imun, • infecţie virală sistemică (faza
CD3+ mai ales în faza timpurie a infecţiei târzie/cronică)-deficit imun
920 - 2580/μL virale sistemice (recirculare crescută) celular
61 - 84 % din • în puseu acut al unei boli autoimune • infecţie HIV, tumori maligne
limfocite • în faza precoce a rejetului de • terapie imunosupresivă
transplant • chemo-şi radioterapie
• în limfoame cu celule T • la vârstnici (constituţional)
Celule T helper • semn precoce de activare imună • faza tardivă a infecţiei virale
CD3+/CD4+ (infecţie virală,boală autoimună) sistemice
550 - 1460/μL • sindrom Sezary şi alte limfoame cu • infecţii virale cronice/persistente
32 - 60 % din celule T (HBV, CMV, EBV)
limfocite • adesea, dar nu obligatoriu în • infecţie HIV,leucemie, tumori
sarcoidoză, scleroza multiplă, ciroza • tuberculoză floridă
hepatică, diabet zaharat juvenil, • terapie imunosupresivă
sindrom hiper-Ig E, SLE, artrita prelungită şi chemo-radioterapie
reumatoidă,sindrom Sjogren antitumorală
• vârsta înaintată
• constituţional
Celule T • infecţii virale acute sistemice (celule • infecţie HIV
supresoare efectoare) • faza finală
+ celule T • infecţii virale cronice active (HBV, • leucemie, tumori
citotoxice HCV, CMV, EBV) şi infectţe HIV • terapie imunosupresivă
CD3+/CD8+ • faza precoce mielom multiplu,maladie prelungită şi chemo-radioterapie
280 - 930/μL Behcet, recoltare sânge CD8 CLL antitumorală
23 – 40% din • stress asociat !! • vârsta înaintată
limfocite • constituţional
Celule T • infectţe (faza precoce)) • infecţie (faza tardivă)
citotoxice • activare imună cu citotoxicitate • activare imună cu citotoxicitate
CD3+/CD57+ crescută (ţintă terapeutică) redusă
< 20%
72
Celule T • infecţii (faza tardivă) • infecţie (faza precoce))

reglatoare • activare imună cu citotoxicitate redusă
CD3+/CD57-
<12 %
CD4+/CD8+- • faza precoce a infecţiilor virale • faza târzie a infecţiilor virale
Raport sistemice sistemice
1.0 – 3.0 • puseu acut al unei boli autoimune • infecţia HIV
• reacitv in unele tumori (de ex. stomac) • infecţii cronice persistente
• limfoame cu celule T (CD4+) (virusuri, bacterii intracelulare,
• facultativ, in boli asociate cu infiltrarea paraziţi)-limfopenii CD4+
ţesuturilor cu celule T citotoxice: idiopatice (non-HIV) la vârstă
scleroză multiplă, encefalită, înaintată
cardiomiopatie dilatativă, ciroza
hepatică, fibroză portală, ciroză biliară
primitivă
Limfocite B • infecţie EBV (faza precoce) • defecte imune
CD19+ • limfoame cu celule B (monoclonale) • adesea constituţional, fără
120 – 630/μL • limfocitoze B policlonale (cauza deficit de anticorpi
7 – 21% din neclară)
limfocite
Celule natural • infecţii virale acute sistemice-infecţie• tumori maligne
killer CD3-/ HIV • terapie imunosupresivă
CD16+/CD56+ • limfom cu celule NK (foarte rar) prelungită şi chemo-radioterapie
210 - 740/μL antitumorală
10 – 30% • infecţii virale cronice/persistente
• defecte imune primare/
secundare
• adesea constituţional, mai ales
la vârstă înaintată
• ! ritm circadian
Limfocite Cresc reactiv în limfocitopoeza accelerată, mai rar în boli limfoproliferative;
imature CD3+/ se recomandă control.
CD8+/CD4+
< 5% din
limfocite
73
17.10 ALTE TESTE
17.10.1 Activitatea diaminoxidazei – intoleranţa la histamină
Intoleranţa la histamină este consecinţa unui dezechilibru între histamina acumulată în organism şi
capacitatea de degradare a acesteia. Această afecţiune nu este mediată prin anticorpi IgE, de aceea
testele cutanate şi dozările de IgE specifice vor da rezultate negative1;2.
Histamina este o amină biogenă prezentă în cantităţi variabile în multe alimente. În mod normal
histamina alimentară este rapid detoxifiată de către aminoxidaze; persoanele care prezintă o activitate
redusă a acestor enzime au risc de a dezvolta intoleranţă la histamină. Principala enzimă implicată în
metabolismul histaminei ingerate este diaminoxidaza (DAO), proteină stocată în structurile veziculare
asociate membranei plasmatice a celulelor epiteliale şi eliberată în circulaţie în prezenţa stimulilor
adecvaţi.
Scăderea capacităţii de degradare a histaminei datorită unei activităţi DAO reduse poate determina o
serie de manifestări clinice care mimează o reacţie alergică: diaree, cefalee, urticarie, prurit, flushing,
simptome rino-conjunctivale, bronhospasm, hipotensiune, aritmii cardiace. Intoleranţa la histamină
devine clinic manifestă când organismul este încărcat cu histamină mai mult decât poate cataliza
(consum de alimente bogate în histamină, alcool sau medicamente care eliberează histamină sau
blochează DAO). Bolile alergice precum febra fânului sau sensibilizările la fungi reprezintă o sursă în
plus de histamină care se adaugă la cea din alimente. Cel mai frecvent afectate sunt persoanele de
sex feminin cu vârste între 30 şi 55 ani.
Histamina apare în alimente datorită activităţii bacteriilor, printr-un proces de decaboxilare a
aminoacizilor. De aceea se găseşte în cantităţi mai mari în alimentele fermentate (de exemplu, brânză,
varză murată sau vin) şi bogate în proteine (de ex.exemplu, peşte, carne şi mezeluri). Niveluri foarte
mari se găsesc de asemenea în alimentele alterate2.
Nivelul de histamină creşte odată cu perioada de păstrare a alimentelor de aceea acestea trebuie
pregatite rapid, nu trebuie stocate mult si nu trebuie reîncălzite! Datorită stabilităţii la căldură, histamina
nu poate fi distrusă nici prin congelare, nici prin fierbere, prăjire sau coacere1;2.
În majoritatea cazurilor, deficitul DAO este dobândit ca urmare a unor afecţiuni gastrointestinale care
scad producţia DAO sau a inhibării activităţii enzimatice prin consum de alcool şi diverse medicamente.
Cu toate acestea, studii recente au evidenţiat o mare variabilitate individuală în expresia DAO la
nivelul celulelor epiteliale intestinale şi diverse polimorfisme la nivelul genei DAO asociate cu afecţiuni
gastrointestinale, care demonstrează existenţa unei predispoziţii genetice la un subgrup de pacienţi
cu intoleranţă la histamină.
Pacienţii diagnosticaţi cu deficit DAO pot beneficia de o dietă corespunzătoare care elimină alimentele
cu un conţinut ridicat în histamină. Deoarece alcoolul creşte permeabilitatea intestinală şi prin aceasta
nivelul histaminei în organism, se vor evita băuturile alcoolice la masă. De asemenea antialgicele
(aspirina) facilitează o creştere a permeabilităţii intestinale2.
Alimente cu un conţinut ridicat în histamină
Vinul şi alte băuturi alcoolice
Histamina apare şi în procesul de fermentaţie alcoolică. Bacterii acidifiante ca Pediococcus cerevisiae
74
au fost identificate ca formatoare de histamină. Conţinutul în histamină este un criteriu de calitate

al vinului. În general vinurile roşii au un conţinut ridicat în histamină. Pot fi întâlnite concentraţii de
histamină de până la 3000 µg/l în vinurile care dau în mod caracteristic cefalee.
Conţinutul mediu în histamină:
• Vin roşu: 60-3800 µg/l
• Şampanie: cca 670 µg/l
• Spumos: 15-80 µg/l
• Vin dulce: 80-400 µg/l
• Vin alb: 3-120 µg/l
• Bere: 20-300 µg/l
Peşte
Categoriile de peşte după consumarea cărora apar adesea simptome de intoxicare aparţin familiei
Scombridae (macrou). De aceea în literatura engleză cazurile de intoxicaţie sunt descrise sub
numele de “scombroid poisoning”. Peştii din această familie (mai ales tonul şi macroul) au o cantitate
mare de carne roşie cu un conţinut crescut de histamină. Dar şi la alte tipuri de peşte s-au măsurat
cantităţi crescute de histamină: heringi, sardine şi sardele. Producţia de histamină este influenţată
de temperatura la care este ţinut peştele până la pregătirea sa culinară. În cazurile în care s-au găsit
cantităţi mari de histamină în conservele de ton sau macrou afumat, cercetările au dovedit că peştele
n-a fost transportat în condiţii de refrigerare corespunzătoare sau a fost depozitat inadecvat. În mod
surprinzător s-au găsit cantităţi mai mari de histamină în marinată decât în carnea de peşte.
• Ton: până la 8000 mg/kg
• Macrou afumat: până la 788 mg/kg
• Macrou (conservă): până la 15 mg/kg
• Sardină: până la 1500 mg/kg
• Sardele: până la 180 mg/kg
• Hering: până la 12 mg/kg (mai ales marinat)
Lapte/brânză
În timp ce laptele crud şi cel de băut conţine cantităţi minime de histamină, unele sortimente de
brânzeturi au niveluri ridicate. În general se consideră că nivelul de histamină creşte cu maturarea şi
cu stocarea. Bacteriile incriminate sunt diverşi lactobacili şi streptococi.
• Emmentaler: 10-500 mg/kg
• Stilton (brânza cu muceagai albastru): cca 160 mg/kg
• Gorgonzola: până la 160 mg/kg
• Camembert: 10-300 mg/kg
• Parmezan: 10-580 mg/kg
Carne/mezeluri
Conţinutul în amine biogene în preparatele de carne este foarte divers. Unele sortimente de cârnaţi
pot conţine cantităţi relativ mari de histamină, în timp ce produsele proaspete abia dacă ating niveluri
critice. Dar mai sunt şi alte amine biogene prezente în carne. Cercetările au arătat că diaminele
cadaverina şi putresceina – ambele substraturi pentru DAO – sunt un indicator al prospeţimii cărnii.
• Salam: până la 280 mg/kg
• Cârnaţi cervelat: până la 100 mg/kg
75
• Jambon Westfal: 40-270 mg/kg

Alte alimente
Oţetul din vin roşu conţine până la 4000 µg/L histamină. În cazul ciocolatei conţinutul oscilează între
5-100 mg/kg, după sortiment1.
Medicamente care eliberează histamină sau inhibă DAO
- miorelaxante: pancuroniu, alcuroniu, D-tubocurarină
- narcotice: tiopental
- analgetice şi antiinflamatorii: acid acetilsalicilic, metamizol, antiinflamatorii nesteroidiene,
opioide
- anestezice locale: prilocaină
- anti-hipertensive: verapamil, alprenolol, dihidralazină
- antiaritmice: propafenonă
- diuretice: amilorid
- antiemetice: metoclopramid
- antibiotice: cefuroxime, cefotiam, isoniazid, pentamidin, clavulanic acid, chorochină
- mucolitice: acetilcisteină, ambroxol
- bronhodilatatoare: aminofilină
- antagonişti de receptori H2: cimetidină
- chimioterapice: ciclofosfamidă
- antidepresive: amitriptilină2
Recomandări pentru determinarea activităţii DAO
Testul este indicat la pacienţi cu suspiciune clinică de intoleranţă la histamină (prezenţa a ≥ 2 simptome
tipice cu răspuns favorabil la dieta fără alimente cu conţinut ridicat în histamină) după excluderea altor
afecţiuni gastrontestinale, a mastocitozei sistemice (rezultat negativ pentru triptază) şi a alergiilor
alimentare (teste cutanate şi IgE specifice negative)2.
bacterian1.
de refrigerare1.
Stabilitate probă - serul este stabil 1 săptămână la 4-8°C1.
Metodă – REA (radioextracţie): la proba de ser a pacientului se adaugă putresceina marcată cu
14
C care constituie un substrat cu afinitate înaltă pentru DAO; sub acţiunea DAO putresceina este
converită în delta-pirolină; cantitatea de pirolină obţinută se corelează cu activitatea DAO din serul
pacientului1.
Valori de referinţă – 10.7-34.6 UI/mL1.
Obţinerea unor valori scăzute ale activităţii DAO indică o capacitate enzimatică redusă de degradare
a histaminei.
76
Obţinerea unor valori crescute ale activităţii DAO sunt sugestive pentru o inducere enzimatică în
cadrul unui proces alergic activ.
Obţinerea unor valori ale activităţii DAO la limita inferioară a normalului exclude existenţa unui deficit
genetic; totuşi în cazul încărcării organismului cu histamină, de exemplu prin alergii floride sau
alimentaţie bogată în histamină, pot apărea manifestări clinice (deficit latent)1.
La unii pacienţi cu simptome clinice de intoleranţă la histamină activitatea DAO este normală sau
situată în jurul limitei inferioare a normalului. La aceşti este utilă determinarea histaminei în sânge2.
În timpul sarcinii se pot înregistra valori DAO mult crescute, de aceea nu se recomandă efectuarea
testului la pacientele gravide1.
Bibliografie
2. Laura Maintz, Natalija Novak. Histamine and histamine intolerance. In American Journal of
Clinical Nutrition, vol. 85, No. 5, 1185-1196, May 2007.
17.10.2 Imunoglobulina IgG (subclase 1-4)
La adultul normal, imunoglobulina G (IgG) constituie 75% din cantitatea totală de imunoglobuline,
fiind implicată în răspunsul imun secundar. În cadrul acestei clase de imunoglobuline se disting 4
subclase: IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4, care reflectă existenţa a 4 lanţuri grele H (γ1-γ4) ce sunt similare
dar un identice în ceea ce priveşte secvenţa de aminoacizi şi proprietăţile generale. Astfel, subclasele
prezintă o variabilitate considerabilă a proprietăţii de fixare a complementului, de legare a macrofagelor
şi traversare a placentei (vezi tabelul de mai jos)2;6.
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

Procentul din IgG total 75 15 6 4
Timpul de înjumătăţire în ser (zile) 22 21 7 22
Transfer placentar +++ + +++ +++
Fixarea complementului (calea
++ + +++ -
clasică)
Fixarea complementului (calea
- - - +
alternă)
Legarea la receptorii Fc +++ + +++ -
Tabel: Proprietăţile subclaselor IgG umane
77
Abilitatea de a fixa complementul (legarea de fracţiunea C1q) variază în ordinea IgG3 > IgG1 > IgG2;
subclasa IgG4 este incapabilă de a lega C1q dar poate activa complementul pe calea alternă. Fragmentele
Fc ale IgG1 şi IgG3 se pot lega de receptorii de suprafaţă ai macrofagelor. Subclasele IgG sunt singurele
imunoglobuline care pot traversa placenta; IgG2 sunt mai puţin eficiente în acest sens.
IgG1, IgG2 şi IgG3 apar în cursul răspunsului imun umoral mediat de limfocitele Th1, pe când IgG4
(ca şi IgE) se asociază caracteristic cu răspunsul indus de limfocitele Th2.
Concentraţii scăzute de subclase IgG se pot înregistra în contextul hipogamaglobulinemiei (de
exemplu, hipogamaglobulinemia comună variabilă în care toate clasele de imunoglobuline sunt
scăzute) sau în deficienţe selective, cu afectarea de obicei a IgG2.
Deficitul de IgG1 se produce în special la pacienţii cu deficienţe severe de imunoglobuline care
afectează şi celelalte subclase IgG; pacienţii prezintă de obicei infecţii cu virusul Epstein-Barr.
Deficitul de IgG2 este mai heterogen; poate să apară izolat sau în asociere cu deficitul de IgA sau
de IgA şi alte subclase IgG. Majoritatea pacienţilor cu deficit de IgG2 prezintă infecţii recurente
de tipul sinuzitelor, otitelor şi pneumopatiilor. Copiii cu deficit de IgG2 prezintă adesea un răspuns
umoral specific deficitar faţă de antigenele polizaharidice, cum ar fi antigenele bacteriilor încapsulate:
Haemophilus influenzae tip B şi Streptococcus pneumoniae.
Deficitele izolate de IgG3 şi IgG4 se produc mai rar. Deficitul de IgG3 se asociază cu sinuzită şi otită
medie, iar cel de IgG4 cu ataxie-telangiectazie şi infecţii sinopulmonare4;5.
La pacienţii alergici anticorpii de tip IgG4 produşi ca urmare a imunoterapiei blochează in vitro eliberarea
de histamină IgE-mediată din bazofile. S-a constatat astfel că o imunoterapie eficientă este însoţită de
o creştere a imunoglobulinelor IgG4 alergen-specifice; din acest motiv această creştere, care depinde
de doza administrată, ar putea reprezenta un marker obiectiv pentru răspunsul terapeutic1.
La pacienţii cu dermatită atopică se constată adesea niveluri crescute de IgG4, probabil induse de
stimularea antigenică prelungită. În general, anticorpii IgG4 au fost consideraţi ca având atât efecte
dăunătoare cât şi protectoare. Pe lângă imunoterapie, efectul protector a fost constatat şi în unele
infestări parazitare prin blocarea legării IgE specifice la celulele trigger. Deoarece există o mare
diferenţă între anticorpii IgG4 şi IgE în ceea ce priveşte specificitatea epitopilor, doar o mică fracţiune
din IgG4 alergen-specifice interferă eficient cu legarea IgE de celulele efectoare9.
O entitate clinico-patologică recent descoperită este boala sclerozantă asociată cu IgG4, primul organ
la care a fost descrisă afectarea fiind pancreasul. Este vorba de o afecţiune sistemică caracterizată
prin infiltrarea extensivă a diverselor organe cu plasmocite IgG4 pozitive şi limfocite T. Pot fi afectate
pancreasul, căile biliare, vezica biliară, glandele salivare, ţesutul retroperitoneal, plămânii, rinichii
şi prostata; la nivelul acestor organe se constată fibroză tisulară cu flebită obliterativă. Pancreatita
autoimună descrisă iniţial în Japonia în 1995 nu este o simplă afectare a pancreasului, ci reprezintă
una din manifestările bolii sclerozante asociate cu IgG4. Pe lângă pancreatita autoimună, această
boală include colangită sclerozantă, colecistită, sialoadenită, fibroză retroperitoneală, nefrită tubulo-
interstiţială, pneumonie interstiţială, prostatită, pseudotumoră inflamatorie, limfadenopatie, toate
asociate cu IgG4. Majoritatea bolilor sclerozante IgG4 pozitive asociază pancreatită autoimună, însă
au fost descrise şi cazuri fără afectare pancreatică. Boala apare în special la bărbaţii în vârstă şi
înregistrează un răspuns bun la corticoterapie. Deoarece adesea tabloul clinic iniţial sugerează o
afecţiune malignă, boala sclerozantă trebuie considerată în diagnosticul diferenţial pentru a evita
intervenţia chirurgicală nenecesară. Nivelurile serice crescute de IgG4 pot fi utile pentru stabilirea
78
diagnosticului corect8.
Recomandări pentru determinarea subclaselor IgG - evaluarea pacienţilor cu simptome şi semne
clinice de deficit imun umoral sau combinat; pacienţi hipogamamglobulinemici; pacienţi cu infecţii
recurente şi cu un nivel normal de IgG; pentru IgG4: evaluarea alergiilor şi a desensibilizării prin
imunoterapie4;5; suspiciune de boală sclerozantă asociată cu IgG48.
Cantitate recoltată - minim 2 mL ser3.
bacterian3.
de refrigerare3.
Stabilitate probă - serul este stabil 8 zile la 4-8°C; timp îndelungat la -20°C3.
Metodă – nefelometrică3.
Valori de referinţă
Variază în funcţie de vârstă3:
Vârstă IgG1 (mg/dL) IgG2 (mg/dL) IgG3 (mg/dL) IgG4 (mg/dL)

0-1 an 140-620 41-130 11-85 <0.8
1-1.5 ani 170-650 40-140 12-87 <25.5
1.5-2 ani 220-720 50-180 18-24 <40.8
2-3 ani 240-780 55-200 15-93 0.6-68.9
3-4 ani 270-810 65-220 16-96 1-94
4-6 ani 300-840 70-255 17-97 1.7-115.7
6-9 ani 350-910 85-330 20-104 3-157.7
9-12 ani 370-930 100-400 22-109 4.3-190
12-18 ani 370-910 110-485 24-116 5.2-196.1
>18 ani 280-800 115-570 24-125 5.2-125
Concentraţii scăzute ale tuturor subclaselor sunt întâlnite în imunodeficienţa comună variabilă,
imunodeficienţa combinată, sindromul ataxie-telangiectazie sau alte imunodeficienţe primare sau
dobândite.
O concentraţie scăzută de IgG2 poate fi clinic semnificativă în contextul infecţiilor sinopulmonare
recurente şi se poate asocia sau nu cu un deficit de IgA5.
În cursul imunoterapiei creşterea IgG4 faţă de nivelul bazal indică faptul că sistemul imun al pacientului
răspunde la tratament. În absenţa unei creşteri IgG4 este puţin probabil ca terapia să fie eficientă7.
Ocazional pot fi întâlnite concentraţii uşor scăzute ale uneia sau mai multor subclase de IgG care nu
prezintă de obicei semnificaţie clinică. Rezultatele vor fi interpretate întotdeauna în contextul clinic al
79
pacientului şi al celorlalte analize de laborator5.

Nu se recomandă utilizarea valorilor IgG4 pentru evaluarea statusului atopic4.
● Interferenţe analitice
Prezenţa în proba testată a factorului reumatoid, complexelor imune circulante sau a paraproteinelor
poate interfera cu metoda de lucru şi conduce la rezultate incerte3.
Bibliografie
1. Canonica GW et al. Clinical Outcome Measures of Specific Immunotherapy. In Allergy 2007;

62:317-324.
2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. The Immune System. In Proteins Laboratory Testing and
Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005, 18-19.
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide.
Immunoglobulin G, Subclasses (1-4). www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet
Communication.
5. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Test Catalog. IgG Subclasses
, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
6. Richard A. McPherson, H. Davis Massey. Laboratory Evaluation of Immunoglobulin Function
and Humoral Immunity. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods,
Saunders-Elsevier, 21st Edition, 840.
7. Rossi RE et.al;. Evaluation of serum IgG4 antibodies specific to grass pollen allergen
components in the follow up of allergic patients undergoing subcutaneous and sublingual
immunotherapy. In Vaccine 2007, Jan 15;25(5):957-64.
8. Terumi Kamisawa, Atsutake Okamoto. IgG4-related sclerosing disease. In World J Gastroenterol
2008 July 7; 14(25): 3948-3955.
9. Urbanek R. IgG subclasses and subclass distribution in allergic disorders. In Monogr.Allergy
23,33 (1988).
17.10.3 Neopterin
Neopterinul, D-eritro-6-trihidroxipropil-pterin, este un compus cu greutate moleculară mică produs
de monocite/macrofage, ce serveşte ca marker al activării sistemului imun celular. Este sintetizat
din guanil trifosfat (GTP) sub acţiunea enzimei GTP - ciclohidroxilaza. Interferonul γ, sintetizat de
limfocitele T în cursul răspunsului imun celular stimulează GTP – ciclohidroxilaza determinând
creşterea producţiei de neopterin. Prin urmare, măsurarea concentraţiilor de neopterin în fluidele
corpului furnizează informaţii despre activarea celulelor T helper. Este eliminat în principal prin urină,
80
astfel încât determinarea nivelelor urinare poate fi utilă în evaluarea răspunsului imun celular, chiar
şi în absenţa simptomelor clinice tipice, deoarece studiile au arătat o corelare între evoluţia bolii şi
concentraţiile urinare.
Creşterea producţiei de neopterin se întâlneşte în infecţiile virale, inclusiv virusul imunodeficienţei
umane (HIV), infecţiile determinate de bacterii şi paraziţi intracelulari, boli autoimune (artrita reumatoidă
şi lupus eritematos sistemic), boli maligne şi în episoadele de rejet de grefă. Concentraţiile plasmatice
de neopterin pot fi utilizate ca indicatori de prognostic pentru anumite tipuri de tumori maligne şi
la persoanele infectate cu HIV, nivelele ridicate fiind asociate cu o perioadă de supravieţuire mai
redusă.
O altă aplicaţie a determinării neopterinului este evaluarea pacienţilor cu transplant de organ în scopul
recunoaşterii precoce a complicaţiilor imunologice. Măsurarea valorilor serice de neopterin este, de
asemenea, utilă pentru monitorizarea tratamentului pacienţiilor cu afecţiuni autoimune şi cei infectaţi
cu HIV.
Screeningul donatorilor de sânge permite detectarea infecţiilor acute şi îmbunătăţeşte siguranţa
transfuziilor de sânge.
Sinteza crescută de neopterin este asociată cu creşterea producţiei de specii reactive de oxigen şi cu
concentraţii plasmatice scăzute de antioxidanţi, ca alfa-tocoferolul. Prin urmare, măsurarea valorilor
serice de neopterin reprezintă o evaluare a gradului de activare a sistemului imun celular, dar şi o
estimare a stresului oxidativ2;3;4.
Recomandări pentru determinarea neopterinului
- infecţii virale (HIV), bacteriene (TBC), parazitare (malarie);
- boli autoimune şi inflamatorii (artrita reumatoidă, LES, boala Crohn, colita ulcerativă);
- tumori maligne (ginecologice, hematologice, pulmonare, prostatice, gastrointestinale);
- complicaţii imunologice (rejetul de grefă);
- monitorizarea terapiei imunomodulatoare cu citokine sau a tratmentului antiviral sau
antibacterian în infecţiile cu HIV sau cu Mycobacterium tuberculosis2,3.
Cantitate recoltată - 1 mL1.
Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat/lipemic/contaminat bacterian1.
Stabilitate probă - serul separat este stabil 1 lună la -20°C1.
Metodă - imunoenzimatică (EIA)1.
Valori de referinţă - < 2.5 μg/L1.
Interpretarea rezultatelor4.
În infecţiile virale nivelul seric de neopterin începe să crească înainte de apariţia primelor simptome şi a
anticorpilor serici. Concentraţia plasmatică se corelează cu evoluţia bolii, scăzând după seroconversie
şi revenind în intervalul de referinţă în perioada de convalescenţă. 96% din pacienţii cu hepatite virale
prezintă valori plasmatice ridicate.
La pacienţii cu infecţie HIV concentraţia serică de neopterin creşte în faza acută, dar spre deosebire
de restul infecţiilor virale, aceasta nu revine în limitele intervalului de referinţă nici după seroconversie.
81
La 80% dintre bolnavii infectaţi cu HIV, faza asimptomatică este caracterizată de valori plasmatice
crescute. Pe măsură ce boala avansează concentraţia creşte, înregistrând valori serice şi urinare
maxime în stadiul de SIDA. Măsurarea concentraţiilor de neopterin are o valoare deosebită pentru
monitorizarea evoluţiei şi tratamentului pacienţilor infectaţi cu HIV.
Nivelele plasmatice de neopterin înregistrează creşteri în infecţiile cu microorganisme intracelulare,
cum ar fi tuberculoza, lepra, malaria şi schistosomiaza. Neopterinul poate fi folosit ca marker al
monitorizării tratamentului, deoarece concentraţia acestuia răpunde rapid la modificările apărute în
evoluţia bolii.
Determinarea valorilor serice de neopterin este utilă în diagnosticul diferenţial al infecţiilor virale şi
bacteriene, deoarece nivelul plasmatic al neopterinului înregistrează valori normale sau uşor crescute
în afecţiunile bacteriene, în timp ce în cele virale concentraţiile sunt marcat ridicate.
La pacienţii cu traume multiple sau postoperator, neopterinul este un indicator important pentru
monitorizarea complicaţiilor septice. S-a constatat că, bolnavii cu sepsis care au decedat aveau nivele
serice mult mai ridicate decât pacienţii supravieţuitori.
Persoanele cu boli autoimune sau inflamatorii (artrita reumatoidă, LES, boala Crohn, colita ulcerativă)
prezintă valori crescute de neopterin în ser, ce se corelează cu gradul de activitate al bolii şi mai puţin
cu stadiul.
Deoarece, neopterinul este sintetizat de celulele sistemului imun, acesta nu este un marker tumoral
propriu-zis. Activarea limfocitelor T, probabil cauzată de prezenţa celulelor tumorale, determină
eliberarea de citokine, activarea macrofagelor şi sinteza de neopterin. Semnificaţia clinică a
determinării neopterinului depinde de localizarea tumorii maligne, astfel aproape toate bolile maligne
hematologice înregistrează valori crescute, în timp ce tumorile solide, cum ar fi cancerul mamar,
prezintă rareori nivele ridicate de neopterin. În general, concentraţia serică de neopterin se corelează
direct proporţional cu gradul de extensie şi masa tumorală, fiind folosit, din acest motiv, în monitorizarea
evoluţiei şi prognosticului bolii maligne.
Neopterinul poate fi folosit în evaluarea complicaţiilor (rejetul de transplant şi infecţii virale), ce pot
apărea după transplant, prin determinări zilnice. Creşterea valorilor serice de neopterin (înainte
de apariţia manifestărilor clinice) începând din ziua 2 şi până în ziua a 7 a este sugestivă pentru
complicaţiile post-transplant, dar investigaţii suplimentare sunt necesare pentru a stabili un diagnostic
corect. Aplazia, ce poate apărea în transplantul de măduvă hematogenă, se asociază cu nivele
plasmatice scăzute de neopterin. Concentraţia serică poate creşte considerabil în infecţiile virale sau
în reacţia de respingere a grefei.
Neopterinul poate fi de asemenea util în screening-ul donatorilor de sânge. Avantajul folosirii unui
astfel de test nespecific este faptul că, acesta poate exclude persoane cu afecţiuni diverse (infecţii
virale, bacteriene, boli autoimune, diferite tipuri de afecţiuni maligne)3.
Bibliografie

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Neopterin,
Serum Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
3. Lothar Thomas. Neopterin. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical
82
Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998,
707-710.
4. Murr C, Widner B, Wirleitner B, Fuchs D. Neopterin as a marker for immune system activation.
In Curr Drug Metab. 2002 Apr;3(2):175-87
17.10.4 QuantiFERON-TB Gold Test
Tuberculoza (TBC) reprezintă o boală infecţioasă respiratorie contagioasă produsă de bacteriile
incluse în complexul Mycobaterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis şi M. africanum).
Infecţia tuberculoasă cuprinde atât forme active cât şi latente; tuberculoza latentă se produce atunci
când o persoană devine expusă la M. tuberculosis, iar organismul controlează infecţia dar nu reuşeşte
să o eradicheze. Se estimează că aproximativ 10% din persoanele cu tuberculoză latentă vor progresa
în cursul vieţii către o formă activă. Printre cauzele associate cu reactivarea infecţiei latente se numără
infecţia HIV şi tratamentele cu antagonişti de TNFα. Din acest motiv, diagnosticarea tuberculozei
latente reprezintă o etapă importantă în prevenirea reactivării infecţiei în special la persoanele cu risc
crescut. Tratamentul tuberculozei latente poate reduce semnificativ riscul de progresie către formele
active5.
QuantiFERON TB, dezvoltat de firma Cellestis Limited (Australia), a fost aprobat de FDA în mai 2005
ca test in vitro cu utilitate în diagnosticul infecţiei cu Mycobacterium tuberculosis, atât pentru forma
latentă cât şi pentru cea activă. În Comunitatatea Europeană testul a fost certificat pentru a fi folosit în
aceleaşi situaţii în care este indicat testul la tuberculină.
Până nu demult, IDR la tuberculină a reprezentat singura metodă de diagnostic a infecţiei TBC. Deşi
larg folosit testul la tuberculină prezintă o serie de limitări. În cazul QuantiFERON-ului, care este un
test de laborator efectuat din sînge, stimularea limfocitelor cu antigenele TBC are loc în tubul de
flebotomie şi nu intradermic. Din acest motiv se exclude efectul de “booster” care poate să apară
în cazul testului la tuberculină (efectuarea unui test cutanat la o persoană care nu a fost expusă
la infecţia TBC stimulează sistemul imun şi-l determină să reacţioneze la tuberculină într-o etapă
ulterioară, când se repetă testul cutanat).
Spre deosebire de IDR la tuberculină, rezultatele testului nu sunt influenţate de vaccinarea BCG;
infecţiile în antecedente cu mycobacterii netuberculoase exercită de asemenea o influenţă mai
redusă. Sunt eliminate şi reacţiile adverse de hipersensibilitate care pot să apară în cazul testului
cutanat. De asemenea rezultatele la QuantiFERON TBC test sunt mult mai obiective, fără să intervină
erori în citire şi interpretare1;4;5.
Indicaţiile testului:
1. Poate fi folosit în toate situaţiile în care este utilizat în mod obişnuit testul la tuberculină:
- suspiciune clinică şi radiologică de tuberculoză activă;
- contacţii pacienţilor cu forme contagioase de TBC;
- screening-ul persoanelor cu risc crescut: personalul din unităţi sanitare şi
83
instituţii de îngrijire, persoane provenite din medii cu igienă deficitară, etc1;4;5.

Un studiu din 2008 a indicat faptul că testul poate fi aplicat şi copiilor peste 2 ani în scopul
diagnosticării tuberculozei latente, cu aceleaşi caracteristici de performanţă ca şi la adulţi2.
Menţiune: QuantiFERON TBC înlocuieşte testul la tuberculină; nu trebuie folosite
concomitent ambele teste1;4;5.
2. Poate constitui un instrument pentru monitorizarea pacienţilor cu tuberculoză
activă. Există unele studii care indică potenţiala utilitate a testului în evaluarea eficienţei
tratamentului tuberculostatic prin urmărirea cantităţii de interferon gamma eliberate care se
modifică în timp6.
Conform unui studiu, evaluarea prin QuantiFERON la 2 luni de la iniţierea terapiei poate
avea valoare predictivă semnificativă asupra probabilităţii ca la sfârşitul fazei intensive de
tratament culturile din spută să rămână pozitive3.
3. Poate fi folosit înaintea unei terapii imunosupresoare (de exemplu cu anticorpi anti-TNFα)
sau înaintea transplantului de organe pentru a exclude o infecţie latentă cu M. tuberculosis1;4.
Pregătire pacient - se va întrerupe terapia imunosupresoare (citostatice) cu cel puţin 14 zile înaintea
recoltării4.
Recipient de recoltare - vacutainer cu heparinat de litiu4.
Volum probă - minim 10 mL sânge heparinat4.
Stabilitate probă - sângele trebuie să ajungă în 12 ore (maxim 16 ore) la laboratorul la care se
efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată
refrigerarea probei4.
sau congelate4.
Metodă
Sângele heparinat al pacientului se incubează timp de 24 ore împreună cu un amestec de peptide
sintetice ce simulează cele 3 proteine specifice pentru M. tuberculosis : ESAT- 6, CFP- 10 şi TB 7.7 (p4).
Aceste proteine sunt produse de toate tulpinile de Mycobacterium tuberculosis şi de tulpinile patogene
de Mycobacterium bovis, dar nu şi de către tulpinile incluse în vaccinul BCG. Astfel, QuantiFERON
este mai specific decât testul la tuberculină în detectarea infecţiei cu M. tuberculosis. Dacă în proba
de sânge sunt limfocite T cu memorie pentru aceste proteine (ceea ce se întâmplă şi în cazul unei
infecţii cu mulţi ani în urmă), aceste celule vor produce γ-interferon în contact cu antigenul specific.
Determinarea cantitativă a γ-interferonului eliberat în plasmă se face printr-o metodă imunoenzimatică
înalt sensibilă (ELISA). Se utilizează obligatoriu controale pozitive şi negative pentru a asigura
validitatea testului. Controlul pozitiv este reprezentat de fitohemaglutinină (substanţa mitogenă) iar
controlul negativ de ser fiziologic (folosit ca un blank pentru a măsura nivelul bazal de γ-interferon).
Cantitatea de γ-interferon eliberată este exprimată în UI/mL1;4.
Rezultat negativ (cantitatea de γ-interferon eliberată < 0.35 UI/mL)
În condiţiile date se poate exclude o infecţie cu Mycobacterium tuberculosis. Totuşi, la pacienţii cu
infecţie cronică HIV sau alte cauze care dau o imunodeficienţă severa (tratament imunosupresor,
anumite afecţiuni hematologice: leucemii, limfoame, anumite tumori solide: pulmonare sau din
84
regiunea cap-gât, diabet, silicoză, insuficienţă renală cronică) trebuie luat în considerare statusul imun
actual şi utilizate şi alte metode de diagnostic al infecţiei1;4.
Un studiu recent efectuat în Japonia indică faptul că QuantiFERON TB test este mai util în
diagnosticarea infecţiei tuberculoase la pacienţi imunodeprimaţi decât testul la tuberculină. Totuşi,
având în vedere faptul că s-a obţinut o rată crescută de rezultate neconcludente la pacienţii cu
limfopenie care primesc tratament imunosupresor rezultatele trebuie interpretate cu prudenţă la
această categorie de pacienţi7.
În cazul unui rezultat negativ la persoanele care au venit recent în contact cu pacienţi diagnosticaţi
cu forme de TBC contagios acesta va fi confirmat printr-un nou test efectuat la 6-8 săptămâni de la
sfârşitul perioadei de expunere (ca şi în cazul testului la tuberculină)1;4.
Rezultat pozitiv (cantitatea de γ-interferon eliberată ≥ 0.35 UI/mL)
Un rezultat pozitiv indică o infecţie cu M. tuberculosis. În majoritatea cazurilor, diferenţierea dintre o
infecţie latentă şi una activă nu este posibilă cu acest test.
În cazul suspiciunii clinice de tuberculoză activă rămân valabile toate metodele de diagnostic
microbiologic (microscopie, cultură) şi de biologie moleculară1;4.
Rezultat neconcludent
Apare în situaţia în care nu s-au obţinut criteriile de validare fie a controlului pozitiv mitogen (răspuns
inadecvat < 0.5 UI/mL), fie ale controlului negativ (nivel bazal crescut al γ-interferonului). În condiţiile
în care recoltarea şi transportul probei s-au efectuat în condiţii adecvate, lipsa de validare a controlului
mitogen indică cel mai probabil o imunosupresie severă cauzată de SIDA şi tratamentul curent cu
medicamente imunosupresoare (corticosteroizi în doze mari, antagonişti ai TNFα, medicamente
folosite la pacienţii cu transplant de organe)1;4.
Limite
Valoarea predictivă a testului depinde de prevalenţa infecţiei cu M. tuberculosis în populaţia testată.
Fiecare rezultat trebuie interpretat în contextul clinic şi epidemiologic al pacientului1.
Bibliografie
1. Gerald H. Mazurek, MD, John Jereb, MD, Phillip LoBue, MD, Michael F. Iademarco, MD, Beverly
Metchock, PhD, Andrew Vernon, MD. Guidelines for Using the Test for Detecting Mycobacterium
tuberculosis Infection, United States. Division of Tuberculosis Elimination, National Center for
HIV, STD, and TB Prevention. MMWR 2005; 54 (No. RR-15).
2. Jennifer Lighter, MD, Mona Rigaud, MD, MPH, Roger Eduardo, BS, Chia-Hui Peng, MPH and
Henry Pollack, MD. Latent Tuberculosis Diagnosis in Children by Using the QuantiFERON-TB
Gold In-Tube Test. In Pediatrics Vol. 123 No. 1 January 2009, pp. 30-37.
3. Katiyar, S.K.; Sampath, A.; Bihari, S.; Mamtani, M.; Kulkarni, H. Use of the QuantiFERON-
TB Gold In-Tube® test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. In The
International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Volume 12, Number 10, October 2008 ,
pp. 1146-1152(7).
5. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide.
QuantiFERON®-TB Gold www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
85
6. R. Markova, R. Drenska, Y. Todorova, V. Terzieva and D. Stefanova. Monitoring the efficacy

of anti-TB therapy by using the QuantiFERON-TB Gold In tube test. In European Respiratory
Review, 2008;17: 74-75.
7. Y. Kobashi, K. Mouri, Y. Obase, M. Fukuda, N. Miyashita and M. Oka. Clinical evaluation of
QuantiFERON TB-2G test for immunocompromised patients. Division of Respiratory Diseases,
Dept of Medicine, Kawasaki Medical School, Kurashiki, Japan, 2008.
86
TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
18
18 TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
18. TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

18.1 TESTE DE GENETICĂ UMANĂ
18.1.1 AFECŢIUNI HEMATOLOGICE
18.1.1.1 Mutaţia factorului V Leiden - detecţie şi genotipare
Informaţii generale şi recomandări

Trombofilia reprezintă o condiţie ereditară sau dobândită asociată cu o predispoziţie individuală faţă
de evenimente trombotice.
Principalele manifestări clinice generate de trombofilie sunt: boala tromboembolică, avorturile
recurente de cauză incertă, complicaţii ale sarcinii (preeclampsie, retard de creştere intrauterină,
apoplexia uteroplacentară, moartea fătului în uter, naştere prematură), sindroamele coronariene acute
(angina instabilă, infarct miocardic), necroza aseptică de cap femural.
Trombofilia trebuie suspectată în următoarele situaţii clinice: evenimente trombotice survenite la
pacienţi tineri (<50 ani), tromboze recurente, antecedente familiale de afecţiuni tromboembolice,
complicaţii multiple ale sarcinii, tromboze venoase în teritorii anatomice “neobişnuite”: vena portă,
vene hepatice, mezenterice, cerebrale etc.
Până la 70% dintre pacienţii diagnosticaţi cu o forma de trombofilie prezintă unul sau mai multe
defecte genetice majore. Dintre acestea, factorul V Leiden şi mutaţia G20210A a protrombinei sunt
responsabile pentru mai mult de jumătate din cazurile de trombofilie ereditară. Aceste mutaţii sunt
relativ recent descoperite (din 1994) şi au la baza substituţii nucleotidice unice, care pot fi detectate în
prezent prin tehnici moleculare6.
Factorul V Leiden constituie o variantă anormală a factorului V ce devine rezistent la acţiunea proteinei
C activate (APC). Este generat de o mutaţie punctiformă a genei de pe cromozomul 1q23 care codifică
sinteza factorului V, prin substituţia guaninei (G) cu adenina (A) în poziţia 1691. În produsul proteic,
substituţia nucleotidică se exprimă prin înlocuirea argininei din poziţia 506 cu glutamina (mutaţia
R506Q). Factorul V astfel modificat este denumit factor Leiden, alterarea constând în modificarea
situsului de legare a APC.
Ca urmare a acestei mutaţii, factorul V Leiden este inactivat de 10 ori mai lent decât cel normal şi
persistă mai mult timp în circulaţie, cea ce conduce la o generare crescută de trombină şi astfel, la
hipercoagulabilitate2;3.
Analizele genetice au indicat faptul că această mutaţie este responsabilă de 85-90% din cazurile de
rezistenţă la APC4.
Mutaţia este transmisă autozomal co-dominant şi este prezentă la aproximativ 3-7% din populaţia
caucaziană, fiind astfel cea mai frecventă cauză de trombofilie ereditară2.
Aceasta mutaţie a fost confirmată la pacienţi cu tromboză venoasă profundă, embolie pulmonară,
ocluzia venei centrale a retinei, tromboza sinusurilor cerebrale şi tromboza venelor hepatice. Mutaţia
este depistată la 10-20% dintre pacienţii aflaţi la primul episod de tromboză venoasă. De asemenea,
40% din pacienţii <50 ani aflaţi la primul episod de tromboză venoasă şi 60% din pacientele gravide
cu tromboză venoasă sunt purtători ai acestei mutaţii.
Riscul de tromboză depinde de statusul homozigot sau heterozigot pentru această mutaţie. Indivizii
88
18
heterozigoţi au un risc de tromboză de 4-8 ori mai mare decât persoanele cu factor V normal, în timp
ce homozigoţii prezintă un risc de 80-100 ori mai mare5.
Riscul creşte exponenţial la persoanele care asociază şi alţi factori de risc trombotic, cum ar
fi: coexistenţa altor defecte genetice (deficit de proteină C, S, antitrombină III, mutaţia genei
protrombinei, mutaţia genei care codifică metilentetrahidrofolat reductaza -MTHFR- şi se asociază cu
hiperhomocisteinemie), consumul de anticoncepţionale orale, sarcina5;6.
Astfel, tromboza venoasă profundă şi tromboza sinusurilor cerebrale apar mai frecvent la pacientele
care iau anticoncepţionale orale, gravide sau aflate în perioada postpartum6.
Middendorf şi colaboratorii săi au efectuat un studiu (2004) despre rolul factorului Leiden la pacienţii
cu infarct miocardic. Concluziile studiului au fost că pacienţii care prezintă mutaţia factorului V Leiden
au o predispoziţie pentru infarctul miocardic iar factorii tradiţionali de risc pentru boala coronariană ar
avea un rol mai puţin important la aceşti pacienţi2.
În ceea ce priveşte complicaţiile sarcinii, prezenţa factorului V Leiden, ca şi cea a mutaţiilor genelor
protrombinei şi MTHFR, se asociază cu un risc crescut de pierderi recurente de sarcină, în special în
trimestrele II şi III1.
Screening-ul membrilor asimptomatici în familiile la care s-a depistat mutaţia nu este recomandat pe
scară largă, datorită riscului scăzut de tromboze venoase letale. Cu toate acestea, investigarea poate
aduce beneficii în situaţiile în care se au în vedere sarcina sau administrarea de contraceptive orale,
la persoanele care au antecedente familiale de tromboze venoase recurente apărute la vârste < 50
ani. Persoanele care solicită testarea şi cele care obţin un rezultat pozitiv trebuie informate în legătură
cu implicaţiile diagnosticului şi cu semnele sau simptomele care necesită intervenţie medicală de
urgenţă2;6.
Testul efectuat în laboratorul Synevo utilizează tehnica real-time PCR pe instrumentul LightCycler
pentru detecţia şi genotiparea mutaţei factorului V Leiden, la pacienţii cu suspiciune clinică de
trombofilie4.
Cantitate recoltată - cât permite vacuumul4.
Cauze de respingere a probei - folosirea heparinei ca anticoagulant4.
Stabilitate probă - 7 zile la 2-8ºC4.
Metodă - Real-time PCR (LightCycler): reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a
produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise; la sfârşitul ciclurilor de amplificare se
efectuează genotiparea, prin analiza curbei de topire4.
Pentru un pacient, se raportează unul din cele 3 rezultate posibile:
- genotip sălbatic homozigot (negativ pentru mutaţia factorului V Leiden);
- genotip heterozigot (conţine o alelă sălbatică şi una mutantă pentru factorul V);
- genotip mutant homozigot (conţine ambele alele mutante)4.
La nivelul genei factorului V, pe lângă mutaţia factorului V Leiden în poziţia 1691, mai sunt posibile alte
3 mutaţii: 1692, 1689 şi 1696. La genotipare, aceste mutaţii rare vor conduce la un rezultat fals-pozitiv
89
(genotip heterozigot sau mutant homozigot). Deoarece numai mutaţia factorului V Leiden se asociază
cu o rezistenţă crescută la proteina C activată, toţi pacienţii care prezintă un rezultat pozitiv la testul
PCR vor trebui să efectueze un test funcţional (de coagulare) pentru a evalua rezistenţa la proteina C
activată, în cazul în care acest screening nu s-a efectuat anterior4.
Bibliografie
1. Ann M. Gronowski. Pregnacy Loss. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During

Pregnancy, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2004, 341.
2. Donna M. Shaw. Factor V Leiden: An Overview. In Clin Lab Sci 2006; 19(4): 218.
3. E. Urleţeanu, Ghe. Bacalbaşa, I. Urleţeanu. Trombofiliile-implicaţii obstreticale. În Obstretica
nr.5/2006.
5. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Factor V Leiden
Mutation Analysis. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
6. Richard D. Press. Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) testing for diagnosis and
management of thromboembolic disorders. In Arch Pathol, nov.2002.
18.1.1.2 Mutaţia factorului II (protrombinei) - detecţie şi genotipare

Mutaţia genei protrombinei a fost descoperită în 1996 de către Poort şi colaboratorii săi. Aceasta se
datorează unei substituţii nucleotidice (guanina G este înlocuită cu adenina) la nivelul perechii de baze
20210, situaţă în regiunea 3’ netranslatată a genei factorului II4. Mutaţia se asociază cu niveluri de
protrombină mai mari cu 30% decât normalul, care vor induce o stare de hipercoagulabilitate uşoară,
ce poate predispune la tromboză venoasă3.Trombofilia reprezintă o condiţie ereditară sau dobândită
asociată cu o predispoziţie individuală faţă de evenimente trombotice.
Prevalenţa mutaţiei în populaţia caucaziană este în medie de 2%, cele mai multe cazuri înregistrându-
se în ţările Europei de Sud. Indivizii heterozigoţi au un risc de tromboză de 3 ori mai mare decât
persoanele cu factor II normal; la homozigoţi magnitudinea riscului nu a fost pe deplin stabilită3;4
După mutaţia factorului V Leiden, mutaţia protrombinei reprezintă a 2-a cauză de trombofilie ereditară,
fiind demonstrată în ~ 20% din cazuri. Astfel, aceasta mutaţie a fost confirmată la pacienţi cu
tromboză idiopatică a venei porte sau a sinusurilor cerebrale, paciente cu tromboze venoase în cursul
administrării contraceptivelor orale, precum şi la gravide care prezintă complicaţii ale sarcinii (retard
de creştere intrauterină, apoplexie utero-placentară). Mutaţia este depistată la 6-8% dintre pacienţii
aflaţi la primul episod de tromboză venoasă3. S-a constatat de asemenea că riscul de tromboză
venoasă profundă este de 16.3 ori mai mare la pacientele care folosesc contraceptive orale şi sunt
purtătoare ale mutaţiei, în comparaţie cu lotul martor. În perioada sarcinii şi post-partum, prezenţa
90
18
mutaţiei conferă un risc de 15.2 ori mai mare decât cel estimat la aceeaşi categorie de paciente în
absenţa defectului genetic, iar la femeile care primesc terapie hormonală de substituţie în perioada
postmenopauză se înregistrează o creştere a riscului de 2-4 ori4.
În plus, riscul de tromboză venoasă creşte la persoanele care asociază şi alte defecte genetice, în special
mutaţia factorului V Leiden. Un procent de până la 40% din indivizii care prezintă mutaţia protrombinică
asociază concomitent şi mutaţia factorului V Leiden; studiile au demonstrat că în aceste cazuri creşte
riscul de tromboză venoasă recurentă după un prim episod trombotic. Acest fapt subliniază necesitatea
analizei ambelor mutaţii la pacienţii cu suspiciune de trombofilie ereditară3;4.
În ceea ce priveşte complicaţiile sarcinii, prezenţa mutaţiei genei protrombinei ca şi cea a factorului
V Leiden şi MTHFR (metilentetrahidrofolat reductaza), se asociază cu un risc crescut de pierderi
recurente de sarcină, în special în trimestrele II şi III1.
Deşi mutaţia protrombinică nu a fost asociată cu tromboze arteriale (infarct miocardic, AVC) aceasta
poate interacţiona cu alţi factori de risc cum ar fi fumatul şi hipertensiunea, crescând riscul de
evenimente trombotice4.
Screening-ul membrilor asimptomatici în familiile la care s-a depistat mutaţia nu este recomandat pe
scară largă, datorită incidenţei anuale scăzute de tromboze venoase. Cu toate acestea, investigarea
poate aduce beneficii în situaţiile în care se au în vedere sarcina, administrarea de contraceptive
orale, sau înaintea unor intervenţii chirurgicale, la care tratamentul anticoagulant profilactic poate
aduce beneficii4.
În concluzie, recomandările pentru detectarea mutaţiei protrombinei sunt aceleaşi ca şi pentru mutaţia
factorului V Leiden:
- evenimente trombotice survenite la pacienţi tineri (<50 ani);
- tromboze venoase recurente;
- tromboze venoase în teritorii anatomice “neobişnuite”: vena portă, vene hepatice,
mezenterice, cerebrale, etc.;
- antecedente familiale de tromboze venoase la indivizi <50 ani;
- paciente cu pierderi de sarcină în trimestrele II şi III, de cauză incertă;
- după o consiliere adecvată, la pacientele asimptomatice din familiile la care s-a depistat
mutaţia, înainte de administrarea de contraceptive orale şi a unei eventuale sarcini4.
Testul efectuat în laboratorul Synevo utilizează tehnica real-time PCR pe instrumentul LightCycler
pentru detecţia şi genotiparea mutaţei factorului protrombinei, la pacienţi cu suspiciune clinică de
trombofilie2.
Metodă - Real-time PCR (LightCycler): reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a
produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise; la sfârşitul ciclurilor de amplificare se
efectuează genotiparea, prin analiza curbei de topire2.
91

- genotip sălbatic homozigot (negativ pentru mutaţia factorului II);
- genotip heterozigot (conţine o alelă sălbatică şi una mutantă pentru factorul II);
- genotip mutant homozigot (conţine ambele alele mutante)2.
La nivelul genei factorului II, pe lângă mutaţia 20210 mai sunt posibile alte 4 mutaţii: 20209, 20207,
20218 şi 20221. La genotipare, aceste mutaţii rare vor conduce la un rezultat neîncadrabil în tipurile
mai sus menţionate2.
Bibliografie
1. Ann M. Gronowski. Pregnacy Loss. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During

Pregnancy, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2004, 341.
3. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Factor
II (Prothrombin) Mutation, DNA Analysis. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet
Communication
4. Ronald C. McGlennen, Nigel S. Key. Clinical and Laboratory Management of the Prothrombin
G20210A Mutation. In Arch Pathol, 2002; 126:1319-1325.
18.1.1.3 Gena MTHFR (mutaţii C677T; A1298C) - risc trombofilie
MTHFR (metilentetrahidrofolat reductaza) este o enzimă care catalizează reducerea 5,10-
methylenetetrahidrofolatului la 5-methylenetetrahidrofolat, un cofactor în remetilarea homocisteinei
la metionină2.
În 1998 a fost descrisă o variantă enzimatică denumită „termolabilă” datorită instabilităţii termice in vitro
care a fost asociată cu un risc crescut de boală coronariană. Această variantă rezultă ca urmare a unei
mutaţii punctiforme la nivelul genei MTHFR (C677T) şi este cu 20% mai puţin eficientă în metabolizarea
homocisteinei, ceea ce poate conduce la hiperhomocisteinemie, mai ales la persoanele cu un deficit
de folaţi2;4. Se raportează o incidenţă de 11% în populaţia caucaziană a statusului homozigot pentru
această mutaţie asociat cu risc crescut de a dezvolta hiperhomocisteinemie şi anumite complicaţii
ale sarcinii ce includ anomalii cromozomiale, malformaţii congenitale, pierderi recurente de sarcină,
afecţiuni ale placentei şi preeclampsie2;5. Mai mult, pe lângă consecinţele asupra embrionului sau
fătului în prima parte a sarcinii, hiperhomocisteinemia şi statusul homozigot pentru mutaţia C677T
sunt implicate şi în fenomenele tromboembolice survenite tardiv în sarcină şi chiar în perioada post-
partum5.
Pacienţii care sunt heterozigoţi pentru această mutaţie nu prezintă hiperhomocisteinemie sau un risc
92
18
crescut de evenimente trombotice.

La nivelul genei MTHFR a mai fost descrisă o mutaţie destul de frecventă în populaţie – A1298C.
Această mutaţie nu se asociază cu hiperhomocisteinemie (indiferent de statusul heterozigot sau
homozigot), însă statusul heterozigot combinat pentru cele 2 mutaţii MTHFR poate genera manifestări
clinice similare cu cele induse de statusul homozigot pentru mutaţia C677T.
De asemenea, unele studii au arătat că statusul homozigot pentru mutaţia C677T conferă un risc
de 2-3 ori mai mare pentru defecte de tub neural cum ar fi spina bifida şi anencefalie în comparaţie
cu persoanele care nu prezintă această mutaţie, iar statusul heterozigot combinat pentru C677T şi
A1298C constituie de asemenea un factor de risc pentru defectele de tub neural4.
Mecanismul prin care mutaţiile MTHFR produc complicaţii ale sarcinii este insuficient cunoscut. O
ipoteză ar fi legată de hiperhomocisteinemia asociată care determină afectarea endoteliului vascular
şi conduce la tromboembolism venos şi insuficenţă placentară. Au fost descrise însă cazuri de
pierderi recurente de sarcină asociate cu status homozigot pentru mutaţia C677T în care nivelurile
de homocisteină s-au încadrate în limitele normalului, ceea ce sugerează existenţa unui mecanism
independent de hiperhomocisteinemie2.
În singurul studiu publicat despre rezultatele tratamentului pacientelor cu avorturi spontane recurente
şi trombofilie (12% cu mutaţie MTHFR) s-a raportat o rată de succes de 94% în obtinerea unei sarcini
duse la termen în urma terapiei anticoagulante profilactice (heparina cu greutate moleculară mică)
ceea ce justifică testarea pentru defecte trombofilice a acestei categorii de paciente1.
Recomandări pentru analiza mutaţiilor MTHFR – hiperhomocisteinemie, avorturi spontane

recurente, tromboze recurente4.
Metodă - Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) cu detecţie prin electroforeză în gel de
agaroză3.
Mutaţie C677T negativă
Mutaţie A1298C negativă
În cazul unui rezultat pozitiv se va comunica statusul homozigot sau heterozigot pentru mutaţia
respectivă3.
Bibliografie
1. Altomare I., Aledort L.M. MTHFR C677T Homozygosity and Recurrent Fetal Loss. In J Thromb
Haemost 2007; 5 Supplement 2: P-S-621.
2. Ivy Altomare, Alan Adler, and Louis M Aledort. The 5, 10 methylenetetrahydrofolate reductase
C677T mutation and risk of fetal loss: a case series and review of the literature. In Thromb. J.
93
2007: 5:17.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide.
Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) Thermolabile Variant, DNA Analysis. www.
labcorp.com 2007. Ref Type: Internet Communication.
5. Willianne L.D.M. Nelen and Henk J. Blom. Pregnancy Complications. In MTHFR Polymorphisms
and Disease. Edited by: Per Magne Ueland, 2005.
18.1.1.4 Mutaţia factorului XIII (G102T) - risc trombofilie

Factorul XIII activat contribuie la consolidarea cheagului de fibrină şi la rezistenţa acestuia la
fibrinoliză prin formarea unor legături încrucişate între filamentele de fibrină ce are la bază un proces
de transpeptidare. Deficitul congenital de factor XIII este asociat cu o diateză hemoragică severă.
Recent a fost identificat un polimorfism la nivelul genei care codifică factorului XIII care, potrivit studiilor
efectuate, constituie un factor protector atât împotriva trombozelor arteriale cât şi a celor venoase4.
Polimorfismul constă în substituirea guaninei cu timidina la nivelul exonului 2 al genei FXIII-A ce are
drept consecinţă înlocuirea valinei cu leucina în poziţia 34 a lanţului de aminoacizi.
Polimorfismul Val34Leu al subunităţii A a factorului XIII (FXIII-A) este localizat la nivelul peptidului de
activare (AP) la o distanţă de 3 aminoacizi faţă de situsul de clivare unde acţionează trombina.
Studiile au arătat că stabilitatea intracelulară şi concentraţia plasmatică a factorului XIII A asociat cu
variante genetice diferite sunt identice, ceea ce indică faptul că nu există nici o diferenţă în rata de
sinteză şi externalizare a tipului mutant în comparaţie cu tipul sălbatic de factor XIII. În schimb, s-a
constatat că eliberarea de către trombină a peptidului de activare se face mult mai repede în cazul
alelei Leu34. Energia de interacţiune dintre varianta Leu şi domeniile corespunzătoare ale trombinei,
calculată prin modelare moleculară, este mai mare decât cea dintre varianta Val şi trombină. Prin
urmare activarea factorului XIII mutant se produce mai repede şi necesită o cantitate mai mică de
trombină5. Astfel, se presupune că factorul XIII V34L este susceptibil la o conversie accelerată
ineficientă din forma de zimogen în cea de enzimă activată; depleţia prematură ar putea explica
efectele cardio-protectoare. În plus faţă de activarea FXIII, mutaţia V34L afectează de asemenea
procesul de formare a legăturilor încrucişate între monomerii de fibrină, în sensul că transglutaminaza
mutantă exercită o activitate specifică mai mare decât varianta sălbatică. Cu toate acestea, se pare
că efectul catalitic crescut generat de mutaţie se epuizează înainte ca beneficiile în consolidarea
cheagului să fie realizate8.
Într-o meta-analiză a 12 studii efectuate pe pacienţi diagnosticaţi cu tromboză venoasă profundă şi
subiecţi de control la care s-a studiat polimorfismul Val34Leu al FXIII s-a constatat faptul că varianta
mutantă exercită un efect protector mic dar semnificativ împotriva trombozei venose profunde7.
În ceea priveşte relaţia cu infarctul miocardic, un studiu recent susţine ipoteza că polimorfismul
94
18
Val34Leu al FXIII deţine un rol protector împotriva infarctului miocardic, efectul fiind semnificativ mai
mare la pacienţii <50 ani4.
Unele studii au indicat faptul că mutaţia Val34Leu a FXIII ar fi asociată cu o tendinţă mai mare către
sângerări. Astfel s-a raportat posibilitatea unui risc mai mare pentru episoade spontane de hemoragie
subconjunctivală2. Un alt studiu publicat recent a demonstrat o asociere între polimorfismul Val34Leu
şi hemoragia subarahnoidiană anevrismală3.
În ceea ce priveşte patologia sarcinii, un studiu a arătat că genotipul 4G/4G PAI-1, statusul homozigot
pentru mutaţia Val34Leu a factorului XIII sau homozigoţia/heterozigoţia compusă pentru ambele
defecte se asociază cu pierderile de sarcină din trimestrul I, prin afectarea formării placentei1.
agaroză6.
Comunicarea şi interpretarea rezultatelor
Pentru un pacient se raportează prezenţa sau absenţa mutaţiei Val34Leu; dacă mutaţia este prezentă,
se comunică dacă este vorba de un genotip homozigot sau heterozigot.
La pacienţii cu mutaţie Val34Leu a FXIII s-a constat o incidenţă mai scăzută de tromboze venoase
şi infarct miocardic în comparaţie cu persoanele fără această modificare. Conform datelor actuale
pacienţii cu această mutaţie prezintă tendinţă mai mare la sângerare. Pe de altă parte, unele studii au
arătat o incidenţă mai mare de avorturi recurente, mai ales dacă se asociază şi mutaţia promotorului
genei PAI-16.
Bibliografie
1. Astrid Dossenbach-Glaninger, Michael van Trotsenburg et al. Plasminogen Activator Inhibitor 1

4G/5G Polymorphism and Coagulation Factor XIII Val34Leu Polymorphism: Impaired Fibrinolysis
and Early Pregnancy Loss. In Clinical Chemistry. 2003; 49:1081-1086.
2. Carlo Incorvaia. Recurrent episodes of spontaneous subconjunctival hemorrhage in patients with
factor XIII Val34Leu mutation. In American Journal of Ophthalmology, 2002 (134), 927-929.
3. Claes Ladenvall, et al. Association between factor XIII single nucleotide polymorphisms and
aneurysmal subarachnoid hemorrhage. In Journal of Neurosurgery, March 2009, no.3, vol. 110.
4. Hancer Veysel Sabri et al. The Association Between Factor XIII Val34Leu Polymorphism and
Early Myocardial Infarction. In Circ J 2006; 70: 239 - 242 Circ J 2006; 70: 239 – 242.
5. István Balogh et al. Val34Leu polymorphism of plasma factor XIII: biochemistry and epidemiology in
familial thrombophilia. In Blood, 1 October 2000, Vol. 96, No. 7, pp. 2479-2486.
7. Philip S. Wells at al. Factor XIII Val34Leu Variant Is Protective against Venous
Thromboembolism: A HuGE Review and Meta-Analysis. In American Journal Of Epidemiology,
95
2006 164(2):101-109.
8. Toni A. Trumbo, Muriel C. Maurer. Examining Thrombin Hydrolysis of the Factor XIII Activation
Peptide Segment Leads to a Proposal for Explaining the Cardioprotective Effects Observed with
the Factor XIII V34L Mutation. In The Journal of Biological Chemistry, 2000.
18.1.1.5 Gena PAI-1 (polimorfism 675 4G/5G) - risc trombofilie

Inhibitorul activatorului plasminogenului (PAI-1) deţine un rol important în procesul fibrinolitic. Astfel,
nivelurile plasmatice crescute de PAI-1 sunt responsabile de scăderea activităţii fibrinolitice şi se
corelează cu dezvoltarea trombozelor arteriale sau venoase.
Gena PAI-1 este situată pe cromozomul 7 şi conţine 8 introni şi 9 exoni. Polimorfismul 4G/5G (deleţia/
inserţia guanozinei în poziţia 675 a promotorului genei PAI-1) este un determinant genetic major
al nivelurilor de PAI-1. Deşi prezenţa alelei 4G a fost asociată cu niveluri crescute de PAI-1 studiile
publicate au dat rezultate contradictorii în ceea ce priveşte incidenţa alelei 4G la pacienţii cu tromboză
venoasă profundă. Unele studii au raportat că nu există nici o diferenţă în distribuţia genotipurilor
4G/5G la pacienţi şi subiecţii de control, altele au demonstrat această asociere6;7;8;10. Pe de altă parte,
unii autori au sugerat că asocierea alelei 4G cu alte defecte trombofilice (cum ar fi factorul V Leiden,
mutaţia protrombinică, hiperhomocisteinemia, scăderea activităţii proteinei C sau S, niveluri crescute
factor VIII) creşte riscul de tromboză3.
În ceea ce priveşte patologia sarcinii, potrivit unui studiu, prezenţa genotipurilor 4G/4G sau 4G/5G este
clinic semnificativă pentru dezvoltarea tromboembolismului venos în sarcină. Un alt studiu a arătat
că genotipul 4G/4G, statusul homozigot pentru mutaţia Val34Leu a factorului XIII sau homozigoţia/
heterozigoţia compusă pentru ambele defecte se asociază cu pierderile de sarcină din trimestrul I,
prin afectarea formării placentei2.
Un studiu publicat recent a raportat că prezenţa alelei 4G constituie un factor de risc independent
pentru infarctul miocardic la pacienţi tineri (≤ 45 ani), la fel ca fumatul, hipertensiunea arterială şi
istoricul familial de afecţiuni cardiovasculare4.
La pacienţii cu boală coronariană prezenţa genotipului 4G/4G a fost asociată cu un risc crescut de
moarte subită1.
Mai multe studii nu au reuşit să demonstreze asocierea polimorfismului cu riscul crescut de accident
vascular ischemic9.
96
18
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) cu detecţie prin electroforeză în gel de agaroză6.
- genotip homozigot 5G/5G;
- genotip heterozigot 4G/5G;
- genotip homozigot 4G/4G.
Homozigoţii 4G/4G (frecvenţă 11% în populaţia europeană) prezintă niveluri PAI-1 cu 25% mai mari
faţă de homozigoţii 5G/5G6;10. Niveluri de PAI-1 peste limita superioară a normalului sunt întâlnite şi în
cazul genotipului heterozigot 4G/5G care are o frecvenţă de 40% în populaţia europeană.
Starea de purtător al alelei 4G este asociată cu adipozitate, hipertensiune arterială şi cu un risc uşor
crescut de infarct miocardic6.
Bibliografie
1. Anvari A, Schuster E, Gottsauner-Wolf M, Wojta J, Huber K. PAI-I 4G/5G polymorphism and

sudden cardiac death in patients with coronary artery disease. In Thromb Res. 2001 Jul
15;103(2):103-7.
2. Astrid Dossenbach-Glaninger, Michael van Trotsenburg et al. Plasminogen Activator Inhibitor 1
4G/5G Polymorphism and Coagulation Factor XIII Val34Leu Polymorphism: Impaired Fibrinolysis
and Early Pregnancy Loss. In Clinical Chemistry. 2003; 49:1081-1086.
3. Guglielmone H., Minoldo S., Jarchum G. PAI-1 GENE 4G/5G GENOTYPE AS AN ADDITIONAL
RISK FACTOR IN PATIENTS WITH THROMBOSIS: A RETROSPECTIVE COHORT STUDY. In
Journal Of Thrombosis and Haemostasis, Vol.5, Supplement 1, August 2007.
4. Irma Isordia Salas et al. Association of the plasminogen activator inhibitor-1 gene 4G/5G
polymorphism with ST elevation acute myocardial infarction in young patients. In Rev Esp
Cardiol, 2009 Apr; 62(4): 365-72.
5. J.F. Schenk, B. Stephan, S. Zewinger, T. Speer, G. Pindur. Comparison of the plasminogen
activator inhibitor-1 4G/5G gene polymorphism in females with venous thromboembolism during
pregnancy or
spontaneous abortion. In Clinical Hemorheology and Microcirculation, 2006.
7. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive GuidePlasminogen
Activator Inhibitor 1 (PAI-1) 4G/5G Polymorphism. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet
Communication
8. Sartori Maria Teresa; Danesin Cristina; Saggiorato Graziella; Tormene Daniela; Simioni
Paolo; Spiezia Luca; Patrassi Giovanni Maurizio; Girolami Antonio. The PAI-1 gene 4G/5G
polymorphism and deep vein thrombosis in patients with inherited thrombophilia, In Clinical and
Applied Thrombosis/Hemostasis, Vol. 9, No. 4, 299-307 (2003).
9. Tsantes, Argirios et al. Plasminogen activator inhibitor-1 4G/5G polymorphism and risk of
ischemic stroke: a meta-analysis. In Blood Coagulation & Fibrinolysis: July 2007 - Volume 18 -
97
Issue 5 - 497-504.
10. Uri Seligsohn, John H. Griffin. Hereditary Thrombophilia. In Williams Hematology. Seventh
Edition. McGraw-Hill, 2006,1990.
18.1.1.6 Alfa – talasemia: testare genetică
Alfa-talasemiile reprezintă un grup de afecţiuni cu transmitere genetică autozomal-recesivă
caracterizate printr-o rată scăzută de sinteză a lanţurilor α ale globinei.
Clusterul genelor α este localizat în apropierea telomerului cromozomului 16, se întinde pe o lungime
de 28 kb şi conţine în următoarea ordine: o genă zeta (ζ), o pseudogenă ζ (ψζ), o pseudogenă α (ψα)
şi două gene α, care codifică α2-globina şi α1-globina, denumite HBA2 şi respectiv HBA11. Fiecare
genă prezintă 3 secvenţe care codifică proteine (exoni) şi 2 regiuni care aparent nu au nici un rol în
sinteza proteinelor (introni = intervening sequences), flancate de secvenţe 5’ şi 3’, care de asemenea
nu intervin în procesul de translaţie. La capătul 5’ al fiecărei gene se găseşte promotorul, o secvenţă
necesară pentru iniţierea transcripţiei. Promotorul genei α include 2 secvenţe: TATA box şi CCATT
box. Atât exonii cât şi intronii suferă fenomenul de transcripţie a ADN-ului în ARN mesager; acest
proces este controlat de factori de transcripţie care se leagă de promotori şi de elementele de control
situate în amonte - intensificatori (enhancers) – care cresc foarte mult viteza de transcripţie. Astfel,
genele α-globinei se află sub influenţa unui element intensificator major, denumit HS-40 (vezi figura
18.1.1.6)1;3.
Fig. 18.1.1.6 Genele α-globinei (Adaptare după J. Clin. Invest 117(4): 850-858 (2007))4
98
18
Fenomenul de transcripţie include următoarele etape:

- transcripţia propriu-zisă: rezultă o copie ARN a genei, ce include secvenţele complementare atât
pentru exoni cât şi pentru introni;
- încapsularea şi poliadenilarea (capping + polyadenilation): ataşarea unor nucleotide speciale la
capetele 5’ şi 3’ ale ARN-ului;
- înnădirea (splicing): îndepărtarea intronilor din ARNm; secvenţele ARN corespunzătoare exonilor
sunt apoi “înnădite” împreună3.
Alfa-talasemiile se produc atunci când una sau mai multe gene care codifică lanţurile α ale globinei
lipsesc sau sunt afectate. Severitatea defectului este variabilă; una din extreme este condiţia complet
asimptomatică ce rezultă din deleţia sau disfuncţia uneia din cele 4 gene α; la polul opus este situat
sindromul Hemoglobinei Bart, produs prin deleţia celor 4 gene α, caracterizat prin hidrops fetal, de
obicei incompatibil cu viaţa (edeme generalizate, efuziuni pleurale şi pericardice, hepatosplenomegalie,
anemie hipocromă severă în absenţa unei incompatibilităţi de grup sangvin şi Rh).
Unele din manifestările clinico-patologice ale sindroamelor alfa-talasemice rezultă ca urmare a
absenţei lanţului α, în timp ce altele se produc prin afectarea precursorilor eritropoietici de către
lanţurile non-α aflate în exces. Astfel, lanţurile β şi γ sintetizate în exces formează tetrameri, rezultând
hemoglobinele H (β4) şi Bart (γ4).
Atunci când ambele gene α de pe un singur cromozom suferă o deleţie sau o inactivare completă
a transcripţiei condiţia rezultată este denumită α0 talasemie (alfa-zero talasemie); atunci când se
menţine o funcţie reziduală a genei şi o anume producţie a lanţului α, de exemplu în cazul deleţiei unei
singure gene α de pe un cromozom, se utilizează termenul de α+ talasemie (alfa-plus talasemie).
Deleţia sau disfuncţia a trei gene α generează boala HbH.
Din punct de vedere al defectului genetic subiacent alfa-talasemiile sunt împărţite în talasemii
deleţionale şi non-deleţionale. Talasemiile deleţionale vor genera α0 talasemie sau α+ talasemie, în
funcţie de natura şi lungimea deleţiei. Talasemiile nedeleţionale conduc de obicei la α+ talasemie şi
rezultă prin:
- mutaţii ale codonului de iniţiere;
- mutaţii care afectează clivajul, înnădirea, poliadenilarea sau stabilitatea ARN-ului;
- producţia unui lanţ α structural anormal, care este fie sintetizat la o rată redusă, fie este
instabil1.
Testarea genetică
Testarea prin tehnici de biologie moleculară a demonstrat că HBA1 şi HBA2 prezintă deleţii (ca urmare
a unor evenimente de recombinare aberantă) în 90% din cazuri şi mutaţii punctiforme la aproximativ
10% dintre indivizii afectaţi.
Metodele bazate pe reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) ce utilizează primeri specifici care flanchează
punctele de ruptură (breakpoints), detectează deleţia unei singure gene de α-globină
(α+-talasemie) sau deleţia ambelor gene, α1 şi α2, de pe un singur cromozom (α0-talasemie). Prin tehnica
MLPA (multiple ligation-dependent probe amplification) se pot detecta deleţii mai puţin întâlnite. Cele
mai obişnuite deleţii care afectează o singură genă α sunt cele denumite -α3.7 şi -α4.2; în plus faţă de
acestea au mai fost raportate 3 deleţii mai rare6. (-α4.2 ) este o deleţie de 4.2 kb la nivelul genei α2;
(-α3.7) desemnează un grup de 3 deleţii uşor diferite cu lungimea de 3.7 kb produse la capătul 3’ al
99
genei α2 şi la capătul 3’ al genei α1 cu formarea unei gene de fuziune α2α1. Ambele deleţii au ca rezultat
reducerea cu 50% a sintezei lanţului α de pe cromozomul afectat1.
În ceea ce priveşte α0 talasemia, sunt cunoscute mai mult de 20 de deleţii diferite, de la 6 kb la 300 kb,
ce conduc la înlăturarea ambelor gene de α-globină (uneori şi la deleţia genei zeta). Cele mai cunoscute
sunt - -SEA , - -FIL, - -THAI, - -MED, - -20.5 care în cazul homozigoţiei provoacă sindromul hemoglobinei Bart5.
Atunci când oricare dintre aceste alele apare în combinaţie cu o altă alelă purtătoare a deleţiei unei
singure gene α (ca de exemplu, -α3.7) rezultă boala Hb H, caracterizată prin prezenţa tetramerului Hb
Bart la naştere, înlocuit ulterior de tetramerul Hb H2.
Deleţia elementului reglator major care include intensificatorul HS-40 induce scăderea marcată sau
anularea expresiei ambelor gene α cu structură normală (α0 talasemie)1.
Tehnica de secvenţiere este aplicată în cazurile în care nu a fost depistată nici o deleţie a lanţurilor
α-globinei în prezenţa suspiciunii clinice de alfa-talasemie. Pot fi detectate astfel mutaţiile
punctiforme:7
● Mutaţiile codonului de terminalizare interferă cu fenomenul de translaţie a ARN-ului prin producerea
unui lanţ α instabil alungit. Cele mai cunoscute exemple sunt hemoglobina Constant Spring (întâlnită
în sudul Chinei, Tailanda, Cambodgia, Vietnam, Laos, bazinul mediteranean) şi hemoglobina Koya
Dora (India).
● Mutaţii care afectează clivajul, splicing-ul şi poliadenilarea ARN-ului. De exemplu IVSI-117(G→A)
la nivelul genei α1 este o mutaţie a joncţiunii de splicing întâlnită în India care conduce la o genă
nefuncţională. αTSaudiα, întâlnită în mod obişnuit în regiunea mediteraneană, este o mutaţie a semnalului
de poliadenilare care conduce la o reducere marcată a sintezei lanţului α1.
● Mutaţii care determină instabilitatea posttranslaţională a unui lanţ α anormal, de exemplu hemoglobina
Quong Sze (α125Leu→Proα sau αQSα), întâlnită la evreii kurzi şi în Asia de Sud-Est, şi hemoglobina Agrinio
(α29Leu→Proα sau αAgrα), întâlnită în regiunea mediteraneană şi Asia de sud-Est1.
În zona mediteraneană α+ talasemia (cauzată de deleţia -α3.7 ) este obişnuită, cu frecvenţa cea mai
mare în Sardinia şi cea mai scăzută în Spania. Pe de altă parte, α0 talasemia este foarte rară, ceea ce
explică şi incidenţa extrem de scăzută a hidropsului fetal. O caracteristică importantă a α- talasemiei
în populaţia mediteraneană este heterogenicitatea mutaţiilor, în special a celor nedeleţionale7.
Recomandări pentru testarea genetică
- confirmarea diagnosticului la persoanele cu suspiciune clinică;
- depistarea statusului de purtător asimptomatic;
- diagnosticul prenatal7.
Cantitate recoltată - 5 mL sânge5.
Cauze de respingere a probei - folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau
hemolizate5.
Stabilitate probă – 7 zile la 2-8ºC5.
Metodă – secvenţiere completă HbA1 şi HbA2; analiza duplicaţiilor/deleţiilor prin metoda MLPA5.
Alfa plus-talasemia
100
18
Tara de α+ talasemie este cea mai frecventă afecţiune monogenică din lume. Mutaţiile cele mai
obişnuite sunt sunt -α3.7 şi -α4.2. Aproximativ un sfert din persoanele de origine africană sunt heterozigote
pentru α+ talasemie (având genotipul -α3.7/αα), în timp ce 1-2% sunt homozigoţi (genotip -α3.7/-α3.7).
Alte grupuri etnice care pot asocia α+ talasemie deleţională sunt grecii, ciprioţii, turcii, sarzii, libanezii,
saudiţii, indienii, tailandezii, filipinezii, indonezienii, melanezienii şi polinezienii. Mai puţin frecvent, α+
talasemia rezultă ca urmare a unei mutaţii punctiforme a genei α2, denumită αTα (întâlnită în Orientul
Mijlociu, dar şi în Cipru şi Sardinia). Alfa-plus talasemiile non-deleţionale care afectează gena α1,
denumite ααT, sunt forme mai uşoare în comparaţie cu αTα, fiind de regulă intermediare ca severitate
între -α/αα şi - -/αα. Anumite variante de lanţ α pot da naştere fenotipului de α+ talasemie. Acestea
includ: Hb Constant Spring, Hb Q, Hb Icaria, Hb Seal Rock şi Hb Koya Dora. Cea mai obişnuită formă
de α-talasemie nedeleţională este hemoglobina Constant Spring, cu o frecvenţă de 1-8% în Tailanda.
Această variantă este datorată unei mutaţii a codonului de terminalizare al genei α2, în urma căreia se
adaugă la lanţul α o secvenţă de 31 aminoacizi; ARN-ul mesager este foarte instabil, iar rata sintezei
lanţului α este redusă la aproximativ 1%.
Alfa plus-talasemia este în majoritatea cazurilor nesemnificativă clinic, persoanele afectate fiind
asimptomatice. Condiţia prezintă însă semnificaţie genetică deoarece heterozigoţia compusă pentru
α+ talasemia deleţională şi α0 talasemie generează boala HbH. Homozigoţii pentru formele mai
severe de α+ talasemie nedeleţională (αTα / αTα) pot prezenta de asemenea caracteristicile clinice
ale bolii HbH. Homozigoţia pentru hemoglobina Constant Spring conduce la o anomalie mai severă
comparativ cu cea întâlnită în statusul homozigot pentru α+ talasemie; pacienţii prezintă de regulă
anemie, iar în unele cazuri pot să apară icter moderat şi hepatosplenomegalie.
Heterozigoţii pentru α+ talasemie (-α/αα) pot prezenta fie un tablou hematologic normal, fie o anemie
discretă, cu reducerea uşoară a VEM şi HEM. În medie, valoarea Hb este cu 1g/dL mai mică decât la
persoanele cu cele 4 gene α intacte. Electroforeza Hb este normală, la fel ca şi separarea fracţiunilor
prin cromatografie lichidă sub înaltă presiune (HPLC). Homozigoţii pentru α+ talasemie (-α/-α) prezintă
de obicei un tablou hematologic similar cu cel întâlnit în beta-talasemia minoră. Heterozigoţii pentru Hb
Constant Spring prezintă un grad mai mare de anemie decât cel întâlnit în tara de α+ talasemie, însă
VEM nu este redus în mod proporţional; punctaţiile bazofile sunt de regulă proeminente. Homozigoţii
pentru această variantă sunt anemici, cu o reducere marcată a HEM; VEM este mai puţin scăzut
datorită hidratării celulare excesive (consecutivă afectării membranei eritrocitare de către lanţurile α
şi αCS oxidate).
Diagnosticul tarei de alfa-talasemie este suspectat în condiţiile unei microcitoze persistente care nu
este explicată prin deficitul de fier sau prin existenţa tarei de β sau δβ talasemie. Numai testarea
genetică poate stabili diagnosticul de certitudine.
Alfa 0-talasemia
Această condiţie rezultă de obicei prin deleţia ambelor gene α; rareori se produce numai prin deleţia
genei α1 şi a secvenţelor în amonte cu inactivarea genei α2 restante. Este relativ comună în sud-
estul Chinei, precum şi în Tailanda, Vietnam, Laos, Cambodgia, Malaezia şi Filipine. Este întâlnită
cu o frecvenţă mai mică în zona mediteraneană (Grecia, Cipru, Turcia, Israel, Sardinia). Trei tipuri de
deleţie sunt mai frecvente în sud-estul Asiei: - -SEA , - -FIL, - -THAI (ultimele două constituie deleţii mari
care includ şi gena ζ). În regiunea mediteraneană cea mai cunoscută deleţie este - -MED, care nu
101
include şi gena ζ. În statusul heterozigot nu există diferenţe ale tabloului clinic sau hematologic între
diferitele deleţii care generează α0 talasemia.
Tara de α0 talasemie conduce la o anemie foarte uşoară însoţită de un număr crescut de eritrocite
şi de reducerea indicilor VEM şi HEM. Diagnosticul este suspectat în prezenţa acestor modificări
apărute la persoane cu origine etnică sugestivă şi având o electroforeză a Hb normală. Confirmarea
se efectuează prin testare genetică.
Boala hemoglobinei H
Este un sindrom clinic rezultat dintr-o varietate mare de anomalii genetice. Cauza cea mai obişnuită
este heterozigoţia compusă pentru α+ talasemie şi α0 talasemie, cum ar fi - -SEA/-α4.2 în sud-estul
Asiei sau –α20.5/-α3.7 ori - -MED /-α3.7 în regiunea mediteraneană. Un mecanism alternativ îl constituie
heterozigoţia compusă pentru α0 talasemie şi o α-talasemie nedeleţională, cum ar fi hemoglobina
Constant Spring sau tipul Saudi (- -SEA/αCSα sau - -MED/ αTSaudiα); mai este posibilă şi homozigoţia pentru
α-talasemia nedeleţională, în principal αTSaudiα/ αTSaudiα.
Boala HbH este caracterizată printr-o reducere semnificativă a ratei de sinteză a lanţurilor α, având
drept rezultat o anemie microcitară hipocromă moderat-severă (Hb 7-10 g/dL, VEM 50-65 fL, HEM
15-20 pg, CHEM 25-30 g/dL) însoţită de reticulocitoză. Electroforeza Hb sau HPLC indică prezenţa
hemoglobinei H cu migrare rapidă, într-un procent de 2-40% (de regulă 8-10%). Procentul de HbA2
este redus, iar cel de HbF poate fi uşor crescut (1-3%). Pe frotiul de sânge colorat supravital pot fi
observate incluziile HbH (precipitatele de lanţuri β), într-un procent ridicat de eritrocite (35-90%),
cu aspect caracteristic de „minge de golf”. Atunci când boala HbH este cauzată de α-talasemii
nedeleţionale, hemoglobina H nu este detectată întotdeauna pe electroforeza Hb, iar incluziile HbH
sunt inconstante; aceasta se datorează probabil faptului că lanţurile β formează împreună cu un lanţ
α anormal dimeri tranzitorii şi instabili care sunt distruşi rapid.
Sindromul hemoglobinei Bart
Homozigoţia pentru α0 talasemie conduce la imposibilitatea sintezei lanţurilor α, cu absenţa producerii
hemoglobinelor F, A sau A2. Această condiţie este de obicei incompatibilă cu viaţa extrauterină.
Deleţia tuturor celor 4 gene α, dar cu una sau ambele gene ζ intacte (- -SEA/- -SEA, - -MED /- -MED,
- -SEA/- -THAI sau - -SEA/- -FIL) are drept rezultat hidropsul fetal al hemoglobinei Bart. Majoritatea
hemoglobinei prezente este constituită de Hb Bart, ce este alcătuită din 4 tetrameri γ, este instabilă
şi incapabilă să furnizeze oxigen ţesuturilor. Restul hemoglobinei este reprezentat de Hb Portland
2 (ζ2γ2) care, fiind capabilă să livreze oxigen ţesuturilor, reuşeşte să menţină fătul în viaţă până în
trimestrul trei de sarcină. Se dezvoltă o anemie severă însoţită de hematopoieză extramedulară ce
conduce la hepatosplenomegalie.
Atunci când există o deleţie mare ce include genele ζ nu poate fi produsă nici o formă de hemoglobină
funcţională. Singurele Hb sintetizate sunt Hb Bart şi un tetramer ε4. Moartea fătului se înregistrează
precoce în sarcină, cu avort consecutiv. Acest sindrom poate rezulta ca urmare a homozigoţiei pentru
- -FIL sau - -THAI.
La electroforeza hemoglobinei şi HPLC se constată Hb Bart într-un procent de 70-100% şi, uneori,
cantităţi mici de Hb Portland 1, Portland 2 şi HbH. Cazurile produse ca urmare a homozigoţiei pentru
- -FIL sau - -THAI nu prezintă Hb Portland 1 sau 2.
Datorită consecinţelor letale asupra fătului, este esenţial ca această condiţie să fie depistată precoce
102
18
în sarcină prin identificarea tuturor cuplurilor purtătoare ale tarei de α0 talasemie. Atunci când
ambii părinţi prezintă tara de α0 talasemie este necesară analiza ADN-ului fetal. Pentru diagnostic
se utilizează ţesut fetal obţinut prin prelevarea de vilozităţi coriale în primul trimestru sau din lichid
amniotic în trimestrul doi de sarcină1.
Bibliografie
1. Barbara J. Bain. Haemoglobinopathy Diagnosis. Blackwell Science, 2001, 7-9; 49-73.

2. BridgesK R, Thalassemia Overview [Online]. Available from http://sickle.bwh.harvard.edu/menu_
thal.html. Reference Type: Internet Communication.
3. Cornel Mironel Niculae. Transcrierea (transcripţia). Bioinformatică. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/
transcrierea.htm. Reference Type: Internet Communication.
4. Frenette PS, Atweh GF. Sickle cell disease: old discoveries, new concepts, and future promise.
In J. Clin. Invest. 117(4): 850/858 (2007).
6. Orathai Tangvarasittichai1, Chanthonrat Sitthiworanan, Warong Dechgitvigrom, Torpong
Sanguansermsri, Rattima Jeenapongsa, Prevalence and Haematological Parameters of
Thalassaemia in Lower Northern Thailand, In Haema 2005; 8(2): 241-244.
7. Renzo Galanello, Antonio Cao. Alpha-Thalassemia. Gene Reviews, 2008. www.ncbi.nlm.nih.
gov. ReferenceType: Internet Communication.
18.1.1.7 Beta- talasemia: testare genetică HBB
Beta-talasemiile reprezintă un grup de afecţiuni cu transmitere genetică autozomal-recesivă

caracterizate printr-o rată scăzută de sinteză a lanţurilor β ale globinei.
Clusterul genelor β este localizat pe cromozomul 11, se întinde pe o lungime de 50 kb şi conţine în
următoarea ordine: o genă epsilon (ε), 2 gene gamma (denumite Gγ şi Aγ), o pseudogenă β (ψβ), o
genă delta (δ) şi o genă β (denumită HBB) care codifică β -globina1. Fiecare genă prezintă 3 secvenţe
care codifică proteine (exoni) şi 2 regiuni care aparent nu au nici un rol în sinteza proteinelor (introni
= intervening sequences), flancate de secvenţe 5’ şi 3’, care de asemenea nu intervin în procesul de
translaţie. La capătul 5’ al fiecărei gene se găseşte promotorul, o secvenţă necesară pentru iniţierea
transcripţiei. Promotorul genei β include 3 secvenţe: TATA box, CCATT box şi motive CACC duplicate.
Atât exonii cât şi intronii suferă fenomenul de transcripţie a ADN-ului în ARN mesager; acest proces
este controlat de factori de transcripţie care se leagă de promotori şi de elementele de control situate
în amonte - intensificatori (enhancers) – care cresc foarte mult viteza de transcripţie. Astfel, genele
β-globinei se află sub influenţa unui element intensificator major, denumit regiunea de control a
locusului β (β-LCR) (vezi figura de mai jos)1;3;4.
103
Genele β-globinei pe cromozomul 11
Adaptare după J. Clin. Invest117(4): 850-858 (2007)

Fenomenul de transcripţie include următoarele etape:
- transcripţia propriu-zisă: rezultă o copie ARN a genei, ce include secvenţele complementare atât
pentru exoni cât şi pentru introni;
- încapsularea şi poliadenilarea (capping + polyadenilation): ataşarea unor nucleotide speciale la
capetele 5’ şi 3’ ale ARN-ului;
- înnădirea (splicing): îndepărtarea intronilor din ARNm; secvenţele ARN corespunzătoare exonilor
sunt apoi “înnădite” împreună3.
Beta talasemia apare mai frecvent la populaţiile din bazinul mediteranean însă pot fi afectate şi alte
grupuri etnice. Severitatea defectului este variabilă. Persoanele normale prezintă 2 alele pentru
β-globină, astfel că β-talasemia poate să apară într-o stare heterozigotă sau homozigotă. Deoarece
există un număr mare de mutaţii asociate cu β-talasemia sunt posibile şi cazuri de heterozigoţie
compusă, care apar atunci când o persoană posedă 2 gene mutante.
Sunt descrise două categorii mari de β-talasemie:
- βo talasemia (beta zero talasemia): caracterizată prin absenţa expresiei unei gene β
anormale sau mai rar, deleţia acesteia; atunci când defectul apare în stare homozigotă (βo/
βo) este afectată complet sinteza lanţurilor β şi implicit a hemoglobinei A;
- β+ talasemie (beta plus talasemie): caracterizată printr-o expresie redusă (dar nu absentă)
a unei gene β anormale; atunci când defectul apare în stare homozigotă există o oarecare
producţie de hemoglobină A1;6.
Heterozigoţii compuşi pentru β-talasemie pot avea 2 gene βo sau β+ diferite sau atât o genă β+ cât şi
una β0 (β+/βo).
Tabloul clinic este extrem de variabil. Statusul heterozigot pentru β-talasemie, denumit şi tară
β-talasemică sau β-talasemie minoră, este în majoritatea cazurilor o condiţie clinic asimptomatică.
Statusul homozigot sau heterozigoţia compusă pentru β-talasemie conduc de obicei la un fenotip
clinic sever, denumit β-talasemie majoră, în care persoanele afectate sunt dependente de transfuziile
de sânge. Termenul de β-talasemie intermedia include condiţii clinice de severitate intermediară între
formele minoră şi majoră; persoanele afectate sunt simptomatice şi pot necesita ocazional transfuzii
de sânge, fără ca acestea să fie însă esenţiale pentru menţinerea vieţii1.
Testarea genetică
Sunt cunoscute la ora actuală peste 200 de mutaţii asociate cu β-talasemia, care pot fi detectate prin
diverse tehnici PCR, hibridizare cu oligonucleotide sintetice sau secvenţiere7.
104
18
În majoritatea cazurilor este vorba de mutaţii apărute la nivelul genei HBB sau în apropierea acesteia
(substituţii ale unei singure nucleotide, deleţii sau inserţii oligonucleotidice). În funcţie de evenimentul
genetic afectat sunt descrise trei tipuri de mutaţii:
- care afectează transcripţia β-globinei;
- care afectează procesarea ARNm (fenomenele de splicing sau poliadenilare);
- care produc o translaţie anormală a ARNm (mutaţii nonsens sau ale cadrului de citire)3.
Un procent redus de cazuri rezultă ca urmare a unei deleţii mari a genei sau a secvenţelor de control
situate în amonte1;2.
Din punct de vedere al severităţii defectului indus mutaţiile genei HBB se clasifică în două mari
categorii:
 Mutaţii care blochează sinteza β-globinei şi determină βo-talasemie
• Mutaţii nonsens: substituţii ale unei singure nucleotide în codoni normali care creează un codon
de terminalizare; de exemplu mutaţia codonului 39 (C – T) introduce codonul de terminalizare
AUG în genă, respectiv rezultând un ARNm nefuncţional; această mutaţie s-a descoperit la
marea majoritate a cromozomilor talasemici de la pacienţi din regiunea Mediteraneană.
• Mutaţia codonului de iniţiere: împiedică complet transcripţia; sunt descrise 7 mutaţii ale codonului
de iniţiere ATG care codifică metionina.
• Mutaţiile cadrului de citire a genei: deleţii sau inserţii a 1, 2 sau mai mult de 3 nucleotide care
alterează cadrul de citire al ARNm prin introducerea unui codon de terminalizare; de exemplu -1
în codonul 41 (UGA); -1 în codonul 6.
• Mutaţiile la nivelul jonţiunii de splicing: toate joncţiunile intron – exon confirmă regula Chambon
(5’ GT/AG 3’) necesară pentru un splicing normal; mutaţiile ce alterează aceste nucleotide nu
vor avea un splicing normal, de exemplu IVSI-1 (G – A); IVSII-1 (G – A)7.
 Mutaţii care diminuează sinteza β-globinei şi determină β+-talasemie
• Mutaţii ale secvenţei consens: creează situsuri de splicing alternative, de exemplu: IVSI-5
(G - T); IVSI-6 (T - C); ultima mutaţie este de origine mediteraneană.
• Mutaţii punctiforme în exoni: mutaţiile în secvenţele codificatoare pot determina procesări
anormale ale ARNm; secvenţa din jurul dinucleotidului GT din codonul 25 are 6 din 9 poziţii în
comun cu secvenţa consens de la situsul de joncţiune de la capătul 5’, dar nu par să fie implicate
în procesarea normală; au fost descrise trei mutaţii în interiorul acestui situs de splicing care duc
la activarea sa: prima mutaţie (G→A din codonul 26) dă naştere structurii proprii HbE care este
asociată cu fenotipul unei β-talasemii uşoare; similar, Hb Knossos are o mutaţie în codonul 27
(G→T) şi prezintă fenotip β-talasemic; a treia mutaţie ce face parte din acest tip este substituţia
A→T din codonul 24 - o substituţie silenţioasă la nivel de proteină, dar asociată cu o severitate
moderată a fenotipului β+-talasemic.
• Mutaţii punctiforme în introni: produc situsuri criptice de splicing şi astfel se generează un ARNm
aberant în plus faţă de un ARNm normal; de exemplu IVSI-110, IVSII-745.
• Mutaţii ale promotorului: au fost descrise diverse mutaţii în regiunea promotorului care reduc rata
de legare a ARN polimerazei, ceea ce are ca rezultat reducerea transcripţiei cu 20-30%; mutaţiile
105
28 A→ G şi 29 A→G sunt frecvente la populaţia chineză şi africană, în timp ce mutaţiile - 87

C→G şi silent - 101 C→T sunt mai frecvente la populaţia din bazinul mediteranean1;7.
Recomandări pentru analiza mutaţiilor
- stabilirea prognosticului în ceea ce priveşte fenotipul clinic (diferenţierea moleculară a
talasemiei intermedia de forma majoră);
- depistarea purtătorilor în familiile cu risc crescut;
- diagnosticul prenatal al beta talasemiei6;7.
hemolizate5.
Metodă – secvenţiere completă HBB5.
Tara de beta-talasemie (statusul heterozigot)
Persoanele purtătoare ale tarei de β-talasemie sunt de obicei asimptomatice; este posibil însă ca în
condiţii de stres hematopoietic (sarcină, infecţii intercurente) să apară manifestări legate de anemie.
Unii pacienţi pot să aibă splenomegalie.
Hemograma prezintă modificări caracteristice ale seriei eritrocitare: scădere uşoară a valorii
hemoglobinei, număr crescut de eritrocite, valori scăzute ale indicilor eritrocitari VEM şi HEM, lărgime
a distribuţiei eritrocitare de obicei normală. În medie, variabilele hematologice diferă la tarele β0 şi β+,
deşi poate exista o suprapunere considerabilă. În cazurile în care coexistă α-talasemia anomaliile
hematologice sunt mai puţin marcate.
Pe frotiul de sânge periferic, alături de microcitoză, se pot observa hipocromie, poikilocitoză, hematii
“în ţintă”, punctaţii bazofile. La examenul măduvei osoase se constată o celularitate crescută ca
urmare a hiperplaziei eritroide.
Diagnosticul se bazează pe detectarea unui procent crescut de HbA2 la electroforeza hemoglobinei
sau prin tehnică cromatografică (HPLC). Aproximativ o treime-o jumătate din pacienţi asociază şi un
procent crescut de HbF.
Proporţia de hemoglobină A2 se corelează cu tipul mutaţiei beta-talasemice. Astfel, în majoritatea
cazurilor de heterozigoţie pentru β0 sau de β+-talasemie severă se înregistrează un procent de 4-5%
HbA2, în timp ce în formele uşoare de β+-talasemie procentul este de obicei de 3.6-4.2%. Procente mai
mari se constată în cazul tarelor asociate cu deleţia porţiunii 5’ a genei HBB, precum şi în cazurile de
mutaţii ale promotorului sau ale codonului de iniţiere.
Cauze de tară β-talasemică cu HbA2 normală
Există şi forme de β-talasemie cu un procent normal de HbA2, denumite silent β-thalasemmia. De
exemplu în cazul mutaţiei C→G din poziţia 6 la codonul de terminalizare se constată un procent
mediu de 2.4%.
Dacă o persoană prezintă indici eritrocitari sugestivi pentru tara beta-talasemică dar procentul de
HbA2 nu este crescut este important să se excludă δβ-talasemia, hemoglobinopatia Lepore, precum şi
106
18
α-talasemia. Poate să existe şi o γδβ-talasemie, însă această condiţie este foarte rară. Unii pacienţi
cu anemie feriprivă pot să aibă indici eritrocitari atipici; în special copiii pot prezenta o anemie feriprivă
însoţită de un număr crescut de eritrocite.
Un nivel scăzut de feritină indică un deficit de fier dar nu exclude diagnosticul de tară beta-
talasemică.
Mutaţiile HBB asociate cu anomalii hematologice minore sau absente în statusul heterozigot pun
probleme importante de diagnostic; identificarea acestora este necesară deoarece pot determina o
afecţiune semnificativă clinic la homozigoţi sau heterozigoţi compuşi. Aceste tipuri de mutaţii pot fi
împărţite în două grupuri:
- mutaţii care determină “silent thalassemia” cu indici eritrocitari şi procent de HbA2 normale;
- mutaţii care determină “almost silent thalassemia” cu procent de HbA2 normal şi indici
eritrocitari modificaţi.
Aceste forme pot fi detectate numai prin testare genetică. Unele mutaţii, cum ar fi +1480 C→G întâlnită
la populaţia greacă, sunt atât de uşoare încât determină aproape întotdeauna “silent thalassemia”.
Mutaţiile cel mai frecvent responsabile de această formă de talasemie sunt -101 C→T şi - 92 C→T
asociate cu următoarele valori medii: VEM=83.9 fL, HEM=28.6 pg şi HbA2=3.4%. “Almost silent
thalassemia” rezultă dintr-un grup mici de mutaţii, cum ar fi CAP+1 A→C în India şi ocazional IVS-6
T→C la mediteraneeni. Heterozigoţii pentru IVS-6 T→C prezintă următoarele intervale de valori :
VEM=60-78 fL şi HbA2=3.2-4-6%.
Deficitul de fier reduce procentul de HbA2 atât la persoanele fără defecte ale globinei cât şi la cele cu
tară beta-talasemică. Acest lucru nu reprezintă o problemă pentru persoanele cu o anomalie genetică
însoţită de creşteri semnificative de HbA2, însă pentru cei cu mutaţii uşoare asociate cu creşteri
minore de HbA2 deficitul de fier maschează tara beta-talasemică. Din acest motiv se recomandă ca la
pacienţii cu anemie feriprivă severă sau moderată să se corecteze mai întâi deficitul de fier după care,
în cazul în care persistă modificările indicilor eritrocitari, să se măsoare procentul de HbA2. O excepţie
de la această recomandare se va face în cazul pacientelor gravide la care diagnosticul tarei beta-
talasemice trebuie stabilit imediat. În această situaţie este necesar să se investigheze şi partenerul;
dacă acesta este depistat cu tară beta-talasemică, se va lua în considerare testarea genetică la
gravidele cu niveluri de HbA2 la limită.
Anemia megaloblastică poate conduce de asemenea la reducerea procentului de HbA2 şi interfera cu
diagnosticul tarei β-talasemice.
Asocierea indicilor eritrocitari modificaţi cu un nivel normal de HbA2 poate rezulta şi din coexistenţa
δ-talasemiei cu o mutaţie β0 sau β+ ce induce un procent mare de HbA2 (întâlnită la sarzi şi ciprioţi).
Hemoglobina Knossos este responsabilă de asemenea de unele cazuri de tară β-talasemică cu un
nivel normal de HbA2.
Prezenţa concomitentă a unei mutaţii β-talasemice uşoare (cum ar fi CAP+1 A→C) şi a unei tare de
α0-talasemie sau a unui status homozigot pentru α+-talasemie face ca diagnosticul tarei β-talasemice
să fie adesea omis.
Tară β-talasemică cu indici eritrocitari normali şi HbA2 crescută
Unii pacienţi heterozigoţi pentru anumite variante de β-talasemie uşoară pot să aibă niveluri crescute
de HbA2 în prezenţa unor indici eritrocitari normali; această condiţie a fost constată la o parte din
107
pacienţii purtători ai mutaţiei -101 C→T.

În plus, coexistenţa α şi β-talasemiei poate conduce la indici eritrocitari normali printr-o sinteză mai
echilibrată a lanţurilor globinei, însă cu un procent crescut de HbA2. Această modificare este întâlnită
în special la pacienţii având deleţii a două gene α sau o formă de α-talasemie nedeleţională.
Anomaliile dobândite, cum ar fi cele induse de afecţiuni hepatice, pot creşte valorile indicilor eritrocitari
la pacienţii cu tară β-talasemică.
Toate aceste exemple ilustrează complexitatea cazurilor de tară β-talasemică şi dificultatea identificării
acestora, testarea genetică fiind uneori singura investigaţie care poate confirma diagnosticului1;2.
Beta-talasemia dominantă
Deşi majoritatea persoanelor heterozigote pentru o mutaţie β-talasemică prezintă caracteristici
clinicopatologice descrise ca talasemie minoră (tablou hematologic modificat în absenţa manifestărilor
clinice), unele dintre acestea dezvoltă splenomegalie, anemie, icter şi litiază biliară, condiţie denumită
β-talasemie dominantă. Fenotipul este similar β-talasemiei intermedia şi este asociat atât cu o
eritropoieză ineficientă cât şi cu o componentă hemolitică. Prezenţa eritroblaştilor cu incluzii (compuse
din lanţuri α în exces şi lanţuri β-anormale) este caracteristică.
Sunt descrise peste 30 alele care induc fenotipul de β-talasemie dominantă, printre care se numără
mutaţiile apărute la nivelul regiunii 3’ a exonilor 2 sau 3 care determină o cantitate importantă de
ARNm mutant. Ca o consecinţă, se sintetizează lanţuri β trunchiate sau alungite, extrem de instabile,
care co-precipită cu lanţurile α normale1.
Beta-talasemia intermedia
Se referă la un fenotip clinic determinat de anomalii genetice diverse. Severitatea β-talasemiei
intermedia variază de la o condiţie clinică însoţită de retard de creştere şi deformaţii osoase, în care
supravieţuirea este rareori posibilă fără transfuzii de sânge, până la forme mai uşoare, asemănătoare
tarei β-talasemice, dar asociate cu un grad mai mare de anemie şi splenomegalie.
Pot să apară complicaţii cum ar fi: hipersplenism, litiază biliară, supraîncărcare cu fier, fenomene de
compresiune exercitate de masele de ţesut hematopoietic extramedular asupra unor organe vitale.
Tabloul hematologic include anomalii similare celor induse de β-talasemia heterozigotă tipică, însă are
o severitate mai mare; alături de microcitoză, hipocromie, anizocitoză, poikilocitoză, punctaţii bazofilie,
pot să apară policromatofilie şi eritroblaşti circulanţi.
Electroforeza hemoglobinei sau HPLC indică niveluri crescute de HbA2 (mai mari decât cele întâlnite
în tara β-talasemică) şi HbF.
β-talasemia intermedia poate să apară la pacienţii care prezintă fie una, fie ambele gene β anormale.
Cei care sunt homozigoţi sau heterozigoţi compuşi pentru alele β-talasemice au mutaţii asociate cu
forme uşoare de β+-talasemie sau prezintă factori amelioratori, cum ar fi coexistenţa tarei α-talasemice
sau o mutaţie care conduce la o sinteză crescută de lanţuri γ în condiţii de stres hematopoietic. Acele
persoane care au doar o genă β anormală fie prezintă o formă de β-talasemie dominantă, fie asociază
concomitent mutaţii care agravează dezechilibrul lanţurilor globinei, cum ar fi statusul homozigot sau
heterozigot pentru triplu α sau cvadruplu α (gene α multiplicate de 3 sau 4 ori).
Testele genetice facilitează identificarea anomaliilor care determină fenotipul de β-talasemie
intermedia1;6
Beta-talasemia majoră
108
18
Pacienţii homozigoţi sau heterozigoţi compuşi pentru mutaţii β-talasemice care sunt dependenţi de
transfuzii de sânge prezintă condiţia clinică numită β-talasemie majoră.
Boala este recunoscută adesea în primul an de viaţă, începând cu vârsta de 3 luni; se caracterizează
printr-o anemie severă însoţită de o eritropoieză accelerată, atât în sectorul medular cât şi în cel
extramedular. Expansiunea hematopoietică conduce la deformări osoase severe, în special ale
oaselor craniului şi feţei; hematopoieza extramedulară conduce la hepatosplenomegalie masivă.
Seria eritrocitară prezintă următoarele valori: Hb=3-7 g/dL, VEM=50-60 fL, HEM=12-18 pg. Frotiul
de sânge include microcitoză, hipocromie, anizocitoză şi poikilocitoză marcate, punctaţii bazofile,
eritroblaşti circulanţi cu defect de hemoglobinizare şi trăsături diseritropoietice.
În cazurile de homozigoţie sau heterozigoţie compusă pentru β0-talasemia (β0/β0) electroforeza
hemoglobinei sau tehnica HPLC indică prezenţa numai de HbA2 şi HbF; atunci când pacienţii prezintă
homozigoţie pentru β+-talasemie (β+/β+) sau heterozigoţie compusă pentru β0 şi β+-talasemie (β+/β0)
este prezentă şi HbA într-un procent de până la 35%.
În β-talasemia majoră procentul de HbA2 poate fi normal, crescut sau, ocazional, scăzut1;2.
Bibliografie
1. Barbara J. Bain. Haemoglobinopathy Diagnosis. Blackwell Science, 2001, 7-9; 73-93.

2. Caterina Borgna Pignatti, Renzo Galanello. Thalassemias and Related Disorders of Hemoglobin
Synthesis. In Wintrobe`s Clinical Hematology, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1083-
1118.
3. Cornel Mironel Niculae. Transcrierea (transcripţia). Bioinformatică. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/
transcrierea.htm. Reference Type: Internet Communication.
4. Frenette PS, Atweh GF. Sickle cell disease: old discoveries, new concepts, and future promise.
In J. Clin. Invest. 117(4): 850/858 (2007).
6. Renzo Galanello, Antonio Cao. Beta-Thalassemia. Gene Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov.
ReferenceType: Internet Communication.
7. Talmaci R, Diagnosticul molecular al β-talasemiilor. Progrese in biotehnologie, vol. II. Ed. Ars
Docendi, p.179-188, 2002.
109
18.1.1.8 Delta-beta talasemia şi persistenţa ereditară de hemoglobină fetală
Un număr semnificativ de deleţii, cu localizări şi dimensiuni variabile, survenite la nivelul clusterului

genelor β de pe cromozomului 11 sunt asociate cu 2 entităţi clinice caracterizate printr-un procent
crescut de HbF în viaţa adultă: delta-beta talasemia şi persistenţa ereditară de hemoglobină fetală2.
● δβ0 (delta-beta zero)-talasemia rezultă din deleţia ambelor gene δ şi β, cu păstrarea intactă a
genelor γ. Aγδβ-talasemia se produce ca urmare a deleţiilor genelor Aγ, δ şi β.
Heterozigoţii prezintă un fenotip similar tarei β-talasemice, însă procentul de HbA2 tinde să fie redus
la jumătate, în timp ce HbF este constant crescută, cu valori de 5-15%. Aceştia prezintă de obicei
splenomegalie şi o valoare a Hb de 8-13 g/dL; VEM poate fi redus sau la limita inferioară a normalului;
HEM poate fi redus sau normal.
Datorită sintezei crescute de HbF, homozigoţii sau heterozigoţii compuşi care asociază o mutaţie
severă β+ sau β0 vor prezenta mai degrabă un fenotip de β-talasemie intermedia decât unul de
β-talasemie majoră.
Homozigoţii pentru δβ sau Aγδβ-talasemia prezintă HbF într-un procent de 100%. δβ-talasemia
este întâlnită la multe grupuri etnice, însă predomină la populaţiile din bazinul mediteramean. Aγδβ-
talasemia apare de asemenea la multe popoare, fiind mai frecventă în China şi India1.
Tipul spaniol de δβ0-talasemie este generat de o deleţie mare care îndepărtează 114 kb din clusterul
genelor β3. Tipul de tară δβ-talasemică întâlnit in Sardinia constituie de fapt o fenocopie a tarei, cauzat
de coexistenţa (în poziţia cis) mutaţiei nonsens a codonului 39 – o cauză obişnuită de β0-talasemie în
zona mediteraneană – şi a mutaţiei promotorului Aγ care conduce la producerea excesivă a lanţurilor
γ; se caracterizează prin prezenţa indicilor talasemici, a unui procent normal de HbA2 şi a HbF într-un
procent de 15-20%. O altă fenocopie, descrisă iniţial în Corfu, este produsă de coexistenţa unei deleţii
care se întinde în aval de gena ψβ şi cuprinde gena δ, cu o mutaţie punctiformă la nivelul genei β;
heterozigoţii prezintă fenotipul tarei de δβ-talasemie, în timp ce homozigoţii au HbF într-un procent
apropiat de 100%.
● Persistenţa ereditară de HbF (HPFH) poate fi definită ca o condiţie moştenită în care heterozigoţii
prezintă un procent crescut de HbF care persistă în viaţa adultă, indici eritrocitari normali şi o sinteză
echilibrată a lanţurilor globinei. Este considerat ca având o valoare diagnostică un procent de HbF
care depăşeşte 8%, în timp ce un procent de 4-8% este considerat echivoc.
HPFH poate rezulta ca urmare a unor deleţii la nivelul clusterului genelor β sau a unor mutaţii sau
polimorfisme ale genelor reglatoare, de pe cromozomul 11 sau în afara acestuia.
HPFH deleţională se produce ca urmare a unor deleţii relativ mari care includ genele δ şi β; este
o condiţie destul de comună în anumite grupuri etnice (prevalenţă de 1 la 1000 în rândul afro-
americanilor). Sunt cunoscute cel puţin 5 tipuri de deleţii clasificate ca (δβ)0HPFH: două sunt întâlnite
la persoane de origine africană, una la indieni şi două la italieni. În toate aceste cazuri se înregistrează
deleţia ambelor gene δ şi β, dar cu menţinerea intactă a celor 2 gene γ. Heterozigoţii pentru (δβ)0HPFH
prezintă un procent variabil de HbF, în funcţie de tipul deleţiei. Procentul de HbA2 este uşor scăzut
sau normal; valoarea hemoglobinei este normală însă VEM şi HEM pot prezenta valori scăzute,
într-o anumită măsură. Diferenţa faţă de δβ0-talasemie constă în faptul că aceasta din urmă prezintă
HbF într-un procent de 5-15% şi un dezechilibru în sinteza lanţurilor globinei; distribuţia HbF este
110
18
pancelulară în (δβ0)HPFH şi heterocelulară în δβ0-talasemie.

Homozigoţii nu prezintă anemie; de fapt poate să apară chiar o policitemie uşoară deoarece HbF
are o afinitate pentru oxigen mai mare decât HbA. În unele cazuri indicii eritrocitari pot sugera tara
β-talasemică (număr crescut de eritrocite,VEM şi HEM scăzute).
Coexistenţa HPFH deleţională cu siclemia determină o formă de boală foarte uşoară, cu aproximativ
30% HbF şi 70% HbS.
Heterozigoţii compuşi pentru HPFH deleţională şi β-talasemie prezintă în jur de 70% HbF. Fenotipul
este variabil. În cazul celor două tipuri africane fenotipul generat este foarte blând, în timp ce pentru
tipul Indian heterozigoţii compuşi prezintă tablou de β-talasemie intermedia1.
- depistarea purtătorilor, mai ales la persoanele care asociază siclemie sau β-talasemie (în
scop prognostic);
- diagnostic prenatal5.
hemolizate4.
Metodă – analiza deleţiilor/duplicaţiilor (MLPA) de la nivelul clusterului genelor β4.
Bibliografie
1. Barbara J. Bain. Haemoglobinopathy Diagnosis. Blackwell Science, 2001, 93-101.

2. Craig JE, et al. Rapid detection of deletions causing delta beta thalassemia and hereditary
persistence of fetal hemoglobin by enzymatic amplification. In Blood, 1994.
3. Eva Barragan. Molecular detection of Spanish δβ-thalassemia associated with β-thalassemia
identified during prenatal diagnosis. In Clinica Chimica Acta, vol.368, Jun 2006, 195-198.
5. Renzo Galanello, Antonio Cao. Beta-Thalassemia. Gene Reviews, 2008. www.ncbi.nlm.nih.gov.
ReferenceType: Internet Communication.
18.1.1.9 Hemoglobinopatia Lepore
Hemoglobinopatia Lepore (delta-beta hemoglobina hibrid) a fost descrisă în 1958 de către Gerald
& Diamond şi denumită astfel după numele primului pacient la care a fost recunoscută această
variantă de Hb; este caracterizată printr-o hemoglobină anormală, în care lanţurile α sunt normale, iar
111
lanţurile non-α au o structură asemănătoare lanţurilor δ la capatul N-terminal şi lanţurilor β la capătul

C-terminal1;3;5.
Mecanismul molecular aflat la baza acestei hemoglobinopatii este apariţia în cursul meiozei a unui
crossing-over inegal, cu deleţia porţiunii 3’ a genei δ şi cea a porţiunii 5’ a genei β, ceea ce dă naştere
la gena de fuziune δβ. Gena de fuziune codifică un lanţ hibrid δβ care este sintetizat la o rată mult mai
redusă în comparaţie cu lanţul β normal, datorită instabilităţii ARN-ului mesager1;2;5.
Hemoglobinopatia Lepore la heterozigoti se caracterizează prin prezenţa Hb Lepore într-un procent
de 5-10%, cu migrare asemănătoare HbS şi scăderea procentului de Hb A2; la homozigoţi Hb Lepore
reprezintă 10-20%, restul fiind format de HbF (Hb A şi Hb A2 lipsesc în totalitate)3.
Deoarece situsurile de deleţie sunt variabile au fost descrise mai multe tipuri de hemoglobinopatie
cu fuziunea δβ, cele mai importante fiind: Hb Lepore Boston-Washington (δ87Glnβ116His), Hb Lepore
Hollandia (δ22Alaβ50Thr) şi Hb Lepore Baltimore (δ50Serβ86Ala) care diferă în ceea ce priveşte regiunea la
care s-a produs crossing-over-ul1;6.
Hemoglobinopatia cea mai frecventă este Hb Lepore Boston-Washington, întâlnită mai ales la populaţia
din sudul Italiei, în Grecia (în special Macedonia), România, Turcia şi Iran (Rowly et al.1969)5.
Trebuie menţionat faptul că fenomenul de crossing-over inegal are loc şi la nivelul genelor normale δ
şi β. Produsul acestor gene anti-Lepore reprezintă 15-20% din totalul de hemoglobină. În funcţie de
localizarea fuziunii au fost descrise mai multe hemoglobine anti-Lepore: Hb Miyada, P Congo, P Nilotic,
Hb Lincoln Park, purtătorii având un nivel normal de hemoglobină şi indici eritrocitari normali2.
Hb Lepore este importantă datorită posibilităţii interacţiunii cu hemoglobina S şi cu beta-talasemiile.
Din punct de vedere funcţional poate fi considerată ca o (δβ)+-talasemie.
Tabloul hematologic la heterozigoţi nu poate fi diferenţiat de cel al tarei de β-talasemie. Hemoglobinopatia
Lepore poate fi detectată prin analiza electroforetică a hemoglobinei; la pH alcalin hemoglobina Lepore
migrează asemănător HbS; în mediu acid Hb Lepore migrează în dreptul HbA. HBA2 este redusă
în medie la jumătate din valoarea normală; HbF poate fi uneori uşor crescută1. Homozigoţii pentru
hemoglobina Lepore, la fel ca şi heterozigoţii compuşi pentru Hb Lepore şi β-talasemie, prezintă
tabloul clinic şi hematologic al β-talasemiei majore sau cel al β-talasemiei intermedia1;2;5.
Identificarea şi cuantificarea Hb Lepore se poate face şi prin metoda cromatografică HPLC, dar
metodele de biologie moleculară sunt necesare pentru stabilirea tipului de hemoglobinopatie2;4.
- depistarea purtătorilor, mai ales la persoanele care asociază siclemie sau β-talasemie (în
scop prognostic);
- diagnostic prenatal2.
Cantitate recoltată – 5 mL sânge4.
hemolizate4.
Metodă – secvenţierea produşilor genei de fuziune δβ4.
112
18
Bibliografie
1. Barbara J. Bain. Haemoglobinopathy Diagnosis. Blackwell Science, 2001, 86-87.

2. Caterina Borgna Pignatti, Renzo Galanello. Thalassemias and Related Disorders of Hemoglobin
Synthesis. In Wintrobe`s Clinical Hematology, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1083-
1118.
3. Dan Coliţă. Hematologie. În Tratat de medicină internă. 1997, 759-802.
5. Marinucci M, Mavilio F, Massa A, Gabbianelli M, Fontanarosa PP, Samoggia P, Tentori L.
Hemoglobin Lepore trait: haematological and structural studie son the Italian population. In Br
JHaematol, 1979, Aug; 42(4): 557-65.
6. Ropero P, González FA, Sánchez J, Anguita E, Asenjo S, Del Arco A, Murga MJ, Ramos R,
Fernández C, Villegas A, Identification of the Hb Lepore phenotype by HPLC, In Haematologica.
1999 Dec;84(12):1081-4.
18.1.1.10 Hemofilia A – testare genetică
Hemofilia A (hemofilia clasică), cauzată de deficienţa activităţii coagulante a FVIII, reprezintă, ca
frecvenţă, cea de-a doua boală hemoragică moştenită după boala von Willebrand, cu o incidenţă de
până la 1/10000 persoane, cu o prevalenţă similară între diferitele grupe rasiale1;2. Hemofilia A este
exemplul clasic de tară recesivă X-linkată, boala fiind cauzată de mutaţii heterogene la nivelul genei
FVIII (F8) de pe cromozomul Xp286.
Boala se manifestă la barbaţi care nu prezintă o alelă normală; aceştia nu transmit anomalia la fiii
lor, dar toate fiicele sunt purtătoare ale tarei. Majoritatea femeilor carrier nu sunt afectate datorită
prezenţei unei alele normale moştenite de la mamă, iar ele vor transmite boala la jumătate din fiii lor
şi statusul de carrier la jumătate din fiice2.
Indivizii afectaţi prezintă un fenotip variabil în funcţie de severitatea deficienţei FVIII, respectiv
expresivitatea defectului genetic, dar în cadrul aceleeaşi familii severitatea clinică este constantă,
deşi alţi factori genetici sau de mediu pot modifica într-o anumită măsură severitatea clinică1;2. Astfel,
pacienţii cu hemofilie A severă (nivel de FVIII <1%) sunt diagnosticaţi în primul an de viaţă, sângerările
musculare profunde şi hemartrozele spontane reprezentând simptomele cele mai frecvente. Indivizii
cu hemofilie A moderat severă (FVIII = 2-5%) prezintă de obicei sângerări prelungite sau întârziate
după traume minore şi sunt diagnosticaţi în general înainte de vârsta de 5-6 ani. Indivizii cu hemofilie
113
A uşoară (FVIII = 5-30%) prezintă sângerări anormale după intervenţii chirurgicale, extracţii dentare
sau traume majore, aceştia fiind de obicei diagnosticaţi mai târziu în timpul vieţii1;5. Proporţia cazurilor
severe, moderate, uşoare este de 50%, 10%, respectiv 40%6. Aproximativ 10% din femeile carrier
au nivelul FVIII <35% şi sunt simptomatice, simptomele fiind de obicei uşoare, variaţiile în nivelul
FVIII fiind atribuite lionizării (inactivarea cromozomului X normal în cursul embriogenezei)1;5;6. Alte
cauze ale hemofiliei A la femei sunt: copilul de sex feminin moşteneşte doi cromozomi X anormali
de la tatăl hemofilic şi mama carrier; anumite boli cromozomiale pot duce la apariţia unui genotip
hemizigot şi induc hemofilia prin absenţa unei alele normale: mozaicism 45XX/45X, cariotip 46XY,
deleţia cromozomului X (genotip XO, sindrom Turner). În cazuri rare bolnavi nehemofilici, cu boli
autoimune (lupus eritematos sistemic, artrită reumatoidă) sau după administrare de medicamente
(peniciline, fenitoin) sau cu boli limfoproliferative, pot dezvolta autoanticorpi anti-FVIII care determină
apariţia hemofiliei A dobândite.
Comoştenirea mutaţiei factorului V Leiden sau a altor factori de risc protrombotic poate explica
variabilitatea fenotipului între pacienţi cu acelaşi defect molecular al FVIII2.
Rosendaal şi alţii (1990) au prezentat dovezi că mortalitatea datorată bolii ischemice cardiace este
mai mică la hemofilici decât în populaţia generală6.
Gena FVIII are 186 bp (perechi de baze), cu 26 exoni şi 25 introni, conţinând insule CpG, care
predispun gena la mutaţii şi codifică un ARNm de 9 kb, aproximativ 5% din ADN fiind localizat în exoni,
iar 95% reprezentând “non-coding” ADN. FVIII este exprimat cu un peptid semnal de 19 aminoacizi,
proteina matură are 2332 reziduuri, structura domeniilor dinspre capătul amino-terminal fiind “A1-A2-
B-A3-C1-C2”, omologă FV al coagulării. Este sintetizat în principal în ficat şi circulă în plasmă sub
formă inactivă fiind stabilizat prin legare de FVW. O dată activat de către trombină, este eliberat de
FVW şi se leagă la suprafaţa membranară fosfolipidică.
Diagnosticul de hemofilie A este stabilit la indivizi cu nivel scăzut al activităţii coagulante a FVIII în
prezenţa unui nivel normal de FVW1;4.
Recomandări pentru testarea genetică în hemofilia A1;5
• Testarea genetică a unui individ afectat pentru detecţia mutaţiei specifice a FVIII într-o
familie, în vederea obţinerii de informaţii necesare consilierii genetice a membrilor familiei
cu risc crescut.
• Diagnosticul diferenţial cu boala von Willebrand, în special tipul 3 (care clinic şi biochimic
este similară hemofiliei A uşoare), constând în testarea genetică a genei FVIII, testarea
genetică a genei FVW sau măsurarea activităţii FVW de legare a FVIII (când aceasta este
disponibilă).
• La indivizii care reprezintă singurul caz din familie identificarea mutaţiei specifice poate
ajuta la predicţia fenotipului clinic şi stabilirea riscului de a dezvolta inhibitori ai FVIII.
• Testarea pentru carrier a rudelor cu risc (necesită identificarea mutaţiei cauzatoare în
familie). Se recomandă ca statusul de carrier să fie stabilit înaintea sarcinii sau cât mai
devreme în sarcină.
• Diagnosticul prenatal şi preimplantare pentru sarcinile cu risc (necesită identificarea mutaţiei
cauzatoare în familie). Procedura uzuală constă în determinarea sexului fetal prin analiza
114
18
cromozomilor în celulele fetale obţinute din vilozităţile coriale la 10-12 săptămâni de sarcină
sau prin amniocenteză la 15-18 săptămâni, iar dacă carioptipul este 46XY, ADN-ul extras
din celulele fetale poate fi analizat pentru prezenţa mutaţiei sau pentru markerii informativi.
Dacă mutaţia nu este cunoscută, iar linkajul nu este informativ, diagnosticul prenatal este
posibil prin măsurarea activităţii coagulante a FVIII în sângele obţinut prin puncţia percutană
a cordonului ombilical la 18-21 săptamâni de sarcină (risc 1-6% de moarte fetală).
Metodă - sunt disponibile două variante de testare:
- analiza inversiilor IVS1 şi IVS2 prin reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) este prima
recomandată la pacienţii cu hemofilie A severă;
- hemofilia A panel extins: secvenţierea genei F8 şi analiza deleţiilor/duplicaţiilor prin MLPA,
la pacienţii cu hemofilie A severă la care nu se depistează una din cele două inversii,
precum şi la pacienţii cu hemofilie A uşoară sau moderată1,3.
Aproximativ 98% din pacienţii cu hemofilie A prezintă mutaţii la nivelul genei F8, fiind raportate peste
1000 mutaţii, incluzând deleţii, inserţii, mutaţiile punctiforme ale dinucleotidelor CpG fiind în mod
special comune. Deleţii largi (>50 nucleotide) apar la aproximativ 5% din pacienţii cu hemofilie A.
Aproximativ 40% din cazurile de hemofilie A severă rezultă dintr-o inversiune majoră a vârfului braţului
lung al cromozomului X, unul dintre punctele sale de ruptură (breakpoints) fiind situate la nivelul
intronului 22. O altă inversiune comună, la nivelul intronului 1, apare în 2-3% din deficienţele severe
de FVIII2;5.
Gena F8A reprezintă o genă situată în interiorul genei FVIII, conţinută în întregime în intronul 22,
lipsită de introni şi fiind transcrisă în direcţie inversă faţă de FVIII. Cromozomul X conţine 3 copii
ale F8A şi regiunilor sale adiacente, una în intronul 22 şi două telomeric şi la ~500kb în amonte de
situsul de start al transcripţiei FVIII. Intronul 22 este neobişnuit din multe puncte de vedere. Este cel
mai mare intron al genei FVIII (32 kb) şi, de asemenea, conţine o insulă CpG localizată ~10kb în aval
de exonul 22, aceasta părând a servi ca promoter bidirecţional pentru F8A şi F8B (gena F8B este
de asemenea localizată în intronul 22 şi este transcrisă în direcţie inversă faţă de FVIII). Multe din
mutaţiile care rezultă în hemofilia A severă sunt bazate pe recombinarea dintre secvenţele omologe
F8A din intronul 22 şi din amonte de gena FVIII, ducând la inversiunea şi translocarea exonilor 1-22
faţă de exonii 23-26. Acest defect îşi are originea în principal în celulele germinale masculine, în
timpul diviziunii celulare meiotice, când lipsa unei formaţiuni bivalente facilitează “îndoirea” (“flipping”)
capătului telomeric al cromozomului X unic4,6.
115
Fig. 18.1.1.10 Factorul VIII cu inversia în intronul 1 din cromozomul X7.

Intronul 1, flancat de exoni, orientaţi în direcţia transcripţiei, conţinând secvenţa repetitivă 9b flancată
de secvenţele unice 9a şi 9c; în urma recombinării intre cele două
secvenţe 9b are loc inversia. CEN-centromeric; TEL-telomeric.
Richard D. Bagnall, Naushin Waseem, Peter M. Green and Francesco Giannelli, Blood, 2002, 99: 168-174.
Rata de detecţie a mutaţiilor la indivizii cu hemofilie A care nu prezintă una din cele două inversiuni
comune variază între 75-98%. În hemofilia A severă alterări grosiere ale genei (deleţii sau inserţii largi,
mutaţii ale cadrului de citire sau ale joncţiunii de “splicing’, mutaţii nonsense şi missense) contează
pentru aproximativ 50% din mutaţiile detectate1.
În schimb la pacienţii cu hemofilie A moderată sau uşoară cel mai frecvent sunt detectate mutaţii
punctiforme missens la nivelul exonilor care codifică domeniile A sau C1;2 , aproximativ jumătate din
mutaţii fiind grupate la nivelul domeniului A26.
Produşii genei anormale variază între absenţa unei proteine detectabile (majoritatea cazurilor
de hemofilie A severă) la niveluri normale ale unei proteine disfuncţionale (5% din cazuri), restul
pacienţilor (45%) având niveluri concordant scăzute ale antigenului şi activităţii coagulante a FVIII.
Anumite mutaţii cum ar fi codoni terminali prematuri, inversii sau deleţii largi ale genei se asociază cu
risc crescut de apariţie a inhibitorilor1;6.
Există elemente ale istoricului familial predictoare pentru statusul de carrier al unei femei:
- o femeie care are un fiu afectat şi o altă rudă afectată pe linie maternă este carrier obligatoriu;
- dacă o femeie are mai mult de un fiu afectat şi mutaţia nu poate fi detectată la nivelul ADN-ului său,
116
18
atunci ea prezintă mozaicism al liniei germinale (rar).

Hemofilia A rezultă şi ca urmare a unei rate crescute de mutaţii spontane, favorizate de dimensiunile
mari ale genei (186kb) şi de prezenţa de puncte fierbinţi (“hot spots”), cum ar fi dinucleotidele CpG,
aceste mutaţii apărând de cel puţin 3 ori mai frecvent la bărbaţi decât la femei. În fapt aproximativ o
treime din hemofilici nu prezintă istoric familial de sângerări anormale2. Dacă un pacient este un caz
simplex (fără istoric familial de hemofilie), există câteva posibilităţi în ceea ce priveşte statusul de
carrier al mamei sale:
- mama nu este carrier şi pacientul prezintă o mutaţie de novo;
- mama este carrier de novo, mutaţia apărând ca o mutaţie a liniei germinale (prezentă
în toate celulele şi detectabilă la nivelul ADN-ului), ca o mutaţie somatică (prezentă în
unele celule şi care poate să nu fie detectabilă la nivelul ADN-ului) sau mozaicism al liniei
germinale (mutaţia este prezentă în unele celule germinale, dar nu este detectabilă în ADN-
ul din leucocite);
- mama este carrier şi a moştenit mutaţia cauzatoare de la mamă, care are o mutaţie de novo
sau de la tatăl asimptomatic care este mozaic pentru mutaţie;
- mama este carrier pentru o mutaţie apărută în generaţiile anterioare, care a trecut prin
familie, fiind asimptomatică la femeile carrier.
Per ansamblu mama are 80% şanse să fie carrier, dar şansele sunt 98% dacă pacientul prezintă o
formă severă de boală asociată cu inversiunea intronului 221.
Mozaicismul poate reprezenta un eveniment destul de comun în hemofilia A; astfel stabilirea riscului
în cadrul consilierii genetice trebuie să ia în considerare posibilitatea mozaicismului somatic în familiile
cu mutaţii aparent de novo, în special în cazul mutaţiilor punctiforme5;6.
Au fast raportate cazuri de hemofilie A cu transmitere autozomal dominantă care trebuie diferenţiate
de tipul 2N de boală vonWillebrand2.
Când testarea pentru carrier este efectuată fără identificarea anterioară a mutaţiei în familie, obţinerea
unui rezultat negativ la o rudă cu risc nu este informativă.
Măsurarea activităţii coagulante a FVIII nu este suficientă pentru determinarea statusului de carrier,
ea fiind doar sugestivă dacă este scăzută1.
Bibliografie
1. Brower C, Thompson A. „Hemophilia A”. GeneReviews, NCBI Bookshelf. Ref Type: Internet
Communication.
2. Friedman K, Rodgers G. „Inherited Coagulation Disorders”. În Wintrobe`s Clinical Hematology,
Wilkins, 2004, 1379-82.
4. Maclean R, Makris M. „Hemophilia A and B”. În Practical Hemostasis and Thrombosis,
O’Shaughnessy D, Makris M, Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 41-43.
117
Organizations. “Hemophilia A, Molecular Analysis for Inversion, Diagnosis and Carrier

Detection”. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
6. Online Mendelian Inheritance in Man, McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns
Hopkins University School of Medicine. „Hemophilia A”. Ref Type: Internet Communication.
7. Richard D. Bagnall, Naushin Waseem, Peter M. Green and Francesco Giannelli. Recurrent
Inversion Breaking Intron 1 of the Factor VIII Gene Is A Frequent Cause of Severe Hemophilia
A. In Blood, 2002, 99: 168-174.
18.1.1.11 Hemofilia B – testare genetică
Hemofilia B (boala Christmas), este caracterizată prin deficienţa activităţii coagulante a FIX şi este
moştenită ca o tară recesivă X-linkată, gena FIX (F9) fiind situată centromeric faţă de gena FVIII pe
cromozomul X, la Xq27. Prevalenţa hemofiliei B este de 1/20-30 mii nou-născuţi vii de sex masculin,
hemofilia A fiind de 4-8 ori mai frecventă. Ca şi hemofilia A, hemofilia B este prezentă la toate grupurile
etnice1;2;5.
Boala se manifestă la bărbaţi care nu prezintă o alelă normală; aceştia nu transmit anomalia la fiii
lor, dar toate fiicele sunt purtătoare ale tarei. Majoritatea femeilor carrier nu sunt afectate datorită
prezenţei unei alele normale moştenite de la mamă, iar ele vor transmite boala la jumătate din fiii lor
şi statusul de carrier la jumătate din fiice.
Fenotipic boala este similară hemofiliei A, defectele FIX putând fi severe sau uşoare, formele severe
fiind mai rare dacât în hemofilia A. Pacienţii cu hemofilie B severă (nivel de FIX <1%) sunt diagnosticaţi
în primul an de viaţă, sângerările musculare profunde şi hemartrozele spontane reprezentând
simptomele cele mai frecvente. Indivizii cu hemofilie B moderat severă (FIX = 1-5%) prezintă de
obicei sângerări prelungite sau întârziate după traume minore şi sunt diagnosticaţi în general înainte
de vârsta de 5-6 ani. Indivizii cu hemofilie B uşoară (FIX = 5-30%) prezintă sângerări anormale după
intervenţii chirurgicale, extracţii dentare sau traume majore, aceştia fiind de obicei diagnosticaţi mai
târziu în timpul vieţii1. La orice individ cu hemofilie B frecvenţa episoadelor hemoragice poate fi mai
mare în copilărie şi adolescenţă decât la vârsta adultă. Aproximativ 10% din femeile carrier prezintă risc
de sângerare, având nivele de FIX <30%, indiferent de severitatea hemofiliei B în familie, simptomele
fiind de obicei uşoare. O creştere foarte uşoară a simptomelor hemoragice poate exista chiar la cele
cu activitate coagulantă a FIX de 40-60%. Sângerarea poate fi mai severă la cele cu activitatea
FVIII la limita inferioară a normalului1. Variaţiile în nivelul FIX sunt atribuite lionizării (inactivarea
cromozomului X normal în cursul embriogenezei)1;6. Alte cauze ale hemofiliei A la femei sunt: copilul
de sex feminin moşteneşte doi cromozomi X anormali de la tatăl hemofilic şi mama carrier; anumite
boli cromozomiale pot duce la apariţia unui genotip hemizigot şi induc hemofilia prin absenţa unei alele
118
18
normale: mozaicism 45XX/45X, cariotip 46XY, deleţia cromozomului X (genotip XO, Sindrom Turner).
În cazuri rare bolnavi nehemofilici, cu boli autoimune (lupus eritematos sistemic, artrită reumatoidă)
sau după administrare de medicamente (peniciline, fenitoin) sau cu boli limfoproliferative, pot dezvolta
autoanticorpi anti-FIX care determină apariţia hemofiliei B dobândite.
În funcţie de detecţia antigenului FIX în plasmă, pot fi definite 3 grupuri distincte: o variantă CRM
(cross reactive material) - pozitivă, forma cea mai comună, o variantă CRM-negativă şi o variantă
CRM-redusă, în care nivelul antigenului şi activităţii coagulante a FIX sunt proporţional reduse2;6.
Modificările de laborator clasice sunt reprezentate de aPTT prelungit cu PT normal. Un subset de
pacienţi cu hemofilie B prezintă PT prelungit atunci când se utilizează creier de origine bovină ca
sursă de tromboplastină, aceşti pacienţi CRM (+) fiind clasificaţi ca având hemofilie B(M). Un număr
de mutaţii missense care afectează aminoacizii din poziţiile 180, 181, 182 şi câteva reziduuri din
apropierea situsului activ rezultă într-un FIX anormal şi inactiv care acţionează ca inhibitor al reacţiei
normale dintre FVII şi FX şi creierul bovin. PT determinat cu creier de iepure sau tromboplastină de
origine umană nu este prelungit2;6.
În hemofilia B Leyden manifestările clinice tind să diminueze o dată cu înaintarea în vârstă în asociere
cu creşterea nivelului FIX de la ~1UI/dL în copilărie până la 20UI/dL în viaţa adultă. Varianta Leyden
este caracterizată ca CRM (-) la naştere, devenind ulterior CRM (+) sau redusă. Baza genetică a
acestei variante este faptul că mutaţiile responsabile sunt localizate la nivelul promotorului genei FIX,
la bp -23 până la bp +13, care se crede că introduc în promotor un element responsiv la androgeni şi
care, cu vârsta, stimulează transcripţia şi sinteza proteinei2;4.
Rogaev et al.(2009) au identificat o mutaţie a situsului de splicing la nivelul genei F9 ca mutaţia
cauzativă pentru ‘boala regală’, forma de hemofilie transmisă de la Regina Victoria la familiile regale
europene şi transmisă nepoatei sale, Împărăteasa Rusiei Alexandra, şi fiului acesteia, prinţul Alexei6.
Gena FIX este considerabil mai mică decât gena FVIII, având 34 kb lungime, conţinând numai 8
exoni care codifică un ARNm de 2.8 kb. Ca şi FVIII, FIX este sintetizat predominant în ficat şi este
omolog FVII, FX şi PC. Produsul genei include câteva domenii distincte: primul şi al doilea domeniu
reprezintă peptidul semnal şi, respectiv, propeptidul, care sunt clivate generând proteina matură de
415 aminoacizi. Modificările posttranslaţionale includ glicozilare, sulfatare, fosforilare, β-hidroxilare şi
γ-carboxilare. O γ-carboxilază se leagă la propeptid înaintea clivării şi, într-o etapă dependentă de
vitamina K, converteşte primele 12 reziduuri de acid glutamic de la capătul N-terminal în reziduuri
γ-carboxilglutamice sau Gla. Apoi domeniul Gla leagă ionii de Ca şi adoptă o conformaţie capabilă
de legarea la suprafeţele fosfolipidice unde are loc coagularea. Adiacent domeniului Gla sunt două
domenii omologe factorului de creştere epidermal. Următoarele domenii constituie o secvenţă de
conectare care include peptidul activator, iar în final domeniul catalitic, acesta fiind o serinprotează
tipică. Peptidul activator este clivat de la nivelul formei de zimogen a FIX de către FVIIa/FT sau FXIa,
rezultând enzima activă FIXaβ1;4;7.
Rar, mutaţii la nivelul domeniului de legare a carboxilazei determină creşterea sensibilităţii la
tratamentul cu warfarină la indivizi fără tendinţă hemoragică de bază1.
Au fost descrise 10 polimorfisme utile pentru analiza linkajului genetic asociate cu gena F9. O listă
actualizată a mutaţiilor este disponibilă pe www.kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemB-database.html.
119
Diagnosticul de hemofilie B este stabilit la indivizi cu nivel scăzut al activităţii coagulante a FIX1.
Deficienţa uşoară a FIX trebuie întotdeauna luată în considerare în diagnosticul diferenţial al pacienţilor
cu sângerări sugestive şi rezultate normale ale testelor de coagulare de rutină (PT, aPTT), deoarece
mulţi reactivi pentru aPTT nu detectează deficienţele uşoare (20-30%) ale FIX1;2.
Activitatea coagulantă a FIX în sângele de cordon la nou-născuţii la termen este mai mică decât la
adulţi (în medie ~30%, limite 15-50%); astfel diagnosticul de hemofilie B poate fi stabilit la sugar dacă
activitatea FIX <1%, dar este echivoc la valori moderat scăzute (15-20%), iar testul trebuie repetat la
vârsta de 6 luni1;4.
Recomandări pentru testarea genetică în hemofilia A
• Testarea genetică a unui pacient pentru detecţia mutaţiei specifice a FIX într-o familie, în
vederea obţinerii de informaţii necesare consilierii genetice a membrilor familiei cu risc
crescut.
• La indivizii care reprezintă singurul caz din familie identificarea mutaţiei specifice poate
ajuta la predicţia fenotipului clinic şi stabilirea riscului de a dezvolta inhibitori ai FIX.
• Testarea pentru carrier a rudelor cu risc (necesită identificarea mutaţiei cauzatoare în
familie) este recomandată înaintea sarcinii sau cât mai devreme în sarcină.
• Diagnosticul prenatal şi preimplantare pentru sarcinile cu risc (necesită identificarea mutaţiei
cauzatoare în familie) Procedura uzuală constă în determinarea sexului fetal prin analiza
cromozomilor în celulele fetale obţinute din vilozităţile coriale la 10-12 săptămâni de sarcină
sau prin amniocenteză la 15-18 săptămâni, iar dacă cariotipul este 46XY, ADN-ul extras
din celulele fetale poate fi analizat pentru prezenţa mutaţiei sau pentru markerii informativi.
Dacă mutaţia nu este cunoscută, iar linkajul nu este informativ, diagnosticul prenatal este
posibil prin măsurarea activităţii coagulante a FIX în sângele obţinut prin puncţia percutană
a cordonului ombilical la 18-21 săptămâni de sarcină (diagnosticul de hemofilie B poate fi
stabilit dacă nivelul FIX este <1%, dar este echivoc dacă este moderat scăzut)1.
Metodă – secvenţierea genei F9 şi analiza deleţiilor/duplicaţiilor prin MLPA3.
Aproximativ 99% din pacienţii cu hemofilie B prezintă mutaţii la nivelul genei F9. Au fost descrise 896
mutaţii distincte raportate în baza de date a FIX, ~30% apărând la nivelul dinucleotidelor CpG, care
de obicei implică reziduuri de arginină critice, rezultând în proteine disfuncţionale. Diferite genotipuri
se asociază cu lipsa absolută sau relativă a proteinei FIX, iar câteva mutaţii missense se asociază cu
o proteină disfuncţională7. Cel mai frecvent intâlnite sunt mutaţiile missense (54%) urmate de mutaţiile
STOP (21,3%).
120
18
Fig. 18.1.11 Adaptare după Oldenburg et al., Medizinische Genetik, 2008.

Distribuţia procentuală a mutaţiilor la pacienţii cu hemofilie B8.
Hemofilia B severă este cauzată de alterări severe ale genei, incluzând mutaţii ale cadrului de citire,
ale situsului de splicing, mutaţii nonsens sau missens. Ocazional indivizii cu hemofilie B severă
prezintă deleţii exonice, multiexonice sau deleţii complete ale genei. Hemofilia B uşoară-moderată
se asociază de regulă cu mutaţii missens. Mutaţiile punctiforme sunt responsabile de majoritatea
mutaţiilor de novo. Deleţiile largi parţiale sau complete sau mutaţii nonsens care determină lipsa FIX
antigen circulant, cum ar fi p.Arg29X (c.85C>T), se asociază cu apariţia inhibitorilor (1-3% din pacienţii
cu hemofilie B severă)1;5. Inhibitorii faţă de FIX apar numai la indivizii cu boală Christmas care nu
au FIX antigen detectabil, dar spre deosebire de FVIII inhibitorii faţă de FIX apar mai puţin frecvent,
sugerând că poate exista o predispoziţie pentru apariţia acestora6. Recent s-a observat că o parte din
aceşti pacienţi prezintă risc de reacţii anafilactice la administrarea de tratament substitutiv cu FIX5.
Există elemente ale istoricului familial predictoare pentru statusul de carrier al unei paciente:
- o femeie care are un fiu afectat şi o altă rudă afectată pe linie maternă este carrier obligatoriu;
- dacă o femeie are mai mult de un fiu afectat şi mutaţia nu poate fi detectată la nivelul ADN-ului său,
atunci ea prezintă mozaicism al liniei germinale.
Aproximativ o treime din mutaţiile responsabile de hemofilia B sunt mutaţii de novo7. Dacă un pacient
este un caz simplex (fără istoric familial de hemofilie), există câteva posibilităţi în ceea ce priveşte
statusul de carrier al mamei sale:
- mama nu este carrier şi pacientul prezintă o mutaţie de novo;
- mama este carrier de novo mutaţia apărând ca o mutaţie a liniei germinale (prezentă în
toate celulele şi detectabilă la nivelul ADN-ului), ca o mutaţie somatică (prezentă în unele
dar nu în toate celulele şi care poate fi detectată în ADN-ul leucocitar în ≤11% din familii)
sau mozaicism al liniei germinale (mutaţia este prezentă în unele celule germinale, dar nu
este detectabilă în ADN-ul din leucocite);
- mama este carrier şi a moştenit mutaţia cauzatoare de la mamă care are o mutaţie de novo
121
sau de la tatăl asimptomatic care este mozaic pentru mutaţie;

- mama este carrier pentru o mutaţie apărută în generaţiile anterioare, care a trecut prin
familie, fiind asimptomatică la femeile carrier.
Testarea ADN combinată cu analiza linkajului poate adesea determina punctul de origine al unei
mutaţii de novo, importantă pentru determinarea ramurilor din familie cu risc de hemofilie B1.
Mozaicismul liniei germinale este posibil, dar rar; astfel dacă un individ afectat se prezintă ca un caz
simplex, iar mutaţia fiului nu poate fi detectată în ADN-ul din leucocitele mamei, aceasta prezintă totuşi
un risc (deşi mic) de a avea şi alţi copii afectaţi1.
Când testarea pentru carrier este efectuată fără identificarea anterioară a mutaţiei în familie, obţinerea
unui rezultat negativ la o rudă cu risc nu exclude un potenţial carrier.
Activitatea coagulantă a FIX este normală la majoritatea carrier-lor şi astfel nu poate fi utilizată pentru
determinarea statusului de carrier, testarea genetică fiind esenţială în acest caz1;5.
Bibliografie
1. Brower C, Thompson A. „Hemophilia B”. GeneReviews, NCBI Bookshelf. Ref Type: Internet
Communication.
Wilkins, 2004, 1395-96.
4. Maclean R, Makris M. „Hemophilia A and B”. În Practical Hemostasis and Thrombosis,
O’Shaughnessy D, Makris M, Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 42-43.
Organizations. “Hemophilia B, FactorIX Gene Mutation Screening”.
www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
Hopkins University School of Medicine. „Hemophilia B”. Ref Type: Internet Communication.
7. Roberts H, Escobar M, White II G. În Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T,
Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 1880-1881.
8. Schwaab R, Rost S, Schröder J, Müller-Reible CR, Oldenburg J. Genetik und Klinik der
Haemophilie A und B. In Medizinische Genetik, 2008, 20;2.
18.1.1.12 Boala vonWillebrand – testare genetică

Boala vonWillebrand (VWD) este cauzată de deficienţa sau anomalia factorului vonWillebrand (FVW)
şi reprezintă cea mai frecventă boală hemoragică moştenită, cu o prevalenţă de 1% în populaţia
122
18
generală. Boala a fost caracterizată pentru prima data de Erick von Willebrand în 1926, ca o condiţie
patologică moştenită autozomal. VWD se asociază cu deficienţe cantitative (tipul 1 şi tipul 3) sau
anomalii calitative ale FVW (tipul 2, cu subtipurile 2A, 2B, 2M şi 2N). FVW este sintetizat în celulele
endoteliale şi megakariocite. Gena sa este localizată pe braţul scurt al cromozomului 12p13.3, include
~178 kilobaze cu 52 exoni, cel mai mare exon, 28, având o lungime de 1.4kb5 şi codifică o proteină
organizată în 4 domenii repetitive, incluzând 3 “A”, 3 „B”, 2 „C” si 4 „D”, care deservesc funcţiile diferite
ale FVW. Domeniul A1 conţine situsurile de legare pentru GPIb plachetară, ristocetină şi colagenul
tip VI, domeniul A3 conţine situsul de legare pentru colagenul I şi III, situsul de legare al FVIII este
localizat în domeniile D’ şi D3, iar domeniul C1 conţine secvenţa RGD capabilă de interacţiunea cu
GPIIb/IIIa plachetară1;2;4.
VWD poate fi moştenită prin mecanisme genetice multiple. Cele mai multe cazuri din tipurile 1 şi 2A,
precum şi tipurile 2B şi 2M sunt moştenie autozomal dominant. Tipurile 2N şi 3, precum şi unele tipuri
1 şi 2A sunt moştenite autozomal recesiv. Pentru transmiterea autozomal dominantă, majoritatea
indivizilor afectaţi au un părinte afectat şi fiecare copil are 50% şanse să moştenească mutaţia. Pentru
transmiterea autozomal recesivă părinţii sunt heterozigoţi obligatorii (carrieri ai unei alele mutante) în
general asimptomatici; la concepţie fiecare frate al unui individ afectat are 25% şanse să fie afectat,
50% şanse să fie carrier asimptomatic şi 25% şanse să nu fie nici afectat nici carrier, iar fiecare copil
al unui individ afectat este heterozigot obligatoriu3.
Mutaţiile şi polimorfismul genei FvW sunt catalogate într-o bază de date internaţională www.shef.
ac.uk/vwf/.
Fig. 18.1.1.12 Adaptare după Keeney et al5.

Gena factorului vonWillebrand (FVW) domeniile funcţionale: a) structura genei FVW şi a
pseudogenei; b) pre-, pro-FVW; c) domeniile funcţionale şi localizarea variantelor tipului 2.
123
Tipul 1, caracterizat prin deficienţa uşoară-moderată de FVW, este forma cea mai comună, fiind
responsabil pentru 70% din cazurile de VWD. Majoritatea pacienţilor cu tipul 1 de VWD au o boală
simptomatică uşoară. Nivelul de FVW este scăzut, cu reducerea concordantă a FVW:Ag şi FVW:RCo,
nivelul de FVIII este egal sau mai mare decât cel al FVW şi toţi multimerii sunt prezenţi, dacă analiza
acestora face parte din evaluarea pacienţilor. Criteriile de diagnostic includ un istoric personal şi familial
de simptome hemoragice, atributabile unor niveluri scăzute de FVW <30 UI/dL. Din păcate mulţi
factori fac dificil diagnosticul tipului 1 de VWD. Boala este moştenită ca o tară autozomal dominantă
incompletă, cu penetranţă variabilă, chiar între membri unei singure familii, astfel că doar 33% din copii
pot fi afectaţi, iar în unele cazuri de VWD uşoară istoricul familial poate să nu fie pozitiv2;3. Locusuri
genetice în afara genei FVW contribuie la variaţiile nivelului FVW. Astfel indivizii de grup 0 au niveluri
cu 30% mai mici decât cei cu grup sanguin A, B sau AB, existând o prevalenţă crescută printre indivizii
de grup 0 de niveluri uşor scăzute de FVW. De asemenea variaţii în nivelurile receptorilor de adeziune
plachetari pot modula severitatea simptomelor conferite de deficienţa FVW2. Nivelele plasmatice ale
FVW pot fi modificate de hormonii tiroidieni, estrogeni, stress8. Recent a fost propus conceptul de
“FVW scăzut”, ce poate fi aplicat pacienţilor cu nivel de FVW sub limita de referinţă, dar deasupra unei
limite ceva mai mici. Studii ale familiilor pacienţilor cu diagnostic de VWD tip 1 sugerează că linkajul cu
gena FVW este mai puţin frecvent întâlnit atunci când nivelul FVW este >30 UI/dL, sugerând că acest
nivel ar putea fi candidatul pentru limita inferioară a categoriei “FvW scăzut” 2. Aceşti pacienţi ar putea
avea risc crescut de sângerare fără a fi încadraţi ca VWD tip14.
S-au efectuat studii în familii cu tipul 1 de VWD care au avut ca rezultat identificarea prin secvenţiere a
112 mutaţii candidate ca fiind răspunzătoare pentru apariţia sindromului. În plus pacienţii cu VWD tip 1
au fost identificaţi ca fiind purtători heterozigoţi de VWD tip 39. S-au publicat rezultate conform cărora
o mutaţie comună Tyr1584Cys a fost întâlnită la 14% din pacienţii canadieni cu VWD tip1 şi posibil o
proporţie similară din pacienţii din Marea Britanie4.
Au fost detectate mutaţii la 60-65% dintre pacienţii cu VWD tipul 1, predominând mutaţiile missens;
mutaţiile missens cu transmitere dominantă complet penetrante sunt adesea identificate când nivelele
FVW:Ag şi FVW:RCo sunt <25 UI/dL, în timp ce mutaţiile missens moştenite dominant cu penetranţă
variabilă (dominant incompletă), ca de exemplu Tyr1584Cys, sunt identificate la ~50% dintre pacienţii
cu FVW:Ag şi FVW:RCo între 25-50 UI/dL3.
Mutaţiile asociate cu VWD tip 1 afectează FVW prin diferite mecanisme incluzând scăderea secreţiei
şi retenţia intracelulară datorată alterării transportului intracelular al subunităţilor FVW, creşterea
clearance-ului din circulaţie sau, într-un număr mic de cazuri, reducerea expresiei proteinei rezultată
dintr-o alelă nulă2;3.
Deoarece aproximativ 50% dintre mutaţii sunt localizate între exonii 18-28, iniţial sunt analizaţi aceşti
exoni, secvenţierea întregii gene furnizând însă informaţii complete.
Tipul 3, responsabil pentru 1-5% din cazurile de VWD, este forma cea mai severă, rezultând din
deficienţa completă a sintezei FVW. Boala hemoragică este în general diagnosticată în copilărie,
formarea de hematoame fiind comună şi hemartrozele putând apărea ca urmare a nivelurilor scăzute
de FVIII întâlnite în această formă de boală. La aceşti pacienţi nivelul FVW este practic nedetectabil,
iar nivelul FVIII este în general de 1-10 UI/dL, similar celui din hemofilia A uşoară-moderată. Analiza
genetică evidenţiază defecte homozigote sau dublu heterozigote ale genei FVW, fiind raportate mutaţii
124
18
la nivelul întregii regiuni codificatoare a genei (exonii 2-52), incluzând deleţii mari sau mici ale genei,
mutaţii ale cadrului de citire, mutaţii ale splicing-site (situsului de “înnădire”), mutaţii missens sau
nonsens2;4. Secvenţierea completă a identificat mutaţii în 80-90% din cazurile de VWD tipul 3:
- 20% sunt mutaţii missens localizate în domeniile D1-D2 (exonii 3-11) şi D4-CK (exonii 37-
52);
- 80% sunt alele nule, localizate la nivelul întregii gene, ce pot rezulta din diferite tipuri de
mutaţii şi care nu produc un produs proteic funcţional3.
Mutaţii ale cadrului de citire şi nonsens, care duc la pierderea expresiei proteinei FVW sau la sinteza
unei proteine FVW marcat trunchiate, au fost identificate la familii cu VWD tip 3, o mutaţie a cadrului
de citire la nivelul exonului 18 fiind răspunzătoare de cele mai multe cazuri de VWD tip 3 în populaţia
suedeză şi este comună în Germania. Această mutaţie constă într-un ARNm stabil care codifică o
proteină trunchiată, rapid degradată la nivel celular4.
Deleţiile largi ale genei au fost identificate într-un număr mic de familii, dar acestea conferă un risc
crescut pentru dezvoltarea de aloanticorpi faţă de FVW în urma tratamentului cu concentrate de
FVW.
Evaluarea de laborator a părinţilor pacienţilor cu tipul 3 de VWD poate evidenţia o deficienţă cantitativă
uşoară a FVW, dar mai frecvent aceştia sunt asimptomatici în concordanţă cu un mod autozomal recesiv
de transmitere a tipului 3 de VWD. Consanguinitatea este comună în familiile cu această variantă2;4.
Totuşi în unele familii cu mutaţii nonsens şi ale cadrului de citire au fost identificaţi heterozigoţi cu VWD
tip 1 aparentă. Mutaţii care dau naştere unor subunităţi anormale de FVW ce interferă intr-o manieră
dominant negativă cu alela normală pot cauza în mod particular VWD simptomatică la heterozigoţi4.
Tipul 2 include tipurile calitative de VWD şi poate reprezenta până la 20-25% din cazurile de VWD.
Tipul 2 este suspectat când severitatea simptomelor pacientului apar excesive faţă de nivelele de
FVW şi FVIII, când există o reducere discordantă între FVW:Ag şi FVW:RCo sau FVIII sau când există
concomitent deficienţă de FVW şi trombocitopenie. În funcţie de natura defectului funcţional tipul 2 se
clasifică în tipurile 2A, 2B, 2M şi 2N2.
- Tipul 2A, întâlnit la majoritatea pacienţilor cu tipul 2, include formele de VWD caracterizate prin
alterarea interacţiunii FVW cu trombocitele datorată deficienţei formelor cu greutate moleculară mare
şi intermediară de FVW (care sunt mai potente în interacţiunea cu GPIb plachetară şi colagenul).
Analiza multimerilor FVW evidenţiază reducerea relativă a formelor cu greutate moleculară mare
şi intermediară. Un fragment proteolitic de 176kD prezent la indivizii normali este marcat crescut
la mulţi pacienţi cu VWD tip 2, acest fragment rezultând prin clivajul proteolitic la nivelul situsului
Tyr1605-Met1606 de către ADAMTS13. Este moştenită în general ca o tară autozomal dominantă,
generată prin mecanisme genetice multiple. La unii pacienţi este alterată multimerizarea FVW (tipul
2A, subgrupul 1), aceştia fiind incapabili să sintetizeze şi să secrete FVW cu lungime completă,
mutaţiile fiind localizate la nivelul propeptidului FVW (în trecut denumit tipul IIC), regiunii N-terminale
a proteinei mature asociate cu formarea multimerilor (tipul IIE) şi regiunii C-terminale implicate în
formarea iniţială a dimerilor (tipul IID). Un al doilea subgrup este caracterizat prin catabolismul rapid
de către ADAMTS13 al multimerilor compleţi eliberaţi în plasmă. Majoritatea cazurilor de VWD tip 2
sunt moştenite autozomal dominant, fiind raportate rare forme recesive (tipurile IIC şi IID). Cele mai
multe mutaţii sunt grupate în regiunea exonului 28 afectând predominant domeniul A2, incluzând
125
situsul proteolitic Tyr1605-Met1606, şi într-o măsură mai mică domeniul A1. Astfel acest exon trebuie
examinat primul când este suspicionat acest subtip de boală. Arg834Trp este mutaţia cel mai frecvent
întâlnită în vWD tipul 2A, absenţa multimerilor mari şi intermediari fiind efectul proteolizei FVW
în plasmă. De asemenea mutaţii missens au fost raportate în exonii 12-16 (în formele autozomal
recesive) şi 51-52 (atât în formele autozomal dominante cât şi recesive), aceştia fiind examinaţi în
continuare2;3;4.
- Tipul 2B este o boală hemoragică paradoxală caracterizată prin interacţiunea crescută a FVW cu
trombocitele, urmată de generarea crescută de complexe FVW-trombocite şi clearance-ul acestora
din circulaţie. Mulţi din aceşti pacienţi au trombocitopenie uşoară persistentă, care se poate
accentua în timpul stresului, sarcinii, intervenţiilor chirurgicale sau administrării de desmopresină.
Analiza multimerilor evidenţiază, ca şi în tipul 2A, absenţa formelor cu greutate moleculară mare,
iar studiile de agregare plachetară indusă de doze mici de ristocetină evidenţiază interacţiunea
crescută a FVW cu plachetele. Tipul 2B este moştenit ca o tară autozomal dominantă, un grup
mic de mutaţii missens în porţiunea exonului 28 care codifică domeniul A1 ce interacţionează cu
GPIb plachetară fiind responsabil pentru toate cazurile raportate2. 4 mutaţii grupate între Arg543
şi Arg578 sunt înregistrate la mai mult de 80% din pacienţi4. Mutaţii care afectează p.P1266L
pot demonstra doar creşterea legării GP1b dar fără trombocitopenie şi pierderea multimerilor cu
greutate moleculară mare3.
- Tipul 2M este caracterizat prin deficienţa funcţiei dependente de plachete a FVW ce nu este
atributabilă deficienţei multimerilor. Ceea ce diferenţiază tipul 2M de tipul 2A este că analiza
multimerilor este normală. Tipul 2M este moştenit ca o tară autozomal dominantă, cu mutaţii în
regiunea exonului 28 care codifică domeniul A1 al FVW, alterând conformaţia proteinei, într-o
arie alternativă faţă de tipul 2B2. O mutaţie recurentă, Arg1205His – VWD 2M Vicenza a fost
recent raportată la familii din Europa, caracterizată prin nivel scăzut de FVW:Ag şi prezenţa
de multimeri cu masă moleculară mai mare decât normal (“supranormali”). Boala a fost iniţial
diagnosticată ca VWD tip 1 la pacienţi din regiunea Vicenza Italia1;4;8.
- Tipul 2N (anterior denumit tipul Normandy) include mutaţii care afectează interacţiunea FVW
cu FVIII, rezultând în „hemofilia autozomală”, cu niveluri de FVIII între 5 şi 30 UI/dL, restul
parametrilor de laborator, respectiv FVW:Ag şi FVW:RCo, fiind în limite normale. Au fost
identificate 37 mutaţii4, majoritatea implicând exonii 18, 19 şi 20 care codifică o mare parte din
domeniul de legare a FVIII şi o proporţie mult mai mică în exonii 17 şi 24-273. Acest tip este
moştenit autozomal recesiv, astfel că pacienţii afectaţi trebuie să moştenească de la părinţi două
alele 2N sau o alelă 2N de la un părinte şi VWD tipul 1 de la celălalt părinte2. Majoritatea indivizilor
sunt heterozigoţi compuşi pentru o mutaţie missens şi o mutaţie care rezultă într-o alelă nulă, mai
rar sunt heterozigoţi compuşi pentru 2 mutaţii missens, iar o proporţie sunt homozigoţi pentru o
mutaţie missens, în mod particular p.Arg854Gln, care apare la 1% din populaţia caucaziană3.
Testarea genetică nu este în general necesară pentru stabilirea dignosticului de vWD, dar poate
furniza informaţii adiţionale în ceea ce priveşte patogeneza, răspunsul la tratamentul cu desmopresină,
consilierea genetică sau riscul formării aloanticorpilor2.
Testarea genetică este în mod special utilă pentru diferenţierea unor tipuri 2B de tipul 2A, precum şi
pentru diagnosticul VWD tipul 2N, respectiv la pacienţi cu hemofilie A uşoară-moderată cu moştenire
126
18
atipică sau cu supravieţuire scurtată a FVIII infuzat care nu este cauzată de inhibitori specifici sau
scăderea activităţii FVIII la femei fără istoric familial de hemofilie A. Iniţial pacienţii trebuie testaţi
pentru mutaţii ale genei FVIII, iar când acestea sunt absente trebuie efectuat screening-ul exonilor
FVW3;7.
Testarea pentru carrier a membrilor familiilor cu risc pentru VWD autozomal recesivă este posibilă o
dată ce mutaţiile cauzatoare au fost identificate în familie3.
Diagnosticul prenatal pentru sarcinile cu risc crescut (în general pentru tipul 3) este posibil prin analiza
ADN-ului extras din celulele fetale obţinute prin amniocenteză în săptămânile 15-18 de gestaţie sau
din vilozităţile coriale la 10-12 săptămâni de sarcină, dacă mutaţia/mutaţiile cauzatoare în familie
este/sunt cunoscute sau, în cazul în care mutaţiile nu sunt cunoscute, diagnosticul poate fi încercat
prin analiza linkajului genetic utilizând un panel larg al polimorfismelor cunoscute în gena FVW, dacă
structura familială este suficientă, rezultatele putând fi obţinute mai rapid decât identificarea mutaţiilor
în ambele alele3;4.
Metodă
Sunt disponibile următoarele variante de testare:
- VWD tip 1 şi 3 – secvenţiere completă a tuturor exonilor genei (rata de detecţie a mutaţiilor este
60-65% pentru tipul 1 şi 80% pentru tipul 3);
- VWD tip 2A – secvenţierea exonului 28 (pot fi identificate 80% din mutaţii);
- VWD tip 2A – secvenţierea exonilor 11-16, 26, 51, 52 (pot fi identificate restul mutaţiilor);
- VWD tip 2B, 2M – secvenţierea exonului 28 (pot fi identificate 80% din mutaţii);
- VWD tip 2N – secvenţierea exonilor 18-20 (pot fi identificate majoritatea mutaţiilor);
- VWD tip 2N – secvenţierea exonilor 17, 24-27 (pot fi identificate restul mutaţiilor) 6.
Clasificarea actuală nu restricţionează VWD ca fiind cauzată de mutaţii localizate la nivelul genei
FVW. Evaluarea întregii gene nu poate identifica existenţa unei mutaţii în cazuri de VWD aparentă.
Astfel imposibilitatea identificării unei mutaţii cauzatoare nu exclude diagnosticul de VWD.
Variantele normale ale genei FVW sunt foarte comune, actual fiind cunoscute aproximativ 150
variante normale. Acest grad crescut al polimorfismului, împreună cu dimensiunile mari ale genei şi
prezenţa unei pseudogene parţiale (localizată pe cromozomul 22q şi corespunzând exonilor 23-34)
pot face dificilă secvenţarea completă a genei şi interpretarea datelor3;8. În plus, defectele genetice din
deficienţele cantitative ale FVW sunt distribuite în întreaga genă, complicând evaluarea.
Tipul plachetar de VWD rezultă din mutaţii în GP1BA, dar se prezintă fenotipic ca VWD tipul 2B.
Sindromul vonWillebrand dobândit este o boală hemoragică uşoară-moderată care nu este cauzată
de o mutaţie a genei FVW, cel mai adesea întâlnită la persoane peste 40 ani fără istoric de sângerare
şi care este asociată cu o varietate de condiţii: sindroame limfoproliferative, paraproteinemii, boli
autoimune, sindrom antifosfolipidic, proteoliză crescută a FVW datorată unor modificări conformaţionale
127
induse de forţe de frecare crescute (stenoză aortică, defect septal ventricular), trombocitoză marcată,
îndepărtarea FVW din circulaţie datorită legării de celule tumorale (tumoră Wilm`s sau anumite boli
limfoproliferative), scăderea sintezei FVW (hipotiroidism), medicamente (acid valproic, ciprofloxacin,
griseofulvin)3.
Bibliografie
1. Castaman G, Tosseto A, Rodeghiero F. „von Willebrand Disease”. În Practical Hemostasis and

Thrombosis, O’Shaughnessy D, Makris M, Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 53-54.
Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams
& Wilkins, 2004, 1392-94.
3. Goodeve A, James P. „von Willebrand Disease”. GeneReviews, NCBI Bookshelf.
4. Johnsen J, Ginsburg D. „von Willebrand Disease”. În Williams Hematology, Lichtman M,
Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006,
1929-37.
5. Keeney S, Bowen D, Cumming A, Enayat S, Goodeve A, Hill M. „The molecular analysis of
von Willebrand disease: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors’ Organisation
Haemophilia Genetics Laboratory Network”. In Haemophilia, (2008); 14: 1099–111.
7. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health
Care Organizations. von Willebrand Disease 2N (subtype Normandy), Blood. www.
Hopkins University School of Medicine. „von Willebrand Disease”.
9. Rajiv K. Pruthi, MBBS, “A Practical Approach to Genetic Testing for vonWillebrand Disease”,
Mayo Clinic Proceedings (May 2006) 81;5: 679-691.
128
18
18.1.1.13 Gena de fuziune BCR-ABL1

– detecţie calitativă şi cantitativă a produşilor de transcripţie
Leucemia mieloidă cronică (LMC) - prototipul afecţiunilor leucemice – constituie o boală clonală a
celulei stem din măduva osoasă ce conduce predominant la hiperproliferarea elementelor granulocitare
în toate stadiile de maturaţie.
LMC se caracterizează prin prezenţa translocaţiei cromozomiale t(9;22)(q34;q11) care a fost
considerată iniţial ca o anomalie 22 q- (un cromozom 22 cu braţul lung scurtat) şi denumită cromozomul
Philadelphia (Ph) (Nowell, 1960; Rowley, 1973). Această translocaţie are drept rezultat juxtapunerea
genei tirozin kinazei ABL1 (Abelson) de pe cromozomul 9 lângă gena BCR (Breakpoint Cluster
Region) de pe cromozomul 22 cu formarea genei de fuziune BCR-ABL1 (fuziune cap-coadă capăt 5’
BCR – capăt 3’ ABL; vezi figura 18.1.1.13.1). Gena anormală se transcrie într-un ARNm hibrid ce va
determina în final sinteza unei proteine himerice Bcr-Abl cu activitate tirozin-kinazică autonomă3;8.
Figura 18.1.1.13.1: Cromozomii 9 şi 22 normali - translocaţia (9,22)
O translocaţie identică citogenetic cu cea din LMC poate fi întâlnită la aproximativ 20-25% dintre
pacienţii adulţi şi la ~5% dintre copiii cu leucemie acută limfoblastică (LAL), precum şi în unele cazuri
rare de leucemie acută mieloblastică (LAM)4;8.
Studiile referitoare la modul în care genele normale BCR şi ABL reglează creşterea au indicat câteva
posibilităţi prin care molecula himerică ar putea facilita proliferarea celulară necontrolată8.
La persoanele normale proteinele codificate de genele BCR şi ABL se exprimă virtual în toate celulele3.
Gena ABL1 (V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1) este o protooncogenă ce
codifică o tirozin kinază Abl1 cu o greutatea moleculară de 145 kD care îşi fosforilează reziduurile de
tirozină proprii (autofosforilare) şi pe cele ale altor proteine. Produsul de transcripţie are fie 6, fie 7 kb,
129
în funcţie de modul de splicing alternativ. Atunci când capătul N- terminal al proteinei este codificat
de exonul 1 (ABL1A), proteina este localizată în nucleu; când este implicat exonul 1b (ABL1B),
conformaţia glicinei N –terminale este modificată de către acidul miristic, ceea ce duce la direcţionarea
proteinei spre membrana plasmatică2. Abl prezintă o structură proteică complexă cu cel puţin trei
domenii funcţionale: un domeniu responsabil de fosforilare şi celelalte două, SH2 şi SH3, care reglează
activitatea primului. Capacitatea Abl de transformare celulară este proporţională cu abilitatea sa de a
fosforila reziduurile de tirozină. Se presupune că Abl se leagă de proteina-ţintă; domeniul SH2 creşte
activitatea kinazică promovând transformarea celulară, în timp ce domeniul SH3 reduce activitatea
Abl. În plus, se crede că SH3 ar interveni şi în reglarea activităţii GTP-azice, cunoscută a fi implicată
în calea de transducţie a semnalului unei alte proto-oncogene, ras, a cărei expresie anormală este
asociată cu dezvoltarea cancerului. Sunt descrise şi alte două domenii funcţionale la nivelul proteinei
Abl: un domeniu care se leagă de secvenţe nucleotidice specifice ale ADN-ului, ceea ce sugerează
posibilitatea ca Abl să fie şi un factor de transcripţie; în al doilea rând există o regiune care facilitează
legarea de F-actină în citoplasmă. Prin studii a fost demonstrat faptul că pierderea regiunii N-terminale
normale a Abl care mediază autoreglarea, ca urmare a translocaţiei Ph, conduce la creşterea activităţii
de fosforilare a tirozinei precum şi la o legare crescută a F-actinei, transformând astfel Abl într-o
proteină oncogenică ce ar putea fi responsabilă de proliferarea anormală a precursorilor mieloizi în
LMC8;13.
Gena BCR are o lungime de 130 kb şi conţine 23 de exoni. Primul intron care separă exonii 1 şi 2 a
fost considerat iniţial ca având o lungime de 68 kb, acum se ştie însă că include doi exoni adiţionali
(un exon alternativ e1’ şi un exon alternativ e2’). Au fost identificaţi doi produşi de transcripţie de 4.5 şi,
respectiv, 7.0 kb în funcţie de modul de splicing alternativ; pot rezulta astfel 2 proteine de dimensiuni
diferite, 130 şi, respectiv, 160 kDa6. Proteina Bcr este exprimată în stadiile primare ale diferenţierii
mieloide, nivelul său scăzând în celulele mature; potrivit unor cercetători ar putea constitui o serin/
treonin kinază mai degrabă decât o tirozin kinază ca proteina ABL8.
Regiunea 5’ netranslatată a genei are o importanţă majoră deoarece gena de fuziune rezultată în urma
translocaţiei Ph este reglată de promotorul BCR. Bogată în bazele nucleotidice G şi C, această regiune
facilitează formarea de structuri loop şi stem cu posibil rol în reglarea translaţională, comună în multe
gene ‘housekeeping’ (gene exprimate constant în toate celulele)5;12. Gena este exprimată ubiquitar,
cu un nivel ridicat al ARN-ului mesager în ţesutul hematopoetic şi creier. Primul exon are o importanţă
majoră, fiind inclus în toţi produşii de fuziune BCR-ABL. La nivelul acestuia se exprimă activitatea de
serin/treonin kinază a proteinei Bcr; astfel Bcr îşi poate autofosforila reziduurile de serină şi treonină.
În afecţiunile Ph pozitive, fosfotirozinele sunt prezente în ambele proteine Bcr şi Bcr-Abl datorită
activităţii de tirozin-kinază a Bcr-Abl. Primul exon al componentei Bcr din Bcr-Abl este de asemenea
fosforilat la reziduurile de serină şi treonină. În plus, acesta conţine mai multe domenii care leagă
regiunile SH2 ale altor proteine şi deţine în acest sens un rol important în asamblarea complexelor de
transducţie a semnalului. Un astfel de domeniu SH2 care se leagă de Bcr este cel al proteinei Abl, iar
această interacţiune este mediată de către serina şi treonina fosforilată. Secvenţele Bcr implicate în
această interacţiune sunt situate între aminoacizii 192-242 şi 298-413 şi sunt esenţiale în activarea
oncogenică a Bcr-Abl. Un alt domeniu funcţional în exonul 1 al Bcr este cel de oligomerizare prin care
s-a constatat că Bcr şi Bcr-Abl co-imunoprecipită. Domeniul de oligomerizare afectează de asemenea
130
18
localizarea proteinei Bcr-Abl4;13. Deşi proteina Abl normală poate fi identificată atât în nucleu cât şi în
citoplasmă, s-a constatat că Bcr-Abl este localizată numai în citoplasmă şi este parţial asociată cu
citoscheletul. Deleţia domeniului de oligomerizare al Bcr este însoţită de reducerea legării Bcr-Abl de
F-actină, demonstrând că acest domeniu intensifică capacitatea de legare a F-actinei de către Bcr-Abl
şi este cel puţin în parte responsabil de localizarea citoplasmatică a oncoproteinei15.
La nivelul ADN-ului, fuziunea BCR-ABL1 se caracterizează printr-o heterogenitate a punctelor de
ruptură („breakpoints”) şi o variaţie a produşilor de transcripţie obţinuţi printr-un splicing alternativ.
Astfel, punctele de ruptură ale genei BCR de pe cromozomul 22 se găsesc în trei regiuni diferite:
majoră (M-bcr), minoră (m-bcr) şi μ-bcr; regiunea M-bcr este relativ scurtă (5.8 kb), include 5 exoni
denumiţi b1-b5 (reprezintă de fapt exonii e12-e16 ai genei BCR), iar punctele de ruptură sunt localizate
specific între exonii b2 şi b3 sau b3 şi b4; m-bcr include exonii e1, e2, e1’ şi e2’; μ-bcr include exonii
e19 şi e20. Pe de altă parte, punctele de ruptură al genei ABL sunt distribuite pe o lungime de 300
kb, între capătul 5’ şi exonul 2. În funcţie de localizarea punctelor de ruptură segmente de dimensiuni
diferite ale genei BCR fuzionează cu secvenţe 3’ ale genei ABL; aceste gene de fuziune vor genera
4 produşi de transcripţie – moleculele ARNm e1a2, b2a2, b3a2 şi e19a2 – care în final vor conduce
la sinteza a 3 proteine himerice cu greutăţi moleculare variabile (p190, p210 şi respectiv p230) şi,
probabil, cu funcţii diferite (vezi figura 18.1.1.13.2).
Fig. 18.1.1.13.2 Punctele de ruptură a genelor BCR şi ABL (marcate prin săgeţi) şi produşii de
transcripţie rezultaţi (Adaptare după Chasseriau et al, JMD, November 2004, vol.6, no.4)
Luând în considerare aceste date, se pot distinge cel puţin 3 entităţi clinico-patologice în LMC: p210
LMC, p190 LMC şi p230 LMC. Marea majoritate a cazurilor de LMC este asociată cu produşii de
transcripţie b2a2 şi b3a2 care conduc la sinteza proteinei p210; deşi în cele mai multe cazuri este
prezent un singur tip de transcript, ocazional tumorile pot prezenta un splicing alternativ şi produce
simultan ambii produşi de transcripţie. Proteina himerică p190 este detectată în ~50% din cazurile
de LAL Ph pozitive, precum şi în cazuri rare de LMC şi LAM. Proteina himerică de greutate mai
131
mare (p230) este prezentă în forme rare de LMC caracterizate printr-o componentă neutrofilică
proeminentă; aceste cazuri nu trebuie incluse însă în entitatea „leucemie neutrofilică cronică”, ci mai
degrabă considerate ca fiind LMC, datorită prezenţei genei de fuziune BCR-ABL. Restul cazurilor
de LAL Ph pozitive demonstrează prezenţa produşilor de transcripţie b3a2 sau b2a2. Merită să fie
menţionat faptul că au fost identificate puncte de ruptură ale genei BCR în afara regiunilor menţionate
în unele cazuri rare de LMC şi LAL. În plus translocaţia (9,22) a fost foarte rar detectată la pacienţi cu
alte neoplazii hematologice, cum ar fi mielomul multiplu şi limfoamele cu celule B3;8;10.
Semnificaţia clinică a diferitelor puncte de ruptură în LMC nu este clar definită. Cu toate acestea
s-au putut efectua anumite corelaţii. LMC survenită atât la copil cât şi la adult este asociată aproape
întotdeauna cu proteina himerică p210; în timp ce două treimi din adulţi prezintă transcriptul b3a2,
la copii predomină b2a2. Mai mult, două grupuri diferite de cercetători au raportat asocierea b3a2
cu un număr mai mare de trombocite decât b2a2. Această constatare nu a fost confirmată însă de
un al treilea grup din Marea Britanie8. În cazurile de LMC asociate cu transcriptul e1a2 componenta
monocitară este mai proeminentă, iar numărul total de leucocite, bazofilia şi splenomegalia sunt mai
reduse decât în p210 LMC10.
Gene de fuziune BCR-ABL pot fi detectate şi în leucocitele unor persoane sănătoase; în timp ce
BCR-ABL se exprimă relativ frecvent în celulele hematopoietice, doar foarte rar celulele dobândesc
modificările necesare pentru a produce leucemie3;10.
Activitatea tirozin kinazică este esenţială pentru procesele de semnalizare celulară şi de creştere, iar
intensificarea acesteia a fost asociată cu modificări oncogenice în câteva sisteme. Atât p210Bcr-Abl cât şi
p190Bcr-Abl prezintă activitate tirozin-kinazică constitutivă (constantă indiferent de cerinţele fiziologice),
cu niveluri mai mari înregistrate la proteina p190Bcr-Abl. Majoritatea tirozinelor autofosforilate se găsesc
la nivelul segmentului Bcr din Bcr-Abl, iar activitatea tirozin kinazică este atribuită domeniului kinazic
localizat în segmentul Abl. Se crede că gradul activităţii de transformare a Bcr-Abl se corelează cu
gradul activităţii tirozin-kinazei şi că această activitate a fost implicată în autonomia faţă de factorii de
creştere pe care Bcr-Abl o conferă celulelor. De asemenea Bcr-Abl induce fosforilarea multor proteine
implicate în transducţia semnalului, adeziunea celulară, proliferare şi apoptoză4.
Clasic, sunt descrise 2 sau 3 stadii clinice de evoluţie a bolii, însă în practica medicală curentă a
devenit din ce în ce mai frecvent ca pacienţii să fie diagnosticaţi în stadiul preclinic ca urmare a
creşterii numărului controalelor periodice. Studiile au arătat că există o perioadă de aproximativ 6 ani
din momentul apariţiei translocaţiei cromozomiale şi dezvoltarea manifestărilor clinice. Primul stadiu
clinic este reprezentat de o fază cronică care în trecut avea o durată medie de 4 ani, urmată de
o fază mai agresivă – faza accelerată/faza blastică cu un prognostic rezervat. Faza accelerată se
caracterizează prin creşterea numărului de blaşti în sângele periferic şi/sau măduva osoasă, bazofilie,
trombocitopenie persistentă, creşterea dimensiunilor splinei şi a numărului de leucocite în condiţiile
tratamentului adecvat, evidenţierea unei evoluţii clonale la examenul citogenetic. Faza blastică
include următoarele elemente: ≥20% blaşti în sângele periferic şi/sau măduva osoasă, proliferarea
extramedulară a blaştilor sau prezenţa unor aglomerări mari de blaşti în măduva osoasă. Această
fază denotă transformarea LMC în leucemie acută, care poate fi de linie mieloidă (~70%) sau limfoidă
(~30%).
Diagnosticul CML se bazează pe examenul frotiului de sânge periferic, biopsia de măduvă osoasă,
examenul citogenetic pentru detectarea cromozomului Philadelphia şi testele moleculare pentru
132
18
evidenţierea genei de fuziune BCR-ABL1 sau a produşilor de transcripţie asociaţi acesteia8.

Tratamentul definitiv al pacienţilor cu LMC este transplantul de măduvă osoasă alogenic sau transplantul
de celule stem. Cu toate acestea, dezvoltarea inhibitorilor de tirozin kinază cu introducerea pe scară
largă a preparatului imatinib mesylate (Gleevec) a modificat semnificativ tratamentul de primă linie al
LMC şi a demonstrat succesul terapiei cu ţintă moleculară3. Imatinibul, un inhibitor de tirozin kinază
specific pentru Abl, inhibă proliferarea liniilor celulare din LMC prin suprimarea activităţii kinazice a
Bcr-Abl8.
Detecţia prin RT-PCR a produşilor de transcripţie ARNm hibrizi BCR-ABL1 prezintă valoare în
diagnosticul LMC şi LAL Ph pozitive. Deşi 98% dintre pacienţii cu LMC sunt BCR-ABL pozitivi, într-un
număr redus de cazuri cu morfologie sugestivă pentru LMC marker-ul genetic lipseşte. Aceste cazuri
încadrate ca LMC atipică, leucemie mielo-monocitară cronică sau ca alte neoplazii mieloproliferative
sau sindroame mielodisplazice beneficiază de alte opţiuni terapeutice decât cele de LMC Ph pozitive.
Pe de altă parte, sunt posibile manifestări atipice în LMC, iar în aceste cazuri demonstrarea anomaliei
BCR-ABL este critică pentru diagnosticul corect şi terapia adecvată. De asemenea testele moleculare
au valoare diagnostică în situaţiile în care examenul citogenetic este negativ pentru cromozomul
Philadelphia (~5% din cazuri) ca urmare a unei anomalii BCR-ABL criptice sau submicroscopice.
Detecţia marker-ului la adulţii şi copiii cu LAL identifică acea categorie de pacienţi care prezintă un
risc crescut de eşec terapeutic şi care ar putea beneficia de programe de tratament intensiv3;8.
Un alt rol al testelor moleculare este monitorizarea răspunsului terapeutic la pacienţii cu LMC. Astfel,
după obţinerea remisiunii citogenetice sub Imatinib testele PCR cantitative reprezintă metoda de
elecţie pentru detectarea bolii minime reziduale (MRD)8. De asemenea acestea îşi găsesc aplicaţia şi
la pacienţii care au primit transplant medular pentru identificarea precoce a recurenţelor bolii10.
Administrarea de Imatinib reprezintă tratamentul standard al pacienţilor cu LMC, iar ELN (European
LeukemiaNet) şi NCCN (National Comprehensive Cancer Network) recomandă o doză zilnică de 400
mg ca opţiune terapeutică de primă linie. Pacienţii care obţin un răspuns citogenetic complet necesită
monitorizarea răspunsului molecular la 3-6 luni pentru identificarea cazurilor de răspuns suboptimal
şi îmbunătăţirea tratamentului prin administrarea unor doze mai mari de Imatinib sau a unor terapii
alternative. De asemenea monitorizarea prin teste moleculare permite recunoaşterea precoce a
rezistenţei primare sau dobândite la Imatinib. Inhibitorii de tirozin kinază de generaţia a doua, cum
ar fi nilotinib şi nisatinib, acţionează mai eficient asupra ţintei moleculare BCR-ABL fiind asociate cu
o rată mai mare de răspuns citogenetic şi molecular precoce; cuantificarea BCR-ABL ARNm va avea
astfel o importanţă şi mai mare în viitorul apropiat.
Răspunsul molecular major (MMR) este definit prin scăderea nivelului BCR-ABL cu cel puţin 3 log (de
1000 ori) faţă de o valoare bazală standardizată (standardized baseline). Această valoare a fost stabilită
prin procesarea în 3 laboratoare centrale implicate în studiul IRIS (International Randomized Study of
Interferon versus STI571) a unor eşantioane efectuate din 30 probe provenite de la pacienţi cu LMC
înainte de iniţierea terapiei11. Fiecare laborator a obţinut o valoare mediană pentru nivelul produşilor
de transcripţie în cele 30 probe analizate care a constituit valoarea bazală standardizată specifică
laboratorului. Reducerea cu > 3 log a nivelului BCR-ABL din această valoare bazală standardizată
specifică a definit răspunsul molecular major. Faptul că s-a utilizat o valoare bazală absolută (comună
tuturor participanţilor) în loc de una relativă (individualizată) a asigurat faptul că pacienţii cu răspuns
similar prezintă acelaşi grad de boală reziduală. Obţinerea unui MMR este asociată cu o probabilitate
133
mai mare de răspuns pe termen lung şi cu îmbunătăţirea perioadei de supravieţuire fără progresia bolii
(PFS = progression-free survival) la pacienţii trataţi cu Imatinib. Astfel, în studiul IRIS toţi pacienţii cu
MMR la 12 luni de la începutul tratamentului nu au prezentat nici un semn de fază accelerată sau criză
blastică la evaluarea efectuată la 60 luni. Este important de menţionat faptul că în acest studiu a fost
evitată folosirea termenului de „răspuns molecular complet“ fiind determinat numai numărul pacienţilor
la care s-a obţinut un rezultat nedetectabil al produşilor de transcripţie cu o sensibilitate analitică
de 4.5 log sub valoarea bazală standardizată. Deoarece un rezultat nedetectabil reflectă limita de
detecţie a metodelor actuale, acesta nu trebuie considerat o dovadă de eradicare a bolii16.
Având în vedere importanţa clinică a evaluării prezenţei bolii minime reziduale au fost iniţiate mai
multe eforturi de a standardiza cuantificarea BCR-ABL. În acest sens, un grup de experţi a propus la
întâlnirea internaţională de consens de la Bethesda (2005) ca măsurătorile BCR-ABL să fie exprimate
pe o scală internaţională (IS) care foloseşte două valori standard: valoarea bazală standardizată
(stabilită în studiul IRIS) considerată ca fiind 100% pe IS şi valoarea MMR standardizată considerată
ca fiind 0.1% pe IS (corespunde unei reduceri cu 3 log faţă de valoarea bazală). O valoare de 1-2%
IS corespunde în linii mari cu limita de detecţie a metafazelor Ph1-pozitive prin examenul citogenetic
standard. O valoare < 0.1% IS indică răspunsul molecular major (MMR)11.
Recomandări pentru efectuarea testului
● diagnosticul LMC şi LAL Ph pozitive;
● monitorizarea răspunsului molecular la tratament şi stabilirea prognosticului;
● detectarea bolii minime reziduale8.
Specimen recoltat - a) sânge venos; b) aspirat medular9.
Recipient de recoltare - a) şi b) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant9.
Cantitate recoltată - a) 3-5 mL; b) 3 mL (minimum 1 mL)9.
Stabilitate probă - maximum 3 zile la 2-8ºC9.
Metodă - se folosesc două tipuri de testări:
Detecţia calitativă a produşilor de transcripţie ARNm BCR-ABL1 (în scop diagnostic)
Include următoarele etape:
- izolarea şi purificarea ARN-ului;
- reacţia de revers transcriptie (RT-PCR) pentru obţinerea ADN-ului complementar (ADNc)
folosit ca matriţă pentru amplificarea PCR;
- multiplex PCR (detecţia uneia sau mai multor secvenţe ADN ţintă în amestec prin folosirea
unuia sau a mai multor seturi de primeri oligonucleotidici) + două nested-PCR optimizate
pentru detectarea diferitelor puncte de ruptură din genele BCR şi ABL;
- fiecare rulare a probelor este însoţită de o reacţie de control cu ADNc de la o linie celulară
cu translocaţia t(9;22) şi o reacţie de control negativ cu ADNc al unei linii celulare care
nu prezintă translocaţia; pentru controlul calităţii ARN din probă şi a eficienţei reacţiei de
revers-transcripţie se utilizează în paralel o amplificare RT-PCR a unui fragment ADNc al
genei ABL umane;
- detecţia produşilor PCR prin electroforeză în gel de agaroză;
- limita de detecţie a testului este de cel puţin 1 celulă LMC la 100 000 celule normale1;7;9.
Detecţia cantitativă a produşilor de transcripţie ARNm BCR-ABL1 (în scop de monitorizare)
134
18
Va fi determinată expresia produşilor de fuziune (nr. copii BCR-ABL) raportată la expresia unei
gene de control intern (ABL) prin Real-Time PCR cantitativ LightCycler cu o conversie finală în
procente.
Raportarea şi interpretarea rezultatelor
Detecţia calitativă
Un rezultat negativ indică absenţa unui transcript (ARNm) BCR-ABL.
Un rezultat pozitiv indică prezenţa unui produs transcripţie BCR-ABL al cărui tip va fi comunicat9.
Detecţie cantitativă
Rezultatul va fi exprimat ca procent BCR-ABL din totalul ABL, astfel:
[Nr. copii BCR-ABL/ Nr. copii ABL] x 100
Nivelul produşilor de transcripţie BCR-ABL reflectă numărul celulelor leucemice reziduale.
O reducere progresivă a nivelului produşilor de transcripţie în cursul tratamentului cu Imatinib
reprezintă criteriul actual pentru răspunsul molecular în leucemia mieloidă cronică.
MMR va fi raportat în conformitate cu studiul IRIS.
O creştere de 5-10 ori a nivelului produşilor de transcripţie (0.5 sau 1 log) a fost propusă ca valoare
prag pentru recăderea moleculară sau rezistenţa la tratament9;16.
Bibliografie
1. B Gleissner, H Rieder, E Thiel, C Fonatsch, L A J Janssen, B Heinze, J W G Janssen, C

Schoch, N Goekbuget, J Maurer, D Hoelzer and C R Bartram. Prospective BCR-ABL analysis by
polymerase chain reaction (RT-PCR) in adult acute B-lineage lymphoblastic leukemia: reliability
of RT-nested-PCR and comparison to cytogenetic data. In Leukemia, December 2001, Volume
15, Number 12, Pages 1834-1840.
2. Chissoe, S. L.; Bodenteich, A.; Wang, Y.-F.; Wang, Y.-P.; Burian, D.; Clifton, S. W.; Crabtree, J.;
Freeman, A.; Iyer, K.; Jian, L.; Ma, Y.; McLaury, H.-J.; Pan, H.-Q.; Sarhan, O. H.; Toth, S.; Wang,
Z.; Zhang, G.; Heisterkamp, N.; Groffen, J.; Roe, B. A. Sequence and analysis of the human
ABL gene, the BCR gene, and regions involved in the Philadelphia chromosomal translocation.
In Genomics 27: 67-82, 1995.
3. David S. Viswanatha, Richard S. Larson. Molecular Diagnosis of Hematopoietic Neoplasms. In
Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st
Edition, 2007, 1296-1299.
4. Eunice Laurent, Moshe Talpaz, Hagop Kantarjian and Razelle Kurzrock. The BCR Gene and
Philadelphia Chromosome-positive Leukemogenesis. In Cancer Research, 61, 2343-2355,
March 15, 2001.
5. Hariharan I. K., Adams J. M. cDNA sequence for human BCR, the gene that translocates to the
ABL oncogene in chronic myeloid leukaemia. In EMBO J., 6: 115-119, 1987.
6. Heisterkamp N., Knoppel E., Groffen J. The first BCR gene intron contains breakpoints in
Philadelphia chromosome positive leukemia. In Nucleic Acids Res., 16: 10069-10081, 1988.
7. Janna Yu Sidorova, Liudmila B Saltykova, Anton A Lyschov, Andrey Yu Zaritskey,Kudrat M
Abdulkadyrov, Michail N Blinov. A rapid RT-PCR based method for the detection of BCR-ABL
translocation. In Clin Pathol: Mol Pathol 1997;50:266-268.
8. Kaaren K. Reichard, Richard S. Larson, Ian Rabinowitz. Chronic Myeloid Leukemia. In
135
Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F,

Glader B, 12th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2009, 2006-2015.
10. Marshall A. Lichtman, Jane L. Liesveld. Chronic Myelogenous Leukemia and Related Disorders.
Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J.,
7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 1237-1248.
11. M. C. Müller, N.C. P Cross, P. Erben, T. Schenk, B. Hanfstein, T. Ernst, R. Hehlmann, S.
Branford, G. Saglio, A. Hochhaus. Harmonization of molecular monitoring of CML therapz in
Europe. In Leukemia (2009) 23, 1957-1963.
12. Muller A. J., Witte O. N. The 5‘ noncoding region of the human leukemia-associated oncogene
BCR/ABL is a potent inhibitor of in vitro translation. In Mol. Cell. Biol., 9: 5234-5238, 1989.
13. Pluk, H.; Dorey, K.; Superti-Furga, G.: Autoinhibition of c-Abl. In Cell 108: 247-259, 2002.
14. Saglio G. Molecular Biology-measuring and reporting Bcr-Abl Transcripts. Workshop on RQ-
PCR for monitoring CML patients treated with imatinib, Orbassano, 2006.
15. Wetzler M., Talpaz M., Van Etten R. A., Hirsh-Ginsberg C., Beran M., Kurzrock R. Subcellular
localization of Bcr, Abl, and Bcr-Abl proteins in normal and leukemic cells and correlation of
expression with myeloid differentiation. In J.Clin. Investig., 92: 1925-1939, 1993.
16. www.eutos.org. European Leukemia Network. Imatinib PCR testing for CML.
18.1.1.14 Mutaţia JAK2V617F şi mutaţiile exonului 12
În clasificarea WHO (World Health Organization) din 2008 a neoplaziilor mieloide şi leucemiilor
acute termenul “mieloid” include toate celulele aparţinând liniilor granulocitară (neutrofile, eozinofile,
bazofile), monocito-macrofagică, eritroidă, megakariocitară şi mastocitară. Noua nomenclatură
a entităţilor mieloproliferative s-a modificat de la “boli mieloproliferative cronice” (MPD, Chronic
Myeloproliferative Diseases) la “neoplazii mieloproliferative” (MPN, Myeloproliferative Neoplasms)
pentru a reflecta cu acurateţe natura lor neoplazică. De asemenea subgrupul desemnat anterior ca
“boli mielodisplazice/mieloproliferative” a fost redenumit “neoplazii mielodisplazice/mieloproliferative”
(MDS/MPN, Myelodysplastic/Myeloproliferative Neoplasms)11.
Atât MPN cât şi MDS/MPN reprezintă neoplazii clonale cu celularitate medulară tipic crescută,
maturaţie a liniilor celulare şi organomegalie, separarea dintre ele bazându-se pe prezenţa
mielodisplaziei în cele din urmă. În plus acestea au în comun grade diferite de fibroză medulară, dar
diferă în general prin linia celulară mieloidă care domină hematopoieza. Dintre MPN există patru tipuri
comune, respectiv leucemia mieloidă cronică (CML, Chronic Myelogenous Leukemia), caracterizată
prin translocaţia 9;22 şi proteina de fuziune BCR/ABL1, şi trei tipuri non-CML, policitemia vera (PV,
Polycythemia Vera), trombocitemia esenţială (TE, Essential Thrombocythemia) şi mielofibroza primară
(PMF, Primary Myelofibrosis), acestea având în comun o incidenţă crescută a unei mutaţii punctiforme
dobândite (V617F) la nivelul JAK2 kinazei, o tirozin kinază citoplasmatică importantă în proliferarea
136
18
hematopoietică2. De asemenea au fost identificate şi alte mutaţii la nivelul căii JAK-STAT la unii
pacienţi cu MPN JAK2V617F(-), sugerând că activarea constituţională a acestei căi de semnalizare
este o trăsătură comună acestor afecţiuni5.
Practic toate căile de transmitere a semnalului intracelular sunt legate printr-o cascadă de fosfotransfer
mediat prin kinaze. La om sunt exprimate mai mult de 500 kinaze care fosforilează proteine distincte, în
mod tipic la nivelul reziduurilor de tirozină, serină sau treonină. JAK2 (Janus-associated kinase 2) este
membră a unei familii de patru tirozin kinaze citoplasmatice, care include de asemenea JAK1, JAK3
şi TYK212. Tirozin kinazele JAK sunt componente cruciale care integrează componente din diverse
căi de semnalizare intracelulară, incluzând căile Src kinazei, Ras-MAP kinazei, PI3K-AKT şi STAT,
consecutiv interacţiunii receptorilor pentru citokine/interferon cu liganzii lor. Astfel activitatea optimă a
JAK kinazelor este critică pentru transmiterea normală a semnalului citokinelor şi factorilor de creştere.
Supraactivitatea JAK kinazelor a fost implicată în tumorigeneză fiind asociată cu diferite sindroame
leucemice, mutaţii activatoare în JAK1 fiind recent descoperite în leucemia acută limfoblastică cu
precursor de celulă T, în schimb deficienţa JAK3 a fost asociată cu imunodeficienţa combinată severă şi
un inhibitor selectiv al JAK3 a fost dezvoltat formând o nouă clasă de medicamente imunosupresoare.
Deficienţa JAK2 la şoareci este letală în stadiul embrionar prin eşecul eritropoiezei7,12,13.
Structura tridimensională a JAK kinazelor este în prezent necunoscută, aceasta datorându-se şi
faptului că acestea sunt proteine relativ mari, de peste 1100 aminoacizi, cu mase moleculare aparente
de 120-140kDa. Fiecare din kinazele JAK are 7 domenii bine conservate între specii, “JAK homology”
JH1-JH7, care nu prezintă asemănare cu niciun model proteic cunoscut (vezi figura 1). Domeniul
JH1 de la capătul C-terminal conţine domeniul catalitic. Valina din poziţia 617 se află în domeniul
JH2, un domeniu pseudokinazic, care prezintă omologie semnificativă cu domeniul JH1, dar îi lipseşte
activitatea catalitică, lipsindu-i câţiva aminoacizi critici, necesari pentru o kinază funcţională. Această
arhitectură în tandem constituie marca JAK kinazelor şi le conferă numele, după zeul Roman Janus
(Ianus) cu două feţe, însemnând începutul şi sfârşitul. Pe baza observaţiei că deleţia domeniului JH2
duce la creşterea activităţii JAK2 kinazei, s-a sugerat că domeniul JH2 reglează negativ activitatea
kinazică JH15;7;10;13. Capătul N-terminal conţine domeniile SH2-like (JH3-JH4) şi un domeniu
omolog FERM (4-point-1, Erzin, Radixin, Moesin) (JH6-JH7), implicat în interacţiunea cu proteine
transmembranare, cum ar fi receptorii pentru citokine, şi, în plus, leagă domeniul kinazic, reglându-i
pozitiv activitatea catalitică13 (vezi fig. 18.1.1.14.1).
Fig. 18.1.1.14.1 Reprezentare schematică a structurii primare a Janus-kinazelor (Jaks)

(Adaptare după Genome Biol. 2004; 5(12): 253).
137
Tirozin kinazele JAK sunt constitutiv asociate în stare inactivă cu regiunea juxtamembranară a
receptorilor pentru citokine, în unele cazuri interacţiunea dintre JAK şi receptor fiind crescută după
legarea ligandului. S-a propus că legarea ligandului promovează o modificare conformaţională
a receptorului, care promovează activarea JAK prin interacţiunea reciprocă a două JAK kinaze
juxtapoziţionate şi auto- şi/sau trans-fosforilarea reziduurilor de tirozină în loop-ul de activare al
domeniului kinazic13. În schimb JAK fosforilate mediază fosforilarea reziduurilor de tirozină ale
domeniului citoplasmatic al receptorului şi creează un situs de docare pentru recrutarea câtorva
proteine, în final ducând la activarea STAT (signal transducer and activator of transcription), MAP
(mitogen-activated protein) kinazei şi căii PI3K-AKT. STAT activate dimerizează şi sunt translocate la
nivelul nucleului unde reglează transcripţia după legarea la secvenţe consens specifice în regiunile
promotor ale câtorva gene ţintă. JAK2 este de asemenea implicată în expresia receptorilor EpoR
(erythropoietin receptor) şi MPL (receptorul pentru trombopoietină) pe suprafaţa celulară acţionând ca
stabilizator al proteinei. Aceste semnale complexe sunt autonom activate în absenţa legării citokinei
la receptorul său în cazul mutaţiilor JAK2 sau ale receptorului (cum ar fi mutaţia W515L/K la nivelul
MPL)10.
Majoritatea citokinelor se pot asocia cu mai mult de o JAK kinază, dar JAK2 este esenţial pentru
citokine hormon-like, cum ar fi hormonul de creştere, prolactina, eritropoietina, trombopoietina şi
familia citokinelor care semnalizează prin intermediul receptorului pentru IL-3 (IL-3, IL-5, şi GM-CSF),
fiind de asemenea important pentru citokine care utilizează receptorul gp130 şi pentru unii interferoni.
JAK2 este JAK kinaza predominantă implicată în proliferarea şi diferenţierea celulelor mieloide5;13.
Gena JAK2 este mapată la nivelul cromozomului 9p24, fiind codificată de doi produşi de transcripţie,
de 5.3 şi 5 kb, iar proteina este exprimată ubicuitar, ca şi JAK1 şi TYK2, spre deosebire de JAK3 care
este predominant exprimată la nivelul celulelor hematopoietice7;13.
Mutaţia JAK2V617F este o substituţie a guaninei cu timidina la poziţia 1849 în exonul 14 care rezultă
în substituţia valinei cu fenilalanina la nivelul codonului 617, care se presupune că duce la pierderea
controlului autoinhibitor al domeniului pseudo-kinazic JH2. Introducerea acestei mutaţii la nivelul
liniilor celulare duce la creşterea acestora citokin-independentă şi la hipersensibilitate la citokine,
mimând creşterea in vitro a progenitorilor hematopoietici de la pacienţii cu MPN şi oferind o explicaţie
pentru mecanismul formării coloniilor eritroide endogene în absenţa eritropoietinei, care constituie
marca PV. Mutaţia nu este prezentă în linia germinală, fiind achiziţionată ca o mutaţie somatică în
compartimentul hematopoietic, descoperită la mai mult de 95% din pacienţii cu PV, până la 50%
din cei cu TE şi PMF, 40-50% din cei cu anemie refractară cu sideroblaşti inelari şi trombocitoză
(RARS-T), rari pacienţi cu CML atipică BCR-ABL1(-), CMML (Chronic Myelomonocytic Leukemia),
AML (Acute Myeloid Leukemia) şi chiar la unii pacienţi cu trombocitoză ereditară sau pacienţi normali
hematologic cu tromboză de venă portă1;3;5;9;10;11. Nicio altă mutaţie alternativă nu a fost descrisă până
în prezent la acest nivel, alte mutaţii activatoare ale JAK2, incluzând T875N la nivelul domeniului
kinazic, deleţia IREED sau mutaţiile exonului 12, fiind mult mai rare comparativ cu JAK2V617F. Pe
de altă parte, deşi calea de semnalizare JAK2 este constitutiv activată de o varietate de mecanisme
genetice şi epigenetice în neoplaziile umane, incluzând limfomul şi mielomul, alela JAK2V617F este
exclusivă pentru neoplaziile mieloide, sugerând mecanisme distincte care activează JAK25.
138
18
Există mai multe ipoteze privind contribuţia unei singure alele de boală la dezvoltarea a trei afecţiuni
mieloide înrudite, dar distincte clinico-patologic3.
▪ În prima ipoteză fenotipul depinde de celula ţintă a mutaţiei JAK2V617F. Studii diferite au arătat
că liniile granulocitară, eritroblastică, megakariocitară şi limfoidă conţin celule JAK2V617F(+) atât
în PV cât şi în PMF, ceea ce nu exclude însă faptul că JAK2V617F ţinteşte subseturi de celule stem
hematopoietice diferite, cu programe transcripţionale şi proprietăţi de diferenţiere diferite. Într-adevăr
există grupuri care au demonstrat diferenţe în compartimentul celulelor stem între PV şi PMF3.
▪ În cea de-a doua ipoteză JAK2V617F este singurul eveniment responsabil de MPN şi fenotipul depinde
de fondul genetic al pacientului. Din analiza comparativă a datelor din patru studii în care tipuri genetice
diferite de şoareci au fost transplantaţi cu celule stem hematopoietice transduse cu JAK2V617F, s-a
observat că aceştia reproduc fenotipuri TE, PV sau post-PV, sugerând că mutaţia JAK2 este suficientă
pentru a induce MPN3.
Al doilea argument privind modularea fenotipului de factori genetici moşteniţi vine de la Pardanani şi
colegii care au găsit că există SNP-uri (single nucleotide polymorphisms) specifice în JAK2 şi EpoR
asociate cu PV sau TE3;5.
▪ În cea de-a treia ipoteză fenotipul depinde de nivelul activităţii kinazice a JAK2V617F. Mutaţia JAK2V617F
poate fi găsită fie în stare heterozigotă, fie în stare homozigotă la pacienţii cu MPN, mecanismul care
duce la homozigotism fiind în majoritatea cazurilor recombinarea mitotică a cromozomului 93. Astfel
colonii eritroide JAK2V617F mutante homozigote sunt observate la majoritatea pacienţilor cu PV, chiar
la cei cu o încărcătură mică a alelei, dar sunt numai rar observate în TE. Datele cercetărilor sugerează că
există diferenţe calitative şi/sau cantitative în semnalizarea constitutivă în celulele JAK2V617F mutante
dependente de doza genei, ceea ce afectează fenotipul, sugerându-se că nivelul semnalizării JAK2-
STAT5 funcţionează ca un reostat care determină fenotipul predominant eritroid sau megakariocitic.
Când este prezentă în stare heterozigotă mutaţia stimulează preferenţial megakariopoieza, iar în stare
homozigotă scade megakariopoieza în favoarea eritropoiezei crescute9. În funcţie de nivelul şi durata
expunerii activitatea kinazică susţinută va duce în final la mielofibroză3.
În general cea mai mare încărcătură a alelei V617F, respectiv nivelul alelei mutante faţă de alela normală,
este găsită la pacienţii cu PV, urmaţi de cei cu PMF şi TE1;5,10.
Explicaţia pentru modul în care variaţii în cantitatea unei proteine mutante unice pot duce la fenotipuri
diferite poate proveni din expresia diferită a EpoR, MPL şi G-CSFR la nivelul progenitorilor. MPL este
exprimat la niveluri crescute în precursorii megakariocitari, sugerând că o cantitate mică de JAK2V617F
ar fi suficientă pentru a induce semnalizarea MPL, proliferarea megakariocitară şi producţia plachetară,
aşa cum se observă în TE. În schimb EpoR este exprimat la niveluri scăzute în precursorii eritroizi,
astfel cantităţi mai mari de JAK2V617F ar fi necesare pentru a induce semnalizarea EpoR şi hiperplazia
eritroidă, ducând la fenotipul de PV. S-a arătat că suprasemnalizarea MPL prin stimularea excesivă de
către Tpo (trombopoietină) duce la mielofibroză, sugerând că o cantitate crescută a JAK2V617F ce duce
la o puternică semnalizare MPL în megakariocite ar fi responsabilă pentru mielofibroză3.
TE JAK2V617F(+) a fost propusă ca fiind o “formă frustă” de PV pe baza observaţiei că aceşti pacienţi
prezintă nivele mai scăzute ale trombocitelor, nivele mai crescute ale hemoglobinei, leucocitelor, nivele
mai mici ale eritropoietinei şi rate mai mari ale trombozei venoase comparativ cu cei cu TE cu JAK2
139
normală1;3;9. În plus pacienţii cu PV cu o încărcătură mare de JAK2V617F (>50%) prezintă niveluri

semnificativ crescute ale hemoglobinei şi o rată crescută de transformare fibrotică comparativ cu
pacienţii heterozigoţi, iar progresia la mielofibroza post-PV este asociată cu creşterea încărcăturii în
JAK2V617F3. Dat fiind faptul că transformarea mielofibrotică a PV şi TE nu poate fi diferenţiată de PMF,
pacienţii diagnosticaţi cu PMF ar putea reprezenta indivizi care se prezintă într-o fază accelerată a unei
MPN preexistente1. Astfel unii consideră MPN JAK2V617F(+) ca fiind o singură boală cu diferite stadii/
fenotipuri3;10.
Pe de altă parte, pacienţii cu TE JAK2V617F(+) aproape niciodată nu evoluează la homozigotism, în
timp ce pacienţii cu PV JAK2V617F(+) aproape întotdeauna au o subclonă homozigotă care poate
fi detectată doar dacă se analizează colonii individuale. Astfel se consideră că există o diferenţă
moleculară fundamentală între pacienţii cu PV şi TE mai degrabă decât un “continuum” aşa cum a fost
sugerat de modelul “formei fruste”9.
De asemenea mutaţii somatice adiţionale pot contribui la patogenia PV, TE şi PMF JAK2V617F(+)5.
▪ În cea de-a patra ipoteză mutaţia JAK2V617F poate să nu fie evenimentul clonogenic iniţial în
dezvoltarea MPN şi poate exista o celulă mutantă pre-JAK2 care determină fenotipul, în sprijinul acestei
afirmaţii venind şi faptul că blaştii leucemici de la pacienţii cu MPN JAK2V617F(+) care evoluează
spre leucemie acută sunt adesea negativi pentru această mutaţie3;10 sau faptul că pacienţi cu MPN
JAK2V617F(+) produc colonii eritroide eritropoietin-independente negative pentru mutaţia JAK21. Multe
grupuri au descris pacienţi care prezintă o altă anomalie moleculară asociată JAK2V617F, cum ar fi
BCR-ABL, mutaţii MPL sau altă mutaţie JAK23. Recent au fost raportaţi pacienţi în care achiziţia mutaţiei
JAK2 a fost precedată de deleţia cromozomului 20q sau o mutaţie în TET2. În plus la o proporţie din
pacienţii cu MPN în fază cronică a fost identificată o boală biclonală în care două evenimente genetice
(mutaţii în JAK2 sau MPL sau deleţii ale cromozomului 20q) pot fi detectate în expansiuni clonale
separate1.
În ultimul rând existenţa cazurilor familiale de MPN, în majoritatea lor cu transmitere autosomal dominantă
cu penetranţă incompletă, este argumentul cel mai puternic pentru prezenţa unui eveniment pre-JAK2 la
unii pacienţi. În toate cazurile JAK2V617F este dobândită ca o alelă somatică. În cadrul aceleeaşi familii
pot coexista entităţi clinice diferite şi forme JAK2V617F(+) şi JAK2V617F(-), sugerând prezenţa unui
eveniment necunoscut la nivelul liniei germinale ce ar fi un factor predispozant pentru MPN3;5.
Există studii care demonstrează că achiziţia mutaţiei JAK2V617F este puternic asociată cu moştenirea
unui haplotip care include gena JAK2. La heterozigoţii pentru acest haplotip mutaţia JAK2 a fost
observată mult mai frecvent în cis faţă de alela predispozantă. Au fost propuse două modele: modelul
hipermutabilităţii, în care alela predispozantă este în mod particular predispusă la achiziţia de mutaţii
ca urmare a unor mecanisme necunoscute, şi modelul „terenului fertil”, în care mutaţiile JAK2 pot
apărea în mod egal la nivelul oricărei alele, dar este mult mai posibil să rezulte în expansiune clonală
cu boală manifestă dacă sunt achiziţionate în cis cu haplotipul predispozant, poate ca urmare a unei
diferenţe în expresia sau funcţia proteinei JAK2 codificate de această alelă1 (vezi fig. 18.1.1.14.2).
140
18
Figura 18.1.1.14.2 Model pentru patogeneza MPN

(Adaptare după Levine, R. L. et al. Blood 2008;112:2190-2198).
CHS = celula stem hematopoietică PV = policitemia vera

TE = trombocitemia esenţială MF = mielofibroză
Rolul mutaţiei JAK2V617F(+) în complicaţiile MPN, incluzând tromboza, mielofibroza şi transformarea
leucemică rămâne necunoscut5. Pacienţii cu TE JAK2V617F(+) au fost raportaţi ca prezentând rate
crescute de tromboză generală şi tromboză venoasă comparativ cu cei fără mutaţie, dar o asociere
directă între TE JAK2V617F(+) şi evenimentele arteriale nu a fost bine stabilită1. Studii recente
sugerează că leucocitoza este un important factor de risc pentru tromboză în MPN, într-un studiu
fiind observată o expresie crescută a genelor indicative a activării neutrofilice la pacienţii cu ET
JAK2V617F(+), sugerând că există o relaţie între activarea neutrofilelor, tromboză şi semnalizarea
JAK2 în MPN5. În ceea ce priveşte progresia spre leucemia acută, aceasta implică achiziţia unor
alte evenimente genetice. Studiile efectuate pe linii celulare sugerează că expresia JAK2V617F
este asociată cu creşterea deteriorării ADN-ului şi reparare aberantă a acestuia. În plus celulele
JAK2V617F(+) de la pacienţi cu PV sau PMF eşuează în a suferi apoptoza ca răspuns la deteriorarea
ADN-ului, furnizând astfel un mecanism pentru acumularea de leziuni genetice. Totuşi în jumătate din
cazuri leucemia dezvoltată în contextul unei MPN JAK2V617F(+) precedente este negativă pentru
mutaţia JAK2, existând două modele alternative pentru a explica acest fenomen: 1. cele două faze ale
bolii sunt legate filogenetic, apărând dintr-o clonă fondatoare comună (pre-JAK2), şi 2. MPN şi AML
sunt nelegate clonal şi reflectă transformarea unor celule stem independente1.
Identificarea de mutaţii activatoare în JAK2 a dus la dezvoltarea de terapii moleculare ţintite pentru
aceşti pacienţi. Trialuri de faza I cu inhibitori JAK2 au fost iniţiate în PMF şi mielofibroza post-PV/
TE.
141
La pacienţii cu PV JAK2V617F(+) utilizarea interferonului a fost raportată că reduce încărcătura alelei

mutante, cu obţinerea ocazională a remisiunii moleculare1.
Spre deosebire de JAK2V617F în care o singură alelă a fost identificată, au fost raportate cel puţin 8
mutaţii distincte în exonul 12 al JAK2, incluzând mutaţii missense, deleţii, şi inserţii implicând reziduurile
537-543 (N542-E543del, F537-K539delinsL, E543-D544del, K539L6). Ca şi în cazul JAK2V617F,
expresia mutaţiilor exonului 12 duce la creşterea citokin-independentă a celulelor hematopoietice,
activarea căilor de semnalizare STAT5, AKT şi MAP kinazei. Mutaţiile activatoare ale exonului 12
contează probabil pentru mai puţin de 2% din pacienţii cu PV, fiind identificate până în prezent numai
la pacienţi cu eritrocitoză JAK2V617F(-) şi, în majoritatea cazurilor, la cei cu eritrocitoză idiopatică fără
leucocitoză şi trombocitoză asociate. Aceasta sugerează faptul că mutaţii activatoare diferite în JAK2
se asociază cu fenotipuri clinice diferite5;10. Mutaţiile exonului 12 JAK2 sunt suficiente să producă
eritrocitoză în stare heterozigotă, rezultând într-o semnalizare ligand-independentă prin JAK2 mai
puternică, iar proteine ţintă, cum ar fi Stat5, ERK1 şi ERK2 par să fie mai puternic fosforilate decât în
cazul JAK2V617F8;9. Absenţa mutaţiilor exonului 12 la pacienţii cu TE este în acord cu conceptul că
niveluri scăzute ale semnalizării JAK2 favorizează trombocitoza, în timp ce semnalizarea mai activă
favorizează eritrocitoza8.
Pacienţii cu mutaţii ale exonului 12 JAK2 se prezintă cu eritrocitoză, niveluri scăzute ele eritropoietinei
serice şi cu histologie medulară distinctivă (hiperplazie eritroidă fără anomalii morfologice ale
megakariocitelor şi liniei granulocitare). Ca şi în alte MPN, se pot obţine culturi eritroide eritropoietin-
independente din celulele sanguine periferice, iar anomaliile citogenetice, splenomegalia sau
transformarea mielofibrotică au fost observate la unii pacienţi8.
Recomandări pentru mutaţia JAK2V617F şi interpretarea rezultatelor
● Evaluarea diagnostică iniţială a pacienţilor cu suspiciune clinică de MPN şi BCR-ABL1(-).
● Evaluarea policitemiilor împreună cu nivelul seric al eritropoietinei.
Genotiparea moleculară face parte din criteriile de diagnostic WHO 2008 pentru MPN, respectiv
testarea pentru mutaţiile JAK2, MPL şi KIT devenind un instrument standard în protocolul de
diagnostic al MPN, detecţia uneia din aceste mutaţii stabilind cu certitudine prezenţa unei boli clonale
şi excluzând granulocitoza, eritrocitoza, trombocitoza sau mielofibroza reactivă11.
În schimb ele nu pot distinge între diferitele forme de MPN, deşi mutaţiile exonului 12 JAK2 nu au fost
raportate până în prezent decât în PV şi nici un pacient cu PV nu a prezentat o mutaţie MPL10. Pentru
un diagnostic definitiv rezultatul trebuie corelat cu datele clinice şi alte date de laborator, precum şi cu
modificările histopatologice caracteristice fiecărui subtip11 (vezi figura 18.1.1.14.3).
142
18
Suspiciune clinică MPN
JAK2V617F genotipare
Pozitiv Negativ
PV, TE, PMF PV: improbabil; test pentru

foarte probabil mutaĠiile ex12 JAK2
TE sau PMF: încă posibile;

test pentru mutaĠia MPL
Se vor folosi criterii
OMS adiĠionale pentru
a fi diferenĠiate între Se vor folosi criterii OMS
ele sau a le distinge de adiĠionale pentru a confirma
alte MPNs rare diagnosticul úi/ sau a le
diferenĠia de condiĠiile reactive
sau de alte de alte MPNs rare
Fig. 18.1.1.14.3 Algoritm de utilizare a genotipării JAK2V617F

în cazul suspiciunii clinice de MPN.
(Adaptare după Vannucchi M A, Guglielmelli P, Tefferi A. „Advance in Understanding and
Management of Myeloproliferative Neoplasms”. CA Cancer J Clin 2009; 59: 171-191).
Semnificaţia prognostică a detecţiei mutaţiei JAK2V617F în MPN nu a fost încă clar stabilită.
Un rezultat negativ pentru mutaţia JAK2V617F nu exclude prezenţa unei MPN sau altei neoplazii. În
cazurile rare de PV la care aceasta este absentă poate fi găsită o mutaţie a exonului 12 JAK2, iar un
procent redus dintre pacienţii cu PMF şi TE la care lipseşte o mutaţie JAK2 poate demonstra mutaţii
activatoare MPL, cum ar fi MPL W515K sau MPL W515L11. Este însă în dezbatere dacă diagnosticul
de PV poate fi susţinut în absenţa unei mutaţii JAK210 .
Datorită implicaţiilor terapeutice testarea pentru BCR-ABL1 trebuie considerată la pacienţii fără mutaţii
JAK2 sau MPL1.
Specimen recoltat – sânge venos4.
Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant4.
Cantitate recoltată – cât permite vacuumul4.
Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant4.
Metodă – secvenţierea exonului 14. La pacienţii negativi pentru mutaţia JAK2V617F se va efectua
secvenţierea exonului 12 JAK24.
Pentru diagnosticul molecular al mutaţiilor exonului 12 este de preferat să se folosească ADN din
celulele medulare sau din colonii hematopoietice clonogene decât ADN din leucocitele periferice,
143
deoarece implicarea granulocitară la aceşti pacienţi este de obicei scăzută8.

Metoda folosită poate să nu identifice mutaţiile la pacienţii cu încărcătură clonală mică6.
Bibliografie
1. Beer A P, Green R A. „Pathogenesis and management of essential thrombocythemia”. In

Hematology 2009(1): 621.
2. George I T. „Pathology of the Myeloproliferative Diseases”. In Wintrobe`s Clinical Hematology,
Wilkins, 2009, 2054-66. 1988.
3. James C. „The JAK2V617F Mutation in Polycythemia Vera and Other Myeloproliferative
Disorders: One Mutation for Three Diseases?”. In Hematology 2008(1): 69.
5. Levine R, Gilliland D G. „Myeloproliferative disorders”. In Blood 2008; 112(6): 2190-98.
6. Ohyashiki H J, Hisatomi H, Shimizu S, Sugaya M, Ohyashiki K. „Detection of Low Allele Burden
of Jak2 Exon 12 MutationsUsing TA-cloning in Patients with Erythrocytosis”. In Japanese Journal
of Clinical Oncology 2009; 39(8): 509-513.
7. Rane S, Reddy E P. „Janus kinases: components of multiple signaling pathways”. In Oncogene
2000; 19(49): 5662-79.
8. Scott M L, et al. „JAK2 Exon 12 Mutations in Polycythemia Vera and Idiopathic Erythrocytosis”.
In NEJM 2007; 356(5): 459-468.
9. Skoda R. „Thrombocytosis”. In Hematology 2009(1): 159.
10. Vannucchi M A, Guglielmelli P, Tefferi A. „Advance in Understanding and Management of
Myeloproliferative Neoplasms”. In CA Cancer J Clin 2009; 59: 171-191.
11. Vardiman W J, et al. „The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification
of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes”. In Blood 2009;
114(5): 937-951.
12. Verstovsek S. „Therapeutic potential of Jak2 inhibitors”. In Hematology 2009(1): 636.
13. Yamaoka K, Saharinen P, Pesu M, Holt ET V III, Silvennoinen O, O`Shea J J. „The Janus
kinases (Jaks)”. In Genome Biol. 2004; 5(12): 253.
18.1.1.15 Mastocitoza sistemică - mutaţia c-Kit D816V
Mastocitoza este recunoscută în majoritatea cazurilor ca reprezentând o boală clonală a celulei
144
18
progenitoare hematopoietice pluripotente, mutaţia cea mai comună fiind reprezentată de mutaţia
activatoare la nivelul codonului 816 al genei c-Kit4. Manifestările clinice ale bolii caracterizate
prin proliferarea patologică a mastocitelor includ prurit, flushing, greaţă, vărsături, diaree, dureri
abdominale, ulcer şi instabilitate vasculară. Trăsăturile patologice dominante sunt reprezentate de
acumularea anormală de mastocite în piele, tractul gastrointestinal, măduvă, ficat, splină, ganglionii
limfatici şi asocierea frecventă a acestei creşteri a numărului de mastocite cu afecţiuni hematologice.
Mastocitoza poate apărea la orice vârstă, prevalenţa exactă nefiind cunoscută, apariţia familială
fiind neobişnuită. Se crede în prezent că diferitele variante ale bolii sunt în parte dependente de
polimorfisme specifice moştenite genetic şi mutaţii somatice dobândite şi sunt împărţite în mastocitoză
cutanată şi sistemică. Clasificarea acestor pacienţi se bazează pe prezentarea clinică, anomaliile
patologice şi prognostic4.
Tabelul 18.1.1.15 Clasificarea WHO a mastocitozei
Variante Subvariante
Mastocitoza cutanată (CM) Urticaria pigmentosa, CM maculopapulară, CM
difuză, Mastocitomul cutanat
Mastocitoza sistemică indolentă (ISM) Smouldering SM, Mastocitoza izolată medulară
Mastocitoza sistemică asociată cu o boală Leucemie acută mieloidă (SM-AML),
clonală hematologică non–mastocitară Sindrom mielodisplazic (SM-MDS), Afecţiuni
(SM-AHNMD) mieloproliferative (SM-MPD), Leucemie
mielomonocitară cronică (SM-CMML), Limfom
nonHodgkin (SM-NHL)

Mastocitoza sistemică agresivă (ASM) SM limfadenopatică cu eozinofilie

Leucemia mastocitară (MCL) MCL aleucemică

Sarcomul mastocitar

Mastocitomul extracutanat
Mastocitele se găsesc în mod normal în ţesuturi, în general localizate în apropierea suprafeţelor

epiteliale, vaselor de sânge, nervilor şi glandelor. Ele derivă din celulele progenitoare pluripotente
CD34+ (celulele stem) care dau naştere mastocitelor, celulelor T, celulelor B şi monocitelor. În afara
unei populaţii de mastocite care se găseşte în măduva osoasă, maturaţia completă are loc în ţesuturile
periferice. Rolul biologic al mastocitelor rămâne în mare parte speculativ, bazat în general pe studii in
vitro şi modele animale, cu 2 excepţii principale, reacţiile de hipersensibilitate imediată mediate-IgE şi
mastocitoza. Mastocitele pot fi caracterizate fie ca mastocite ale mucoaselor, fie mastocite ale ţesutului
conjunctiv, primele predominând în plămân şi mucoasa tractului gastrointestinal şi conţinând o triptază
specifică (mastocite tip T), iar ultimele fiind aflate mai frecvent în derm şi ţesuturile submucoase
şi conţinând atât triptază cât şi chimotriptază (mastocite CT). Granulele mastocitare conţin de
asemenea heparină, condroitin sulfat proteoglicani, TNF-α, histamină, hidrolaze acide, catepsină
G, carboxipeptidază. Împreună aceşti mediatori sunt responsabili de semnele clinice ale reacţiei de
hipersensibilitate imediată, incluzând prurit, flushing, palpitaţii, de asemenea raportate la mulţi pacienţi
145
cu mastocitoză. De asemenea activarea mastocitară duce la sinteza şi secreţia de factori de creştere

şi citokine, incluzând MIP 1-α, BFGF, NGF, TNF, GM-CSF, VEGF, IL1-6, 8-10, 13,164,5.
Studiile efectuate au arătat că multe aspecte ale dezvoltării mastocitelor sunt reglate în mod critic
de SCF (Stem Cell Factor), mecanismul prin care acesta promovează supravieţuirea mastocitelor
fiind inactivarea factorului de transcripţie FOXO3a şi reducerea fosforilării ţintei sale, o proteină
proapoptotică Bim5.
Kit, receptorul pentru SCF, este o tirozin kinază tip III transmembranară, care aparţine aceleeaşi
subfamilii ca şi receptorii PDGF, Flt3 şi M-CSF. Kit este exprimat de celulele progenitoare
hematopoietice, celulele pacemaker gastrointestinale, melanocite şi celulele germinale. Kit scade de
pe suprafaţa celulelor progenitoare pe măsură ce acestea se diferenţiază, mastocitele reprezând o
excepţie de la acest fenomen, ele menţinând expresia de suprafaţă a Kit la nivele ridicate în stadiul
de celule mature4;5. Stimularea Kit de către ligandul său, SCF, duce la dimerizarea sa şi activarea
activităţii sale tirozin kinazice intrinseci. Reziduuri specifice de tirozină se autofosforilează, ceea ce
are ca urmare activarea unor căi de semnalizare în aval, incluzând calea Ras/Erk şi calea PI3-kinazei.
Domeniul care reglează activitatea proteinei Kit este domeniul de activare A loop6. Kit exercită funcţii
critice în biologia celulelor germinale feminine şi masculine, reglând ovogeneza, foliculogeneza şi
spermatogeneza4.
Kit este codificat de c-Kit, localizată pe cromozomul 4 (q11-12)4. Mutaţii ce duc la pierderea funcţională
a Kit duc la defecte în hematopoieză, melanogeneză şi gametogeneză, spre exemplu piebaldismul, o
afecţiune a pigmentării autosomal dominantă caracterizată prin prezenţa de porţiuni de piele şi păr albe.
Mutaţiile missense c-Kit pot să apară în exonul 11 (care codifică regiunea juxtamembranară), găsite
predominant in tumori stromale gastrontestinale, sau in exonul 17 (care codifică regiunea activatoare
a domeniului kinazic A loop). Un tip de mutaţie frecvent apărută în exonul 17 este la nivelul codonului
816, mutaţie găsită în câteva malignităţi umane, incluzând leucemia acută mieloidă, mastocitoză,
tumori ale celulelor germinale, limfomul sino-nazal cu celulă NK/T, teratoame intracraniale. Aceste
mutaţii în codonul 816 duc la substituţia acidului aspartic cu valina, tirozina, fenilalanina, asparagina
sau histidina5;7.
Mutaţiile Asp816 în c-Kit (activatoare) se asociază cu activarea constitutivă a tirozin kinazei şi
promovează autofosforilarea ligand-independentă a receptorului, conferind mastocitelor activate un
avantaj de supravieţuire faţă de celulele normale. Cea mai comună mutaţie a c-Kit este substituţia
acidului aspartic cu valina, D816V, mecanismul prin care mutanta oncogenică „semnalizează” fiind
numai parţial cunoscute6. Mutaţia D816V este întâlnită la >80% din pacienţii cu mastocitoză sistemică
şi poate reprezenta o potenţială ţintă terapeutică6.
Heterogenitatea clinică nu poate fi explicată prin existenţa aceleeaşi mutaţii la majoritatea pacienţilor.
Astfel, cel puţin la unii pacienţi, una sau mai multe mutaţii adiţionale independente în celulele
progenitoare CD34+ sau în alte celule ar putea constitui baza moleculară responsabilă pentru fenotipul
bolii. Nu există încă dovezi că mutaţia D816V trece de la o generaţie la alta4.
Au fost identificate şi alte mutaţii ce pot juca un rol în etiologia mastocitozei la unii pacienţi, cum
ar fi V560G (în domeniul juxtamembranar al Kit) detectată în leucemia mastocitară, D816Y, D816F,
D816H, precum şi E839K (mutaţie inactivatoare) în câteva cazuri raportate de mastocitoză la copii
şi mutaţia rară a liniei germinale F522C, căile semnalizării intracelulare responsabile de oncogeneză
146
18
nefiind pe deplin elucidate în toate cazurile, deşi alterarea asocierii Kit mutant cu subunitatea p85 a
fosfatidilinozitol 3`-kinazei pare a juca un rol în creşterea ligand-independentă şi supresia apoptozei.
Mutaţii extrem de rare, prezente la <1% din pacienţii cu mastocitoză, includ R815K, D820G, V533D,
V559A, del419, K509I, A533D5.
Figura 18.1.1.15: Reprezentare schematică a proteinei Kit şi localizarea mutaţiilor; domeniul

extracelular conţine 5 domenii imunoglobulin-like, domeniul intracelular codifică 2 domenii repetitive
tandem ale domeniului catalitic enzimatic. Mutaţiile în codonul 560 în regiunea juxtamembranară şi
codonul 816/820 unde are loc autofosforilarea proteinei Kit, în timp ce mutaţia la nivelul codonului 839
are ca efect pierderea funcţiei receptorului.
1
Adaptare după J Mol Diagn. 2005 May; 7(2): 252–257
Mutaţia c-Kit D816V sau o altă mutaţie similară activatoare este în general considerată un eveniment
precoce cromozomial important pentru dezvoltarea bolii la majoritatea pacienţilor adulţi şi la unii
copii. Mutaţia c-Kit devine iniţial detectabilă în mastocitele din leziunile cutanate. Este în prezent
acceptat că majoritatea adulţilor cu mastocitoză prezintă mutaţia D816V dacă sunt examinate celulele
mononucleare din măduvă. Pe măsura expansiunii clonale şi progresia bolii, mutaţia poate deveni
detectabilă în celulele sanguine periferice. Astfel, analiza mutaţiilor c-Kit este cel mai bine efectuată pe
măduva osoasă4. Deşi celulele T şi B ale acestor pacienţi poartă o mutaţie a codonului 816 (ca de ex.
D816V), spre deosebire de mastocite, aceste celule când devin mature nu exprimă Kit pe suprafaţă,
putând fi astfel mai puţin susceptibile efectelor biologice ale Kit activat constituţional.
În plus faţă de căile Kit-dependente, inhibarea apoptozei mastocitare prin alte mecanisme biologice
147
poate duce de asemenea la mastocitoză, spre exemplu prin implicarea PDGFRβ, care codifică pentru
o tirozin kinază imatinib-sensibilă.
Creşterea numărului de mastocite nu este limitată la mastocitoză, spre exemplu unii pacienţi cu
leucemie eozinofilică cronică care poartă o proteină de fuziune FIP1L1-PDGFRα prezintă de
asemenea număr crescut de mastocite şi niveluri serice crescute de triptază, manifestările clinice
putându-se suprapune cu cele ale mastocitozei sistemice cu eozinofilie. Identificarea mutaţiei c-Kit
sau a proteinei de fuziune este necesară pentru diferenţierea acestor pacienţi cu evoluţie clinică,
prognostic şi tratament diferite4;5.
Mutaţia poate fi detectată în ADN-ul extras din biopsie cutanată, ADN din sânge periferic sau din
măduva osoasă.
Recomandări pentru mutaţia c-Kit D816V - diagnosticul mastocitozei sistemice3.
Specimen recoltat – a) sânge venos; b) aspirat medular2.
Recipient de recoltare – a) şi b) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant2.
Cantitate recoltată – a) 3-5 mL; b) 3 mL (minimum 1 mL)2.
Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant2.
Metodă – amplificare PCR specifică a alelei mutante2.
Detecţia unei mutaţii la nivelul codonului 816 este inclusă ca unul din criteriile minore de diagnostic
pentru mastocitoza sistemică în clasificarea WHO a neoplaziilor hematopoietice, prezentând de
asemenea relevanţă terapeutică, întrucât imatinibul este ineficient în majoritatea cazurilor de
mastocitoză sistemică asociate cu mutaţia D816V în c-Kit3;4;7.
Aceste mutaţii sunt mai uşor identificate la pacienţii cu boală mai severă datorită expansiunii clonale a
celulelor derivate din progenitorii neoplazici. Astfel, prezenţa mutaţiei c-Kit în smouldering SM este un
marker de prognostic nefavorabil. De asemenea formele agresive de mastocitoză la copii se asociază
adesea cu o mutaţie identificabilă în c-Kit5.
În unele cazuri de mastocitoză sistemică mutaţia poate fi prezentă numai în mastocite. Deoarece
aceste celule rareori circulă în sânge şi sunt dificil de obţinut în număr semnificativ în specimenele de
aspirat medular, rezultate fals negative pot apărea dacă celulele neoplazice sunt prezente sub limita
de sensibilitate a testului2.
Mutaţiile c-Kit, inclusiv D816V, pot fi de asemenea prezente la puţini pacienţi cu tumori ale celulelor
germinale sau alte tumori nonmastocitare cu sau fără mastocitoză sistemică coexistentă5.
Bibliografie
1. Hirokatsu Yanagihori, Noritaka Oyama, Koichiro Nakamura, Fumio Kaneko. C-kit Mutations in
Patients with Childhood-Onset Mastocytosis and Genotype-Phenotype Correlation. In J Mol
Diagn. 2005 May; 7(2): 252-257.
148
18
3. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health
Care Organizations. “Kit Asp816Val Mutation Analysis, Qualitative PCR”. www.
4. Metcalfe D, „Mast Cells and Mastocytosis”. In Blood, 2008, 112 (4): 946-956.
5. Worobec A, Metcalfe D. „Systemic Mastocytosis”. În Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J,
Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins,
2004, 2054-66.
6. Schumacher J A, Elenitoba-Johnson K S, Lim, M S. “Detection of the c-Kit D618V Mutation in
Systemic Mastocytosis by Allele Specific PCR”. In J Clin Patol, 2008, 61:109-114.
7. Sun J, Pedersen M, Rönnstrand L. „The D816V Mutation of c-Kit Circumvents a Requirement for
Src Family Kinases in c-Kit Signal Transduction”. In J Biol Chem (2009), 284 (17):11039-11047.
149
150
18
18.1.2 AFECŢIUNI ONCOLOGICE
18.1.2.1 Polipoza adenomatoasă familială
Polipoza adenomatoasă familială (PAF), deşi este o afecţiune rară, constituie cel mai frecvent sindrom
de polipoză adenomatoasă. Are o transmitere autozomal dominantă şi se caracterizează prin apariţia
precoce a sute sau chiar mii de polipi adenomatoşi diseminaţi în întregul colon şi rect. În absenţa
tratamentului PAF evoluează invariabil spre cancer colonic până la vârsta de 35-40 ani. În plus, există
un risc crescut şi pentru alte tumori maligne.
Incidenţa PAF este constantă în întreaga lume şi variază de la 1:6000 la 1:12000 naşteri, ambele sexe
fiind implicate în mod egal.
Defectul genetic în PAF este reprezentat de o mutaţie a liniei germinale în gena APC (adenomatosis
polyposis coli), o genă supresoare tumorală situată pe braţul lung al cromozomului 5, banda q21.
Aceasta este formată din 15 exoni şi codifică o proteină cu greutate moleculară mare (309 kDa).
Proteina APC are mai multe domenii care mediază oligomerizarea dar şi interacţiunea cu o varietate
de proteine intracelulare, care au un important rol în adeziunea celulară, transducţia semnalului şi
activarea transcripţiei. Studiile efectuate atât in vitro cât şi pe modele animale (ce au folosit şoarecii)
au demonstrat că APC este de asemenea implicată în alinierea cromozomilor în metafază, migrarea
celulelor şi promovarea apoptozei în celulele colonului1;2;4.
APC este o proteină supresoare tumorală clasică care deţine un rol central în calea de semnalizare
Wnt, în parte prin reglarea degradării β-cateninei. Semnalele transmise pe calea Wnt influenţează
stabilitatea unui complex de proteine, care conţine β-catenina, conductina şi GSK3 (kinaza glicogen
sintetazei). În absenţa Wnt sau în prezenţa proteinei APC de tip sălbatic β-catenina este degradată în
proteazom printr-un proces mediat de ubiquitină. În prezenţa Wnt sau lipsa APC (aşa cum se întâmplă
în cele mai multe forme de cancer colonic), sunt exprimate genele ţintă ale β-cateninei, printre care
şi c-MYC. Expresia genei MYC determină creşterea expresiei poliamin-ornitin-decarboxilazei (ODC),
care este o protooncogenă. Deci, produsul genei APC reglează indirect transcrierea unui număr de
gene critice implicate în proliferarea celulară, prin intermediul interacţiunii cu factorul de transcripţie
β-catenina.
Mai mult de 300 tipuri diferite de mutaţii sunt recunoscute astăzi ca fiind cauza polipozei adenomatoase
familiale. Ele sunt reprezentate de deleţii mici - 46%; inserţii mici - 10% şi mutaţii nonsens - 28%. Au
fost de asemenea raportate şi alterări genice mari (13%), datele recente sugerând că acestea pot fi
responsabile de până la 20% din cazurile de PAF1.
Cea mai frecventă mutaţie, care apare la aproximativ 10% din pacienţi cu PAF, este o deleţie în
codonul 1309, iar următoarea ca frecvenţă, (care apare la 5% din pacienţi), este tot o deleţie dar în
codonul 1061. Mai mult de 60% din mutaţiile APC se găsesc în regiunea centrală denumită MCR
(„mutation cluster region”), situată între codonii 1284 şi 1580; această regiune este responsabilă de
degradarea β-cateninei.
Analiza mutaţiilor genei APC indică faptul că majoritatea anomaliilor genetice duc la sinteza unei
proteine trunchiate sau nefuncţionale. Pierderea funcţiei APC determină inhibarea apoptozei şi
151
permite β-cateninei să se acumuleze intracelular, lucru ce determină stimularea creşterii celulare cu

dezvoltarea ulterioară a adenoamelor.
Există corelaţii între anumite mutaţii şi manifestările clinice de boală, dar cu toate acestea, corelaţia
nu este exactă şi pot apărea diferenţe.
Anomaliile genetice care determină apariţia formei clasice de boală se găsesc între exonul 5 şi
porţiunea 5’ din exonul 15, în timp ce cele asociate cu forma atenuată tind să se grupeze în regiunea
extremă 5’ a genei şi porţiunea 3’ a exonului 15 (proximal de codonul 1517 sau distal de 1900).
Mutaţiile din regiunea codonilor 1250 - 1464 sunt asociate cu polipoză severă. Pacienţii cu mutaţii
între codonii 1445 - 1578 pot dezvolta tumori desmoide severe1;2;4.
Diferitele mutaţii ale genei APC definesc un spectru larg de sindroame cunoscute sub numele de
polipoză asociată cu APC, care includ:
1. PAF - forma clasică;
2. sindromul Gardner;
3. sindromul Turcot;
4. FAP - forma atenuată (AFAP)2.
1. În PAF - forma clasică diagnosticul este stabilit pe prezenţa a peste 100 polipi adenomatoşi colorectali
sau mai puţin de 100 polipi adenomatoşi şi o rudă cu PAF. Până în prezent au fost descrise cazuri la
care se întâlneau câteva mii de polipi, dar în general media a fost de 500 în momenul diagnosticului.
Vârstele medii pentru dezvoltarea polipilor, a manifestărilor clinice intestinale precum şi a carcinomului
colorectal sunt 16, 29 şi, repectiv, 36 ani2. Hipertrofia congenitală a epiteliului pigmentar retinian este
înalt specifică penru PAF; sunt prezente leziuni plate pigmentate discrete la nivelul retinei, adesea
bilaterale, fără consecinţe clinice. Acestea preced de obicei apariţia polipozei şi se corelează cu
prezenţa unor mutaţii între exonii 9 şi 15 ai genei APC4.
2. Sindromul Gardner (SG) reprezintă asocierea polipozei colonice adenomatoase cu osteoamele
(localizate în principal la nivelul craniului şi mandibulei), anomaliile dentare (lipsa erupţiei dentare,
absenţa congenitală a unuia sau mai multor dinţi, dinţi supranumerari, chisturi şi odontoame) şi
tumorile ţesuturilor moi (chisturi epidermoide, fibroame, tumori desmoide). Aceste tumori benigne
extraintestinale apar la aproximativ 20% din indivizii şi familiile cu PAF.
3. Sindromul Turcot (ST) este o combinaţie rară de polipoză adenomatoasă colonică multicentrică şi
tumori ale SNC (de obicei, meduloblastoame). Pacienţii dezvoltă carcinom colorectal în perioada de
adult tânăr, fie ca urmare a transformării maligne a leziunilor precanceroase, fie a dezvoltării de novo
în epiteliul intact intercalat.
4. AFAP este o formă de boală caracterizată prin prezenţa unui număr redus de polipi, în medie 30,
localizaţi în colonul ascendent. Vârsta medie de apariţie a polipilor este 36 ani, iar pentru carcinomul
colorectal este de 50-55 ani (cu 10-15 ani mai târziu faţă de pacienţii cu PAF clasic, dar mai devreme
decât formele sporadice de carcinom colorectal). Se asociază frecvent polipi gastrici (cu potenţial
malign minim) precum şi polipi adenomatoşi ai intestinului subţire (cu un risc cumulat de malignizare
de 4-12%)2.
Tumorile desmoide apar la aproximativ 10% din pacienţii cu PAF, sunt mai frecvente la femei, şi sunt
induse de intervenţii chirurgicale sau sarcină. Acestea reprezintă cauza principală de morbiditate, ca
urmare a efectului de compresiune pe care îl exercită atât pe vasele sanguine, cât şi pe diversele
152
18
organe abdominale. Orice suspiciune clinică trebuie confirmată prin examene imagistice. Tratamentul
tumorilor desmoide ar trebui să fie rezultatul unui echipe multidisciplinare care să includă chirurgi,
oncologi şi gastroenterologi.
Alte tumori extra-intestinale sunt rare şi sunt reprezentate de adenocarcinomul pancreatic (2%),
cancerul tiroidian (2%), adenocarcinomul gastric (0.5%) şi hepatoblastomul la copiii mai mici de 5 ani
(1.6%).
Diagnosticul PAF se bazează pe datele clinice şi istoricul familial, dar trebuie confirmat prin teste
genetice.
Pacientul poate fi complet asimptomatic şi de aceea obţinerea unui istoric detaliat privind neoplasmele
familiale este esenţială pentru un diagnostic corect. Sângerările rectale sau manifestările abdominale
pot fi, în funcţie de stadiul bolii, un semn de alarmă. Identificarea unor manifestări extracolonice (tumori
desmoide sau osteoame la nivelul mandibulei) poate determina medicul să recomande sigmoidoscopie
sau colonoscopie, în funcţie de vârsta pacientului sau forma de boală suspicionată.
În timpul copilăriei, prin endoscopie pot fi identificate doar adenoame mici, limitate în principal
la regiunea rectosigmoidiană. Pe măsură ce pacienţii înaintează în vârstă pot fi întâlnite sute de
adenoamele colorectale sau cu localizare extracolonică.
Diagnosticul de PAF forma atenuată este mult mai complex decât în cazul formei clasice, datorită
variaţiei fenotipice largi. Colonoscopia, mai degrabă decât sigmoidoscopia, a fost recomandată
pentru screening-ul indivizilor ce prezintă risc de boală, deoarece polipii tind să se grupeze în
colonul ascendent. Diagnosticul AFAP se bazează pe o combinaţie de manifestări clinice şi analize
genetice1.
Testarea genetică este folosită în principal pentru screening-ul persoanelor asimptomatice cu risc de
a dezvolta precoce PAF, dar şi pentru confirmarea diagnosticului la pacienţii cu manifestări clinice
neclare. O dată identificată mutaţia testarea poate fi extinsă şi la rudele pacientului.
Pentru testarea adulţilor asimptomatici cu risc sunt disponibile în laboratorul nostru teste pentru
evidenţierea mutaţiilor de la nivelul genei APC.
La aproximativ 25-30% dintre pacienţii cu manifestări clinice evidente de PAF nu a fost identificată
nicio mutaţie.
Deoarece PAF este o afecţiune ereditară ce se transmite autozomal dominant, fiecare copil al unei
persoane afectate are un risc de 50% de a moşteni mutaţia APC. La majoritatea persoanelor cu o
mutaţie APC predispozantă la PAF aceasta este moştenită de la unul dintre părinţi.
Riscul fraţilor persoanei afectate depinde de statusul genetic al părinţilor. Dacă un părinte este afectat
sau este purtătorul unei mutaţii APC riscul ca aceasta să fi transmisă copiilor este de 50%.
Aproximativ 20-30% din pacienţi au mutaţii de novo.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut este posibil prin analiza ADN-ului extras din celulele
fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei efectuată la aproximativ 15-18 săptămâni de gestaţie, sau
biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-12 săptămâni de gestaţie. Mutaţiile cauzatoare de boală
trebuie să fie identificate înainte de testarea prenatală la un membru afectat al familiei.
Scopul diagnosticului genetic la persoanele asimptomatice este identificarea purtătorilor şi prevenirea
mortalităţii premature prin cancer sau de alte complicaţii ale PAF. Indivizii cu PAF au risc de 100% de a
dezvolta cancer colorectal, care este redus aproape la zero atunci când pacienţii sunt introduşi într-un
153
program de screening şi tratament adecvat1;3. Tratamentul chirurgical profilactic aplicat în multe centre
este proctocolectomia cu anastomoză ileo-anală care permite menţinerea funcţiei rectale4.
Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau
hemolizate3.
Metodă – secvenţierea tuturor exonilor genei APC+ analiza deleţiilor/duplicaţiilor MLPA3.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate în gena APC şi genotipul respectiv3.
Bibliografie
1. Elizabeth Half, Dani Bercovich, Paul Rozen. Familial adenomatous polyposis. In Orphanet
Journal of Rare Diseases, 4:22, 2009.
2. ES Boia, R Mejdi. Familial Adenomatous Polyposis (FAP): What Must Be Known And What
Should Be Done – Case Report. În Jurnalul Pediatrului –XI: 43-44, 2008.
4. Mohammad Wehbi, Nicole M Griglione, Vincent W Yang, Kamil Obideen, Jae W Nam, John M
Carethers, Familial Adenomatous Polyposis, www.emedicine.medscape.com. Ref Type: Internet
Communication.
18.1.2.2 Cancerul colorectal nonpolipozic ereditar (HNPCC)
Informaţii generale şi recomandări pentru testarea genetică

Sindromul cancerului colorectal nonpolipozic ereditar (HNPCC), cunoscut şi sub denumirea de
sindromul Lynch, are la bază o predispoziţie genetică de a dezvolta cancer colorectal, uterin (de
endometru) sau alte tipuri de neoplazii.
HNPCC este responsabil de 1-3% din cancerele de colon şi 0.8-1.4% din cancerele de endometru; are
o incidenţă de 1 la 1000 în populaţia generală. HNPCC este caracterizat printr-un risc cumulat de 80%
de dezvoltare a cancerului colorectal până la vârsta de 70 ani şi de 60% pentru cancerul endometrial
la femei. În acest sindrom sunt incluse cancere cu localizări multiple: colon, rect, endometru, stomac,
ovar, pancreas, ureter, pelvis renal, canal biliar, creier (glioblastom), piele (adenom sebaceu) sau
intestin subţire1;2;3;5:6;7.
154
18
Riscul în populaţia HNPCC

Cancer
generală Risc Vârsta medie de debut
Colon 5.5% 80% 44 ani
Endometru 2.7% 20%-60% 46 ani
Stomac <1% 11%-19% 56 ani
Ovar 1.6% 9%-12% 42.5 ani
Tract hepatobiliar <1% 2%-7% necunoscută
Tract urinar <1% 4%-5% ~55 ani
Intestine subţire <1% 1%-4% 49 ani
Sistem nervos central <1% 1%-3% ~50 ani
HNPCC este o afecţiune autozomal dominantă cauzată de o mutaţie a liniei germinative la nivelul
genelor care intervin în repararea erorilor apărute la nivelul materialului genetic în timpul procesului
de replicare – MMR (MMR – “mismatch repair genes”). Funcţia MMR constă în eliminarea greşelilor de
împerechere bază-bază şi a buclelor de inserţie-deleţie care apar ca urmare a fenomenului de “derapaj”
a ADN-polimerazei în cursul replicării ADN. Alterarea funcţiei acestor gene are drept consecinţă esenţială
apariţia unor substituţii nucleotidice (de exemplu G - T) ori inserţia sau deleţia unor scurte unităţi repetitive
(tip CA) din constituţia microsateliţilor, (segmente de ADN alcătuite din secvenţe care cuprind 1-5 perechi
de nucleotide, repetate în tandem şi localizate în regiunile codificatoare sau necodificatoare ale unor
gene), fenomen denumit instabilitatea microsateliţilor – MSI.
Cercetătorii au identificat 7 gene distincte MMR, care determină apariţia cancerului nonpolipozic colonic:
 hMLH1 pe banda 3p22;
 hMSH2 şi hMSH6 pe banda 2p16;
 hPMS1 pe banda 3p32;
 hPMS2 pe banda 7q22;
 hMSH3 pe banda 5q14.1;
 EXO1 pe 1q43 banda1;3;5:6;7.
Gena Cromozomul Frecvenţa

MSH2 2p16 45-50%
MLH1 3p22.3/A> 20%
MSH6 2p16 7-10%
PMS2 7p22.1 < 2%
PMS1 2q32.2 Rară
MSH3 5q14.1 Rară
EXO1 1q43 Rară
Anomaliile genetice de la nivelul genelor MLH1 şi MSH2 reprezintă aproape 90% din mutaţiile MMR
din HNNPC, 7-10% implică afectarea genei MSH6, iar <2% sunt mutaţii în gena PMS2.
155
Anomaliile genetice apărute în genele PMS1, MSH3, EXO1, TGFβR2 nu se testează, semnificaţia lor
clinică nefiind încă determinată.
Funcţia acestor gene poate fi perturbată de deleţii, inserţii sau rearanjamente genomice mari.
O mutaţie care inactivează gena MMR duce la acumularea de mutaţii celulare şi creşte foarte mult
probabilitatea de transformare malignă.
Deoarece penetranţa mutaţiilor este incompletă, aceste anomalii genetice predispun indivizii la cancer,
dar nu toţi cei care le moştenesc dezvoltă tumori.
Mutaţiile sunt adesea moştenite, dar pot apărea, de asemenea, de novo într-o generaţie. Aceşti
pacienţi sunt deseori identificaţi doar după ce dezvoltă timpuriu cancer de colon. Transmiterea este
autozomal dominantă, ceea ce înseamnă că 50% din copiii unei persoane afectate moştenesc o alelă
mutantă.
Nu există corelaţii genotip-fenotip bine definite, deşi mutaţiile MSH2 par a fi asociate mai frecvent
cu manifestările extracolonice decât mutaţiile MLH1. De asemenea mutaţiile MSH6 implică cel mai
adesea un debut tardiv, o incidenţa crescută a cancerelor endometriale şi un grad mai redus de
instabilitate a microsateliţilor1;3;5:6;7.
Persoanele cu sindrom Muir-Torre prezintă mai des mutaţii în gena MSH2, iar mutaţiile în gena PMS2
sunt mai frecvent prezente în familiile cu sindrom Turcot.
Gena MLH1 este formată din 19 exoni, care codifică o proteină de 756 aminoacizi. Peste 200 mutaţii
diferite au fost raportate la acest nivel.
Produsul genei MLH1, proteina Mlh, formează heterodimeri cu proteinele hMLH3, hPMS2 sau hPMS1,
complexele astfel alcătuite având rol în coordonarea ataşării altor polipeptide implicate în procesul
de reparare a ADN-ului, care includ helicazele, proteina codificată de EXO1, antigenul nuclear de
proliferare celulară (PCNA), proteina care leagă ADN-ul monocatenar (RPA) şi ADN-polimeraza.
La nivelul genei MSH2, care are în componenţă 16 exoni şi codifică o proteină de 934 aminoacizi, au
fost descrise peste 170 mutaţii. Proporţia mare a regiunilor Alu repetitive poate contribui la o rată mai
mare de rearanjamente genomice în MSH2 decât în MLH1.
Pentru recunoaşterea erorilor proteina MSH2 formează un heterodimer cu MSH6 (în cazul
împerecherilor greşite bază-bază) sau cu MSH3 (în situaţia apariţiei unor bucle de inserţie-deleţie).
Aceste complexe de proteine recunosc şi se leagă de orice secvenţă nucleotidică greşită care ar
putea apărea în timpul replicării ADN-ului. Ataşarea complexului determină recrutarea altor proteine
care vor tăia secvenţa fiică incorectă şi o vor înlocui cu una corectă, folosind componenta parentală
ca şablon.
Gena MSH6 este alcătuită din 10 exoni şi codifică o proteină de 1360 aminoacizi. Peste 30 mutaţii au
fost identificate în MSH6. Proteina Msh6 este de asemenea implicată în repararea greşelilor apărute
în replicarea ADN-ului, dar nu este absolut necesară procesului de corectare a materialului genetic.
În lipsa Msh6, proteina Msh3 poate înlocui parţial funcţia acesteia şi poate reprezenta un factor de
protecţie împotriva acumulării de erori de replicare.
Mutaţiile la nivelul genei PMS2, alcătuită din 15 exoni, sunt rare. Acestea sunt reprezentate de
mutaţii punctiforme sau rearanjamente mari. Produsul genei PMS2, o proteină de 862 aminoacizi,
dimerizează cu proteina Mlh1 formând un complex ce are rol în ataşarea altor proteine implicate în
procesul de reparare a ADN-ului1;3;5:6;7.
156
18
Diagnosticul clinic al cancerului nonpolipozic ereditar al colonului se poate face pe baza criteriilor
clinice Amsterdam sau prin testare genetică.
În 1990, în urma unei conferinţe la Amsterdam, International Collaborative Group (ICG) au elaborat
criterii clinice pentru identificarea pacienţiilor cu risc de a dezvolta HNPCC. Aceste criterii, cunoscute
acum drept criteriile Amsterdam, au la bază identificarea unui istoric familial exact de cancer
colorectal.
Criteriile Amsterdam (Amsterdam I)
- 3 sau mai mulţi membri ai unei familii cu diagnostic de certitudine de HNPCC, dintre care unul
este rudă de gradul I cu ceilalţi doi;
- 2 generaţii succesive afectate;
- 1 sau mai multe persoane diagnosticate cu tumori maligne de colon înainte de vârsta de 50
ani.
În 1999, criteriile Amsterdam I au fost revizuite pentru a include forme de cancer extracolonic şi
acestea sunt cunoscute sub numele de criteriile Amsterdam II.
Criteriile Amsterdam modificate (Amsterdam II)
- 3 sau mai mulţi membri ai unei familii diagnosticaţi cu cancere asociate cu HNPCC (colorectale,
endometriale, de intestin subţire, ureter sau pelvis renal, gastric, ovarian, tumori cerebrale -
sindromul Turcot - şi adenoame ale glandei sebacee sau keratoacantoame - sindromul Muir-
Torre), dintre care unul este rudă de gradul I cu ceilalţi doi;
- afectarea trebuie să includă cel puţin două generaţii;
- 1 sau mai multe persoane diagnosticate cu tumori maligne de colon înainte de vârsta 50 ani;
- polipoza adenomatoasă familială trebuie exclusă3;5;7.
Acurateteţea diagnosticului bazat pe criteriile clinice depinde de acurateţea datelor furnizate de
anamneza familială; verificarea buletinelor de rezultate histopatologice şi a biletelor de externare din
secţiile de chirurgie sunt esenţiale pentru documentarea cazurilor. Au fost raportate o sensibilitate de
61% şi o specificitate de 67% a criteriilor Amsterdam în ceea ce priveşte identificarea unei mutaţii
MMR în genele MSH2 şi MLH1.
Studii mai recente care au comparat riscul de cancer în familiile care întrunesc criteriile Amsterdam
şi ale căror tumori exprimă instabilitate a microsateliţilor cu cel din familiie care întrunesc criteriile
Amsterdam dar care nu prezintă MSI sugerează faptul că aceste criterii identifică mai degrabă familiile
cu o varietate de etiologii genetice şi nu doar HNPCC. Astfel, criteriile bazate numai pe istoricul familial
ar putea să nu facă distincţia între cazurile induse de mutaţii MMR şi cele rezultate ca urmare a unor
gene predispozante neidentificate încă. Din acest motiv, includerea datelor de examen molecular
(testarea MSI în ţesut tumoral şi identificarea mutaţiilor MMR) este necesară pentru stabilirea unui
diagnostic corect de HNPCC.
Ca strategie de diagnostic, se recomandă mai întâi testarea MSI în tumori, după care în cazul unui
rezultat pozitiv se va recurge la identificarea unei mutaţii MMR la nivelul liniei germinative.
Criteriile Bethesda au fost dezvoltate (1997) pentru a identifica persoanele ale căror tumori sunt
candidate la testarea MSI. S-a raportat că aceste criterii au o sensibilitate de 94%, însă specificitatea
lor este redusă (25%); modificarea acestor criterii prin includerea pacienţilor diagnosticaţi cu cancer
de colon înainte de 50 ani poate creşte specificitatea, conform studiilor efectuate.
157
Criteriile Bethesda revizuite (2004) sunt următoarele:

 Cancer colorectal diagnosticat la un pacient mai tânăr de 50 ani;
 Prezenţa cancerului colorectal sincron sau metacron sau alte tumori asociate cu HNPCC,
indiferent de vârstă;
 Cancerul colorectal cu o histologie MSI pozitivă diagnosticat la un pacient înainte de vârsta
de 60 ani;
 Cancer colorectal diagnosticat la una sau mai multe rude de gradul I afectate de tumori
asociate cu HNPCC, având un cancer diagnosticat înainte de vârsta de 50 ani;
 Cancer colorectal diagnosticat la 2 sau mai multe rude de gradul unu sau doi, indiferent
de vârstă3;5;7.
Cancerele de colon care se dezvoltă în cadrul HNPCC diferă de cele sporadice prin mai multe
caracteristici: debutul este mai precoce (vârsta medie fiind mai mică de 45 ani), localizarea
predominantă la nivelul hemicolonului drept (60-70% din cazuri), risc crescut de dezvoltare a unor
cancere de colon multiple sincrone (tumori primare diagnosticate în termen de 6 luni una faţă de
cealaltă) sau metacrone (tumori primare care apar la mai mult de 6 luni diferenţă), frecvenţa crescută
a unor cancere coloide, cu infiltrat abundent limfocitar, prognostic mai bun.
Un individ cu o mutaţie HNPCC care nu suferă colectomie parţială sau totală, după prima formaţiune
tumorală diagnosticată ca malignă are un risc de aproximativ 30-40% de a dezvolta o tumoră
metacronă în termen de 10 ani şi un risc de 50% la 15 ani. În populaţia generală, riscul este de 3% în
10 ani şi 5% la 15 de ani3;7.
Femeile cu HNPCC au risc de 20-60% de a dezvolta cancer endometrial, vârsta medie de diagnostic
al bolii fiind între 46-62 ani. La fel ca şi în cazul cancerului de colon, supravieţuirea femeilor cu tumori
endometriale este bună. Dintre femeile cu HNPCC care dezvoltă atât cancer de colon cât şi cancer
endometrial, aproximativ 50% sunt diagnosticate întâi cu tumori endometriale.
În cadrul HNPCC, vârsta medie de diagnosticare a cancerului gastric este de 56 ani, adenocarcinomul
de tip intestinal fiind forma histopatologică cea mai frecvent raportată.
Pentru cancerul ovarian asociat cu HNPCC vârsta medie de diagnostic este de 42.5 ani, aproximativ
30% din cazuri fiind confirmate înainte de vârsta de 40 ani.
Tumorile tractului urinar asociate în mod specific cu HNPCC sunt carcinoamele de tranziţie ale
ureterului şi pelvisului renal.
Cel mai comun tip de afecţiune malignă a sistemului nervos central este glioblastomul.
Cancerul mamar, laringian sau hematologic au fost de asemenea raportate în familiile cu HNPCC, dar
nu au fost demonstrate asociaţii clare între aceste tipuri de tumori.
Sindromul Turcot este considerat o tulburare caracterizată clinic prin multiple adenoame colorectale şi
tumori cerebrale primare. În 1995, Hamilton et al au demonstrat că această asociere ar putea rezulta
din cel puţin două tipuri distincte de mutaţii: o mutaţie în gena APC (care reprezintă două treimi din
cazuri şi este responsabilă pentru polipoza adenomatoasă familială) şi o mutaţie în gena PMS2 sau
MLH1 (care reprezintă o treime din cazuri). Meduloblastomul este mai frecvent asociat cu mutaţii
APC, în timp ce glioblastomul este asociat cu mutaţiile genei MMR.
Sindromul Muir-Torre, o variantă a HNPCC, este determinat de o mutaţie în genele MSH2 şi MLH1.
Reprezintă mai puţin de 1% din toate cazurile de cancer colorectal ereditar şi se caracterizează
158
18
prin manifestări tipice de HNPCC asociate cu tumori ale glandelor sebacee (adenoame sebacee,
epiteliome sebacee, carcinoame sebacee) şi keratoacantoame.
Persoanele homozigote pentru mutaţii în genele MLH1, MSH2, şi PMS2 prezintă forme precoce
de cancer de colon, apărute înainte de al doilea deceniu de viaţă şi dezvoltă de asemenea tumori
hematologice sau cerebrale3;7.
În general, testarea genetică ar trebui efectuată atunci când criteriile clinice de cancer ereditar
colorectal nonpolipozic au fost îndeplinite. Este general acceptat faptul că pacienţii care îndeplinesc
criteriile Amsterdam sau criteriile Bethesda sunt candidaţi ideali pentru testarea moleculară. Cu toate
acestea, 30% din potenţialii purtători ai anomaliilor genetice care îndeplinesc criteriile Amsterdam nu
sunt identificaţi cu mutaţii.
Deoarece 95% dintre cancerele de colon dezvoltate în cadrul HNPCC prezintă instabilitatea
microsateliţilor, testarea acestui fenotip trebuie efectuată înaintea testelor genetice pentru identificarea
unor mutaţii ale genelor MMR la toţi pacienţii care întrunesc criteriile clinice de diagnostic3;7.
Dacă istoricul clinic şi familial nu poate identifica de la care părinte a fost moştenită mutaţia în gena
MMR, testarea moleculară ar trebui efectuată ambilor părinţi.
Pentru testarea adulţilor asimptomatici cu risc sunt disponibile în laboratorul nostru teste pentru identificarea
mutaţiilor la nivelul genelor MLH1, MSH2, MSH6 şi PMS2. Astfel de teste nu sunt utile pentru estimarea
vârstei de debut, severităţii, tipului de simptome sau modalităţii de progresie a bolii.
Testarea persoanelor asimptomatice cu risc se efectuează doar la indivizii care au un membru al
familiei afectat de o mutaţie cauzatoare de boală şi implică, de obicei, interviuri pre-test, în care
sunt solicitate motivele testării, sunt discutate cunoştinţele individuale ale pacientului despre forma cu
debut precoce, posibilul impact al rezultatelor testelor pozitive sau negative. Cei care doresc testarea
ar trebui să fie consiliaţi cu privire la eventualele probleme pe care le pot întâmpina legate de sănătate,
invaliditate, educaţie, discriminare, interacţiune socială şi familială.
Testarea genetică pentru HNPCC nu este recomandată de rutină în cazul persoanelor cu risc înaintea
vârstei de 18 ani, decât în cazul în care vârsta unui membru al familiei diagnosticat cu cancer a fost mai
mică de 28 ani. Deoarece există indivizi cu HNPCC diagnosticaţi la vârste foarte mici se recomandă
ca screening-ul să înceapă cu 10 ani înainte de cea mai fragedă vârstă de debut a cancerului în familia
respectivă. Astfel, în unele familii screening-ul ar putea începe înainte de vârsta de 18 ani.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru mutaţii în genele MLH1, MSH2, MSH6 şi
PMS2 este posibil prin analiza ADN-ul extras din celule fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei
efectuată la aproximativ 15-18 săptămâni de gestaţie sau biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-
12 săptămâni de gestaţie. Mutaţiile cauzatoare de boală trebuie să fie identificate înainte de testarea
prenatală la un membru afectat al familiei7.
hemolizate4.
Metodă – secvenţierea genelor MLH1, MSH2, MSH6 şi PMS24.
159

Vor fi comunicate mutaţiile depistate în genele MLH1, MSH2, MSH6 şi PMS2 şi genotipul respectiv4.
HNPCC este transmis autozomal dominant. Fiecare copil al unei persoane afectate de cancer colonic
are un risc de 50% de a moşteni mutaţia.
La majoritatea persoanelor o mutaţie predispozantă la cancer colonic nonpolipozic ereditar este
moştenită de la unul dintre parinţi.
Datorită penetranţei crescute a mutaţiilor cauzatoare de boală, persoanele asimptomatice purtătoare
ale acestor mutaţii vor fi incluse obligatoriu într-un program de prevenţie primară sau de monitorizare
periodică4.
Se recomandă ca persoanele din aceste familii să beneficieze de screening pentru diverse variante
de cancer. Astfel, colonoscopia trebuie începută la 20-25 ani şi efectuată la fiecare 1-3 ani.
Screening-ul pentru cancerul endometrial constă în analiza citologică a aspiratelor endometriale sau
ultrasonografia transvaginală şi trebuie început la 25-35 ani, cu repetare la fiecare 1-2 ani. Screening-
ul pentru cancerele gastrice sau de tract urinar trebuie recomandat numai în familiile care au avut
asemenea cazuri şi constă în gastroscopie, ecografie şi analize urinare efectuate la fiecare 1-2 ani
începând cu vârsta de 30-35 ani. Opţiunea colectomiei profilactice trebuie avută în vedere atunci
când sunt identificate adenoame colonice sau la diagnosticul primului cancer de colon. De asemenea
histero-salpingo-ooforectomia bilaterală poate fi efectuată profilactic, mai ales că riscul de dezvoltare
a cancerelor endometriale depăşeşte la aceste femei chiar pe cel al dezvoltării cancerelor de colon7.
Bibliografie
1. Fay Kastrinos, and Sapna Syngal. Recently Identified Colon Cancer Predisposition: MYH and
MSH6 Mutations. In Semin Oncol. 2007 October; 34(5): 418–424.
2. I. Rogoz, Suzana Rogoz, Amelia Dobrescu, F.Burada Rolul mutaţiilor dinamice în patogeneza
unor boli ereditare, În Craiova Medicală, vol 8, nr 1, 2006.
3. Juan Carlos Munoz, Louis R Lambiase, Hereditary Colorectal Cancer, www.emedicine.
medscape.com, Ref Type: Internet Communication.
5. Quest Diagnostics. Colorectal Cancer. Laboratory Support of Diagnosis and Manangement.
Clinical Focus. www.questdiagnostics.com. Reference Type: Internet Communication.
6. R. J. Mitchell, S. M. Farrington, M. G. Dunlop, and H. Campbell. Mismatch Repair Genes hMLH1
and hMSH2 and Colorectal Cancer: A HuGE Review. In Am J Epidemiol; 156:885–902, 2002.
7. Wendy Kohlmann, Stephen B Gruber, Hereditary Non-Polyposis Colon Cancer, Gene Reviews,
2006. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
160
18
18.1.2.3 Cancerul gastric difuz ereditar (HDGC)
Informaţii generale şi recomndări pentru efectuarea testului genetic

Cancerul gastric este al patrulea cancer ca frecvenţă şi reprezintă a doua cauză de mortalitate prin
cancer la nivel mondial, cu aproximativ 700.000 decese anual.
Până la 90% din cazurile de cancer gastric sunt sporadice, un rol cauzal important avându-l anumiţi
factori de mediu, cum ar fi dieta şi infecţia cu Helicobacter pylori. Tumorile gastrice sporadice se
dezvoltă printr-un proces ce implică mai multe etape, în care gastrita cronică conduce la atrofie, apoi
la metaplazie intestinală şi în cele din urmă la displazie; tumorile sunt de obicei exofitice, adesea
ulcerante şi localizate în porţiunea distală a stomacului.
Restul de 10% dintre pacienţii cu tumori gastrice prezintă forme familiale, iar 3% din acestea se
transmit autozomal dominant cu penetranţă crescută. Cancerul gastric ereditar tinde să aibă un model
difuz de creştere, cu celule slab diferenţiate ce infiltrează mucoasa peretelui gastric şi determină
îngroşarea acestuia (linită plastică), fără să formeze o masă distinctă şi fără să prezinte leziuni
histologice precursoare. Deoarece celulele conţin mucină şi nucleul este situat excentric, acestea
sunt adesea denumite celule în „inel cu pecete”. Cancerul gastric a fost asociat cu câteva sindroame
moştenite de predispoziţie la cancer cum ar fi cancerul ereditar colorectal nonpolipozic (NHPCC/
sindromul Lynch), polipoza adenomatoasă familială, sindromul Peutz-Jeghers şi cancerul gastric
ereditar dizuz (HDGC)1;6.
Cancerul gastric difuz ereditar este un sindrom moştenit autozomal dominant care determină o
susceptibilitate crescută faţă de cancerul gastric difuz, 30-50% din pacienţi prezentând mutaţii
inactivatoare în gena ce codifică caderina E, CDH1. Studiile efectuate până în prezent au estimat că
riscul cumulativ până la vârsta de 80 ani al cancerului gastric difuz la persoanele purtătoare de mutaţii
CDH1 este de aproximativ 67% pentru bărbaţi şi 83% pentru femei. În plus, femeile au un risc de 20-
40% de a dezvolta cancer mamar lobular. Vârsta medie de apariţie a cancerului gastric difuz ereditar
este de 38 ani, cu un interval între 14-69 ani. Majoritatea tipurilor de cancer apar înainte de vârsta de
40 ani. Vârsta de debut este de asemenea variabilă între familii şi în cadrul aceleeaşi familii.
Incidenţa cancerului gastric arată diferenţe semnificative la nivel internaţional. Frecvenţa este mai
mare în Japonia (80 cazuri la 100000) şi Asia de Est, dar şi în Europa de Est şi părţi din America
Latină. Deşi incidenţa cancerului gastric este mai mare în Japonia şi China, cele mai multe mutaţii în
gena CDH1 au fost găsite în populaţiile europene.
Mutaţii în gena CDH1 au fost, de asemenea, asociate cu tumori extragastrice - cancer lobular mamar
şi posibil colorectal. Trebuie remarcat, totuşi, că două treimi din familiile HDGC raportate până în
prezent nu au mutaţii CDH1 ale liniei germinale. Această constatare reflectă în parte limitările inerente
asociate cu tehnicile actuale de detectare, dar, de asemenea, sugerează şi existenţa altor gene care
pot determina HDGC1;4.
Gena caderinei E, numită CDH1 (Cadherin 1), a fost clonată în 1995 de către Berx et al, este situată
pe cromozomul 16q22.1 şi are în compoziţie 16 exoni. Până în prezent aproximativ 100 mutaţii au
fost raportate în familiile cu CGDE. Cele mai frecvente tipuri de mutaţii sunt inserţiile şi deleţiile mici,
reprezentând circa 35% (1003C>T, 1901C>T şi 1137G>A), mutaţiile nonsens (16%) şi deleţiile exonice
(5%). În plus faţă de aceste mutaţii majore, alte două variante, -160 C→A şi 163+37235G>A, au fost
161
asociate cu un risc crescut de HDGC, deşi aceste anomalii genetice sunt rareori implicate într-o
agregare familială. Nu există o anumită zonă predispusă la mutaţii, acestea fiind distribuite pe toată
lungimea genei şi, de asemenea, nu există corelaţii între fenotip şi tipul de mutaţii CDH1.
Gena codifică un precursor al caderinei E, un polipeptid de 135KDa. Aceasta este rapid prelucrat pentru
a constitui forma matură de 120KDa, ce joacă un rol fundamental în menţinerea arhitecturii normale a
ţesutului epitelial. Caderina E este un membru al familiei caderinelor, glicoproteine transmembranare.
De fapt, această proteină este un homodimer transmembranar ce mediază interacţiunea celulă-celulă
dependentă de calciu, fiind esenţială pentru stabilirea şi menţinerea polarităţii celulelor epiteliale.
Activitatea proteinei în aderenţa celulelor depinde de asocierea sa cu actina citoscheletului prin
intermediul unor proteine numite catenine (α-, β- şi γ-)2;4;5.
Multe carcinoame umane (piele, cap şi gât, sân, plămâni, tiroidă, gastric, de colon şi ovariene) prezintă
o expresie redusă a caderinei E în raport cu celulele normale. Efectul de cauzalitate dintre pierderea
expresiei caderinei E şi tumorigeneză a fost demonstrată utilizând linii celulare de carcinom şi modele
transgenice. Studiile susţin un rol important al complexului caderina E/catenină atât în suprimarea
invaziei şi metastazării cât şi în inhibarea proliferării. Pierderea expresiei caderinei E poate fi observată
în cele mai multe cancere gastrice difuze şi în tumorile mamare lobulare, dar expresia este de obicei
normală în cancerele gastrice sporadice, intestinale şi cancerul ductal de sân.
Simptomele bolii sunt nespecifice în fazele timpurii, iar atunci când sunt prezente, tind să fie ignorate
atât de către persoanele afectate cât şi de către medici. În momentul în care apar simptomele,
pacienţii sunt într-un stadiu avansat al bolii. Acestea includ dureri abdominale, greaţă, vărsături,
disfagie, plenitudine postprandială, pierderea apetitului şi pierderea în greutate. Târziu în cursul
evoluţiei cancerului gastric se poate observa o masă palpabilă. Apariţia metastazelor determină
hepatomegalie, icter, ascită, noduli cutanaţi şi fracturi.
În cazul cancerului gastric difuz detectat precoce, adică înainte de a invada peretele stomacului, rata
de supravieţuire la cinci ani poate fi mai mare de 90%. Dacă însă diagnosticul se face într-un stadiu
avansat, supravieţuirea la cinci ani scade la mai puţin de 20%4.
Testarea genetică a adulţilor asimptomatici cu risc pentru HDGC se efectuează doar la persoanele
care au o rudă apropiată cu o mutaţie CDH1 cauzatoare de boală şi implică, de obicei, interviuri pre-
test, în care sunt solicitate motivele testării, sunt discutate cunoştinţele individuale ale pacientului
despre acestă formă de boală şi posibilul impact al rezultatelor testelor pozitive sau negative4.
Un studiu efectuat de Brooks-Wilson et al pe 42 familii cu HDGC a stabilit câteva criterii care trebuie
luate în considerare atunci când este propusă testarea genetică. Aceste criterii revizuite înlocuiesc
criteriile stabilite anterior de Consorţiul Internaţional pentru cancerul gastric (IGCLC) şi sunt aplicabile
în America de Nord, nordul Europei şi în alte regiuni cu incidenţă scăzută a tumorilor gastrice, dar nu
sunt valabile în regiunile cu incidenţă ridicată, cum ar fi Japonia şi Coreea. Cele şase criterii sunt:
1. Două sau mai multe cazuri de cancer gastric într-o familie, cu cel puţin un cancer gastric difuz
diagnosticat înainte de vârsta de 50 ani.
2. Trei sau mai multe cazuri de cancer gastric într-o familie, diagnosticate la orice vârstă, cu cel
puţin un caz documentat de cancer gastric difuz.
3. O persoană diagnosticată cu cancer gastric difuz înainte de 45 ani.
4. O persoană diagnosticată atât cu cancer gastric difuz cât şi cu cancer mamar lobular.
162
18
5. Un membru al familiei diagnosticat cu cancer gastric difuz şi un altul cu cancer mamar

lobular.
6. Un membru al familiei diagnosticat cu cancer gastric difuz şi un altul cu cancer de colon cu
celule în „inel cu pecete”4.
Testele genetice efectuate la persoanele mai tinere de 18 ani au fost întotdeauna o problemă
controversată. Deoarece au existat studii cu persoane diagnosticate cu HDGC sub vârsta de 18 ani
s-a propus testarea minorilor de la aceeşi vârstă cu cea mai mică vârstă de debut a cancerului gastric
menţionată în literatură. Această regulă încearcă să maximizeze beneficiile pentru copiii, reducând la
minimum riscurile. În general, o cerere din partea părinţilor pentru testarea copiilor asimptomatici cu
risc crescut necesită consiliere atât pentru părinţi cât şi pentru copii4.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutaţie CDH1 este posibil prin analiza
ADN-ul extras din celule fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei efectuată la aproximativ 15-18
săptămâni de gestaţie, sau biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-12 săptămâni de gestaţie.
Mutaţii cauzatoare de boală trebuie să fie identificate înainte de testarea prenatală la un membru
afectat al familiei4.
hemolizate3.
Metodă – secvenţierea tuturor exonilor genei CDH13.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate in gena CDH1 si genotipul respectiv3.
HDGC este transmis autozomal dominant. Fiecare copil al unei persoane afectate de cancer gastric
difuz are un risc de 50% de a moşteni mutaţia CDH1.
La majoritatea persoanelor cu o mutaţie CDH1 predispozantă la cancer gastric difuz aceasta este
moştenită de la unul dintre părinţi. Este posibil ca părintele de la care fost moştenită mutaţia să nu fi
făcut boala datorită penetranţei incomplete. Nu au fost raportate mutaţii de novo.
Riscul fraţilor persoanei afectate depinde de statusul genetic al părinţilor. Dacă un părinte este afectat
sau este purtătorul unei mutaţii CDH1 riscul ca aceasta să fi transmisă copiilor este de 50%4.
Datorită penetranţei crescute a mutaţiilor CDH1 cauzatoare de boală, persoanele asimptomatice
purtătoare ale acestor mutaţii vor fi incluse obligatoriu într-un program de prevenţie primară sau de
monitorizare endoscopică periodică. Deoarece urmărirea prin endoscopie nu este eficace în detectarea
precoce a HDGC, gastrectomia totală profilactică se impune ca fiind mijlocul preventiv cel mai bun.
În mai multe cazuri de persoane asimptomatice purtătoare de mutaţii CDH1 la care s-a practicat
gastrectomie totală profilactică stomacul rezecat a prezentat la examenul histopatologic focare mici
de cancer gastric difuz care nu au fost depistate la endoscopie; în aceste situaţii gastrectomia a fost
curativă şi nu profilactică.
Intervenţia chirurgicală este recomandată purtătorilor de mutaţii CDH1 la o vârstă cu 5 ani mai mică
decât cea a persoanei celei mai tinere afectate de cancer gastric în familie. Persoanele care nu sunt
163
de acord cu gastrectomia profilactică trebuie monitorizate prin cromoendoscopie de două ori pe an, iar
persoanele de sex feminin trebuie supravegheate periodic prin RMN al glandei mamare6.
Bibliografie
1. Aparna Mukherjee, Thomas McGarrity, Kevin Staveley-O’Carroll, Francesca Ruggiero, and
Maria J. Baker. Hereditary diffuse gastric cancer: lifesaving potential of prophylactic gastrectomy.
In Commun Oncol, 6:41–45, 2009.
2. F. Graziano, B. Humar2 & P. Guilford. The role of the E-cadherin gene (CDH1) in diffuse gastric
cancer susceptibility: from the laboratory to clinical practice. In Annals of Oncology 14: 1705–
1713, 2003.
4. Pardeep Kaurah, David G Huntsman, Hereditary Diffuse Gastric Cancer, Gene Reviews, 2006.
www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
5. Parry Guilford, BostJan Humar, Vanessa Blair. Hereditary diffuse gastric cancer: translation of
CDH1 germline mutations into clinical practice. In Gastric Cancer 13: 1–10, 2010.
6. Robin M. Cisco, James M. Ford, Jeffrey A. Norton, Hereditary Diffuse Gastric Cancer,
Implications of Genetic Testing for Screening and Prophylactic Surgery. In Cancer 2008;113(7
suppl):1850–6.
18.1.2.4 Cancerul de prostată (ELAC2, RNASEL, BRCA2, SRD5A2)
Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului genetic

Cancerul de prostată este cea mai frecventă formă de cancer care apare la bărbaţi. Incidenţa bolii
creşte odată cu înaintarea în vârstă, însă afecţiunea poate fi întâlnită şi la bărbaţii tineri. Diagnosticat
precoce, cancerul de prostată este vindecabil.
În prezent, mecanismele care stau la baza apariţiei şi progresiei cancerului de prostată rămân în mare
parte necunoscute. Factorii de risc, cum ar fi dieta, stilul de viaţă şi hormonii au fost mult timp incriminaţi
în apariţia cancerului de prostată. În plus faţă de vârstă şi rasă, un istoric familial pozitiv de cancer
prostatic este unul din factorii determinanţi ai bolii. Numeroase studii epidemiologice şi genetice indică
faptul că predispoziţia ereditară are un impact considerabil asupra dezvoltării cancerului de prostată.
Cu toate acestea, lipsa de coerenţă între studii sugerează, în plus, că tumorile prostatice sunt tulburări
genetic heterogene, cu implicarea multiplilor factori genetici şi de mediu4;6.
În 1996, a fost descrisă gena HPC1, cartografiată pe cromozomul 1q24-25 asociată cu cancerul
prostatic. Studiile ulterioare de corelare a HPC1 cu tumora s-au dovedit neconcludente, unele au
confirmat legătura, iar altele nu. Cu toate acestea, într-o analiză globală a 772 familii din 9 grupuri
internaţionale a fost confirmată corelaţia dintre HPC1 şi cancerul prostatic.
Una dintre genele implicate în patologia prostatică, situată în regiunea HPC1, este RNASEL, care
164
18
codifică RN-aza L 2’-5’-oligoadenilat dependentă (RNASEL). Este o endoribonuclează secretată

constitutiv, ce mediază activităţi antivirale şi proapoptotice ale sistemului 2-5A IFN-inductibil. Direct
sau indirect, RN-aza L suprimă una sau mai multe etape în tumorigeneză şi/sau apariţia metastazelor
în prostată.
Efectul polimorfismelor Glu265X, Arg462Gln şi Asp541Glu de la nivelul genei RNASEL asupra riscului
de cancer de prostată a fost raportat, dar cu concluzii contradictorii.
Carpten et al. au detectat o mutaţie nonsens, Glu265X, într-o familie de origine europeană, în care trei
fraţi erau afectaţi. Rökman et al. au raportat o frecvenţă semnificativ mai mare de mutaţii Glu265X la
pacienţii finlandezi cu cancer ereditar de prostată decât în loturile control, cu cea mai mare frecvenţă
a mutaţiei în familiile în care mai mult de 4 membri erau afectaţi. În schimb, Wiklund et al. şi Maier
şi colab. nu au găsit nici o asociere între această mutaţie şi un risc crescut de tumori prostatice la
pacienţii suedezi sau germani. Având în vedere însă raritatea acestei variante în rândul populaţiei,
studii mai mari cu multe mii de subiecţi ar fi necesare pentru a confirma acest rezultat.
Rökman et al. au constatat, de asemenea, că mutaţia Arg462Gln este implicată în mai mult de 13%
din cazurile de cancer ereditar de prostată. Activitatea enzimatică a RN-azei L 2’-5’-oligoadenilat
dependentă în aceste cazuri este de trei ori mai mică decât în tipul sălbatic. Acest tip de mutaţie a fost
asociat cu risc crescut de cancer de prostată la caucazieni şi afro-americani.
Rennert et al. au raportat o creştere semnificativă a riscului de apariţie a tumorilor prostatice la pacienţii
care prezintă genotipul Arg/Gln şi Gln/Gln.
Wang şi colab. şi Nakazato et al. au demonstrat efectul protector al genotipului Gln/Gln la caucazieni
şi japonezi. Cu toate acestea, nu a existat nici o dovadă a asocierii dintre Arg462Gln şi cancerul
de prostată în populaţiile suedeze şi respectiv germane. Deşi Nakazato et al. au raportat un efect
protector al mutaţiei Arg462Gln la japonezi, studii suplimentare ar trebui să fie efectuate pentru a
confirma un astfel de efect în populaţiile asiatice.
Nakazato et al. a raportat că genotipul Asp/Asp al polimorfismului Asp541Glu prezintă un risc crescut
de dezvoltare a cancerului de prostată în rândul populaţiei japoneze. Polimorfismul Asp541Glu a fost,
de asemenea, identificat la finlandezi, albii non-hispanici, suedezi, germani şi americanii de origine
europeană.
Mutaţiile genetice, cum ar fi Met1Ile la americanii de origine africană, Gly59Ser şi Ser406Phe în
populaţia finlandeză şi 471delAAAG la evreii Ashkenazi au fost identificate în gena RNASEL în plus
faţă de Glu265X, Arg462Gln, şi Asp541Glu. Cu toate acestea, doar unul sau două studii au investigat
aceste mutaţii6;7.
Gena care determină apariţia cancerului ereditar de prostată, elaC homolog-2 (ELAC2/HPC2), situată
pe cromozomul 17p11, formată din 24 exoni, a fost prima genă identificată implicată în determinismul
tumorilor prostatice. Proteina codificată, ELAC2, este o hidrolază metal-dependentă posibil implicată
în repararea ADN-ului şi formarea ARNm. În plus, proteina ELAC2 umană deţine activitate de 3’-tRN-
ază şi interacţionează cu γ-tubulina, o componentă a aparatului mitotic, ceea ce sugerează un posibil
rol al ELAC2 în reglarea ciclului celular.
Mutaţiile în gena ELAC2 sunt rare. Analiza secvenţială a genei ELAC2 a identificat mai multe mutaţii cu
penetranţă scăzută, Ser217Leu, Ala541Thr, Arg781His, Glu622Val şi insG 1641. Mutaţia Ser217Leu,
situată în regiunea hidrofilică a proteinei ELAC2, determină substituţia serinei cu leucina hidrofobă
165
ceea ce poate modifica structura tridimensională a proteinei, iar a doua mutaţie, Ala541Thr, poate
produce alterarea funcţiilor acestei proteine. Camp et al. şi Severi et al. au făcut o meta-analiză a
asocierii dintre cele 2 mutaţii missens ale genei ELAC2 şi riscul apariţiei cancerului de prostată, dar
rezultatele au fost neconcludente. Cu toate că în ultimii ani au fost efectuate un număr mare de studii
axate pe corelaţia dintre aceste mutaţii şi susceptibilitatea apariţiei cancerului de prostată, rezultatele
au fost, din păcate, contradictorii.
Un studiu extins recent efectuat de B. Xu et al. a evidenţiat că mutaţiile genei ELAC2 (Ser217Leu şi
Ala541Thr) pot fi asociate cu riscul de apariţie al cancerului de prostată, însă au penetranţă redusă.
Este de aşteptat ca mai multe studii prospective cu un număr mai mare de participanţi din întreaga
lume să analizeze asociaţia dintre anomaliile genei ELAC2 şi riscul de cancer de prostată şi să
stabilească corelaţia exactă boală-factori genetici2;4.
Gena SRD5A2 situată pe cromozomul 2p23 este formată din aproximativ 40 kilobaze, conţinând
5 exoni şi 4 introni. Aceasta genă codifică o enzimă, steroid 5 α-reductaza tip II (SRD5A2), care
catalizează conversia ireversibilă a testosteronului într-un androgen mai puternic, dihidrotestosteron.
Dihidrotestosteronul şi (într-o măsură mai mică) testosteronul se leagă la receptorul androgen
intracelular, complexul astfel format traversează porii nucleari şi ajunge în nucleu unde activează
transcrierea genei.
Makridakis et al. au identificat 10 mutaţii (A49T, A51T, C5R, F194L, F234L, P30L, P48R, R227Q,
T187M, şi V89L) în gena SRD5A2. Cu excepţia V89L şi A49T cele mai multe dintre aceste substituţii
sunt rare, având o frecvenţă mai mică de 2%. Substituirea valinei cu leucina la codonul 89 reduce
activitatea SRD5A2 atât in vitro cât şi in vivo; pe de altă parte, substituţia alaninei cu treonina la
codonul 49 creşte activitatea in vitro a enzimei de 5 ori. Makridakis et al. au postulat că prin modificarea
activităţii enzimatice aceste mutaţii ar putea influenţa nivelul dihidrotestosteronului şi astfel, riscul de
apariţie a cancerului de prostată.
Studii efectuate de Kantoff et al. au evidenţiat o asociere între variaţia numărului de dinucleotide TA
repetitive şi riscul de apariţie a cancerului de prostată.
Gena SRD5A2 a fost mult timp considerată un element important în apariţia tumorilor prostatice, din
cauza rolului său în metabolismul androgenilor. Unele cercetări in vitro având ca obiect de studiu
mutaţiile V89L şi A49T au evidenţiat modificări funcţionale enzimatice. Cu toate acestea, după un
deceniu de cercetare, studiile genetice au produs rezultate contradictorii. O meta-analiză efectuată
de Jun Li et al. a constatat că tumorile de prostată nu se asociază cu mutaţia V89L şi, foarte probabil,
nici cu A49T. În mod evident, rolul metabolismului androgenilor, inclusiv funcţia SRD5A2, rămâne un
domeniu important pentru studiu în identificarea factorilor genetici în cancerului de prostată8.
Genele BRCA1 şi BRCA2, care determină o creştere a riscului de cancer mamar, au fost studiate,
de asemenea, pentru implicarea lor în cancerul prostatic. BRCA1 este situată pe cromozomul 17q21
şi codifică o fosfoproteină nucleară cu rol important în reglarea ciclului celular, menţinerea stabilităţii
genomice şi în supresia tumorală. Studii populaţionale efectuate pe evreii ashkenazi au evaluat cele
două mutaţii BRCA1, 185delAG şi 5382insC, comune acestui grup etnic şi au evidenţiat o dublare
a riscul de apariţie a cancerului de prostată în rândul purtătorilor acestor mutaţii faţă de nepurtărori,
cu un risc cumulat de 30% până la de 80 de ani. Studiile clinice efectuate pe loturi de persoane
care prezintă mutaţii la nivelul genei BRCA2 (situată pe cromozomul 13q12-q13), au furnizat dovezi
166
18
consistente pentru susţinerea ideii că riscul apariţiei cancerului de prostată este de 5-7 ori mai mare
la purtătorii acestei mutaţii, iar vârsta de debut este mai mică. Gena are 27 exoni şi codifică o proteină
cu rol în repararea ADN-ului prin interacţiunea cu un supresor tumoral, RAD 51. Bărbaţii care prezintă
mutaţii în genele BRCA1 sau BRCA2 au un scor Gleason semnificativ mai mare decât non-purtătorii
cu tumori prostatice şi, prin urmare, sunt markeri de prognostic pentru formele agresive de cancer
prostatic, dar aceste mutaţii sunt rare (2%) şi explică doar o foarte mică fracţiune din cancerele
ereditare de prostată3;5.
Studiile epidemiologice indică faptul că formele ereditare de cancer de prostată cu penetranţă
crescută reprezintă 5-10% din totalul cazurilor de tumori prostatice şi maxim 30-40% din formele cu
debut timpuriu. În plus, un procent mai mare din cazuri este probabil atribuit unor variante genetice
care determină doar o creştere moderată a riscului de apariţie a bolii. Bărbaţii cu un istoric familial
de cancer de prostată au în mod semnificativ un risc mai crescut de boală, în special în cazul în care
o rudă a fost diagnosticată la o vârstă tînără sau în cazul în care mai mulţi membri ai familiei au fost
afectaţi. Cele mai multe studii sugerează că riscul de a dezvolta cancer prostatic este mai mare dacă
există în familie un frate afectat decât dacă este afectat tatăl. Deoarece prevalenţa bolii afectează
valoarea predictivă pozitivă a testelor de screening, bărbaţii cu o valoare crescută a PSA şi un istoric
familial pozitiv de cancer de prostată sunt mai susceptibili de a dezvolta tumora decât cei cu aceeaşi
valoare PSA şi un istoric familial negativ.
Prin urmare, istoricul familial trebuie întotdeauna evaluat atunci când se decide efectuarea unei biopsii
la bărbaţii cu un PSA de 3-10 ng/mL.
Agregarea familială a cancerului de prostată poate fi cauzată şi de factori genetici care nu sunt
moşteniţi. Prin urmare, în contextul unei incidenţe în creştere a populaţiei cu tumori de prostată, dar şi
a unei creşteri a expunerii la anumiţi factori de mediu, este posibil ca apariţia tumorilor să se datoreze
unei interacţiuni gene-mediu9;11.
Cea mai importantă caracteristică clinică a cancerului ereditar de prostată este vârsta relativ timpurie
de debut. Pacienţii care provin din familiile cu cancer ereditar de prostată sunt diagnosticaţi, în medie,
cu 6-7 ani mai devreme decât cei cu formă sporadică.
Simptomatologia tumorilor prostatice cuprinde manifestări urinare (polakiuria şi disuria sunt semnele
cele mai frecvente) însoţite în stadiile avansate şi de semne generale. Semnele urinare apar ca
urmare a obstrucţiei cervico-prostatice şi extensiei tumorii spre uretră. Disuria este provocată
de infiltraţia tumorală a colului vezical şi are o evoluţie progresivă, invariabil spre retenţie urinară,
incompletă sau completă. Hematuria nu este caracteristică, dar apare ca urmare a invaziei colului şi
trigonului vezical. Durerea este cauzată de extensia extracapsulară a tumorii şi poate fi însoţită de
senzaţia de corp străin rectal. Prezenţa determinărilor secundare vertebrale poate determina dureri
lombo-sacrate de tip sciatic, paraplegie prin compresie medulară şi fracturi patologice. Compresiunea
venoasă determinată de adenopatia regională extinsă se manifestă prin edem scrotal şi al membrelor
inferioare. Oliogoanuria apare tardiv ca urmare a obstrucţiei ureterale bilaterale10;11.
Au fost identificate mai multe mutaţii ce pot determina apariţia cancerului ereditar de prostată, însă cu
toate acestea, din cauza numărului mare de gene implicate, testarea este complicată şi nu va putea
întotdeauna să identifice o mutaţie relevantă.
Pentru invetigarea adulţilor asimptomatici cu risc sunt disponibile în laboratorul nostru teste pentru
167
mutaţii la nivelul genelor RNASEL, ELAC2, BRCA şi SRD5A2.

Criteriile pentru prezenţa cancerului ereditar de prostată sunt:
1) familie nucleară cu 3 sau mai multe cazuri;
2) cancer de prostată prezent la 3 generaţii succesive;
3) cel puţin două persoane diagnosticate înainte de vîrsta de 55 ani.
Testarea persoanelor asimptomatice cu risc de boală implică, de obicei, interviuri pre-test, în care
sunt solicitate motivele testării, sunt discutate cunoştinţele individuale ale pacientului despre forma
cu debut precoce, posibilul impact al rezultatelor testelor pozitive sau negative. Deoarece nevoia de
consiliere genetică creşte pe măsură ce populaţia conştientizează faptul că tumorile ereditare sunt în
creştere, toţi urologii ar trebui să poată oferi o bază de consiliere, inclusiv notificarea corespunzătoare
a riscului şi informaţiile privind măsurile disponibile pentru a reduce riscul de deces prematur din
cauza cancerului de prostată.
Mecanismele genetice ce stau la baza apariţiei cancerului ereditar de prostată s-au dovedit a fi
remarcabil de greu de desluşit, cel mai probabil pentru că sunt mult mai complexe decât în alte forme
ereditare de cancer. În prezent datele disponibile sugerează că riscul de cancer de prostată în familiile
cu sau fără cazuri multiple de boală este modulat de un număr mare de gene şi, de asemenea, de
factorii de mediu10;11.
hemolizate1.
Metodă
1) secvenţierea exonilor 7, 16, 17, 20, 24 ELAC2;
2) secvenţierea exonilor 1 & 3 RNASEL;
3) secvenţierea exonilor 11, 12, 15, 18 BRCA2;
4) secvenţierea exonului 3 (V89L) SRD5A21.
Vor fi comunicate polimorfismele/mutaţiile depistate în genele ELAC2, RNASEL, , BRCA2 şi SRD5A2
precum şi genotipul respectiv2.
Bibliografie
1. Angelescu Nicolae, Tratat de patologie chirurgicală, Ed. Medicală, 2919-2933, 2003.
2. Annika Rőkman, Tarja Ikonen, Nina Mononen, Ville Autio, Mika P. Matikainen, Pasi A. Koivisto,
Teuvo L. J. Tammela, Olli-P. Kallioniemi, and Johanna Schleutker. ELAC2/HPC2 Involvement in
Hereditary and Sporadic Prostate Cancer. In Cancer Reserch, 61:6038–6041, 2001
3. A Mitra, C Fisher, CS Foster, C Jameson, Y Barbachanno, J Bartlett, E Bancroft, R Doherty,
Z Kote-Jarai, S Peock, D Easton, The IMPACT and EMBRACE Collaborators and R Eeles
British. Prostate cancer in male BRCA1 and BRCA2 mutation carriers has a more aggressive
168
18
phenotype. In Journal of Cancer 98:502 – 507, 2008.

4. B Xu, N Tong, J-m Li, Z-d Zhang and H-f Wu. ELAC2 polymorphisms and prostate cancer risk:
a meta-analysis based on 18 case–control studies, Prostate Cancer and Prostatic Diseases,
13:270–277, 2010.
5. Daniel J. Schaid. The complex genetic epidemiology of prostate cancer. In Human Molecular
Genetics, 13:R103–R121, 2004.
6. Fredrik Wiklund, Björn-Anders Jonsson, Anthony J. Brookes, Linda Strömqvist, Jan Adolfsson,
Monica Emanuelsson, Hans-Olov Adami, Katarina Augustsson-Bälter,and Henrik Grönberg.
Genetic Analysis of the RNASEL Gene in Hereditary, Familial, and Sporadic Prostate Cancer. In
Clinical Cancer Research, 10:7150–7156, 2004.
7. Huihua Liand Bee ChooTai. RNASEL Gene Polymorphisms and the Risk of Prostate Cancer: a
Meta- analysis. In Clin Cancer Res, 12:5713, 2006.
8. Jun Li, Ralph J. Coates, Marta Gwinn, and Muin J. Khoury, Steroid 5-a-Reductase Type 2
(SRD5a2) Gene Polymorphisms and Risk of Prostate Cancer: A HuGE Review. In Am J
Epidemiol, 171:1–13, 2010.
9. L.E. Johns and R.S. Houlston. A systematic review and meta-analysis of familial prostate
cancer risk. In BJU International, 91:789– 794
11. Ola Bratt, Hereditary prostate cancer: clinical aspects. In The Journal Of Urology, 168:906–
913, 2002
169
18.1.2.5 Mutaţii BRCA1, BRCA2 - cancer ereditar sân/ovar
Sindromul cancerului ereditar de sân şi de ovar (HBOC = hereditary breast-ovarian cancer syndrome)
are la bază o predispoziţie genetică de a dezvolta cancer şi se caracterizează prin:
● existenţa într-o familie a mai multor cazuri de cancer mamar, ovarian sau a ambelor forme;
● asocierea la aceeaşi persoană a ambelor forme de cancer;
● cancer mamar cu debut precoce.
Deşi cele mai multe cazuri de cancer mamar şi ovarian nu sunt moştenite, aproximativ 3-5% dintre
cancerele de sân şi 10% dintre cancerele de ovar sunt încadrate în HBOC. Numeroasele studii
efectuate au arătat că mutaţiile genelor BRCA1 şi BRCA2 care afectează linia germinală sunt
responsabile de marea majoritate a cancerelor ereditare de sân şi ovar1;7.
BRCA1 (Breast Cancer 1 Gene) şi BRCA2 (Breast Cancer 2 Gene) sunt gene supresoare ale
tumorilor care codifică proteine cu rol în procesele de reparare a ADN-ului. Au fost comunicate peste
1200 mutaţii ale genei BRCA1 şi peste 1300 mutaţii ale genei BRCA2. Deşi persoanele cu HBOC
moştenesc o alelă BRCA1 sau BRCA2 defectuoasă de la unul dintre părinţi, aceştia prezintă o a doua
alelă funcţională; în cazul în care şi cea de-a doua alelă devine nefuncţională se dezvoltă procesul
neoplazic, prin acumularea de mutaţii adiţionale. Se estimează că prevalenţa mutaţiilor BRCA în
populaţia generală este de 1/300 - 1/800. În populaţiile întemeiate de un grup ancestral mic, anumite
mutaţii BRCA1 sau BRCA2 se pot întâlni mai frecvent şi sunt denumite „mutaţii fondatoare”. Aceste
tipuri de mutaţii au fost identificate predominant la evreii Ashkenazi (din Europa de Est), canadienii
francezi şi la islandezi1.
Gena BRCA 1 localizată la nivelul cromozomului 17q21 este formată din 22 de exoni şi codifică o
proteină de 1863 de aminoacizi. Proteina BRCA1 este o fosfoproteină nucleară cu rol important în
menţinerea stabilităţii genomice şi în supresia tumorală; împreună cu alte proteine supresoare ale
tumorilor sau cu rol în transmiterea semnalului celular, formează un complex cu subunităţi multiple
denumit BASC (BRCA1-asociated genome surveillance complex); de asemenea se asociază cu
ARN polimeraza II intervenind astfel în transcriptie, repararea ADN-lui dublu catenar, precum şi în
recombinare.
Mutaţiile genei BRCA1, ce conduc la erori în replicarea ADN-ului şi proliferarea necontrolată a
celulelor epiteliale, sunt răspunzătoare de aproximativ 40% din cazurile de cancer mamar ereditar şi
mai mult de 80% din cazurile de cancer mamar şi ovarian ereditare. Splicing-ul alternativ deţine rol în
modularea localizării subcelulare (citoplasmă, nucleu) şi funcţionarea normală a genei BRCA1. Au fost
descrise mai multe variante de produşi de transcripţie unele fiind asociate cu mutaţii cauzatoare de
boală. A fost identificată şi o pseudogenă, localizată tot pe cromozomul 17. În literatura de specialitate
este specificat că această regiune de pe cromozomul 17 conţine o duplicaţie în tandem (ΨBRCA1),
de aproximativ 30kb, care duce la apariţia a 2 copii ale exonilor 1 şi 2 ai BRCA1, ale exonilor 1 şi 3 ai
genei adiacente denumită 1A1-3B, precum şi a unei regiuni intergenice de 295 bp3. Prin secvenţiere
s-a demonstrat că aceşti exoni duplicaţi constituie pseudogene neprocesate.
Aceste constatări pot nu numai să îngreuneze analiza mutaţiilor BRCA1, ci să aibă şi implicaţii asupra
reglării normale sau anormale a transcripţiei, translaţiei şi funcţiei BRCA13;4.
Mutaţiile genei BRCA1 se caracterizează prin apariţia prematură a codonilor STOP la nivelul cadrului
170
18
de citire (open reading frame, ORF), produsul rezultat fiind o proteină trunchiată. Cele mai frecvente
mutaţii sunt 185delAG (c.68_69del AG) şi 5385insC (c.5266dupC) prezente în procent de 1%,
respectiv, 0.15% la evreii Ashkenazi. Au fost identificaţi mii de purtători ai deleţiei 185delAG, care
determină apariţia codonului STOP la aminoacidul 39 din secvenţa proteică2. O mutaţie asemănătoare
este 188del11 (c.71_81del) care schimbă cadrul de citire în exonul 3 (la nivelul codonilor 39 şi 36),
rezultând de asemenea o proteina trunchiată.
Un alt element caracteristic al genei BRCA1 îl constituie secvenţele Alu repetitive. Au fost identificate
45 de rearanjări genetice, care includ deleţii şi duplicaţii într-unul sau mai mulţi exoni. Genomul uman
conţine peste 1 milion de copii de elemente Alu (un element la fiecare 5kb), care aparent mediază
rearanjările cromozomiale şi recombinarea omoloagă, rezultând duplicaţii, inversii sau deleţii.
Aproximativ 41.5% din secvenţele intronice ale genei BRCA1 sunt constituite din elemente Alu, privite
de multe ori ca factori genetici de instabilitate4;8.
Deşi sunt prezente numeroase elemente repetitive, rearanjările sunt mai puţin frecvente la nivelul
genei BRCA2, situată pe cromozomul 13q12-q13; cadrul de citire începe la nucleotidul 229 şi codifică
o proteină de 390 kDa. Gena are 27 exoni, cel mai mare exon fiind, ca şi în cazul genei BRCA1, exonul
11. Iniţierea translaţiei are loc în exonul 2, gena fiind foarte bogată în nucleotide AT. BRCA2 funcţionează
tot ca o proteină de reparare a ADN-ului prin interacţiunea cu RAD 51 (supresor tumoral)3;8. Prin
examinarea modificărilor posttranslaţionale ale BRCA2, s-a stabilit că proteina este hiperfosforilată
de Polo-like kinaza 1 (PLK1) în metafază şi defosforilată când celula iese din metafază şi intră în
interfază. RAD 51 interacţionează cu domeniul C-terminal al BRCA (BRCT), o secvenţă unică de
aminoacizi care se repetă de 8 ori în regiunea centrală a BRCA2. Îndepărtarea acestei regiuni duce la
inhibarea apoptozei (BRCT fiind implicată în apoptoză pe calea caspazei). Majoritatea mutaţiilor sunt
alterări ale cadrului de citire şi mutaţii non-sens localizate în exonul 11, cea mai frecventă fiind mutaţia
6174delT întâlnită cu o frecvenţă de aproximativ 1% în populaţia evreilor Ashkenazi6.
Celulele care nu au proteinele normale BRCA1 şi BRCA2 acumulează anomalii cromozomiale: rupturi,
aneuploidii severe, amplificarea centrozomului; instabilitatea cromozomială generată poate constitui
baza patogenică a dezvoltării tumorilor mamare. La femeile care moştenesc o mutaţie inactivatoare,
deficitul unei proteine BRCA este critic pentru apariţia bolii, fiind generat atât de alela inactivată
moştenită, cât şi de pierderea somatică a alelei sălbatice în celulele epiteliale mamare sau ovariene.
În plus s-a constatat că expresia genelor este suprareglată în timpul pubertăţii şi sarcinii, fiind asociată
cu creşterea secreţiei de estrogeni; această observaţie sugerează că estrogenii ar putea stimula
expresia BRCA1 şi/sau BRCA2. A fost propus şi un model de tumorigeneză la femeile purtătoare de
mutaţii BRCA ale liniei germinale: la pubertate, ca urmare a nivelului crescut de estrogeni, celulele
epiteliale ale glandei mamare proliferează rapid; prezenţa unei mutaţii BRCA inactivatoare în contextul
unei replicări crescute reduce mult capacitatea de reparare a ADN-ului şi creşte frecvenţa alterărilor
genomice somatice la nivelul elementelor repetitive din genele BRCA1 şi BRCA2. Majoritatea celulelor
care prezintă ambele tipuri de mutaţii nu supravieţuiesc în ciclul celular următor datorită incapacităţii
de reparare a ADN-ului, însă în cazul în care se produc mutaţii adiţionale la nivelelor unor gene
care controlează ciclul celular („checkpoint genes”), unele celule BRCA-nule se imortalizează şi pot
constitui punctul de plecare în dezvoltarea tumorilor9.
Penetranţa mutaţiilor BRCA1 şi BRCA2, definită ca probabilitatea de a dezvolta cancer atunci când
171
este prezentă o mutaţie, este variabilă, fiind influenţată probabil de etnicitate, vârstă, tipul de cancer.
În tabelul de mai jos este prezentat riscul cumulat de cancer de sân, în funcţie de decada de viaţă, la
femeile purtătoare de mutaţii BRCA1 sau BRCA2, provenite din familiile cu risc crescut :
Risc cumulat
Vârstă
BRCA1 BRCA2
30 ani 3.2% 4.6%
40 ani 19.1% 12%
50 ani 50.8% 46%
60 ani 54.2% 61%
70 ani 85% 86%
Cancerul mamar la bărbaţi a fost observat în familiile cu mutaţii BRCA2, unele dintre acestea
prezentând în exclusivitate afectarea persoanelor de sex masculin. Într-un studiu efectuat pe 26
familii care au prezentat cel puţin un caz de cancer de sân la bărbaţi, 77% au demonstrat o asociere
cu mutaţii BRCA2 (Ford, 1998). Dacă însă nu s-a luat în considerare istoricul familial, prevalenţa
mutaţiilor BRCA2 ale liniei germinale la pacienţii cu cancer mamar a fost de numai 4-14% (Couch,
Friedman, 1994). Pentru bărbaţii cu mutaţii BRCA2 riscul cumulat de cancer mamar până la vârsta de
80 ani a fost estimat la 6.9%7.
La femeile cu mutaţii BRCA1 sau BRCA2 riscul de cancer ovarian este de 39-46% şi, respectiv, de
12-20%. Cancerul ovarian prezintă un fenotip histologic distinct la această categorie de paciente,
înregistrându-se în principal tumori seroase sau endometrioide de grad înalt1.
În afara cancerului ereditar de sân şi ovar mutaţiile BRCA1 şi BRCA2 pot fi asociate şi cu alte forme de
cancer. Astfel, s-a estimat că riscul de cancer de prostată este de 3 ori mai mare la bărbaţii purtători de
mutaţii BRCA1 în comparaţie cu populaţia generală. Mai mult, cazuri de cancer de pancreas, prostată,
esofag, laringe, stomac, colon, vezică biliară, duct biliar, melanom au fost raportate în familiile cu
mutaţii BRCA2 ce predispun la cancer. De asemenea în anemia Fanconi s-a constatat inactivarea
bialelică BRCA27.
Testarea genetică este importantă în practica clinică pentru identificarea persoanelor care prezintă
un risc semnificativ de cancer de sân sau de ovar şi aplicarea strategiilor adecvate de screening şi
prevenţie1;7.
Recomandări pentru analiza mutaţiilor genelor BRCA1 şi BRCA2

Se recomandă testarea genetică la persoanele cu un risc ≥20-25% de a avea o predispoziţie moştenită
pentru cancerul mamar sau ovarian:
● femei cu antecedente personale atât de cancer mamar, cât şi ovarian;
● femei cu cancer ovarian ce au o rudă apropiată fie cu cancer ovarian, fie mamar cu debut înainte
de menopauză sau ambele;
● femei cu cancer ovarian ce aparţin grupului etnic al evreilor Ashkenazi;
● femei cu cancer ovarian depistat la vârsta de 50 ani sau mai devreme, ce au o rudă apropiată fie cu
172
18
cancer ovarian, fie cu cancer mamar la bărbat dezvoltat la orice vârstă;

● femei ce aparţin grupului etnic al evreilor Ashkenazi cu cancer mamar diagnosticat la o vârstă ≤40
ani;
● femei având o rudă apropiată ce prezintă o mutaţie BRCA1 sau BRCA2 cunoscută.
Testarea genetică este opţională la persoanele cu un risc ≥5-10% de a avea o predispoziţie moştenită
pentru cancerul mamar sau ovarian:
● femei cu cancer mamar diagnosticat la o vârstă ≤40 ani;
● femei cu cancer ovarian, peritoneal primar sau de trompă uterină, histologic de grad înalt şi de tip
seros, dezvoltat la orice vârstă;
● femei cu cancer mamar bilateral (în special dacă prima tumoră a fost diagnosticată la o vârstă ≤50
ani);
● femei cu cancer mamar diagnosticat la o vârstă ≤50 ani, având o rudă apropiată cu cancer mamar
dezvoltat ≤50 ani;
● femei ce aparţin grupului etnic al evreilor Ashkenazi cu cancer mamar diagnosticat la o vârstă ≤50
ani;
● femei cu cancer mamar dezvoltat la orice vârstă, având cel puţin 2 rude apropiate cu cancer mamar,
indiferent de vârsta la care a fost depistat (în special dacă cel puţin unul din cazuri a fost diagnosticat
la o vârstă ≤50 ani);
● femei sănătoase având o rudă apropiată care întruneşte unul din criteriile mai sus menţionate.
Menţiuni:
- cancerul primar de trompă uterină sau peritoneal primar fac parte din spectrul de manifestări
caracteristice HBOC;
- o rudă apropiată este definită ca orice rudă de gradul I (mamă, soră, fiică) sau de gradul II
(bunică, nepoată, mătuşă).
Dacă este posibil, testarea genetică trebuie iniţiată la persoana afectată; deoarece numărul mutaţiilor
BRCA1 şi BRCA2 este foarte mare se va efectua secvenţierea completă a ambelor gene. O dată
identificată o mutaţie specifică aceasta va fi căutată ţintit la rudele cu risc crescut (testarea în scop
predictiv).
În cazul în care nu este posibilă testarea persoanelor afectate se va recurge la secvenţierea completă
a genelor BRCA1 şi BRCA2 la membrii familiei cu risc crescut.
Înaintea recomandării de efectuare a testării este indicat ca pacientul să fie consiliat de către medicul
trimiţător, în sensul că persoana trebuie să fie informată asupra semnificaţiei şi consecinţelor unui
rezultat pozitiv, negativ sau de semnificaţie necunoscută1.
hemolizate5.
Metodă - secventierea tuturor exonilor genei BRCA1 şi BRCA2 + analiza deleţiilor/duplicaţiilor (MLPA);
se pot identifica 90-95% dintre mutaţiile cunoscute şi se pot depista altele noi5.
173
Un rezultat negativ este definit prin absenţa mutaţiilor liniei germinale în genele BRCA1 şi BRCA2. În
cazul unei persoane afectate acesta indică că procesul neoplazic a apărut spontan şi nu ca urmare
a mutaţiilor pe linie germinală. În cazul unei persoane cu risc crescut un rezultat negativ poate avea
următoarele semnificaţii:
- nu a fost moştenită mutaţia specifică familiei;
- este prezentă o mutaţie BRCA1 sau BRCA2 care nu poate fi detectată sau nu a fost încă
identificată; în acest caz predispoziţia persoanei în cauză pentru cancerul mamar sau
ovarian ereditar rămâne necunoscută;
- nu există o predispoziţie familială pentru cancerul mamar sau ovarian ereditar.
Dacă nu este detectată o mutaţie la persoanele cu risc crescut, probabilitatea de apariţie a cancerului
de sân, respectiv, de ovar este comparabilă cu cea din populaţia generală.
Prezenţa unei mutaţii a liniei germinale la o persoană afectată conferă un risc crescut de dezvoltare în
viitor a unei tumori noi (asociate cu BRCA1 şi BRCA2).
În cazul unui rezultat pozitiv pentru mutaţiile BRCA1 şi BRCA2 ale liniei germinale la o persoană cu
risc crescut, este necesar ca medicul trimiţător să furnizeze toate informaţiile cu privire la opţiunile
de monitorizare, screening, chimioprofilaxie sau chirurgie profilactică disponibile; trebuie să se ia
obligatoriu în considerare implicaţiile psihologice şi familiale.
Menţionăm câteva din recomandările Asociaţiei Medicilor Ginecologici-Ostetricieni din SUA:
Screening-ul şi prevenţia cancerului de sân: se recomandă ca în cazul purtătoarelor de mutaţii BRCA1
sau BRCA2 să se efectueze un examen clinic binual al sânilor împreună cu o mamografie şi un RMN
al glandei mamare anual, începând cu vârsta de 25 ani. Rezonanţa magnetică este o metodă mai
sensibilă decât mamografia pentru detecţia cancerului mamar.
Studii preliminare au arătat că chimioprofilaxia cu Tamoxifen poate reduce cu ~62% riscul de cancer
mamar la femeile purtătoare de mutaţii BRCA2, dar nu şi la cele de mutaţii BRCA1 (deoarece incidenţa
tumorilor mamare estrogen-pozitive este redusă în cazul asocierii mutaţiei BRCA1).
Chirurgia profilactică cu mastectomie bilaterală reduce riscul cancerului mamar cu peste 90-95% în
funcţie de procedura aplicată.
Salpingo-ovariectomia profilactică reduce riscul de cancer mamar cu 40-70% dacă se aplică femeilor
aflate la premenopauză. Protecţia faţă de cancerul mamar este mai mare în cazul femeilor purtătoare
de mutaţii BRCA2.
Screening-ul şi prevenţia cancerului ovarian: deşi are o valoare limitată în depistarea precoce a
tumorilor ovariene, se recomandă efectuarea periodică (la 6 luni) a marker-ului CA125 în asociere cu
ecografia transvaginală la persoanele cu mutaţii BRCA1 sau BRCA2, începând cu vârsta de 30-35
ani.
Salpingo-ovariectomia profilactică în jurul vârstei de 40 ani poate reduce riscul de cancer ovarian la
această categorie de persoane cu ~ 85-90%1.
Un rezultat negativ la o persoană cu risc crescut nu exclude complet HBOC deoarece testarea
genetică actuală nu reuşeşte să identifice toate mutaţiile asociate cu acest sindrom.
În cazuri foarte rare poate fi depistată o variantă genetică BRCA1 sau BRCA2 a cărei implicaţie în
dezvoltarea cancerului nu poate fi precizată1;5;7.
174
18
Bibliografie
1. ACOG Practice Bulletin. Clinical Management Guidelines for Obstetrician-Gynecologists.

Hereditary Breast and Ovarian Cancer, No.103, April 2009.
2. Buisson M, Anczukow O, Zetoune AB, Ware MD, Mazoyer S. The 185delAG Mutation
(c.68_69del AG) in the BRCA1 gene riggers translation reinitation at a downstream AUG codon.
In Human Mutation, 2006, 27(10):1024-1029.
3. BRCA1 Gene, BRCA2 Gene. Gene cards. www.genecards.org. Reference Type: Internet
Communication.
4. Ewald IP, Ribeiro Izetti PL, Plamero EI, Cossio SL, Giuliani R, Ashton-Prolla P. Genomic
rearrangements in BRCA1 and BRCA 2: a literature review. In Genetics and Molecular Biology,
2009, 32, 3: 437-446.
6. Lin HR, Ting NSY, Qin J, Lee WH. M-Phase- specific phosphorylation of BRCA2 by Polo-like
kinase 1 correlates with the dissociation of the BRCA2-P/CAF complex. In The Journal of
Biological Chemistry, 2003, 278,13: 35979-35978.
7. Nancie Petrucelli, Mary B Daly, Julie O Bars Culver, Gerald L Feldman. BRCA1 and BRCA2
Hereditary Breast/Ovarian Cancer. Gene Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType:
8. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). Breast Cancer 1 Gene (BRCA1), Breast cancer 2
Gene (BRCA2). http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
9. Welcsh PL, King MC. BRCA1 and BRCA2 and the genetics of breast and ovarian cancer. In
Human Molecular genetics, 2001, 10 (7): 705-713.
18.1.2.6 Mutaţii KRAS în tumori de colon

Gena KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), omologul celular uman al
oncogenei izolate din virusul Kirsten al sarcomului şobolanului, face parte din familia RAS de proto-
oncogene care include şi două alte gene: HRAS şi NRAS. Toate genele RAS au o structură intron-
exon similară, iar proteinele codificate sunt GTP-aze (proteine G care leagă GDP/GTP şi acţionează
ca transductori ai semnalului intracelular) cu rol important în procesele de proliferare, diferenţiere şi
apoptoză celulară. Mutaţiile genelor RAS sunt frecvent asociate cu diverse tipuri de tumori (20-30%
din totalul tumorilor umane); este suficientă o singură mutaţie punctiformă pentru a transforma genele
RAS în oncogene potente1;5.
În 1982 Chang şi colaboratorii săi au izolat clonele corespunzătoare genei KRAS din băncile de ADNc
placentar şi embrionar uman; au fost izolate 2 izoforme denumite KRAS1 şi KRAS2. Un an mai târziu
175
McCoy a caracterizat gena KRAS izolată din linia celulară umană de adenocarcinom de colon (SW480)
şi a stabilit că aceasta corespunde izoformei KRAS2 identificată de Chang. Ulterior gena KRAS2 a
fost amplificată în câteva linii celulare tumorale. În 1983 McGrath a clonat genele KRAS1 şi KRAS2,
KRAS1 fiind identificată ca pseudogenă. Gena KRAS2 are 6 exoni, este localizată pe braţul scurt al
cromozomului 12 şi codifică o proteină alcătuită din 188 aminoacizi, cu o masă moleculară de 21.66
kDa; comparaţia între cele 2 gene KRAS a demonstrat că în cazul KRAS1 lipsesc anumite secvenţe
de intervenţie, concluzia fiind că aceasta este o pseudogenă copiată dintr-un ARNm procesat al
KRAS2 şi încorporată în cromozomul 6. Transcriptul ARNm KRAS2 major are o lungime de 5.5 kb;
în urma splicing-ului alternativ al exonului 5 se formează două izoforme A şi B care diferă în regiunea
C-terminală. În ARNm KRASB exonul 6 codifică regiunea C-terminală; în ARNm KRASA acelaşi
exon codifică regiunea netranslatată 3’. Regiunile C-terminale diferite ale celor două izoforme vor
suferi modificări post-translaţionale. Procesarea post-tanslaţională diferenţiată are efecte funcţionale
marcate ce conduc la căi de semnalizare şi localizări alternative ale proteinei5.
Proteina K-Ras funcţionează ca un “comutator” ce este deschis şi închis de către moleculele de
GTP şi respectiv GDP. În stare activă, legarea GTP induce ataşarea de membrana celulară; hidroliza
GTP la GDP permite revenirea la forma inactivă, disocierea de membrană şi inactivarea transmiterii
semnalului la nucleu1. Proteina K-ras este recrutată de către receptorul EGFR activ pentru a iniţia
cascada de semnalizare pe calea RAS/MAPK4.
EGFR (epidermal growth factor receptor = receptorul pentru factorul de creştere epidermică) aparţine
familiei de receptori tirozin kinazici pentru factori de creştere. Reprezintă veriga de legătură între
spaţiul extracelular şi transducţia intracelulară a semnalului; este alcătuit dintr-un receptor extracelular,
un domeniu transmembranar lipofilic şi un domeniu intracelular cu proprietăţi de tirozin kinază. EGFR
este activat extracelular de către liganzi cum ar fi EGF (epidermal growth factor = factor de creştere
epidermică) sau TGF-alfa (transforming growth factor – alpha = factorul transformator al creşterii),
ce determină homodimerizarea receptorului. Rezultă autofosforilarea receptorului tirozin kinazic
care declanşează diverse cascade de transmitere a semnalului în care proteina K-ras joacă un rol
important6.
Mutaţiile somatice activatoare ale genei KRAS determină schimbarea unui singur aminoacid şi conduc
la activarea constitutivă a proteinei K-ras, prin împiedicarea hidrolizei GTP (proteina se găseşte
permanent în forma activă legată de GTP). Activarea proteinei K-Ras se face în aval de fosforilarea
tirozin kinazei EGFR; în continuare transducţia semnalului este legată de RAF (root abundant factor),
MEK (MAP kinaza, ERK kinaza) şi ERK (extracellular regulated MAP-kinaza), ce conduce în final
la transcripţia genelor care influenţează apariţia şi progresia tumorilor. Astfel se explică implicarea
mutaţiilor KRAS în mai multe tipuri de cancer, în special pancreatic, pulmonar şi colorectal2;6.
Cancerul colorectal, ce include tumorile maligne de la nivelul colonului, rectului şi apendicelui, este
a treia cea mai frecventă formă de cancer şi a doua cauză de deces conform WHA (World Health
Asssociation). Mutaţii KRAS au fost identificate în 40% din carcinoamele colorectale non-ereditare, ce
constituie 90% din totalul carcinoamelor colorectale. Studii efectuate pe pacienţii proveniţi din familii
cu cancer colorectal non-polipozic ereditar (HNPCC) au demonstrat că mutaţiile genei KRAS sunt
independente de detectarea instabilităţii microsateliţilor, iar frecvenţa mutaţiilor în cazurile de carcinom
ereditar este comparabilă cu cea din cazurile sporadice6. Mutaţiile KRAS constituie în majoritatea
176
18
cazurilor un eveniment precoce în dezvoltarea şi progresia cancerelor colorectale. Câteva studii au

demonstrat că statusul KRAS este un factor important de prognostic. Astfel, mutaţiile KRAS sunt
asociate cu tumori în stadiu mai avansat, cu un potenţial metastatic crescut şi cu un prognostic scăzut.
Până în prezent au fost comunicate peste 3000 de mutaţii punctiforme KRAS în cancerul colorectal
(www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). În majoritatea cazurilor anomaliile sunt detectate în
codonii 12 (~82% din toate mutaţiile KRAS) şi 13 (~17%) ai exonului 2; se pare că aceste mutaţii
punctiforme missens au un rol important în progresia cancerului de colon2. Mutaţiile cele mai obişnuite
sunt următoarele: Gly12Asp, Gly12Ala,Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys şi Gly13Asp4.
Statusul mutaţiilor KRAS are de asemenea impact şi asupra deciziilor terapeutice la pacienţii cu
cancer colorectal. Luând în considerare importanţa axei EGFR menţionate mai sus, au fost dezvoltate
medicamente care interferă cu domeniile funcţionale ale receptorului; sunt descrise astfel două clase
de antagonişti EGFR: anticorpi monoclonali anti-EGFR, care se leagă de domeniul extracelular EGFR
şi intră în competiţie cu liganzii naturali blocând activarea receptorului, şi molecule mici de inhibitori ai
tirozin kinazei EGFR, care intră în competiţie cu ATP-pentru legarea domeniului catalitic intracelular
al tirozin kinazei (vezi figura 18.1.2.6). La ora actuală au fost aprobate două preparate de anticorpi
monoclonali anti-EGFR în tratmentul cancerului colorectal: Cetuximab (un anticorp monoclonal IgG1
chimeric provenit de la om şi şoarece) şi Panitumumab (un anticorp monoclonal IgG2k uman). A
fost dovedit că ambele preparate reduc riscul de progresie a tumorii şi îmbunătăţesc supravieţuirea
globală, perioada de supravieţuire fără progresie a bolii, precum şi calitatea vieţii la pacienţii cu cancer
colorectal refractar la tratament. Cu toate acestea, studiile au arătat că nu toţi pacienţii răspund la aceşti
agenţi care au drept ţintă moleculară EGFR. Deoarece terapia este costisitoare şi este însoţită de
reacţii adverse este esenţial să se identifice pacienţii care pot beneficia într-adevăr de aceasta2;4;6.
Literatura de specialitate furnizează informaţii conform cărora mutaţii în gena KRAS conferă
rezistenţă faţă de anticorpii monoclonali anti-EGFR; mutaţiile sunt asociate cu răspuns slab la terapie
deoarece acestea activează constitutiv calea RAS/MAPK în aval de EGFR, iar terapia anti-EGFR
care împiedică legarea ligandului la EGFR nu îşi poate exercita efectul inhibitor asupra proliferării
celulare. Concluzionând, statusul genei KRAS este un parametru important în selectarea pacienţilor
pentru terapie: pacienţii cu mutaţii nu pot beneficia de terapia anti-EGFR. Pe baza acestor date,
Agenţia Europeană a Medicamentului (EMEA) a aprobat folosirea cetuximabului şi panitumumabului
în tratamentul cancerelor metastatice la pacienţii care au gena KRAS de tip sălbatic (normală)2.
Mutaţiile KRAS sunt detectate cu ajutorul unor teste moleculare pe probe de ţesut tumoral conservat
în parafină6. În general, un bloc de parafină care conţine un material ce provine de la un adenom sau
de la un carcinom neinvaziv nu trebuie folosit pentru testarea mutaţiilor KRAS. În cazul în care se
efectuează o biopsie pe cale endoscopică din tumora primară sau dintr-o metastază patologul trebuie
să se asigure că există celule tumorale în materialul prelevat şi să indice blocul sau lamele care
trebuie utilizate în testul molecular.
177
EGFR dimer
Ligand
Anticorpi
moniclonali
P P PI3K Anti-EGFR
RAS
PTEN
STAT P
RAF Akt
Molecule inhibitoare
ale EGFR Tirozin-kinazei
MEK mTOR
MAPK
Nucleu
Fig. 18.1.2.6 Căile de transducţie controlate de activarea EGFR şi blocarea terapeutică a EGFR;
activarea EGFR indusă de ligand duce la activarea a trei căi de transducţie importante, RAS-
MAPK, PI3K-Akt şi STAT, care controlează transcripţia, progresia, proliferarea celulară, adeziunea,
angiogeneza şi migrarea celulară. Anticorpii monoclonali anti-EGFR se leagă de domeniul specific
extracelular al receptorului, inhibă legarea ligandului şi automat activarea EGFR. Molecule inhibitoare
ale EGFR inhibă fosforilarea, activarea căilor de transducţie şi implicit proliferarea celulară (Adaptare
după Ensari et al.)
În cadrul testării mutaţiilor KRAS se folosesc în prima etapă tehnici de amplificare PCR; în funcţie de
ţesutul analizat, raportul ţesut tumoral versus ţesut sănătos este variabil şi heterogen, rezultând un
amestec al ţintei de amplificat în care ADN-ul mutant şi cel sălbatic nu sunt prezente într-un raport
echimolar. De aceea este important ca pentru genotipare ţesutul selectat să conţină suficient material
tumoral pentru analiză (mai mult de 70% celule de carcinom invaziv). Ulterior are loc secvenţierea
exonului 2 al genei KRAS în vederea detectării mutaţiilor2.
Recomandări pentru analiza mutaţiilor genei KRAS
Analiza mutaţiilor genei KRAS contribuie semnificativ la selectarea pacienţilor care pot beneficia de
terapia cu anticorpi monoclonali anti–EGFR. Testul genetic se indică la pacienţii cu tumori metastatice
(stadiul IV)4;6.
Specimen recoltat – secţiuni nefixate, necolorate din ţesut conservat în parafină (4-5 lame); cu
ajutorul unui marker cariocă vor fi evidenţiate zonele în care este prezent ţesutul tumoral3.
Metodă - secvenţierea exonului 23.
Raportarea rezultatelor
Va fi comunicată prezenţa sau absenţa unei mutaţii la nivelul codonului 12 sau 13 din exonul 2 al genei
KRAS în ADN-ul extras din ţesutul tumoral colonic3;4.
Nu toţi pacienţii care prezintă gena KRAS de tip sălbatic răspund la terapia anti-EGFR. Au fost descrise
polimorfisme rare care pot conduce la rezultate fals-pozitive sau fals-negative4.
178
18
Bibliografie
1. Genetics Home Reference. Genes. KRAS. http://ghr.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet
Communication.
2. Jung A, van Krieken JHJM, Kirchner T, Carneiro F, Seruca R, Bosman FT, Quirke P, Flejou JF,
Plato Hnasen T, Hertogh G, Jares P, Langner C, Hoefler G, Ligtenberg M, Tiniakos D, Tejpar S,
Bevilaqua G, Ensari A. KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for
colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program. In Virchows Arch,
2008, 453: 417-431.
4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: KRAS Gene, 7 Mutation Panel, Tumor.
www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). V-KI-RAS2 KIRSTEN RAT SARCOMA VIRAL
ONCOGENE HOMOLOG; KRAS, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet
Communication.
6. Stintzing S, Heinemann V, Jung A, Moosmann N, Hiddemann W, Kirchner T, The Treatment of
Colorectal Carcinoma With Monoclonal Antibodies - The Importance of KRAS Mutation Analysis
and EGFR Status. In Deutsches Arzteblat, 2009; 106(12): 202-6.
18.1.2.7 Neoplazia endocrină multiplă de tip 1 – testare genetică
Neoplaziile endocrine multiple (Multiple Endocrine Neoplasia – MEN) sunt sindroame caracterizate
prin asocierea simultană sau succesivă la acelaşi bolnav a unor leziuni hiperplazice sau tumorale,
benigne sau maligne, de obicei hipersecretante, a cel puţin două glande endocrine, fără interrelaţii
funcţionale evidente.
Sunt descrise până în prezent trei tipuri distincte de MEN: MEN 1 (sindromul Wermer), MEN 2A
(sindromul Sipple) şi MEN 2B (sindromul Shimcke), la care se adaugă complexul Carney3.
Sindromul neoplaziei endocrine multiple tip I (MEN1) include combinaţii variate a mai mult de 20
tumori endocrine şi non-endocrine. În cadrul tumorilor endocrine manifestările clinice sunt consecinţa
producţiei hormonale excesive sau a efectului de masă exercitat de tumoră2.
● Tumorile paratiroidiene constituie principala endocrinopatie asociată cu MEN1 – prevalenţă 100%
în MEN1 (până la vârsta de 50 ani toţi pacienţii vor fi diagnosticaţi cu hiperparatiroidism primar);
în 90% din cazuri tumorile debutează la vârsta de 20-25 ani şi reprezintă astfel prima manifestare
a sindromului MEN1; de obicei sunt asimptomatice o perioadă îndelungată de timp; hipercalcemia
indusă de secreţia excesivă de parathormon este depistată întâmplător sau atunci când devine clinic
manifestă: letargie, depresie, confuzie, anorexie, greaţă, vărsături, constipaţie, poliurie, deshidratare,
179
hipercalciurie, litiază renală, fracturi pe os patologic (datorită creşterii resorbţiei osoase), hipertensiune
arterială, modificări electrocardiografice (scurtarea intervalului QT); intraoperator se constată adesea
hiperplazia tuturor celor patru glande paratiroide, fiind uneori prezente şi glande supranumerare2;3.
● Tumorile hipofizare includ cel mai frecvent prolactinoame care se manifestă la femei prin sindrom
amenoree-galactoree, iar la bărbaţi prin disfuncţii sexuale; apar la 51-65% dintre pacienţii cu
MEN11;3.
● Tumorile tractului gastro-enteropancreatic se pot manifesta prin sindrom Zollinger-Ellison
(gastrinoame) caracterizat prin ulcere peptice severe care, netratate, duc la perforaţii gastrice sau
intestinale; hipoglicemie (insulinoame); hiperglicemie, anorexie, glosită, anemie, diaree, tromboze
venoase, erupţii cutanate (glucagonoame); diaree apoasă, hipokaliemie, aclorhidrie (tumori secretante
de polipeptid intestinal vasoactiv – vipoame); aceste tipuri de tumori se constată la 1 din 3 pacienţi
cu MEN1; sunt frecvente şi tumorile pancreatico-duodenale non-secretante care sunt dificil de
diagnosticat şi se asociază cu o reducere a speranţei de viaţă.
● Tumorile carcinoide se manifestă după vârsta de 50 ani; au o prevalenţă de ~10% în MEN1; sunt
reprezentate de tumori timice, bronşice şi gastrice tip II.
● Tumorile corticosuprarenaliene includ adenoame „silenţioase”, hiperplazii adrenocorticale,
adenoame secretoare de cortizol şi, mai rar, carcinoame; prevalenţă de 20-40% în MEN12;3.
Menţionăm că în cadrul sindromului Wermer nu se întâlnesc feocromocitoame sau carcinom medular
tiroidian3.
Tumorile non-endocrine sunt reprezentate de angiofibroame faciale, colagenoame, lipoame,
meningioame, ependimoame, leiomioame2.
Incidenţa MEN1 este relativ rară (1 la 30 000 locuitori), cu o afectare egală a ambelor sexe. Sunt
descrise două forme de MEN1: sporadică şi familială3.
Diagnosticul clinic al neoplaziei endocrine multiple de tip 1 presupune identificarea a două tumori
endocrine - paratiroidiene, hipofizare sau ale tractului gastro-entero-pancreatic3. Testele biochimice
detectează niveluri serice crescute de parathormon şi calciu în hiperparatiroidismul primar, de
prolactină în prolactinoame şi de gastrină, insulină, glucagons, VIP în tumori ale tractului gastro-
entero-pancreatic4.
Metodele imagistice sunt necesare pentru aprecierea morfologiei şi topografiei paratiroidelor
(ecografie, CT, IRM, scintigrafie paratiroidiană), pentru identificarea tumorilor pancreasului endocrin
(ecografie endoscopică, scintigrafie cu octreoscan, arteriografie) şi pentru a evidenţia afectarea
hipofizară (radiografie de şa turcească, CT, IRM cranian). Explorarea organelor ţintă este de asemenea
foarte importantă: radiografie eso-gastro-duodenală – ulcer peptic (gastrinom), ecografie renală –
litiază renală (hipercalcemie, hiperparatiroidism) etc.
Diagnosticul molecular se face pe baza analizei genetice a genei MEN1, singura gena cunoscută
ca fiind asociată cu sindromul Wermer. Gena MEN1 este localizată pe cromozomul 11q13 şi codifică
menina, o proteină ce acţionează ca un factor supresor tumoral. Menina interacţionează cu alte
proteine, inclusiv cu factori de transcripţie: AP1, JunD, Smad3, NFkB, fiind astfel implicată în reglarea
unor funcţii celulare importante, cum ar fi replicarea ADN, repararea leziunilor ADN, precum şi în
transcripţie2;3.
De la clonarea genei în 1997 au fost depistate 1336 mutaţii şi 24 variante alelice normale (polimorfisme).
180
18
Peste 1000 mutaţii ale liniei germinale sunt „răspândite” în interiorul şi în jurul cadrului de citire, care
fie produc o proteină anormal scurtată, inactivă sau instabilă, fie suprimă exprimarea acesteia. Dacă
şi cea de-a doua alelă este afectată de mutaţii (inactivată), celulele endocrine proliferează necontrolat
generând neoplazii2.
Gena MEN1 este constituită din 10 exoni, cu o regiune de 1830 bp ce codifică proteina cu o lungime
de 610 aminoacizi. Mutaţiile liniei germinale pot fi de mai multe tipuri:
● mutaţii missens (situaţie în care alterarea unei baze azotate duce la schimbarea aminoacidului
codificat de către acel codon, circa 10% din cazuri);
● mutaţii nonsens (situaţie în care se generează un codon stop care conduce la obţinerea în final a
unui lanţ proteic amputat, circa 25% din cazuri);
● mutaţii în situsul de splicing (<5% din cazuri);
● mutaţii ale cadrului de citire (care prin inserţii sau deleţii creează un decalaj în citirea codonilor, circa
60% din cazuri).
Un procent de 1-4% dintre mutaţiile liniei germinale sunt deleţii mari (exonice sau ale întregii gene)
detectate prin MLPA2;3.
Într-un studiu recent care a analizat mutaţiile depistate până în prezent s-a constatat că patru dintre
anomaliile genetice - c.249_252delGTCT (deleţie la nivelul codonilor 83-84), c.1546_1547insC
(inserţie la nivelul codonului 516), c.1378C>T (Arg460Ter) şi c.628_631delACAG (deleţie la nivelul
codonilor 210-211) se produc la 4.5%, 2.7%, 2.6% şi, respectiv, 2.5% dintre familii5.
Analiza meninei a demonstrat că nu are omologie cu nici o altă proteină, este localizată în nucleu, iar
proteina trunchiată rezultată în urma mutaţiilor nonsens sau a celor care alterează cadrul de citire nu
prezintă semnalul de localizare nucleară.
O comparaţie a manifestărilor clinice prezente la pacienţii proveniţi din familii cu acelaşi tip de mutaţii
a demonstrat absenţa corelaţiilor genotip-fenotip2;5.
- testarea în scop predictiv a membrilor adulţi asimptomatici din familiile cu risc crescut;
- diagnosticul prenatal, în cazul sarcinilor cu risc crescut.
Pentru ultimele două situaţii este necesară identificarea în prealabil a mutaţiei care a determinat boala
în familie2.
hemolizate4.
Stabilitate probă - 7 zile la 2-8ºC; 1 an la -20 ºC4.
Metodă – secvenţiere completă MEN1; analiza duplicaţiilor/deleţiilor prin metoda MLPA4.
Sindromul MEN1 familial este definit ca sindrom MEN1 la o persoană care prezintă cel puţin o rudă de
gradul I cu cel puţin una tumorile endocrine specifice sindromului sau numai un singur organ afectat
şi o mutaţie MEN1 a liniei germinale.
181
Sindromul MEN1 sporadic se referă la prezenţa unui singur caz de sindrom MEN1 într-o familie.
Rata de detecţie a mutaţiilor MEN1 ale liniei germinale este de 80-90% la persoanele cu MEN1 familial
şi de 65% în cazurile sporadice; acest lucru se datorează faptului că MEN1 sporadic poate fi cauzat
uneori de un mozaicism somatic.
Persoanele care prezintă o singură tumoră asociată cu MEN1 şi nu au un istoric familial pozitiv prezintă
rareori mutaţii ale liniei germinale. Probabilitatea de detecţie a unei mutaţii MEN1 creşte la pacienţii cu
mai multe tumori principale (paratiroidiene, hipofizare sau pancreatice), în special la cei proveniţi din
familii cu hiperparatiroidism primar şi tumori insulare pancreatice.
În formele sporadice de boală rata de detecţie a mutaţiilor MEN1 depinde de numărul şi tipul
manifestărilor clinice. Astfel, probabilitatea de detectare creşte în cazul afectării pancreatice sau în
prezenţa a două manifestări clinice. Pe de altă parte probabilitatea este mai mică în formele sporadice
asociate cu prolactinoame sau tumori carcinoide.
Sindromul MEN1 are o transmitere autozomal dominantă; aproximativ 90% dintre persoanele
identificate cu o mutaţie MEN1 au un părinte afectat; 10% prezintă o mutaţie de novo. Riscul fraţilor de
a moşteni mutaţia depinde de statusul genetic al părinţilor; dacă un părinte prezintă o mutaţie asociată
cu boala riscul este de 50%; dacă nu s-a putut detecta o mutaţie la nici unul dintre părinţi sunt posibile
două situaţii: mutaţie de novo la persoana afectată sau mozaicism al liniei germinale la un părinte.
Fiecare copil al persoanei afectate are un risc de 50% de a moşteni mutaţia.
Datorită penetranţei mari a mutaţiilor MEN1 (riscul de a dezvolta tumori creşte cu vârsta ajungând la
95% la 40 ani), persoanele asimptomatice depistate cu aceste anomalii genetice vor fi incluse într-un
program de monitorizare prin teste biochimice şi investigaţii imagistice; depistarea precoce a tumorilor
contribuie semnificativ la reducerea morbidităţii şi mortalităţii.
Hiperparatiroidismul familial izolat se caracterizează prin adenoame sau hiperplazii paratiroidiene fără
alte endocrinopatii asociate; la 20-57% dintre familiile afectate pot fi detectate mutaţii MEN1 ale liniei
germinale; spre deosebire de MEN1, pacienţii cu hiperparatiroidism primar izolat prezintă un risc
crescut de carcinom paratiroidian.
Tumorile sporadice (adenoame paratiroidiene, gastrinoame, insulinoame sau tumori carcinoide
bronşice) unice (în absenţa altor modificări asociate cu MEN1) pot prezenta frecvent mutaţii MEN1
somatice2.
Bibliografie
1. Agarwal S, Ozawa A, Mateo CM, Marx SJ, The MEN1 gene and pituitary tumours, In Horm
Research, 2009, 71(suppl 2): 131-138.
2. Alberto Falchetti, Francesco Marini, Maria Luiza Brandi. Multiple Endocrine Neoplazia Type 1.
Gene Reviews, 2010. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Internet Communication.
3. E. Târcoveanu, Fl. Zugun. Neoplaziile endocrine multiple: de la diagnosticul genomic la
chirurgia profilactică. În Jurnalul de Chirurgie, Iasi, 2007, Vol. 3, Nr. 1.
5. Lemos MC, Thakker RV. Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1): analysis of 1336
mutations reported in the first decade following identification of the gene. In Human Mut 2008,
Jan; 29(1): 22-32.
182
18
18.1.2.8 Neoplazia endocrină multiplă de tip 2 – testare genetică
Neoplazia endocrină multiplă de tip 2 (MEN 2) este o afecţiune ereditară rară şi complexă, caracterizată
prin asocierea la acelaşi pacient a carcinomului tiroidian medular (CTM), feocromocitomului uni- sau
bilateral şi a altor hiperplazii sau neoplazii ale diferitelor ţesuturi endocrine.
MEN 2 este o afecţiune cu transmitere autozomal dominantă cauzată de mutaţii în gena RET, localizată
pe cromozomul 10q11.2.
Au fost descrise două forme diferite de MEN 2: sporadică şi familială. Forma sporadică asociază două
dintre principalele tumori endocrine MEN tip 2. Forma familială, mai frecventă, reprezintă subtipul în
care există cel puţin o rudă de gradul 1 cu una dintre tumorile endocrine caracteristice sindromului.
MEN 2 include trei subtipuri: MEN 2A, MEN 2B şi carcinomul medular tiroidian familial (CMTF).
Sindromul MEN 2 a fost raportat la aproximativ 500–1000 familii în întreaga lume, iar prevalenţa este
estimată la 1 la 30000 de indivizi3.
Toate cele 3 subtipuri MEN1 prezintă un risc crescut de dezvoltare a carcinomului medular tiroidian;
subtipurile 2A şi 2B asociază un risc crescut de feocromocitom; în plus, subtipul 2A este asociat cu un
risc crescut de adenom sau hiperplazie paratiroidiană.
MEN 2B include şi anomalii constituţionale, cum ar fi habitusul marfanoid, precum şi neuroame
mucoase labiale sau linguale şi ganglioneuromatoză intestinală, în timp ce afecţiunile paratiroidiene
sunt absente4.
Debutul carcinomului tiroidian medular este tipic în prima copilărie în cadrul MEN2B, la începutul
perioadei de adult în MEN2A şi la vârsta mijlocie în CMTF. Astfel, forma MEN 2B este considerată
mai agresivă decât MEN 2A sau CMTF deoarece boala apare mult mai devreme (o medie de 10 ani
mai devreme) decât MEN 2A6.
● MEN 2A (sindromul Sipple) este forma cea mai frecventă a sindromului MEN 2 (80% din cazuri).
Se caracterizează prin prezenţa carcinomului medular tiroidian (CMT), feocromocitomului uni- sau
bilateral (în peste 50% din cazuri) şi hiperparatiroidismului (în 15-30% din cazuri), dar fără tumori
pancreatice endocrine .
Hiperplazia celulelor C apare precoce în timpul vieţii şi poate fi considerată ca o leziune precursoare
pentru CMT. CMT este, în general, prima manifestare a MEN 2A. În familiile cu MEN 2A, manifestările
biochimice ale CMT apar la vârste între 5-25 ani.
Feocromocitomul este o tumoră secretantă de catecolamine care se dezvoltă pe o hiperplazie a
medulosuprarenalei, secundar unei mutaţii RET a liniei germinale, dar care devine manifestă (teste
biochimice şi/sau metode imagistice) la doar 50% dintre pacienţi. În 70% din cazuri este bilateral.
Vârful de incidenţă maximă este în jurul vârstei de 40 ani, dar pot fi interesaţi şi copii sub 10 ani.
Mai puţin de 25% din pacienţi prezintă un hiperparatiroidism franc. Unele variante de MEN 2A pot fi
asociate cu sindroame paraneoplazice (amiloidoza licheniformă cutanată sau producerea excesivă
de ACTH).
● MEN 2B (sindromul Shimcke) se întâlneşte în aproximativ 5% din cazurile cu MEN 2 şi include
carcinomul medular tiroidian (bilateral), ganglioneuromatoză, neurofibroame, anomalii scheletale
(pectus excavatum, sindrom Marfan etc.). Acest subtip MEN 2B este caracterizat prin apariţia precoce
183
(de obicei cu 10 ani mai devreme ca MEN 2A) a unor forme mai agresive de CMT şi feocromocitom
(40-50 % din cazuri), neuroame multiple şi/sau ganglioneuromatoză digestivă (40% dintre cazuri), dar
fără interesare paratiroidiană.
● Carcinomul medular tiroidian familial (CMTF) este un subtip al MEN 2 în care persoanele
afectate dezvoltă numai carcinom tiroidian medular, fără alte manifestări de MEN 2. Această formă se
referă numai la apariţia CMT la cel puţin 4 membri ai aceleiaşi familii. Prognosticul este relativ bun în
majoritatea cazurilor.
Cele mai multe cazuri de carcinom tiroidian medular (CMT) şi/sau feocromocitom sunt sporadice.
Numai 10% din cazuri sunt ereditare şi se încadrează în MEN 2.
Carcinomul medular tiroidian dezvoltat din celulele parafoliculare C producătoare de calcitonină este
obligatoriu în toate cazurile de MEN 2, reprezentând de regulă şi prima manifestare clinică. CMT
apare de obicei într-o ordine descrescătoare a severităţii în MEN 2B, MEN 2A şi CMTF. CMT se
dezvoltă iniţial pe o hiperplazie multifocală a celulelor C, a cărei progresie către CMT este extrem
de variabilă şi poate dura mai mulţi ani. CMT prezintă o tendinţă naturală către metastazarea locală
(limfonoduli cervicali, mediastinali) şi la distanţă (ficat, os, plămâni).
CMT se corelează în general cu niveluri crescute serice ale calcitoninei (bazal sau stimulat cu
pentagastrină şi/sau calciu), considerată marker tumoral specific pentru CMT (normal <10 pg/mL).
Metodele imagistice (ecografia, CT, IRM) pot fi utilizate pentru a determina extensia tumorală şi
existenţa unor posibile metastaze.
Chirurgia este tratamentul de elecţie al CMT, atât pentru pacienţii MEN 2A, cât şi pentru cei MEN 2B.
Tratamentul chirurgical constă în tiroidectomie totală şi limfadenectomie care, ideal, trebuie realizat
înainte de vârsta posibilei transformări maligne. Biopsia cu ac fin şi evaluarea nivelului calcitoninei
serice (bazal şi la 2, respectiv 5 minute după stimularea cu calciu) sunt importante pentru diagnosticul
preoperator al CMT.
Feocromocitomul apare la aproximativ 50% dintre pacienţii MEN 2A şi MEN 2B, este aproape
totdeauna benign, are tendinţa de a fi bilateral în 50-80% dintre cazuri. În general, feocromocitomul
este prima manifestare a bolii în 25% dintre cazuri, după CTM care este raportat a fi sindromul de
debut la 40% din bolnavi; în timp ce în 35% dintre cazuri CTM şi feocromocitomul sunt diagnosticate
în acelaşi timp. Feocromocitomul poate determina hipertensiune arterială, cefalee episodică, palpitaţii,
iritabilitate, transpiraţii, paloare din cauza sintezei excesive de epinefrină, norepinefrină şi dopamină
de către celulele cromafine ale glandei suprarenale.
Testele pentru metanefrinele plasmatice şi urinare sunt cele mai fidele pentru screening-
ul feocromocitomului; dintre investigaţiile imagistice sunt indicate CT, IRM, tomografie cu
metaiodobenzilguanidin (MIBG), OctreoScan-ul, tomografia prin emisie de pozitroni (positive emission
tomography - PET).
Înainte de operaţie, prezenţa unui feocromocitom funcţional trebuie exclusă prin analize biochimice
adecvate la toţi pacienţii MEN 2A şi MEN 2B. Dacă se descoperă un feocromocitom, suprarenalectomia
trebuie realizată înainte de tiroidectomie sau de altă intervenţie chirurgicală, pentru a evita criza
catecolaminică intraoperatorie. Tratamentul feocromocitomului constă în excizia chirurgicală
laparoscopică. Tratamentul pe termen lung cu alfa şi beta blocante trebuie folosit doar la pacienţii cu
tumori nerezecabile.
184
18
Hiperparatiroidismul primar (HPTP) apare în 20-30% dintre pacienţii MEN 2A şi este asimptomatic în
majoritatea cazurilor. Diagnosticul este pus pe baza testelor biochimice care arată un nivel ridicat al
PTH şi al calciului seric. Tratamentul HPTP în MEN 2 este chirurgical: paratiroidectomie subtotală sau
totală cu autotransplantarea în muşchiul sternocleidomastoidian sau în musculatura antebraţului3.
Gena responsabilă de MEN 2 este varianta patologică a protooncogenei RET. Protooncogena RET
are o lungime de 80 kb şi codifică un receptor protein kinazic cu rol important în proliferarea, migrarea,
diferenţierea şi dezvoltarea celulară în timpul embriogenezei.
Proteina RET este constituită din 3 domenii: extracelular, transmembranar şi intracelular. Domeniul
extracelular conţine 4 domenii de adeziune celulară dependente de Ca2+ „cadherin-like” (care induc
şi stabilizează modificările conformaţionale necesare pentru interacţiunea cu liganzi şi coreceptori)
şi o regiune juxtamembranară bogată în cisteină (responsabilă pentru structura terţiară şi formarea
de dimeri). Domeniul extracelular conţine de asemenea mai multe situsuri de glicozilare; proteina
glicozilată, forma matură RET, cu o masa moleculară de 170 kDa este localizată în membrana celulară;
forma imatură, neglicozilată, de 150 kDA, este prezentă numai în reticulul endoplasmic şi citoplasmă.
Domeniul intracelular include două subdomenii de tirozin-kinază (TK1 şi TK2) care sunt implicate în
activarea a numeroase căi de transducţie a semnalelor intracelulare. În funcţie de splicing-ul alternativ
al regiunii 3’ se generează 3 izoforme ale proteinei care conţin 9 (RET9), 43 (RET43) şi, respective,
51 (RET51) aminoacizi la capătul carboxi-terminal; RET9 şi RET 51 sunt principalele izoforme (vezi
fig.18.1.2.8).
În mod normal RET poate fi activată de către un complex de coreceptori şi liganzi ce aparţin a două
grupe de proteine: liganzi din familia factorului neurotrofic de origine glială (GDNF) şi α-receptori
pentru familia GDNF. La cuplarea ligandului receptorii RET normali dimerizează, iar această dimerizare
activează funcţia kinazică a RET şi transducţia de semnale activatoare. Mutaţiile activatoare la nivelul
genei RET induc activarea oncogenică a domeniului tirozin-kinazic cu rol semnificativ în dezvoltarea
tumorilor neuroendocrine.
RET are expresie specifică în celulele derivate din creasta neurală, celulele C din glanda tiroidă sau
celulele cromafine din suprarenală. În MEN2 au fost depistate mutaţii punctiforme în gena RET la
nivelul liniei germinale; identificarea prin testare genetică a persoanelor cu risc crescut a permis
instituirea unor măsuri eficace de profilaxie.
Aproximativ 98% dintre pacienţii MEN 2 prezintă mutaţii ale c-RET afectând mai mulţi dintre cei 21
exoni ai genei. Mutaţiile MEN 2 sunt localizate în exonii 10, 11, 13, 14, 15, 16, şi 8. Mutaţiile c-RET de
la nivelul domeniului bogat în cisteină şi de la nivelul domeniilor tirozin-kinazice determină activarea
constitutivă a tirozin-kinazei receptorului mutant. Mecanismele oncogenetice ale diferitelor mutaţii RET
par a fi dependente de poziţia de substituţie a aminoacidului. Astfel, mutaţiile de la nivelul domeniului
extracelular bogat în cisteină, întâlnite în general la pacienţii cu MEN 2A, transformă un reziduu
cisteinic într-unul non-cisteinic. În mod normal aceste reziduuri de cisteină sunt implicate în formarea
de legături disulfidice intramoleculare în proteina RET sălbatică; ca urmare a mutaţiilor un reziduu de
cisteină necuplată dintr-un monomer de RET formează o legătură disulfidică intermoleculară cu un
alt monomer mutant. Cele două molecule RET mutante sunt activate şi dimerizate constitutiv în trans,
indiferent de prezenţa ligandului. Mutaţiile cisteinei din poziţia 634 au demonstrat o capacitate mai
mare de transformare malignă comparativ cu mutaţiile altor reyiduuri extracelulare de cisteină.
185
Pe de altă parte marea majoritate a mutaţiilor la pacienţii cu MEN 2B şi CMTF afectează unul dintre
cele două domenii intracelulare cu rol de tirozinkinază şi alterează specificitatea de substrat a acestora
prin modificări ale domeniului de legare. Rezultă o fosforilare aberantă a substraturilor preferate de
tirozin kinazele citoplasmatice, ca de exemplu c-Src şi c-abl, în detrimentul substratului folosit în mod
normal de receptorul tirozin kinazic.
În concluzie, proteina RET mutantă nu mai necesită dimerizare pentru a deveni activă2.
Domeniul
DomeniulCadherina
cadherină
Domeniul Cisteina
cisteină
Membrana
Membranacelulara
celulară
TK1
TK2
RET 9
RET 43
RET51
Fig. 18.1.2.8 Reprezentare schematică a tirozin kinazei RET. Regiunea extracelulară este alcătuită
din 4 domenii de cadherină şi un domeniu bogat în cisteină; cele două domenii tirozin kinazice sunt
localizate în regiunea intracelulară (TK1 si TK2). Izoformele RET sunt indicate RET9, RET43 şi
RET51. (Adaptare după de Groot et al. 2006)
- testarea în scop predictiv a membrilor adulţi asimptomatici din familiile cu risc crescut
(imediat după naştere în cazul copiilor cu risc de MEN 2B şi înainte de 5 ani pentru copii cu
risc de MN 2A şi CMTF); conform ASCO (American Society of Clinical Oncologists) MEN
2 este considerat un sindrom bine definit de cancer ereditar la care testarea genetică face
parte din management-ul standard al membrilor cu risc crescut din familiile afectate;
- diagnosticul prenatal, în cazul sarcinilor cu risc crescut.
Pentru ultimele două situaţii este necesară identificarea în prealabil a mutaţiei care a determinat boala
în familie1;4.
hemolizate4.
186
18

Metodă - sunt disponibile două modalităţi de testare5:
1. secvenţiere exoni 10, 11, 13, 14, 15 şi 16;
2. secvenţiere completă a genei RET.
Spectrul mutaţiilor genei RET în MEN2 este de 58 mutaţii distincte, fiind afectaţi 19 codoni aparţinând
celor 7 exoni mentionaţi mai sus: 8, 10, 11, 13, 14, 15 şi 16.
Sindromul MEN 2 prezintă o corelaţie puternică genotip-fenotip:
● MEN 2A
Aproximativ 95% dintre familiile cu MEN 2A prezintă o mutaţie RET la nivelul domeniului bogat în
cisteină în exonii 10 şi 11. Mutaţia codonului 634, caracterizată prin substituţia cisteinei cu arginina
în pozitia 634 (Cys634Arg), strict asociată cu apariţia feocromocitomului şi/sau HPTP este întâlnită
în ~85% din cazuri6; mutaţiile reziduurilor de cisteină de pe codonii 609, 611, 618 şi 620 sunt
responsabile de restul mutaţiilor identificabile în exonii 10 şi 11. Alte mutaţii mai rare afectează
codonul 804 de pe exonul 144.
● Cancerul medular tiroidian familial (CMTF)
Aproximativ 88% din familiile cu CMTF prezintă o mutaţie RET. Aceste mutaţii se produc la nivelul
unuia din cele 6 reziduuri de cisteină (codonii 609, 611, 618, 620, 630 şi 634), mutaţiile codonilor
618, 620 şi 634 fiind responsabile de 25-35% din cazuri. CMTF a fost de asemenea asociat cu mutaţii
ale domeniului intracelular al RET (la nivelul codonilor 768, 790 şi 791 de pe exonul 13, codonii 804 şi
844 de pe exonul 14 şi codonul 891 de pe exonul 15)4;6.
● MEN 2B
Aproximativ 95% dintre persoanele cu fenotipul MEN 2B prezintă o mutaţie punctiformă în domeniul
tirozin-kinazic al genei RET la nivelul codonului 918 din exonul 16, care substituie metionina cu
treonina (Met918Thr). La unii dintre pacienţii care sunt negativi pentru mutaţia Met918Thr a fost
depistată a doua mutaţie la nivelul codonului 883 din exonul 15 care inlocuieşte alanina cu fenilalanina
(Ala883Phe). Aceste două mutaţii sunt considerate a fi foarte agresive.
La pacienti MEN 2B au fost identificate şi mutaţii rare missens la nivelul exonilor 14, 15, 16 (codonii
804, 806, 904, 922)1;4.
În urma consensului de la cel de-al 7-lea Workshop MEN (1999) s-a efectuat o clasificare a mutaţiilor
RET în funcţie de riscul de CMT agresiv; această clasificare este folosită în recomandarea vârstei
la care să se efectueze tiroidectomia profilactică, pentru stabilirea necesităţii unui screening pentru
feocromocitom şi are valoare predictivă în ceea ce priveşte fenotipul:
- mutaţii de nivel 3 (asociate cu cel mai mare risc de CMT agresiv, fiind necesară o
tiroidectomie profilactică în primele 6 luni de viaţă): mutaţiile codonilor 883 şi 918;
- mutaţii de nivel 2 (este necesară o tiroidectomie profilactică înainte de vârsta de 5 ani):
mutaţiile codonilor 609, 611, 618, 620, 630, 634;
- mutaţii de nivel 1 (asociate cu cel mai mic risc de CMT agresiv, fiind necesară o tiroidectomie
profilactică între vârsta de 5 şi 10 ani): mutaţiile codonilor 768, 790, 804, 891.
Toate subtipurile MEN 2 au o transmitere autozomal-dominantă:
- MEN 2A: aproximativ 95% dintre persoanele cu MEN2 identificate cu o mutaţie RET au
187
un părinte afectat; 5% prezintă fie o mutaţie de novo a liniei germinale, fie o penetranţă
incompletă a alelei mutante;
- CMTF: prin definiţie, pacienţii cu CMTF prezintă numeroşi membri ai familiei ce sunt
afectaţi;
- MEN 2B: aproximativ 50% dintre persoanele afectate prezintă o mutaţie de novo a liniei
germinale şi ~50% moştenesc mutaţia de la un părinte; majoritatea mutaţiilor de novo sunt
de origine paternă.
Riscul fraţilor de a moşteni mutaţia depinde de statusul genetic al părinţilor; dacă un părinte prezintă
o mutaţie asociată cu boala riscul este de 50%; dacă nu s-a putut detecta o mutaţie la nici unul
dintre părinţi sunt posibile două situaţii: mutaţie de novo la persoana afectată sau mozaicism al liniei
germinale la un părinte. Fiecare copil al persoanei afectate are un risc de 50% de a moşteni mutaţia.
Pacienţii cu CMT sporadic (fără istoric familial) pot prezenta mutaţii RET ale liniei germinale în 1-24%
din cazuri şi mutaţii RET somatice ale codonului 918, care le conferă o evoluţie mai agresivă, în 30-
67% din cazuri.
Mutaţiile RET mai pot fi asociate şi cu următoarele 2 afecţiuni:
- boala Hirschprung: o afecţiune a plexului enteric de la nivelul colonului asociată cu megacolon
şi constipaţie cronică; 20-40% din cazuri sunt determinate de mutaţii RET ale liniei germinale,
însă în majoritatea cazurilor sunt implicaţi codoni diferiţi de cei din MEN 2;
- carcinomul papilar tiroidian: în 40% din cazuri sunt prezente rearanjări somatice ale genei
RET4.
Bibliografie
1. Abdelhakim A, Barlier A, Kebbou M, Benabdeljalil N, Timinouni M, Fechtali T, Roche C, El Antri

S, RET genetic Screening in patients with medullary thyroid cancer: The Moroccan experience,
In JCRT, 2009, 5 (3): 198-202.
2. De Groot JWB, Links TP, Plukker JTM, Lips CJM, Hofstra RMW, RET as a Diagnostic and
Therapeutic Target in Sporadic and Hereditary Endocrine Tumors, In Endocrine Reviews, 2006,
27(5):535–560.
3. E. Târcoveanu, Fl. Zugun. Neoplaziile endocrine multiple: de la diagnosticul genomic la
chirurgia profilactică. În Jurnalul de Chirurgie, Iasi, 2007, Vol. 3, Nr. 1.
4. Georgia L Wiesner, Karen-Snow Bailey. Multiple Endocrine Neoplazia Type 2. Gene Reviews,
2010. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Internet Communication.
6. Milos I, Frank-Raue K, Wohllk N, Maia AL, PusiolE, Patocs A, Robledo M, Biarnes J, Barontini
M, Links TP, Willem de Groot J, Dvorakova S, Peczkowska M, Rybicki LA, Sullivan M, Raue F,
Zosin I, Eng C, Neumann H, Age-related neoplastic risk profiles and penetrance estimations in
multiple endocrine neoplasia type 2A caused by germ line RET Cys634Trp (TGC>TGG) mutation,
In Endocrine-Related Cancer, 2008, 15 (4):1035 -1041.
188
18
18.1.3 AFECŢIUNI ENDOCRINE, DIGESTIVE ŞI METABOLICE
18.1.3.1 Microdeleţii ale cromozomului Y
Infertilitatea este o problemă majoră de sănătate care afectează 10-15% dintre cupluri, iar în
aproximativ jumătate din cazuri poate fi identificat un factor masculin.
Multe cazuri de infertilitate masculină sunt asociate cu oligozoospermie (reducerea producţiei
de spermatozoizi) sau azoospermie (absenţa spermatozoizilor în ejaculat)2. Astfel de alterări în
producerea de spermatozoizi pot fi corelate cu modificări histopatologice testiculare de severitate
diferită, de la absenţa completă a celulelor germinale („sindromul existenţei doar a celulelor Sertoli”
-SCO) la hipospermatogeneză şi oprirea maturaţiei. Pe de altă parte, afectarea spermatogenezei se
poate datora mai multor cauze: afecţiuni sistemice, criptorhidie, tulburări endocrinologice, obstrucţia/
absenţa căilor seminale, infecţii, medicamente, iradiere etc. Cel puţin la un subgrup din această
categorie mare de persoane cu defect de spermatogeneză (~ 30%) este implicată o cauză genetică,
ceea ce înseamnă că una sau mai multe gene care influenţează spermatogeneza şi-au pierdut funcţia
normală15. Sunt descrise astfel trei cauze genetice de infertilitate masculină:
- anomalii cromozomiale: prezente la 5-10% dintre bărbaţii cu oligozoospermie şi 10-15%
dintre cei cu azoospermie; cea mai cunoscută anomalie este sindromul Klinefelter (47,
XXY);
- microdeleţii ale cromozomului Y: prezente la 10-18% dintre pacienţii cu oligo-sau
azoospermie severă;
- mutaţiile genei fibrozei chistice (CFTR): se transmit autozomal-recesiv; anumite mutaţii pot
determina: absenţa congenitală bilaterală a canalului deferent (CBAVD), absenţa unilaterală
a acestuia fără manifestări pulmonare sau pancreatice (CUAVD) sau obstrucţia canalului
deferent; varianta 5T constituie o mutaţie comună asociată cu CBAVD9.
Microdeleţiile cromozomului Y constituie o cauză genetică relativ recent descoperită de infertilitate.
Majoritatea acestor anomalii apar de novo şi datorită fenotipului asociat cu infertilitate nu sunt de
regulă transmise descendenţilor10.
Detecţia microdeleţiilor este importantă în special pentru pacienţii care intenţionează să beneficieze
de o reproducere asistată prin ICSI (injecţia intracitoplasmatică de spermă) deoarece există riscul
ca aceste anomalii genetice să fie transmise şi descendenţilor, ca urmare a şuntării mecanismului
fiziologic al fertilizării2.
Cromozomul Y, unul dintre cei doi gonozomi (cromozomi sexuali), conţine 2% din întregul ADN
celular şi are o lungime de ~60 milioane de perechi de baze. Are rol distinctiv în determinarea sexului
masculin prin gena SRY, alcătuită dintr-un singur exon care codifică un factor de transcripţie denumit
TDF (testis determining factor)3. Mutaţiile survenite la nivelul acestei gene dau naştere unui fenotip
feminin cu cariotip 46,XY, iar translocaţia genei SRY pe cromozomul X induce un fenotip masculin cu
cariotip 46,XX1.
Cei doi cromozomi sexuali X şi Y au evoluat dintr-o pereche de cromozomi ancestrali în urmă cu
câteva sute de milioane de ani; în timp ce cromozomul X a păstrat multe din proprietăţile unui
189
autozom (cromozom non-sexual), cromozomul Y şi-a pierdut majoritatea genelor, reducându-şi mult
dimensiunile (vezi figura 18.1.3.1.1)5.
Fig. 18.1.3.1.1 Cromozomul X (stânga) şi cromozomul Y (dreapta)

Genome biology: Tales of the Y chromosome
Huntington F. Willard Nature 423, 810-813 (19 June 2003).
Astfel, funcţia genetică actuală a cromozomului Y este limitată la inducerea dezvoltării masculine
în cursul vieţii embrionare şi la menţinerea spermatogenezei la adult. La cele două capete ale
cromozomului Y există regiuni scurte ce sunt identice cu regiunile corespondente de pe cromozomul
X, ceea ce indică schimbul de material genetic între aceste zone (recombinare) în cursul meiozei; cele
două regiuni pseudoautozomale au fost identificate prin bandare cromozomială şi denumite PAR1 şi
PAR2 (2.6 Mb şi, respectiv, 320 kb). Totuşi, mai mult de 95% din materialul genetic al cromozomului
Y este specific sexului masculin şi nu este implicat în procesul de recombinare X-Y – regiune non-
recombinantă (non-recombining region NRY). În 2003, Skaletsky şi colaboratorii săi au secvenţiat
această regiune şi, deoarece au descoperit că la acest nivel se produce un tip special de recombinare
genică, au înlocuit denumirea NRY cu regiunea specifică sexului masculin (male specific region of
Y, MSY).
MSY constituie de fapt un mozaic de secvenţe heterocromatice şi eucromatice. Heterocromatina,
considerată inertă din punct de vedere genetic, cu un conţinut înalt de secvenţe repetitive, este
distribuită în principal în porţiunea distală a braţului lung al cromozomului Yq ; mai este întâlnită în
zona centromerică, dar şi la nivelul unei porţiuni de ~400 kb care întrerupe eucromatina din regiunea
proximală Yq. Eucromatina, acea regiune care conţine majoritatea genelor (~23 Mb: 8 Mb pe braţul
scurt Yp şi ~14.5 Mb pe braţul Yq) este alcătuită din 3 clase de secvenţe nucleotidice:
● regiunea X-transpusă (3.4 Mb derivate prin transpoziţie din fostele gene X-linkate);
● regiunea X-degenerată (8.6 Mb derivate din autozomul ancestral);
● secvenţele ampliconice (10.2 Mb), Y-specifice, caracterizate prin perechi de secvenţe aproape
identice (99.9% similitudine), organizate în palindroame masive (secvenţe care sunt citite la fel pe
ambele catene ale ADN-ului dublu helicoidal); fiecare palindrom prezintă două braţe ce pornesc
dintr-un punct central, cu o simetrie în oglindă. Palindroamele MSY, desemnate P1-P8, sunt extrem
de mari, cu lungimi ale braţului ce variază între 9 Kb (P7) şi 1.45 Mb (P1); ca urmare a structurii
lor speciale secvenţele ampliconice suferă un proces de recombinare denumit conversie genică –
transfer non-reciproc de material genetic între secvenţe duplicate din cadrul aceluiaşi cromozom.
190
18
Deoarece regiunea MSY nu participă la crossing-over-ul X-Y din timpul meiozei, aceasta este
lipsită de mecanismul de înlocuire a mutaţiilor sau a rearanjărilor structurale cu secvenţe normale.
Se presupune că fenomenul de conversie genică între secvenţele palindromice (recombinarea Y-Y)
serveşte drept mecanism de refacere a secvenţelor normale care au devenit nefuncţionale pe un braţ
al palindromului (vezi figura 18.1.3.1.2).
Palindrom în cromozomul Y
Segment 1 Segment 2
Genă Genă
mutantă intactă
Reparare
Palindroame – compuse din segmente ADN care sunt imagini în

oglindă ce permit autorepararea cromozomului Y; Y poate corecta o
mutaĠie într-unul din segmente (a) prin formarea unei bucle úi
copierea versiunii intacte de pe celălalt segment (b).
Fig 18.1.3.1.2 Palindrom în cromozomul Y.

(Adaptare după Y Chromosome. http://universe-review.ca/R11-14-YChromosome.htm)16.
Pe lângă menţinerea integrităţii genelor această structură neobişnuită poate constitui baza structurală
pentru deleţii sau rearanjări; se crede că deleţiile sunt rezultatul recombinării omoloage între secvenţe
repetitive identice cu pierdere de material genetic1;4.
Marea majoritate a regiunilor cromozomului Y (57 din 60 Mb) are o rată redusă de recombinare şi se
transmite în bloc de la o generaţie la alta. Markerii cromozomiali cu o rată mutagenă înaltă, cum ar
fi regiunile microsatelite, sunt variabile în toate populaţiile, iar o combinaţie specifică de alele poate
fi utilizată pentru a defini un haplotip. Prin utilizarea cromatografiei de lichid sub înaltă presiune
denaturantă (DHPLC) au fost depistate 153 haplotipuri la nivelul cromozomului Y uman. Structura
cromozomului Y care se găseşte în GenBank aparţine haplotipului R1. Noţiunea de haplotip este
importantă deoarece persoanele cu diverse haplotipuri Y pot prezenta fenotipuri diferite (de la normal
până la grade variabile de oligozoospermie) atunci când apar microdeleţii7.
O mare parte dintre genele de pe cromozomul Y au fost identificate relativ recent, fiind clasificate în
trei grupuri în funcţie de localizare, numărul de copii şi modul lor de exprimare:
a) gene pseudoautozomale, ale căror secvenţe sunt identice pe cromozomii X şi Y (ca de exemplu
ASMTL, MIC2, IL9R) şi care sunt exprimate, în marea majoritate a cazurilor, în ţesuturi diverse;
b) gene localizate în regiunile NRY care sunt omoloage cromozomilor X şi Y (USP9Y, DBY, UTY);
191
aceste gene sunt exprimate ubiquitar, deşi unele dintre ele prezintă produşi de transcripţie specifici
testiculelor;
c) gene Y-specifice (DAZ, CDY, TSPY); aceste gene sunt prezente în copii multiple, fiind larg distribuite pe
cromozomul Y sau grupate într-o regiune mică; sunt exprimate numai la nivelul testiculelor. O excepţie de
la această clasificare o constituie gena SRY care determină dezvoltarea testiculelor: deşi este Y-specifică,
este prezentă într-o singură copie şi are un mod diferit de exprimare ce este limitat la creasta genitală,
celulele Sertoli (atât la făt cât şi la adult) şi celulele germinale2.
Conform publicaţiei autorilor L. Tiepolo şi O. Zuffardi (1976), există o zonă în regiunea MSY care
deţine un rol important în spermatogeneză, deleţia acestei regiuni fiind asociată cu azoospermia
şi implicit cu infertilitatea; această zonă a fost denumită abreviat AZF (Azoospermia Factor) cu
localizare Yq11.2313.
Cu toate acestea, complexitatea genetică a locusului AZF a putut fi evidenţiată doar în urma dezvoltării
tehnicilor STS-PCR (Sequence-Tagged Sites PCR) şi de hibridizare Southern Blot care au permis
detectarea deleţiilor interstiţiale submicroscopice (invizibile la nivel citogenetic - microdeleţii). Studiile
de mapare moleculară au complicat ipoteza iniţială a locusului unic pentru spermatogeneză de pe
Yq sugerând existenţa a 3 regiuni ce pot suferi deleţii la bărbaţii infertili; aceste 3 locusuri au fost
denumite AZFa, AZFb şi AZFc2 (vezi figura 18.1.3.1.3).
CSF 2RA
IL3RA
ANT3
PAR 1 PSEUDOAUTOZOMAL ASMT

XE7
MIC2
SRY
ZFY
CENTROMER
USP9Y Eucromatina
DBY
EIF1AY
NRY RBMY
DAZ
BPY2
PRY, CDY1
PAR 2
Heterocromatina
PAR 2 PSEUDOAUTOZOMAL
Fig. 18.1.3.1.3: Reprezentare schematică a cromozomului Y

(Adaptare după www.uhmc.sunysb.edu).
Genele Y din AZFa sunt importante în perioada de embriogeneză şi cea pre-pubertară, având
rol în diferenţierea spermatogoniilor; genele Y din AZFb şi AZFc au rol în maturarea deplină a
spermatogoniilor până la stadiul de spermatozoizi capabili de fertilizare15. Literatura de specialitate
menţionează faptul că pacienţii cărora le lipseşte complet regiunea AZFa nu au celule germinale în
epiteliul testicular, diagnosticul clinic fiind „sindromul existenţei doar a celulelor Sertoli” (Sertoli-Cell-
Only-Syndrome SCO)11.
192
18
Alături de deleţiile care apar în una din cele cele 3 regiuni AZFa, AZFb şi AZFc, au fost descrise
deleţii combinate AZFbc, AZFabc, precum şi deleţii parţiale AZFc (denumite AZFc/gr/gr). Frecvenţa
deleţiilor, în cazul pacienţilor cu azoospermie neobstructivă este diferită pentru AZFa, AZFb, AZFc,
AZFbc şi AZFabc: 4.9%, 15.8%, 59.6%, 13.6% şi, respectiv, <1%. Se presupune că aceste deleţii ar
surveni în cursul gametogenezei sau în faza timpurie preimplantare şi ar implica un deficit al enzimelor
responsabile de repararea ADN-ului normal7.
Genele din regiunea AZFa
Se estimează că intervalul AZFa se întinde pe o lungime de 792 kb şi include două gene funcţionale
larg exprimate: USP9Y (Y-linked Ubiquitin-Specific peptidase 9) şi DDX3Y (DEAD Box polypeptyde 3
Y linked), cunoscută anterior ca DBY. Rolul exact al genelor din regiunea AZFa nu este încă cunoscut,
deoarece mutaţiile spontane specifice unei singure gene sunt foarte rar întâlnite. Deleţia completă
a regiunii AZFa este relativ rară (frecvenţă <2% la bărbaţii cu defect de spermatogeneză) dar bine
documentată, fiind întotdeauna asociată cu sindromul SCO3;12.
Gena USP9Y are o lungime de 170 kb, conţine cel puţin 46 exoni şi codifică o proteină ce funcţionează
ca o ubiquitin hidrolază C-terminală. Deşi s-a crezut că deleţia genei USP9Y este asociată cu
azoospermia şi oligospermia, un studiu recent a demonstrat că USP9Y nu deţine un rol esenţial în
producerea spermatozoizilor şi fertilitate (ar contribui doar la eficientizarea acestor procese)8.
DDX3Y ar putea reprezenta gena majoră a spermatogenezei în această regiune, este mai frecvent
implicată în deleţii decât USP9Y, prezentând produşi de transcripţie specifici ţesutului testicular alături
de cei ubiquitari. Gena include 17 exoni şi codifică o ARN-helicază ATP dependentă, însă rolul său în
dezvoltarea celulelor germinale maculine nu este complet definit2.
Genele din regiunea AZFb
Regiunea AZFb cuprinde genele EIF1AY (translation-initiation factor 1A, Y isoform) şi RBMY (RNA
binding motif on Y). Rolul genei EIF1AY în spermatogeneză este până acum necunoscut, nefiind
raportată nici o deleţie specifică a acesteia. Deleţiile parţiale care includ şi locusul RBMY, au fost
asociate conform studiilor de specialitate cu hipospermatogeneza, iar deleţia completă a AZFb este o
cauză frecventă de oprire a maturaţiei spermatocitelor, ceea ce sugerează că familia de gene RBMY
are un rol important în spermatogeneză, fiind exprimată numai la nivelul ţesutului testicular14.
Genele din regiunea AZFc
AZFc este regiunea de 3.5 Mb a cărei deleţie este cel mai frecvent întâlnită la bărbaţii cu azoospermie
şi oligozoospermie; conţine mai multe familii de gene implicate în spermatogeneză, candidatul principal
în microdeleţii fiind DAZ (“deleted in azoospermia”)11;14. DAZ are o lungime de 48 kb, este alcătuită din
cel puţin 16 exoni şi este exprimată specific în ţesutul testicular.
Un complex de trei palindroame, cel mai mare având o lungime de 3 Mb şi 99.97% identitate între
braţele sale cuprinde şi regiunea AZFc care suferă frecvent deleţie. Cu o lungime totală de 4.5 Mb,
acesta conţine şase familii distincte de unităţi repetitive aproape identice (ampliconi). Ampliconii b,
g, u, r şi t au 4, 3, 3, 4 şi, respectiv, 2 secvenţe repetitive în cadrul haplotipului R1. Aceste secvenţe
reprezintă repetiţii directe, repetiţii inversate şi palindroame. AZFc conţine 12 familii de unităţi de
transcripţie, toate fiind exprimate în ţesutul testicular ca BPY2, DAZ, CDY1, CSPG4LY, GOLGA2LY,
TTTY3, TTTY4 etc.
Microdeleţiile de la nivelul AZFc pot fi grupate în mai multe subtipuri: deleţie completă b2/b4 şi deleţii
193
parţiale g1/g2, r1/r2 si r2/r47 (vezi figura 18.1.3.1.4).
deleĠie b2/b4 (deleŗie completĈ AZFc)
deleĠie gr/gr (g1/g2)
deleĠie gr/gr (r1/r3)
deleĠie gr/gr (r2/r4)
Figura 18.1.3.1.4: Regiunile AZF din cromozomul Y uman

(Adaptare după Li Z, Haines C, Han Y. “Micro-deletions” of the human Y chromosome
and their relationship with male infertility. In J Genet. Genomics, 2008).
A. Regiunile AZFa, AZFb, AZFc.
B. Ampliconi şi palindroame în porţiunea de 4.5 Mb care include AZFc.
C. Genele din regiunea AZFc.
D. Microdeleţie completă b2/b4.
E. Microdeleţie parţială g1/g2.
F. Microdeleţie parţială r1/r3.
G. Microdeleţie parţială r2/r4.
Date recente indică faptul că deleţiile parţiale AZFc se produc relativ frecvent; în timp ce unele
modificări pot avea relevanţă clinică contribuţia acestora la infertilitatea masculină nu a fost complet
analizată12.
Recomandări pentru determinarea microdeleţiilor cromozomului Y – evaluarea bărbaţilor cu
azoospermie, oligozoospermie sau infertilitate de cauză neprecizată, pentru stabilirea prognosticului
şi a opţiunilor terapeutice10;12.
Metodă – analiză prin metoda multiplex PCR a regiunilor AZFa, AZFb, AZFc; prin acest test pot fi
194
18
detectate >95% din deleţiile celor 3 regiuni AZF; sunt folosiţi primeri specifici: sY84 şi sY86 pentru
regiunea AZFa, sY127 şi sY134 pentru regiunea AZFb şi SY254 şi SY255 pentru AZFc6.
Microdeleţiile Y pot constitui cauza defectului de spermatogeneză. Deoarece fertilitatea este compatibilă
cu microdeleţiile Y (în funcţie de statusul fertilităţii feminine, fertilizarea naturală se poate produce şi
în prezenţa unui număr redus de spermatozoizi) este mai adecvat să se considere microdeleţiile Y ca
fiind cauza oligo-, azoospermiei decât cauza infertilităţii masculine12.
Datele din literatură arată că deleţiile Y relevante sunt asociate de obicei cu un număr de spermatozoizi
< 1x106/mL10.
Deleţia întregii regiuni AZFa conduce invariabil la sindromul SCO şi la imposibilitatea recoltării de
spermatozoizi maturi din epiteliul testicular în vederea injecţiei intracitoplasmatice de spermă.
Deleţia izolată a genelor USPY9 sau DBY a fost asociată cu fenotipuri testiculare variabile ce nu au
fost confirmate de alte grupuri de studiu.
Deleţiile complete AZFb şi AZFbc se caracterizează prin tabloul histologic al SCO sau oprirea
maturaţiei spermatogoniilor, condiţii ce conduc la azoospermie. La fel ca şi în cazul deleţiei complete
AZFa nu se recomandă pacienţilor tehnica de reproducere asistată prin ICSI12. Aceştia vor fi consiliaţi
de medicul specialist, putând fi luate în considerare opţiuni alternative ICSI (de exemplu, donatori de
spermă)10.
Deleţiile regiunii AZFc (b2/b4) sunt asociate cu un fenotip clinic şi histologic variabil şi sunt în general
compatibile cu spermatogeneza reziduală. Deleţiile AZFc pot fi întâlnite la bărbaţi cu azoospermie
sau oligoazoospermie severă şi, în cazuri rare, pot fi transmise descendenţilor de sex masculin. De
asemenea pacienţii cu deleţii AZFc pot beneficia de ICSI; copiii lor de sex masculin vor prezenta
microdeleţii AZFc12.
Acest test nu detectează toate cauzele de azoospermie sau infertilitate masculină, de aceea un rezultat
negativ nu exclude prezenţa unui factor genetic sau non-genetic care ar determina tabloul clinic.
Rezultatele testului trebuie interpretate întotdeauna în contextul clinic al pacientului, istoricului familial
şi al altor date de laborator.
În cazuri rare pot fi detectate polimorfisme care pot conduce la rezultate fals-pozitive sau fals-negative.
Un transplant medular alogenic în antecedente va interfera cu testarea10.
Bibliografie
1. Eberhard Passarge. Genomic Structure of X and Y Chromosomes. In Color Atlas of Genetics,
Georg Thieme Verlag KG, 3rd Edition, 2007, 256-257.
2. Foresta C, Moro E,, Ferlin A. Y chromosome Microdeletions and alterations of Spermatogenesis.
In Endocrine Reviews, 2001, 22 (2): 226-239.
3. Genetics Home Reference. Chromosome Y. Reference Type: Internet Communication.
4. Helen Skaletskzy et al. The Male-Specific Region of Human Chromosome Y is a mosaic of
discrete sequence classes. In Nature 423, 825-836 (19 June 2003).
5. Huntington F. Willard Genome biology: Tales of the Y chromosome. In Nature 423, 810-813 (19
June 2003).
195
6. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.
7. Li Z, Haines C, Han Y. “Micro-deletions” of the human Y chromosome and their relationship with
male infertility. In J Genet. Genomics, 2008, 35: 193-199.
8. Luddi A, Margollicci M, Gambera L, Serafini F, Cioni M, De Leo V, Balestri P, Piomboni P.
Spermatogenesis in a man with complete deletion of USP9Y. In N Engl J Med. 2009 Feb
26;360(9):881-5.
9. Male Infertility. www.genecare.com. Reference Type: Internet Communication.
Organizations. Y Chromosome Microdeletions, Molecular Detection.
www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
11. Navarro-Costa P, Goncalves, Plancha CE. The AZFc region of the Y chromosome: at the
crossroads between genetic diversity and male infertility. In Hum. Reprod. Update, 2010, March,
1-18.
12. Simoni M, Bakker E, Krausz C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of
y- chromosomal microdeletions. State of the art 2004. In Int J Androl 2004;27: 240-9.
13. Tiepolo L, Zuffardi O. Localisation of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent
portion of the human Y chromosome long arm. In Hum. Genet. 1976, 34:119-124.
14. Vogt HP. Azoospermia factor (AZF) in Yq11: towards a molecular understanding of its function for
human male fertility and spermatogenesis. In RMB Online, 2005, 10 (1): 81-93.
15. www.klinikum.uni-heidelberg.de/AZ. Deletionen-und-maennliche-Infertilitaet. Reference Type:
16. Y Chromosome. http://universe-review.ca/R11-14-YChromosome.htm. Reference Type: Internet
Communication.
196
18
18.1.3.2 Sindromul adrenogenital
Hiperplazia suprarenaliană congenitală sau sindromul adrenogenital reprezintă un grup de afecţiuni
cu transmitere autozomal recesivă cauzate de deficitul uneia sau mai multor enzime implicate în
sinteza normală a steroizilor din cele trei clase hormonale principale: mineralocorticoizi (aldosteron),
glucocorticoizi (cortizol) şi hormoni sexuali.
În toate formele există scăderea producţiei de cortizol ceea ce conduce la o sinteză crescută de
ACTH hipofizar; stimularea excesivă a suprarenalei determină hiperplazie asociată cu hipersecreţie
de steroizi şi de metaboliţi ai acestora proximal de defectul enzimatic.
Manifestările clinice variază în funcţie de localizarea defectului enzimatic în calea biochimică a
steroizilor suprarenalieni şi de gradul deficienţei (vezi figura 18.1.3.2).
StAR
Colesterol
Colesterol
desmolază
(CYP11A) 17 Į 17,20
Pregnenolon (CYP17)
17-OH-pregnenolon (CYP17) DHEA DHEAS
3ȕ 3ȕ 3ȕ
(HSD3B2) (HSD3B2) (HSD3B2)
17 Į 17,20
Progesteron (CYP17)
17-OH-progesteron Androstendion Estronă
21 21
(CYP17)
(CYP21A2) (CYP21A2)
Deoxicorticosteron 11-Deoxicortizol Testosteron Estradiol

11ȕ 11ȕ
(CYP11B1) (CYP11B1)
Corticosteron Cortizol Dihidrotestosteron

A
(CYP11B2)
Aldosteron
Fig. 18.1.3.2 Căile biochimice de sinteză a hormonilor steroizi

StAR = steroid acute regulatory protein (proteina ce transportă colesterolul la nivelul membranei
mitocondriale interne)
17 α = 17α-hidroxilază; 17,20 = 17,20-liază; 3 β = 3β-hidroxisteroid-dehidrogenaza;
11 β = 11β-hidroxilaza; DHEA = dehidroepiandrostendion; DHEAS = DHEA sulfat
A: procesul de sinteză în 2 etape a aldosteronului:
1. hidroxilarea corticosteronului pentru a forma 18-hidroxicorticosteron
2. oxidarea 18-hidroxicorticosteronului pentru a forma aldosteron
(Adaptare după www.questdiagnostics.com)
În timp ce persoanele cu un defect enzimatic parţial pot avea o simptomatologie redusă prezentând
cel mai adesea un tablou clinic sugestiv pentru sindomul ovarelor polichistice, cele cu defect sever
pot manifesta insuficienţă suprarenaliană acută cu pierdere de sare, ambiguitate genitală şi virilizare
197
(de la forme uşoare până la masculinizarea completă a organelor genitale externe a feţilor de sex
feminin XX)9.
Ţinând cont de severitatea manifestărilor clinice, sindromul adrenogenital poate fi împărţit într-o formă
clasică (severă, cu debut neonatal) şi o formă non-clasică (criptogenă, cu debut tradiv). La rândul său
forma clasică este subdivizată în varianta asociată cu pierdere de sare şi în cea fără pierdere de sare
(variantă virilizantă simplă).
Hormonii corticosuprarenalieni sunt derivaţi steroizi sintetizaţi din LDL-colesterol furnizat suprarenalelor
şi captat de receptori specifici. StAR asigură transportul acestuia prin membrana mitocondrială externă
în vederea iniţierii căilor de sinteză a steroizilor. Enzimele care afectează biosinteza cortizolului sunt:
P450SCC (defect la nivelul StAR), 3β-hidroxisteroid dehidrogenaza, 21-hidroxilaza, 11-hidroxilaza şi
17-hidroxilaza3.
Deficitul de 21-hidroxilază constituie cea mai frecventă cauză de sindrom adrenogenital, fiind
responsabil de aproximativ 90-95% din cazuri. Enzima este localizată în reticululul endoplasmatic
mitocondrial şi catalizează conversia 17-OH progesteronului în 11-deoxicortizol, precum şi cea a
progesteronului în deoxicorticosteron (DOC). Astfel, deficitul de 21-hidroxilază conduce la niveluri
crescute de 17-OH progesteron în ser şi de valori crescute de pregnanetriol şi 17-OH progesteron în
urină. Aceşti precursori sunt şuntaţi către calea care conduce la o producţie excesivă de androstendion
şi testosteron, cu virilizare consecutivă. În acelaşi timp se înregistrează scăderi variabile ale nivelurilor
de DOC, 11-deoxicortizol, corticosteron, cortizol şi aldosteron.
Tabloul clinic se corelează adesea cu severitatea disfuncţiei enzimatice. Forma clasică de boală
debutează în perioada neonatală sau în prima copilărie cu insuficienţă suprarenaliană însoţită de
virilizare, cu sau fără pierdere de sare. Nou-născuţii de sex feminin (XX) prezintă grade variabile de
masculinizare, de la mărirea clitorisului până la dezvoltarea completă a organelor genitale externe de
tip masculin, ceea ce face dificilă stabilirea sexului la naştere. Nou-născuţii de sex masculin au organe
genitale externe normale. Aproximativ 75% din nou-născuţii afectaţi asociază un deficit de aldosteron
care determină pierderea de sare; simptomele de hiponatremie, hiperkaliemie, depleţie a volumului
sangvin şi hipotensiune se manifestă în cursul primelor 2 săptămâni de viaţă.
Forma non-clasică se manifestă mai tîrziu în copilărie prin adrenarhă precoce sau în perioada de
adult tânăr cu hirsutism, amenoree şi infertilitate. La femei tabloul clinic este similar celui asociat cu
sindromul ovarelor polichistice. Bărbaţii pot dezvolta pubertate pecoce, resturi de ţesut suprarenalian
în testicule şi infertilitate.
Forma clasică a sindromului adrenogenital are o incidenţă de 1 la 5000-15000 naşteri de feţi vii, în
timp ce forma non-clasică de 1 la 10003;8;9.
Există o relaţie strânsă între corticosuprarenală şi medulosuprarenală. În deficitul clasic de 21-
hidroxilază a fost descrisă displazia medulosuprarenalei şi scăderea producţiei de catecolamine. S-a
sugerat că gradul afectării suprarenalei ar putea constitui un marker pentru severitatea sindromului
adrenogenital3.
Diagnosticul de sindrom adrenogenital prin deficit de 21-hidroxilază este stabilit prin determinarea
cantitativă a hormonilor steroizi şi a precursorilor acestora. Programele de screening neonatal instituite
în multe ţări, care constau în măsurarea nivelului de 17-OH progesteron în spoturi de sânge recoltate
pe hărtie de filtru au scopul de a identifica nou-născuţii cu formă clasică de deficit de 21-hidroxilază
deoarece instituirea precoce a tratamentului minerolocorticoid/glucocorticoid poate preveni apariţia
198
18
crizelor severe de pierdere de sare9;10.

Gena funcţională pentru 21-hidroxilaza suprarenaliană - CYP21A2 – este localizată pe braţul scurt
al cromozomului 6 în cluster-ul de gene HLA, la o distanţă de 30 kb de o pseudogenă CYP21A2P
care este inactivă ca urmare a unor mutaţii multiple. CYP21A2 şi CYP21A2P prezintă un grad înalt
de similitudine a secvenţelor nucleotice (98% identitate între exoni şi 96% între introni) şi ambele
conţin 10 exoni. Au fost descrise cinci alele normale ale genei active. Cele două gene sunt situate
într-o regiune în care există şi alte gene duplicate, dispuse în tandem, ceea ce facilitează apariţia
evenimetelor de recombinare între secvenţele repetate. Aceste recombinări reprezintă o cauză majoră
de mutaţii CYP21A2 ce determină deficitul de 21-hidroxilază. Recombinarea ce rezultă ca urmare a
crossing-over-ului inegal din cursul meiozei între omologii CYP21A2 funcţionali poate genera o deleţie
sau o duplicaţie mare a genei. Pe de altă parte, gradul mare de similitudine a secvenţelor nucleotidice
între CYP21A2 şi CYP21A2P facilitează conversia genică, fenomen prin care un segment al genei
funcţionale CYP21A2 este înlocuit de un segment copiat din pseudogena CYP21A2P care conţine
mutaţii; astfel, sunt generate variante patologice care inactivează expresia normală a genei CYP21A2
şi/sau translaţia proteinei normale.
Au fost descrise până în prezent peste 100 mutaţii CYP21A2 ce includ mutaţii punctiforme, deleţii
sau inserţii mici, precum şi rearanjări complexe ale genei. Majoritatea persoanelor cu deficit de 21-
hidroxilază sunt heterozigoţi compuşi (prezintă 2 alele mutante diferite). Cele mai obişnuite mutaţii
sunt reprezentate de: c.293-13A>G; c.293-13C>G, p.Pro31Leu, p.Ile173Asn, cluster-ul de mutaţii
ale exonului 6 p.(Ile237Asn, Va238Glu, Met240Lys), p.Val282Leu, p.Leu308PhefsX6, p.Gln319X,
p.Arg357Trp, p.Pro454Ser, p.Gly111ValfsX21. Acestea împreună cu deleţia de 30 kb ce afectează
capătul 3’ al pseudogenei CYP21A2P, gena adiacentă a complementului C4B şi capătul 5’ al genei
CYP21A2 constituie ~90% dintre mutaţiile cauzatoare de boală.
La marea majoritate a pacienţilor cu sindrom adrenogenital prin deficit de 21-hidroxilază genotipul
CYP21A2 poate fi utilizat în scop predictiv pentru evaluarea severităţii bolii. Astfel, fenotipurile asociate
cu pierdere de sare, virilizare simplă, sau forma non-clasică pot fi „prognosticate” la persoanele care
efectuează teste de genetică moleculară. În general fenotipul se corelează cu gradul cel mai mare
de activitate enzimatică reziduală de la o alelă mutantă (fenotipul exprimat reflectă mutaţia cu efectul
fenotipic mai puţin sever).
Uneori, din motive necunoscute, genotipul obţinut nu se corelează întotdeauna cu acelaşi fenotip, fie
în cazul grupurilor cu mutaţii identice, fie în cadrul aceleiaşi familii.
Pe baza activităţii enzimatice reziduale alelele mutante sunt clasificate în severe şi uşoare (vezi
tabelul 18.1.3.2).
Genotipul asociat cu forma clasică de boală se caracterizează prin prezenţa unei mutaţii severe pe
ambele alele CYP21A2. Deleţiile homozigote ale genei constituie cele mai severe anomalii, fiind
întotdeauna asociate cu fenotipul însoţit de pierdere de sare. Conversiile genice mari pot înlocui un
segment mare al genei funcţionale CYP21A2 cu un segment al pseudogenei CYP21A1P ce este
nefuncţional ca urmare a unor mutaţii multiple. Acestea se manifestă de asemenea printr-un fenotip
sever.
Una din cele mai frecvente mutaţii (întâlnită în 20-30% din cazuri) este substituţia A>G sau C>G la
nivelul intronului 2 (c.293-13A>G; c.293-13C>G) care are drept rezultat un splicing aberant al ARNm
şi o modificare a cadrului de citire; va fi generată în final o proteină trunchiată, nefuncţională. Deşi
199
majoritatea persoanelor care sunt homozigote pentru această mutaţie prezintă varianta de boală cu
pierdere de sare, severitatea tulburării hidroelectrolitice este variabilă. Astfel, mutaţia intronului 2
poate fi întâlnită şi în formele virilizante simple. Această lipsă de concordanţă genotip-fenotip poate
fi explicată prin splicing-ul alternativ crescut care apare atunci când cel normal este suprimat ca
urmare a unei mutaţii a situsului de splicing, ceea ce permite o oarecare producţie a proteinei cu
activitate variabilă. Aproximativ 20% din alelele mutante sunt rezultatul recombinării meiotice între
secvenţe repetate care vor da naştere deleţiei de 30 kb descrise mai sus, ce va conduce în final la o
pseudogenă himerică nefuncţională. În urma conversiilor genice mici pot să mai apară următoarele
anomalii asociate cu fenotip sever:
- o deleţie de 8 baze în exonul 3 (G110del8): este afectat cadrul de citire, conducând la
apariţia unui codon stop prematur (130) şi, în final, la o proteină scurtată;
- mutaţiile punctiforme missens de la nivelul exonului 6 (I236N, V237E, M239K);
- inserţia unei baze în exonul 7 (F306+T);
- o mutaţie nonsens în codonul 318 (Q318X);
- o mutaţie missens în exonul 8 (R356W).
Mutaţia I172N este întâlnită frecvent la pacienţii care prezintă forma de boală cu virilizare simplă;
nu apar tulburări hidrolectrolitice deoarece există o activitate enzimatică reziduală care asigură o
producţie minimă de aldosteron.
Genotipul asociat cu forma non-clasică de boală conţine două mutaţii uşoare CYP21A2 sau o mutaţie
uşoară şi una severă. Aproximativ 2/3 din pacienţi sunt heterozigoţi compuşi. Mutaţiile missens P30L
şi V281L sunt caracteristice pentru pacienţii care prezintă forma non-clasică, însă există şi cazuri rare
(<3%) în care una dintre aceste mutaţii în asociere cu o mutaţie severă pot da naştere unui fenotip
clasic1;10.
Activitate enzimatică Fenotip Mutaţie CYP21A2
Deleţia întregii gene (mutaţie nulă)
Conversie genică mare
p.Gly111ValfsX21 (G110del8)
0% Sever (clasic) p.[Ile237Asn; Val238Glu; Met240Lys]
(I236N, V237E, M239K) p.Leu308PhefsX6 (F306+T)
p.Gln319X (Q318X)
p.Arg357Trp (R356W)
Activitate reziduală c.293-13A>G sau c.293C>G (In2G)
minimă (<1%)
2%-11% p.Ile173Asn (I172N)
~ 20%-50% Uşor p.Pro31Leu (P30L)
(non-clasic) p.Val282Leu (V281L)
p.Pro454Ser (P453S)
Tabel 18.1.3.2.
Clasificarea principalelor mutaţii CYP21A2 în funcţie de activitatea enzimatică reziduală
200
18
Prin secvenţierea întregii gene CYP21A2 pot fi depistate mutaţii rare: de exemplu mutaţiile V304M şi
G375S au fost depistate la femei cu hiperandrogenism care nu prezentau nici unul dintre genotipurile
asociate în mod obişnuit cu sindrom adrenogenital prin deficit de 21-hidroxilază7.
Deficitul de 11ß-hidroxilază este al doilea defect întâlnit în biosinteza de hormoni steroizi fiind
responsabil de 5-8% din cazurile de sindrom adrenogenital (incidenţă de 1:100 000 nou- născuţi).
În cazul acestui defect enzimatic este blocată transformarea 11-deoxicortizolului în cortizol şi cea
a DOC în corticosteron şi, consecutiv, în aldosteron. Spre deosebire de deficitul de 21-hidroxilază,
această formă nu asociază pierdere de sare însă virilizarea feţilor de sex feminin (XX) poate fi la fel
de severă. Activitatea reninei plasmatice este adesea suprimată de nivelurile crecute de DOC care
determină retenţie hidrosalină. Din acest motiv, aproximativ două treimi din pacienţi manifestă precoce
hipertensiune arterială.
Nivelurile crescute ale tensiunii arteriale împreună cu cele ale DOC şi 11-deoxicortizolului facilitează
diferenţierea clinică între deficitul de 11-hidroxilază şi cel de 21-hidroxilază. Tratamentul substitutiv
cu glucocorticoizi normalizează nivelurile DOC şi activitatea reninei plasmatice (hiperaldosteronism
remediabil cu glucocorticoizi).
Există şi o formă de boală cu debut tardiv asemănătoare clinic cu forma non-clasică de 21-
hidroxilază.
Gena care codifică 11-hidroxilaza - CYP11B1 – este localizată pe cromozomul 8q21, la 40 kb distanţă
de o genă înalt omoloagă - CYP11B2 – corespunzătoare aldosteron sintazei. Deşi a fost descris un
cluster de mutaţii la nivelul exonilor 2, 6, 7 şi 8, studiile au arătat că mutaţiile inactivatoare CYP11B1
sunt distribuite la nivelul întregii regiuni codante, ceea ce face ca strategia de testare să includă
secvenţierea întregii gene. Majoritatea mutaţiilor sunt missens cu afectarea cadrului de citire şi apariţia
prematură a codonului stop. În plus au fost descrise şi gene himerice, rezultate ca urmare a crossing-
over-ului inegal între CYP11B1 şi CYP11B2, care suprimă complet funcţia 11-hidroxilazei2;3;9;11.
La evreii de origine marocană, unde prevalenţa acestui defect este relativ crescută (1 la 5000-7000
naşteri de feţi vii), este prezentă aproape întotdeauna aceeaşi mutaţie R448H în exonul 8: substituţia
argininei cu histidina la nivelul codonului 448 care afectează activitatea enzimatică13.
Deficitul de 3ß-hidroxisteroid dehidrogenază constituie o formă rară de sindrom adrenogenital
(<1% din cazuri) caracterizată prin niveluri crescute de pregnenolon, 17-OH pregnenolon, DHEA şi
prin niveluri scăzute ale tuturor celorlalţi steroizi suprarenalieni.
La om sunt descrise două izoenzime ale 3ß-hidroxisteroid dehidrogenazei, care diferă doar prin 23
aminoacizi, codificate de genele HSD3B1 şi, respectiv, HSD3B2 ce se exprimă în ţesuturi diferite.
Astfel, HS23B2 se exprimă la nivelul suprarenalelor şi gonadelor, în timp ce HSD3B1 se exprimă în
placentă, la nivel cutanat, precum şi în alte ţesuturi periferice şi, de obicei, rămâne intactă în sindromul
adrenogenital.
Pacienţii cu forma clasică de boală vor prezenta manifestări ale deficitului de glucocorticoizi, asociate
sau nu cu pierdere de sare. Băieţii prezintă o masculinizare incompletă; se înregistrează variaţii
fenotipice, de la hipospadias până la pseudohermafrodism masculin. Fetiţele pot fi normale sau pot
prezenta virilizare uşoară. A fost descrisă şi o formă de boală cu debut tardiv asociată cu manifestări
similare sindromului ovarelor polichistice (hirsutism, oligomenoree şi infertilitate)3;4;9.
Gena HSD3B2 are o lungime de 8 kb şi este localizată pe cromozomul 1 în regiunea p11-13. Au fost
201
descrise cel puţin 31 mutaţii diferite în deficitul de 3ß-hidroxisteroid dehidrogenază; forma clasică
de boală cu pierdere de sare în care activitatea enzimatică este suprimată complet este asociată
cu mutaţii missens neconservative ale cadrului de citire şi ale regiunii de splicing. În formele non-
clasice cu debut tardiv se înregistrează un deficit enzimatic parţial indus de anumite mutaţii missens
HSD3B24.
Câteva exemple de mutaţii HSD3B2:
- mutaţiile A10E, G15D, W171X, L205P, P222Q, P222T, R249X, 818delAA (status homozigot)
au fost descrise la pacienţi cu pierdere de sare;
- mutaţia A82T a fost asociată cu fenotipul fără pierdere de sare; apare cu frecvenţă mai
mare în populaţia feminină;
- mutaţiile T259M (status homozigot) şi G129R/P222Q (status heterozigot compus) au fost
descrise la femei cu virilizare5;12.
- confirmarea diagnosticului la persoanele cu suspiciune clinică:
• nou-născuţi cu test screening pozitiv;
• nou-născuţi cu ambiguitate genitală;
• nou-născuţi sau copii cu insuficienţă suprarenaliană şi/anomalii inexplicabile ale
sodiului şi potasiului;
• copii cu pubertate precoce sau, dimpotrivă, întârziată;
• copii cu hipertensiune arterială fără alte cauze;
• femei cu sindrom al ovarelor polichistice, hirsutism şi/sau semne de deficit
estrogenic;
• persoane cu suspiciune de hiperandrogenism;
- stabilirea prognosticului persoanelor afectate (corelaţii genotip-fenotip);
- depistarea purtătorilor în familiile cu istoric pozitiv pentru sindromul adrenogenital;
- diagnostic prenatal în cazul sarcinilor cu risc crescut, după identificarea în familie a
mutaţiilor cauzatoare de boală2;4;9;10.
hemolizate4.
Metode
În laboratorul nostru sunt disponibile următoarele tipuri de teste6:
1. Testarea genetică pentru deficitul de 21-hidroxilază: secvenţiere completă CYP21A2 +
analiza deleţiilor-duplicaţiilor MLPA.
2. Testarea genetică pentru deficitul de 11-hidroxilază: secvenţiere completă CYP11B1.
3. Testarea genetică pentru 3ß-hidroxisteroid dehidrogenază: secvenţiere completă HSD3B2.
Testarea genetică pentru deficitul de 21-hidroxilază
202
18
În absenţa oricărei rearanjări, deleţii sau mutaţii heterozigote cunoscute ca fiind asociate cu boala,
diagnosticul de deficit de 21-hidroxilază este puţin probabil.
Depistarea statusului homozigot sau heterozigot compus pentru rearanjări, deleţii sau mutaţii
cunoscute ca fiind cauzatoare de boală confirmă diagnosticul de deficit clasic de 21-hidroxilază.
Depistarea pe o alelă CYP21A2 a uneia din cele 3 mutaţii cunoscute ca fiind asociată cu forma non-
clasică a bolii şi pe cealaltă alelă a unei rearanjări, deleţii sau mutaţii cunoscute ca fiind cauzatoare de
boală confirmă diagnosticul de formă non-clasică de deficit de 21-hidroxilază.
Depistarea unei singure rearanjări, deleţii sau mutaţii heterozigote cunoscute ca fiind asociată cu
boala denotă starea de purtător8.
Majoritatea părinţilor copiilor afectaţi de deficit de 21-hidroxilază sunt heterozigoţi pentru o alelă
mutantă. Heterozigoţii sunt clinic asimptomatici însă pot prezenta valori uşor crescute de 17-OH
progesteron la stimularea cu ACTH. Este important să fie testaţi ambii părinţi deoarece în unele cazuri
un părinte poate fi depistat ca având formă non-clasică de boală.
În situaţia în care sunt detectate mutaţii multiple este posibil ca acestea să fie prezente în configuraţia
trans (pe cromozomi separaţi, moştenite de la ambii părinţi) sau în configuraţia cis (situate pe acelaşi
cromozom ca rezultat al conversiei genice, considerate ca fiind o singură alelă mutantă). Pentru
evitarea erorilor de diagnostic investigarea ambilor părinţi este obligatorie.
Dacă pe acelaşi cromozom se depistează prin MLPA alături de gena CYP21A2 funcţională şi o
duplicaţie a genei cu o mutaţie pacientul nu va fi considerat purtător.
Aproximativ 1% dintre mutaţii sunt de novo astfel că 1% dintre persoanele afectate au doar un singur
părinte heterozigot pentru o alelă mutantă.
Dacă ambii părinţii sunt heterozigoţi, 25% dintre copii prezintă riscul de a moşteni ambele alele şi de
a dezvolta boala, 50% au riscul de a deveni purtători ai unei alele mutante şi 25% prezintă ambele
alele normale.
Diagnosticul prenatal în cazul sarcinilor cu risc crescut pentru forma clasică de deficit de 21-hidroxilază
este foarte important deoarece instituirea tratamentului prenatal cu dexametazonă la feţii de sex
feminin afectaţi reduce virilizarea.
Un program de tratament prenatal trebuie să includă următoarele etape:
• consilierea genetică preconcepţie;
• testarea genetică preconcepţie atât a copilului afectat cât şi a părinţilor, în vederea identificării celor
2 mutaţii CYP21A2 cauzatoare de boală;
• după confirmarea sarcinii şi înainte de 9 săptămâni se va administra zilnic mamei dexametazonă în
3 doze orale pentru a suprima eventualul exces androgenic fetal;
• la 10-12 săptămâni de sarcină se va efectua prelevare de vilozităţi coriale (de preferat) sau la 15-18
săptămâni amniocenteză în vederea diagnosticului prenatal;
• dacă fătul este de sex masculin sau este vorba de un făt de sex feminin neafectat se va întrerupe
tratamentul cu dexametazonă;
• dacă fătul este de sex feminin şi se constată că prezintă mutaţiile asociate cu forma clasică de sindrom
adrenogenital sau este vorba de un status genetic incert, se va continua tratamentul cu dexametazonă
până la termen; tratamentul prenatal nu are nici un efect asupra necesităţii de tratament hormonal
substitutiv postnatal.
În general nu se recomandă tratament prenatal la feţii cu risc de formă non-clasică de sindrom
203
adrenogenital; există doar cîteva excepţii rare de neconcordanţă genotip-fenotip10.

Testarea genetică pentru deficitul de 11-hidroxilază
Interpretarea rezultatelor este similară cu cea pentru deficitul de 21-hidroxilază. Dacă ambii părinţi
sunt cunoscuţi a fi purtători de mutaţii CYP11B1 asociate cu forma virilizantă de boală există opţiunea
tratamentului prenatal la feţii de sex feminin afectaţi6.
Testarea genetică pentru 3ß-hidroxisteroid dehidrogenază
Fiind de asemenea o afecţiune cu transmitere autozomal-recesivă interpretarea rezultatelor este
similară cu cea pentru deficitul de 21-hidroxilază6.
Bibliografie
1. Catherine E. Keegan, Anthony A. Killeen. An Overview of Molecular Diagnosis of Steroid 21-

Hydroxylase Deficiency. In JMD 2001, Vol.3, No.2.
2. Gabriel I Uwaifo. C-11 Hydroxylase Deficiency. www. emedicine.medscape.com. Ref Type:
3. Helena A. Guber, Amal F. Farag, James Lo, James Sharp. Evaluation of Endocrine Function. In
Henry´s Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 344-
348.
4. J. Paul Frindik . 3-Beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Deficiency. www. emedicine.medscape.
com. Ref Type: Internet Communication.
5. Jacques Simard, Marie-Louise Ricketts, Sébastien Gingras, Penny Soucy, F. Alex Feltus and
Michael H. Melner. Molecular Biology of the 3ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase/Δ5-Δ4 Isomerase
Gene Family. In Endocrine Reviews 26 (4): 525-582.
7. Lajic S, Clauin S,Robins T, Vexiau P, Blanche H, Bellanne-Chantelot C, Wedell A. Novel
mutations in CYP21 detected in individuals with hyperandrogenism. In The Journal of Clinical
Endocronology and Metabolism, 2002, 87(6):2824-2829.
Organizations. 21-Hydroxylase Gene, Known Mutation. www.mayomedicallaboratories.com.
2010. Ref Type: Internet Communication.
9. Quest Diagnostics. Congenital Adrenal Hyperlasia. Laboratory Support of Diagnosis and
Manangement. Clinical Focus. www.questdiagnostics.com. Reference Type: Internet
Communication.
10. Saroj Nimkarn, Maria I New. 21-Hydroxylase-Deficient Congenital Adrenal Hyperplasia. Gene
Reviews, 2008. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Internet Communication.
11. Silvia Parajes, Lourdes Loidi, Nicole Reisch, Vivek Dhir, Ian T. Rose, Rainer Hampel, Marcus
Quinkler, Gerard S. Conway, Lidia Castro-Feijóo, David Araujo-Vilar, Manuel Pombo, Fernando
Dominguez, Emma L. Williams, Trevor R. Cole, Jeremy M. Kirk, Elke Kaminsky, Gill Rumsby,
Wiebke Arlt, Nils Krone. Functional Consequences of Seven Novel Mutations in the CYP11B1
Gene: Four Mutations Associated with Nonclassic and Three Mutations Causing Classic 11β-
Hydroxylase Deficiency. In J Clin Endocrinol Metab. 2010 February; 95(2): 779-788.
12. Suemi M, Russell AJ, Paula F, Dick-de-Paula I, Marcondes JA, Mendonca BB. Genotyping of the
204
18
type II 3b hydroxysteroid dehydrogenase gene (HSD3B2) in women with hirsutism and elevated
ACTH-stimulated D5-steroids. In Fertiltiy and Sterility, 2000, 74 (3): 553-557.
13. White PC, Dupont J, New MI, Leibermann E, Hochberg Z, Rosler A. A mutation in CYP11B1
(Arg448-His) associated with steroid 11b-hydroxylase deficiency in Jews of Moroccan origin. In J
Clin Invest. 1991, 87: 1664-1667.
18.1.3.3 Fibroza chistică

Fibroza chistică sau mucoviscidoza este cea mai frecventă afecţiune monogenică, având o incidenţă
de 1:2500-3500 nou-născuţi în rândul populaţiei de origine caucaziană. Se transmite autozomal
recesiv şi se caracterizează prin pleiomorfism clinic, cu evoluţie cronică, având o durată medie de
supravieţuire de 37 ani, vârstă ce este mai mare la bărbaţi decât la femei.
Frecvenţa purtătorilor Rata de detecţie a

Rasă sau grup etnic
(heterozigoţilor) mutaţiilor
Americani de origine africană 1/65 77%
Evreii Ashkenazi 1/25 99%
Americani de origine asiatică 1/90 54%
Europeni 1/25 80%
Est europeni 1/25 75%
Români 1/30 65%
Canadieni de origine franceză 1/25 91%
Americani de origine hispanică 1/46 81%
Nord europeni 1/25 91%
Sud europeni (italiani) 1/25 77%5
Boala este cauzată de mutaţii la nivelul unei genei situate pe braţul lung al cromozomului 7 (7q31),
care codifică o proteină transmembranară, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator), ce face parte din familia proteinelor cu activitate ATP-azică şi funcţionează ca un canal
de clor la nivelul polului apical al membranei celulelor epiteliale. În plus, proteina este implicată şi
în reglarea canalelor de sodiu, intervine în transportul HCO3- prin membranele celulelor epiteliale şi
poate acţiona ca un canal pentru alte proteine, cum ar fi glutationul. Studii proteomice recente au
demonstrat că CFTR interacţionează cu multe proteine intracelulare însă relevanţa fiziopatologică a
acestor interacţiuni nu a fost încă pe deplin elucidată1.
După depistarea în 1989 a defectului genetic de la nivelul genei implicate în fibroza chistică, s-a
crezut că un număr limitat de mutaţii cauzează această boală, însă până în prezent au fost descrise
mai mult de 1500 mutaţii diferite. Aproape toate sunt mutaţii punctiforme sau deleţii mici (de la 1 la
205
84 bp). Cu toate acestea este important să se înţeleagă că majoritatea sunt rare, iar consecinţele
funcţionale ale multora dintre ele sunt greu de înţeles. De fapt mai puţin de 10 mutaţii (evidenţiate în
tabelul 2), apar cu o frecvenţă mai mare de 1%, în timp ce cea mai frecventă mutaţie la nivel mondial,
caracterizată prin deleţia fenilalaninei în poziţia 508 (ΔF508 - Phe508del) (deleţia a 3 perechi de baze
de la nivelul exonului 10), se găseşte la aproximativ 30-80% dintre pacienţii cu mucoviscidoză, în
funcţie de grupul etnic afectat. În tabelul 1 sunt enumerate 25 dintre mutaţiile testate în laboratorul
nostru pentru stabilirea diagnosticului de fibroză chistică sau testarea purtătorilor1;3.
Mutaţiile genei CFTR pot fi grupate în 6 clase diferite, împărţite în raport cu consecinţele lor funcţionale
la nivel celular (vezi figura 18.1.3.3.1):
- clasa I: proteina nu este sintetizată;
- clasa II: CFTR este insuficient prelucrată la nivelul aparatului Golgi;
- clasa III: proteina nu este funcţională;
- clasa IV: CFTR prezintă conductanţă anormală;
- clasa V: CFTR prezintă un defect parţial de sinteză;
- clasa VI: CFTR este degradată accelerat1.
Mutaţiile din clasele I, II, III sunt mai frecvente şi se asociază cu insuficienţă pancreatică, în timp ce
mutaţiile din clasele IV, V şi VI sunt mai rare, iar pacienţii nu prezintă manifestări pancreatice1.
Figura 18.1.3.3.1 Adaptare după Roberta Rodrigues; Carmen S. Gabetta, Karla P. Pedro, Fabio
Valdetaro, Maria I. M. Fernandes, Patrícia K. R. Magalhães, José N. Januário, Léa M. Z. MacielI,
Cystic fibrosis and neonatal screening, Cad. Saúde Pública vol.24 suppl.4, 2008.
Tabelul 1
3120+1G>A A455E G85E R334W 1717-1G>A
3659delC ΔF508 R347P 1898+1G>A 3849+10kbC>T
206
18
ΔI507 N1303K R553X 2184delA 621+1G>T

G542X R1162X R560T 2789+5G>A 711+1G>T
G551D R117H W1282X 1078delT I148T6
Tabelul 2
Mutaţii Frecvenţa Clasa Fenotipul
ΔF508 66.0% II
G542X 2.4% I
G551D 1.6% III
N1303Lys 1.3% II
Clasic
W1282X 1.2% I
R553X 0.7% I
621+1G>T 0.7% I
1717-1G>A 0.6% I
R117H 0.3% IV Non-clasic
R1162X 0.3% Nedeterminată * Clasic6
*
Transcripţia se realizează în condiţii normale, dar proteina este trunchiată, probabil incorect
împachetată, de aceea cel mai probabil face parte din clasa II.
Gena CFTR conţine aproximativ 250-280 kilobaze, fiind alcătuită din 27 exoni. Aceasta codifică o
glicoproteină constituită din 1480 aminoacizi, ce formează cinci domenii: 2 domenii transmembranare,
fiecare cu 6 deschideri în α-helix, 2 domenii nucleotidice (NBD) în citoplasmă, interconectate la regiunile
transmembranare şi un domeniu reglator (R), care leagă între ele domeniile transmembranare. Canalul
ionic se deschide doar atunci când regiunea reglatoare a fost fosforilată de către proteinkinaza A
(PKA), iar domeniul nuceotidic leagă ATP (vezi fig.18.1.3.3.2).
Figura 18.1.3.3.2 Gena CFTR

(Adaptare după http://www.chromosome7.htmlplanet.com/custom4.html)
207
Consecinţa anomaliilor genetice este reprezentată de absenţa sau funcţionarea inadecvată a canalelor
de clor la nivel celular, ceea ce se traduce prin alterarea transportului clorurilor în glandele mucoase
şi seroase de la nivelul majorităţii organelor. Aceste secreţii vor avea un conţinut scăzut de apă, vor
fi vâscoase, aderente la epiteliile ductelor excretoare şi greu de eliminat spre exterior. Acumularea
acestora produce în timp alterarea funcţiilor şi distrucţia diferitelor organe (plămâni, pancreas, ficat,
intestin, organe de reproducere). La nivelul pielii apare o secreţie sudorală cu concentraţie ridicată
de sare.
Mucoviscidoza variază ca severitate în funcţie de mutaţiile CFTR şi factorii de mediu şi se prezintă sub
mai multe forme, unele care determină moarte precoce a copiilor, ca urmare a unei boli pulmonare
obstructive progresive cu bronşiectazii, altele caracterizate prin insuficienţă pancreatică şi boală
pulmonară obstructivă progresivă în timpul adolescenţei cu creşterea frecvenţei de spitalizare la
maturitate, iar altele manifestate prin sinuzite şi bronşite recurente sau infertilitate la bărbaţii tineri.
Prezentarea clinică, vârsta la diagnostic, severitatea simptomelor şi rata de progresie a bolii în
organele implicate variază pe scară largă1;2;6.
Manifestări pulmonare. In utero, la naştere şi imediat după aceea copiii cu fibroză chistică prezintă
histologie normală a plămânilor (cu excepţia ductelor glandelor submucoase din căile respiratorii care
sunt dilatate). La scurt timp însă, apar modificările pulmonare, ce se caracterizează prin obstrucţia căilor
aeriene periferice ca urmare a acumulării de secreţii. Persoanele afectate dezvoltă ulterior un sindrom
inflamator la nivelul tractului respirator inferior şi apoi infecţii cronice endobronşice. Deoarece elastaza
(NE) eliberată de neutrofile la locul inflamaţiei determină clivajul receptorului CR1, a componentei
C3b a complementului şi a imunoglobulinei G (IgG), bacteriile nu mai pot fi opsonizate şi distruse fiind
astfel favorizată persistenţa acestora. Alterarea apărarii antiinfecţioase duce la apariţia bronşitelor şi
bronşiolitelor bacteriene (cel mai frecvent cu Staphylococcus aureus şi Pseudomonas aeruginosa, dar
şi Aspergillus fumigatus cu dezvoltarea de micetoame), cu infiltraţie neutrofilică intensă şi obstrucţia
tractului respirator. Prezenţa elastazei determină de asemenea creşterea la nivelul celulelor epiteliale
a producţiei de IL-8, care este chemoatractant pentru neutrofile, distruge elastina şi acţionează ca
secretagog, contribuind la menţinerea inflamaţiei şi infecţiei şi producând astfel leziuni structurale şi
tulburări ale schimbului de gaze2.
Simptomele respiratorii pot începe din prima lună de viaţă cu tuse, tahipnee sau wheezing, unii copii
putând prezenta chiar detresă respiratorie severă asociată cu bronşiolită.
Deoarece polipii nazali apar la 10-32% dintre pacienţii cu fibroză chistică, prezenţa acestora reprezintă
o indicaţie pentru efectuarea testului sudorii. Majoritatea copiilor de peste 8 luni (90%) prezintă
sinuzită recurentă refractară la terapia cu antibiotice.
La adulţi manifestările mucoviscidozei se caracterizează prin tuse cronică (la început uscată,
intermitentă, concordantă cu episoadele infecţioase, ulterior se prelungeşte în timp, devine paroxistică,
cu exacerbări nocturne şi în special dimineaţa la trezire, apoi productivă), expectoraţie intermitentă
cu creşterea producţiei de spută asociată cu modificări ale culorii acesteia, febră uşoară, dispnee de
efort, pneumonie, bronşiolită recurentă, atelectazie, hiperreactivitatea căilor respiratorii cu apariţia
astmului refractar şi lipsa răspunsului la tratamentul cu agenţi β-adrenergici, bronşiectazii, hemoptizie,
pneumotorax şi retracţii suprasternale şi intercostale. Pe măsură ce boala pulmonară progresează,
ca urmare a infecţiilor cronice, apar leziuni structurale importante ale căilor respiratorii (chisturi sau
208
18
abcese) însoţite de fibroza parenchimului pulmonar adiacent şi apariţia obstrucţiei cu hiperinflaţie şi

blocarea gazelor. Hipoxemia apare iniţial în timpul somnului şi efortului fizic, iar hipercapnia se dezvoltă
tardiv şi este un element de prognostic negativ. De asemenea apariţia hipertensiunii pulmonare şi
dezvoltarea cordului pulmonar o dată cu boala parenchimatoasă avansată reprezintă un semn de
prognostic nefavorabil, care este asociat cu o supravieţuire de aproximativ 8 luni.
Un studiu recent a raportat că expunerea pasivă la fumul de ţigară afectează negativ funcţia pulmonară
la persoanele cu fibroză chistică.
În ciuda tuturor intervenţiilor terapeutice bolile pulmonare rămân cauza majoră de morbiditate şi
mortalitate în fibroza chistică2;3;5;6.
Manifestări gastrointestinale. Mutaţiile de la nivelul genei CFTR determină apariţia unei secreţii
alterate de clorură şi apă la nivel intestinal, ce poate conduce la apariţia ileusului meconial la naştere
(mai frecvent la homozigoţii ΔF508) sau a sindromului de obstrucţie intestinală distală mai târziu în
viaţă.
Ileusul meconial apare la 15-20% din nou-născuţii diagnosticaţi cu mucoviscidoză, putând fi principala
manifestare în perioada neonatală. Sindromul de impactare meconială este determinat de acumularea
de masă mucofecaloidă lipicioasă în ileonul terminal şi cec, aderentă la peretele intestinal, ce uneori
se poate calcifica.
Atrezia jejunală asociată frecvent cu volvulus şi peritonită meconială poate fi de asemenea o formă
de prezentare a fibrozei chistice.
Diagnosticul de mucoviscidoză poate fi suspectat încă din viaţa intrauterină datorită evidenţelor
ultrasonografice sugestive pentru obstrucţie intestinală, cum ar fi aspectul hiperecogen al intestinului
fetal.
Cauza sindromului de obstrucţie intestinală distală este neclară, putându-se asocia cu deshidratarea,
febra, reducerea suplimentelor enzimatice, boala hepatică sau utilizarea medicamentelor cu efect
antiperistaltic (opiacee, anticolinergice). Clinic se caracterizează prin crampe recurente, prezenţa unei
mase palpabile la nivelul abdomenului şi semne de obstrucţie intestinală completă sau parţială. 50%
dintre aceşti pacienţi suferă complicaţii cum ar fi peritonită, volvulus, atrezie, necroză, perforaţie sau
formarea unui pseudochist.
Impactarea mucoidă a apendicelui poate fi observată ca o masă palpabilă asimptomatică în cadranul
abdominal inferior.
Ca urmare a creşterii presiunii intraabdominale secundare tusei aceşti pacienţi dezvoltă frecvent
prolaps rectal.
Colonopatia fibrozantă este o entitate caracterizată prin strictura colonului ascendent, ce a fost
descrisă iniţial în 1994 şi este caracteristică fibrozei chistice. Dozele mari de enzime pancreatice,
în special lipaze au fost incriminate în etiologia bolii. Simptomele iniţiale sunt similare cu cele din
sindromul obstructiv, iar diagnosticul se stabileşte în urma efectuării unui tranzit baritat.
Incidenţa tumorilor gastrointestinale (esofagiene, gastrice, intestinale, hepatice, biliare, pancreatice
şi retroperitoneale) este în creştere la pacienţii cu fibroză chistică, colonul fiind cea mai frecventă
localizare a cancerului.
Insuficienţa pancreatică exocrină (cauzată de obstrucţia ductelor pancreatice cu secreţii, apariţia
autodigestiei enzimatice şi în final a fibrozei interstiţiale) însoţită de sindrom de malabsorbţie apare
209
încă de la naştere la marea majoritate a persoanelor diagnosticate cu FC, cu excepţia celor care au
anumite mutaţii CFTR şi nu necesită administrarea de enzime pancreatice. Aceştia riscă totuşi să
dezvolte pancreatită acută sau recurentă.
Manifestările clinice sunt steatoreea, distensia abdominală, durerile abdominale, flatulenţa, retardul
de creştere (determinat de sindromul de malabsorbţie şi anemia hemolitică), defectele de coagulare
sau erupţiile cutanate asociate cu deficienţele de vitamine liposolubile (A, D, E şi K) şi zinc. La aceşti
pacienţi se recomandă administrarea de enzime pancreatice. Persoanele cu FC şi funcţie pancreatică
nomală au o evoluţie clinică mai blândă cu rata medie de supravieţuire mai mare (56 ani) faţă de cei
cu insuficienţă pancreatică.
La copii deficitul de vitamine, electroliţi şi proteine se manifestă prin: fontanele proeminente; anemie
hemolitică prin deficitul de vitamină E; complicaţii hemoragice ce pot rezulta prin deficitul de vitamină
K datorat insuficienţei hepatice sau malabsorbţiei; hipoproteinemie şi edeme; hepatomegalie însoţită
de creşterea valorilor enzimelor hepatice; acrodermatită enteropatică, constipaţie, deshidratare
hiponatremică/hipocloremică şi piele sărată, alcaloză metabolică hipokaliemică secundară pierderii
cronice de sare.
Scăderea toleranţei la glucoză este frecventă la bolnavii cu mucoviscidoză (în medie 40%). Diabetul
zaharat asociat cu fibroza chistică (DZAMV) se manifestă în adolescenţă (prin cetoacidoză şi
cetonurie), fiind diagnosticat la 7% din pacienţii cu vârstă între 11 şi 17 ani, cu creşterea prevalenţei
la maturitate. Este mai frecvent la homozigoţii ΔF508 şi la sexul feminin. DZAMV reprezintă o entitate
distinctă faţă de diabetul de tip 1 sau 2, dar are caracteristici comune cu ambele tipuri. Etiologia este
o combinaţie între secreţia redusă de insulină (secundară fibrozei pancreatice şi numărului redus de
celule insulare) şi rezistenţă periferică la insulină. Apariţia acestui tip de diabet se asociază cu un
declin al funcţiei pulmonare, cu o stare nutriţională mai precară şi cu supravieţuire mai scurtă.
Odată cu creşterea perioadei de supravieţuire la aceşti pacienţi, bolile hepatobiliare asociate
mucoviscidozei au devenit o complicaţie serioasă şi frecventă ce pot afecta calitatea vieţii pacienţilor.
Implicarea hepatobiliară devine clinic aparentă după primii 10 ani de viaţă.
Absenţa proteinei CFTR funcţională în celulele epiteliale care tapetează ductele biliare determină
formarea unei secreţii vâscoase, care obstruează canaliculele. Dacă acest proces este extins apare
ciroză obstructivă, ce se poate complica cu varice esofagiene, splenomegalie şi hipersplenism.
Nou-născuţii cu fibroză chistică pot prezenta icter obstructiv prelungit prin stază biliară intra şi
extrahepatică.
Calculii biliari au prevalenţă mai mare la pacienţii cu mucoviscidoză (15% dintre adulţii tineri cu fibroză
chistică) decât la subiecţii normali.
Boala hepatică este a doua cauză de mortalitate după afecţiunile pulmonare în fibroza chistică2;3;5;6.
Fertilitate. Mai mult de 95% dintre bărbaţii cu FC sunt infertili, ca urmare a absenţei congenitale
bilaterale a ductelor deferente şi mai rar prin azoospermie obstructivă. Corpul, coada epididimului
şi veziculele seminale poate fi anormal dilatate sau chiar absente. Doar 1% dintre pacienţii cu
mucoviscidoză sunt fertili, aceştia prezentând forme uşoare de boală. Spermatogeneza este normală
la aceşti barbaţi.
Femeile cu FC sunt fertile, deşi câteva (20%) pot prezenta un mucus cervical anormal care contribuie
la infertilitate.
210
18
Deoarece supravieţuirea indivizilor cu FC s-a îmbunătăţit considerabil în ultimele decenii, sarcina la

femeile cu FC a devenit o problemă importantă. Există studii care afirmă că sarcina decurge bine la
aceste pacientele, dar şi studii care atestă apariţia unor complicaţii.
Factorii de predicţie negativi, atât pentru mamă cât şi pentru făt, în cazul unei sarcini sunt capacitatea vitală
forţată (CVF) mai mică de 50% din valoarea prezisă şi starea nutriţională proastă. De fapt o valoare a CVF
mai mică de 50% din valoarea prezisă reprezintă o contraindicaţie absolută a sarcinii.
Cu toate acestea tratamentul adecvat al afecţiunilor pulmonare, managementul agresiv al infecţiilor
cu o mare varietate de antibiotice şi îmbunătăţirea nutriţiei au făcut ca sarcina să fie bine tolerată,
în special la femeile cu forme uşoare sau moderate. La acestea factorii de risc pentru deteriorarea
sănătăţii şi deces precoce după sarcină sunt aceleaşi ca şi pentru populaţia adultă non-gravidă. Într-
un studiu recent, Goss et al a luat în considerare valoarea VEF (volumul expirator forţat), greutatea,
înălţimea şi rata de exacerbare pulmonară pe an şi a constatat că sarcina nu a fost asociată cu un risc
crescut de deces. De fapt sarcina nu pare să prezinte riscuri suplimentare nici pentru subgrupurile de
femei cu diabet zaharat sau cu valoare FEV mai mică de 40% din valoarea prezisă. Factorii predictori
importanţi pe parcursul sarcinii sunt severitatea insuficienţei pulmonare materne şi starea de nutriţie,
în sensul că deteriorarea acestora pot precipita naştere prematură. În ciuda tuturor eforturilor rata de
nou-născuţi vii la femeile cu mucoviscidoză cu vârste cuprinse între 13 şi 45 ani este de 1.9%.
Riscul de apariţie a anomalilor congenitale la făt nu este crescut, iar alăptatul nu reprezintă o
contraindicaţie2;3;6.
Manifestări osteoarticulare. Osteoartropatia hipertrofică afectează peste 6% dintre bolnavi, fiind mai
rară la copiii mici şi mai frecventă la sexul masculin (2:1). Este un sindrom caracterizat prin proliferare
anormală a ţesutului osos la nivelul extremităţilor distale ale oaselor lungi, cu apariţia hipocratismului
digital, durerii sau tumefacţiei articulare, de obicei simetrică, şi a periostitei.
Artropatia în fibroza chistică apare la 10% dintre bolnavi, putându-se manifesta în orice moment
evolutiv. Etiologic sunt implicate mecanisme imunologice probabil legate de infecţia cronică cu
Pseudomonas aeruginosa. Debutul este brusc cu durere, tumefacţie şi uneori se poate asocia cu
leziuni tegumentare cum ar fi rash-ul maculopapular, eritemul nodos şi ocazional purpura. Poate
fi mono- sau poliarticulară, afectând articulaţiile mari sau mici, cele mai frecvente fiind genunchiul,
glezna, articulaţia mâinii, cotului sau umărului.
Osteopenia sau osteoporoza sunt manifestări frecvente ale pacienţii cu FC şi sunt asociate cu apariţia
fracturilor şi a cifozei3.
Clasic diagnosticul fibrozei chistice se stabileşte pe baza elementelor clinico-anamnestice caracteristice
şi este apoi confirmat prin testul sudorii sau analiză moleculară.
La 70% dintre pacienţi diagnosticul este stabilit înaintea vârstei de 1 an, de obicei în primele luni de
viaţă. Totuşi există bolnavi la care diagnosticul este confirmat abia după vârsta de 10 ani.
Diagnosticul de FC poate fi stabilit la persoanele suspicionate dacă prezintă:
1. una sau mai multe caracteristici fenotipice ale FC;
şi
2. dovada anomaliei funcţiei CFTR:
- prezenţa mutaţiilor cauzatoare de boală în gena CFTR;
sau
211
- 2 valori anormale ale clorurilor în sudoare la iontoforeza cantitativă pilocarpinică (>

60 mEq/L);
sau
- valori specifice ale diferenţei de potenţial nazal.
Testul sudorii rămâne gold standard-ul în diagnosticarea bolii şi evaluează concentraţia de ioni de clor
şi sodiu din transpiraţie. Valorile normale ale electroliţilor în sudoare se situează <40mMol/L; valorile
pozitive sunt la copii >60 mMol/L, iar la adolescenţi şi adulţi tineri >70 mMol/lL; valorile echivoce:
între 40-60 mMol/L se repetă obligatoriu şi se interpreteză în context clinic. O concentraţie de clorură
de mai mare de 60 mMol/L în sudoare, la două determinări diferite stabileşte diagnosticul de boală.
Rezultatele fals pozitive pot fi asociate cu sindromul Hurler, iar cele fals negative pot să apară în
cazul pierderilor acute de sare. În cazul în care FC este suspectată la un individ cu hiponatremie şi
hipocloremie, testul sudorii ar trebui amânat până la restabilirea unui echilibrul electrolitic3;6.
În următoarele situaţii speciale testarea genetică este testul iniţial de diagnostic:
- diagnosticarea in utero a feţilor cu risc ridicat (în 2002, 4% din persoanele nou
diagnosticate au fost identificate cu ajutorul diagnosticului prenatal);
- testarea prenatală a feţilor cu risc scăzut, dar cu imagini ecografice sugestive pentru
boală;
- screening-ul nou-născuţilor (în 2002, 12.8% din persoanele nou diagnosticate au fost
identificate prin intermediul screening-ului neonatal);
- testarea sugarilor simptomatici (cu ileus meconial), care sunt prea mici pentru a
produce un volum adecvat de sudoare;
- testarea unei persoane simptomatice care are rude cu mutaţii CFTR identificate6.
Deoarece mucoviscidoza se transmite autozomal recesiv, în momentul concepţiei fiecare frate al unui
individ afectat are 25% şanse să fie purtător şi să prezinte afecţiunea, 50% şanse să fie purtător
asimptomatic şi 25% şanse să fie nepurtator şi să nu fie afectat.
Testarea prenatală se efectueză pe celule fetale obţinute prin biopsia vilozităţilor coriale prelevate la
aproximativ 10-12 săptămâni de gestaţie sau prin amniocenteză, de obicei la circa 15-18 săptămâni
de viaţă intrauterină.
Testul sudorii trebuie efectuat postnatal la toţi pacienţii la care fibroza chistică a fost suspectată.
Testarea genetică are un rol important în detectarea unor mutaţii cu implicaţii importante în determinismul
anumitor fenotipuri. Cea mai bună corelaţie între genotip şi fenotip este legată de funcţia pancreatică.
Mutaţiile cele mai frecvente au fost clasificate în două categorii: cele care determină insuficienţă
pancreatică şi cele care se asociază cu funcţie pancreatică normală (denumite „pancreatic sufficient”,
PS). Persoanele fără afectare pancreatică au, de obicei, una sau două alele mutante de tip PS, ce
sunt dominante în ceea ce priveşte fenotipul pancreatic.
În schimb, corelaţia genotip-fenotip este, în general, slabă pentru bolile pulmonare în fibroza chistică.
Afecţiunile pulmonare în rândul persoanelor cu genotipuri identice variază foarte mult, o explicaţie
plauzibilă fiind intervenţia factorilor de mediu.
Heterozigoţii cu mutaţii ΔF508/A455E au funcţie pulmonară mai bună faţă de indivizii homozigoţi
pentru ΔF508.
Severitatea bolii pulmonare la persoanele cu una sau două mutaţii R117H depinde de lungimea
212
18
regiunii poli T de la nivelul intronului 8, astfel dacă bolnavul prezintă varianta 5T în configuraţie cis
dezvoltă de obicei boli pulmonare, iar cei cu varianta 7T sau 9T au un fenotip extrem de variabil, care
se poate extinde de la lipsa manifestărilor pulmonare până la forme moderate de boală.
Deoarece mutaţiile A455E şi R117H sunt asociate cu funcţie pancreatică normală, boala pulmonară mai
puţin severă observată la aceste persoanele ar putea fi consecinţa stării de nutriţie mai bune6.
Un test genetic negativ pentru mutaţiile ţintite nu poate exclude boala. Deoarece în prezent sunt
descrise peste 1000 mutaţii, pe piaţă există mai multe truse de diagnostic, care pot identifica cele mai
frecvente mutaţii pentru o anumită zonă geografică sau grup populaţional. Pentru cazurile cu adevărat
suspecte se poate apela la metode complexe de analiză genetică a ADN-ului (secvenţiere).
Colegiul American de Genetică Medicală recomandă screening-ul purtătorilor utilizând un panel care
pune în evidenţă 23 mutaţii, în care sunt incluse majoritatea mutaţiilor ce au o frecvenţă mai mare
de 0.1% în populaţia generală din SUA. Lista mutaţiilor de screening poate fi însă completată cu alte
mutaţii pentru a îmbunătăţi sensibilitatea detecţiei pentru anumite grupuri etnice.
Testele genetice sunt disponibile pentru screening-ul persoanelor asimptomatice care doresc să afle
dacă sunt sau nu purtătoare ale genei defective de fibroză chistică şi implică, de obicei, interviuri
pre-test, dar şi consiliere privind posibilul impact al rezultatelor testelor pozitive sau negative. Acest
tip de analize genetice permite părinţilor să afle dacă au un risc crescut de a avea un copil cu fibroză
chistică.
Screening-ul purtătorilor de fibroză chistică se recomandă următoarelor persoane:
- adulţii care au în familie rude cu fibroză chistică;
- partenerii persoanelor cu fibroză chistică; dacă un partener are fibroză chistică şi celălalt
este purtător al genei defective de fibroză chistică, atunci copilul va avea 50% şanse de a
dezvolta boala;
- cuplurile care doresc să conceapă copii.
Dacă investigaţiile arată că o persoană este purtătoare a genei defective de fibroză chistică, este
necesară şi testarea partenerului. Pentru ca un copil să dezvolte afecţiunea, ambii părinţi trebuie să
fie purtători ai genei mutante. În cazul în care analizele partenerului sunt negative sunt şanse minime
pentru copil să dezvolte boala6.
hemolizate4.
Metodă
În laboratorul nostru sunt disponibile două tipuri de testare:
1. detectarea a 25 mutaţii comune prin secvenţierea exonilor specifici şi analiza deleţiilor/duplicaţiilor
MLPA: 3120+1G>A, A455E, G85E, R334W, 1717-1G>A,
3659delC, ΔF508, R347P, 1898+1G>A, 3849+10kbC>T, ΔI507, N1303K, R553X, 2184delA,
621+1G>T, G542X, R1162X, R560T, 2789+5G>A 711+1G>T, G551D, R117H, W1282X, 1078delT
şi I148T;
213
2. secvenţierea tuturor exonilor CFTR şi analiza deleţiilor/duplicaţiilor MLPA: detectează peste 98%
dintre mutaţii.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate în gena CFTR şi genotipul respectiv4.
Bibliografie
1. Felix A Ratjen MD PhD FRCP(C). Cystic Fibrosis: Pathogenesis and Future Treatment
Strategies. In Respir Care 2009 May;54(5):595-605.
2. Girish D Sharma. Cystic Fibrosis, www.emedicine.medscape.com, Ref Type: Internet
Communication.
3. Ioan Popa, Liviu Pop, Zagorca Popa, Casandra Cîlţ. Ghid de management în mucoviscidoză–
(fibroza chistică).
5. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Cystic Fibrosis Mutation Analysis, 70-
Mutation Panel. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
6. Samuel M Moskowitz, James F Chmiel, Darci L Sternen, Edith Cheng, and Garry R Cutting.
CFTR-Related Disorders. Gene Reviews, 2008. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet
Communication.
18.1.3.4 Hemocromatoza ereditară (mutaţii HFE: C282Y; H63D; S65C)
În accepţiunea curentă, hemocromatoza include afecţiunile ereditare însoţite de supraîncărcare
cronică cu fier care prezintă un fenotip comun caracterizat prin eritropoieză normală, valori crescute
ale saturaţiei transferinei şi feritinei şi depunerea progresivă a fierului în celulele parenchimatoase ca
urmare a unei producţii scăzute (dar care este normal reglată) a hormonului peptidic hepatic denumit
hepcidină.
De la descoperirea în 1996 a genei HFE a hemocromatozei ereditare au fost identificate şi alte defecte
genetice care explică mecanismul şi varietatea acestei afecţiuni. Considerată mult timp drept o boala
unitară monogenică hemocromatoza este de fapt o afecţiune poligenică cu faţete multiple5.
O teorie recentă în ceea ce priveşte patogeneza hemocromatozei ereditare este legată de axa
reglatoare hepcidină-feroportină. Nivelele scăzute de hepcidină determină creşterea exprimării
feroportinei (proteina care exportă fierul din celule în circulaţie) la nivelul enterocitelor intestinale şi
macrofagelor reticuloendoteliale. În acest fel creşte biodisponibilitatea fierului plasmatic, se produce
saturarea transferinei şi apare în exces fierul nelegat de transferină care este preluat rapid de către
ficat, cord şi pancreas – principalele organe afectate de supraîncărcarea cronică cu fier2.
214
18
Baza de date OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) listează 4 tipuri de hemocromatoză
ereditară caracterizate prin mutaţii genetice diferite. Genele afectate codifică proteine care sunt
implicate în căile metabolice relevante pentru sinteza hepatică de hepcidină.
Hemocromatoza ereditară de tip 1 reprezintă forma clasică a acestei afecţiuni asociată cu mutaţii ale
genei HFE. Populaţiile de origine nord-europeană prezintă incidenţa cea mai mare a acestei afecţiuni
(1 caz la 300 indivizi). Sexul masculin este mai afectat decât cel feminin, raportul bărbaţi:femei fiind
de 1.8:1. Boala devine aparentă după vârsta de 40 de ani la bărbaţi şi după 50 de ani la femei. Ficatul
este principalul organ ţintă, deoarece la nivelul acestuia se depozitează cantitatea excedentară de fier
din organism. Netratată, acesta formă de hemocromatoză poate evolua până la ciroză hepatică iar
un anumit procent din pacienţi dezvoltă carcinom hepatocelular. Pancreasul este un alt organ afectat
frecvent în contextul hemocromatozei primare. În stadiile incipiente (în absenţa cirozei), pacienţii
dezvoltă adesea rezistenţă la insulină, iar pacienţii cu ciroză prezintă frecvent diabet zaharat insulino-
dependent. Hiperpigmentarea cutanată este des întâlnită, de unde şi denumirea de diabet bronzat. La
aproape jumătate dintre pacienţii cu hemocromatoză primară apare artropatia, ce afectează în mod
frecvent a doua şi a treia articulaţie metacarpofalangiană. În stadiile tardive ale bolii, unii pacienţi de sex
masculin dezvoltă hipogonadism pituitar cu impotenţă secundară si scăderea libidoului. Interesarea
cardiovasculară include cardiomiopatia şi aritmiile, fiind o cauza frecventă de deces la pacienţii cu
hemocromatoză primară. Aceste complicaţii pot fi prevenite prin practicarea precoce (înainte de a se
produce deteriorarea tisulară) a flebotomiilor.
Hemocromatoza ereditară de tip 2 include cazurile de hemocromatoză juvenilă şi prezintă două
forme:
- hemocromatoza ereditară juvenila tip 2A (majoritară) asociată cu o mutaţie localizată pe
cromozomul 1q, unde se află gena (HJV sau HFE2) ce codifică hemojuvelina care intervine
probabil în modularea expresiei hepcidinei;
- hemocromatoza ereditară juvenila tip 2B (cazuri foarte rare) asociată cu mutaţia homozigotă
a genei HAMP care codifică hepcidina.
Hemocromatoza juvenilă are o evoluţie multă mai severă decât forma clasică a hemocromatozei şi
devine clinic manifestă la ambele sexe în a doua decadă de viaţă.
Hemocromatoza ereditară tip 3 este clinic similară cu hemocromatoza clasică şi include puţinele cazuri
descrise până în prezent în asociere cu mutaţia genei care codifică TfR2 (receptorul 2 al transferinei).
Acesta este bine exprimat la nivelul hepatocitelor şi mediază preluarea fierului legat de transferină.
De asemenea, studiile au sugerat că TfR2 este un modulator al producerii hepcidinei ca răspuns la
acumularea fierului. Valorile hepcidinei au fost scăzute sau chiar absente în majoritatea cazurilor cu
mutaţie homozigotă pentru TfR2.
Hemocromatoza ereditară tip 4 este asociată cu mutaţia genei SLC40A1 care codifică feroportina.
Spre deosebire de celelalte tipuri de hemocromatoză are un mod de transmitere autozomal dominant,
o evoluţie clinică mai blândă, iar din punct de vedere biochimic nivelurile de feritină sunt disproporţionat
crescute faţă de saturaţia transferinei1.
Adesea, tipurile de hemocromatoză altele decât cea clasică sunt grupate împreună sub termenul
„hemocromatoză ereditară non-HFE”.
Gena HFE, la care se referă testul de faţă, este localizată pe braţul scurt al cromozomului 6 şi codifică
215
o proteină similară antigenului de histocompatibiliate HLA din clasa I. Proteina HFE interacţionează
cu TfR1 (receptorul 1 al transferinei) facilitând probabil preluarea fierului legat de transferină; de
asemenea exercită un posibil efect modulator asupra expresiei hepcidinei1;7.
Cea mai obişnuită mutaţie în gena HFE are drept rezultat substituirea cisteinei cu tirozina în poziţia
282 al lanţului de aminoacizi al proteinei HFE (C282Y). Statusul homozigot pentru această mutaţie
este asociat cu 60-90% din toate cazurile de hemocromatoză ereditară pe când statusul heterozigot
cu numai 3-8% din cazuri. În populaţia europeană mutaţia C282Y apare în forma heterozigotă la 10%
şi în forma homozigotă la 0.4% din indivizi6;8.
Penetranţa pentru anomaliile biochimice (valori crescute ale saturaţiei transferinei şi feritinei) la
persoanele homozigote pentru mutaţia C282Y este relativ crescută, dar nu atinge 100%. Pe de altă
parte, penetranţa pentru complicaţiile clinice (ciroză hepatică, diabet zaharat, cardiomiopatie, etc)
este redusă, ceea ce indică faptul că alţi factori, cum ar fi cei de mediu, pot influenţa expresia clinică
a hemocromatozei. Pe baza observaţiilor din studii clinice se estimează că 40-70% din persoanele
cu genotip C282Y homozigot vor dezvolta semne clinice ale supraîncărcării cu fier. Nu este disponibil
nici un test care să indice dacă o persoană cu genotip C282Y homozigot va prezenta în viitor semne
şi simptome clinice3;8.
O altă mutaţie în gena HFE are drept consecinţă înlocuirea histidinei cu acidul aspartic în poziţia
63 (H63D). Această mutaţie este asociată cu hemocromatoza ereditară dar efectele sale clinice
sunt încă neclare. Statusul homozigot pentru mutaţia H63D, în absenţa altor factori modificatori,
este insuficient pentru a produce o supraîncărcare cu fier clinic semnificativă. Totuşi, heterozigoţia
compusă pentru C282Y/H63D a fost asociată cu concentraţii hepatice de fier crescute. Aproximativ
1-2% din persoanele cu acest genotip vor dezvolta semne clinice ale supraîncărcării cu fier. Deşi
indivizii cu acest genotip pot prezenta anomalii ale markerilor biochimici este posibil să nu dezvolte
manifestări clinice de hemocromatoză în absenţa altor factori de comorbiditate: steatoză, diabet sau
consum excesiv de etanol. Alela mutantă H63D se întâlneşte la cca. 22% din europeni6;8.
A treia mutaţie se caracterizează prin înlocuirea serinei cu cisteina în poziţia 65 (S65C). La fel ca
mutaţia H63D şi mutaţia S65C ar fi asociată cu o formă uşoară de hemocromatoză. Mutaţia S65C
apare la pacienţi cu tablou clinic de hemocromatoză de 3 ori mai frecvent decât la persoanele dintr-un
grup de control (7.8% faţă de 2.5%). Este interesant faptul că la pacienţii homozigoţi pentru mutaţia
C282Y sau H63D sau heterozigoţi pentru ambele mutaţii, nu s-a putut evidenţia mutaţia S65C, ceea
ce înseamnă că mutaţia S65C ar fi întâlnită doar pe cromozomi care nu poartă nici mutaţia C282Y,
nici H63D.
Cu toate că există indicii privind legătura dintre mutaţia S65C şi o încărcare uşoară/moderată cu fier a
ficatului, relevanţa acestei mutaţii în legătură cu hemocromatoza este încă controversată4;6.
Recomandări pentru analiza mutaţiilor genei HFE
Observaţiile generate de studiile clinice au indicat faptul că analiza mutaţiilor genei HFE contribuie
semnificativ la diagnosticul hemocromatozei ereditare. Depistarea precoce şi iniţierea flebotomiilor
înainte de apariţia cirozei poate reduce morbiditatea şi normaliza speranţa de viaţă.
Testul genetic se indică la pacienţii care prezintă în mod repetat valori ale saturaţiei transferinei > 45%
, chiar în absenţa valorilor crescute ale feritinei.
Screening-ul populaţiei generale nu este recomandat datorită penetranţei scăzute a mutaţiilor HFE. În
216
18
schimb pot beneficia în mod real de testare persoanele cu risc crescut, cum ar fi rudele de gradul I ale
pacienţilor cu hemocromatoză ereditară1;9.
hemolizate6.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) cu detecţie prin electroforeză în gel de agaroză6.
Un rezultat negativ este definit prin absenţa celor 3 mutaţii HFE (C282Y; H63D; S65C).
În cazul unui rezultat pozitiv se va comunica statusul homozigot sau heterozigot pentru mutaţia
respectivă6.
Având în vedere faptul că testul nu detectează toate mutaţiile asociate cu hemocromatoza ereditară
un rezultat negativ nu exclude diagnosticul în prezenţa unei suspiciuni clinice7;8.
Bibliografie
1. Antonello Pietrangelo. Hereditary Hemochromatosis – A New Look at an Old Disease. In The

New England Journal of Medicine, June 3, 2004; 350: 2383-2397.
2. Bergman JP, Kemna EH, Janssen MC, Jacobs EM, Stalenhoef AF, Marx JJ, Swinkels DW.
Hereditary Haemochromatosis: novel genes, novel diseases and hepcidin. In Ned Tijdschr
Geneeskd. 2007 May 19; 151 (20): 1121-7.
3. Hanson EH, Imperatore G, Burke W. HFE Gene and Hereditary Hemochromatosis: a HuGE
Review. Human Genome Epidemiology. In Am J Epidemiol. 2001. Aug 1; 154(3): 193-206.
4. Holmström P, Marmur J, Eggertsen G, Gafvels M, Stal P. Mild overload in patients carrying the
HFE S65C gene mutation: a retrospective study in patients with suspected iron overload and
healthy controls. In Gut. 2002 Nov; 51(5): 723-30.
5. Janssen MC, Swinkels DW. Hereditary Hemochromatosis. In Best Pract Res Clin Gastroenterol,
2009; 23(2): 171-83.
7. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Hereditary
Hemochromatosis, DNA Analysis. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
8. www.mayomedicallaboratories.com. Test Catalog. Hemochromatosis HFE Gene Analysis,
Blood. Ref Type: Internet Communication, 2009.
9. Zlocha J, Kovács L, Poygayová S, Kupcová V, Durinová S. Molecular Genetics Diagnostics and
Screening of Hereditary Hemochromatosis. In Vnitr Lek. 2006. Jun; 52(6): 602-8.
217
18.1.3.5 Pancreatita ereditară (testare genetică PRSS1 şi SPINK1)
Pancreatita ereditară, descrisă prima dată de Comfort şi Steinberg în anul 1952, este o afecţiune ce
se transmite autozomal dominant, cu o penetranţă de 80%. Se caracterizează prin debut precoce cu
episoade recurente de pancreatită acută la copii, tineri şi adulţi, ce progresează spre forma cronică
cu insuficienţă exo- şi endocrină. Boala apare de obicei la mai mult de doi membri ai unei familii sau
la mai multe generaţii ale aceleiaşi familii. De precizat este faptul că în aceste cazuri agentul etiologic
care declanşează episoadele de pancreatită acută nu poate fi identificat. Manifestările clinice ale
formei ereditare a pancreatitei variază de la forme uşoare cu evoluţie favorabilă până la forme severe
cu prognostic grav.
După descrierea corelaţiei între pancreatita ereditară şi o mutaţie la nivelul braţului lung al cromozomului
7, o serie de studii genetice au dus la evidenţierea altor defecte responsabile de inhibarea activităţii
tripsinogenului, reglarea funcţiei pancreatice şi modularea procesului inflamator. Există cel puţin patru
tipuri mutaţii care determină apariţia pancreatitei ereditare:
- mutaţii în gena care codifică tripsinogenul cationic (PRSS1);
- mutaţiile genei care codifică inhibitorul serin-proteazic al tripsinei (SPINK1);
- mutaţii la nivelul genei fibrozei chistice (CFTR);
- polimorfism la nivelul genelor implicate în reglarea răspunsului inflamator (TNF, IL-1,
IL-10).
Sucul pancreatic conţine 3 izoforme ale tripsinogenului ce au fost diferenţiate pe baza mobilităţii lor
electroforetice: tripsinogenul cationic (PRSS1), anionic (PRSS2) şi mesotripsinogen. În mod normal,
tripsinogenul cationic reprezintă aproximativ 66% din totalul tripsinogenului, în timp ce forma anionică
doar o treime. Mesotripsinogenul este o specie minoră, reprezentând mai puţin de 5% din totalul
tripsinogenului sau 0.5% din totalul proteinelor ce intră în alcătuirea sucului pancreatic3.
Tripsinogenul este secretat în celulele acinare pancreatice. Este activat în tripsină la nivelul duodenului
de către enterokinază sau o altă moleculă de tripsină, care scindează tripsinogenul la capătul
N-terminal şi îndepărtează un lanţ peptidic scurt (peptidul de activare a tripsinogenului, TAP). Tripsina
activează apoi o cascadă de precursori enzimatici. Pentru evitarea activării tripsinei în pancreas există
o serie de mecanisme de protecţie4.
Tripsina este alcătuită din 2 domenii proteice globulare conectate printr-un lanţ lateral unic ce este
denumit “bucla” de autoliză, situat opus faţă de situsul activ. Molecula de tripsină conţine de asemenea
un “buzunar“ de legare a calciului localizat în apropierea lanţului lateral; lanţul prezintă un reziduu de
arginină la aminoacidul R122 ce reprezintă ţinta pentru o altă moleculă de tripsină. Astfel, clivajul
enzimatic al lanţului lateral în poziţia R122 de către o a doua moleculă de tripsină produce inactivarea
rapidă a primei molecule de tripsină prin autoliză. Analiza biochimică sprijină ideea că Arg122 este
un aminoacid important pentru autoliză şi mutaţii ale acestui aminoacid conduc la creşterea stabilităţii
tripsinei. ”Bucla” de autoliză este flexibilă, iar R122 ajunge în apropierea “buzunarului“ de legare
a calciului; pe măsură ce concentraţia calciului creşte, acesta pătrunde în “buzunar“ şi limitează
expunerea situsului R122 la atacul enzimatic al unei alte molecule de tripsină. Din acest motiv
calciul deţine un rol important nu numai în secreţia tripsinei ci şi în stabilizarea moleculei, tripsina
218
18
fiind susceptibilă la autoliza rapidă în celulele acinare atunci când concentraţia calciului este scăzută,
dar protejată de autoliză după secreţia activă în ductele pancreatice când concentraţia calciului este
crescută. Pancreatita acută se dezvoltă ca urmare a activării intrapancreatice a tripsinogenului care
la rândul său converteşte toate proenzimele proteolitice în forme active, fapt ce determină în final
autodigestia pancreasului.
În urma descrierii mutaţiei de pe cromozomul 7, multe studii efectuate au arătat faptul că la nivelul
genei care codifică molecula de tripsinogen cationic există de fapt mai multe mutaţii care se pot asocia
cu pancreatita ereditară, cele mai frecvent descrise fiind R122H şi N29I. O altă moleculă modificată
evidenţiată la unele familii cu boală ereditară este inhibitorul serin-proteazic descris de Kazal (serine
protease inhibitor Kazal type1 - SPINK1), cu rol în inhibarea activităţii tripsinice intrapancreatice.
Această enzimă poate inactiva 10-20% din tripsina activă.
Mutaţiile specifice responsabile pentru pancreatita ereditară au fost identificate în 1996, atunci
când s-a confirmat că gena care determină boala se găseşte pe cromozomul 7 (7q35). Whitcomb
şi colaboratorii săi au demonstrat la aceşti pacienţi existenţa unei mutaţii în exonul 3 din gena care
codifică tripsinogenul cationic (PRSS1). Această mutaţie, în care guanina (G) este substituită cu
adenina (A) în codonul 117, determină înlocuirea argininei (CGC) cu histidina (CAF) şi a fost denumită
la început R117H. Mutaţia elimină situsul iniţial de hidroliză ceea ce face ca tripsinogenul/tripsina să
fie rezistente la autoliză şi inactivare permanentă. În acest fel, atunci când tripsinogenul este activat
în tripsină intrapancreatic, în cantităţi care depăşesc capacitatea inhibitorie a inactivatorului SPINK1,
iar tripsina rămâne activă datorită mutaţiei R117H, aceasta din urmă poate activa toate proenzimele,
iniţiind autodigestia pancreatică3.
O a doua mutaţie în gena tripsinogenului cationic - N21I - se caracterizează prin înlocuirea adeninei cu
tiamina (T) în exonul 2, conducând la substituţia asparaginei (ACC) cu izoleucina (ATC). Mecanismul
prin care mutaţia N29I cauzează pancreatită este neclar. Caracterizarea biochimică a mutaţiei
N29I utilizând tripsinogen recombinat nu a evidenţiat nici un efect asupra stabilităţii tripsinei sau
tripsinogenului. S-a sugerat totuşi (pe baza a 4 studii efectuate în două laboratoare independente)
că mutaţia N29I ar creşte autoactivarea tripsinogenului, modificând legarea inhibitorului specific la
tripsină sau prin afectarea inactivării tripsinei, prin modificarea accesibilităţii situsului la hidroliză.
Modificarea conformaţională a moleculei de tripsinogen susţine prima ipoteză.
Aceste două mutaţii (R117H şi N21I) au fost identificate în familiile cu pancreatită ereditară din multe
ţări (Franţa, Germania, Marea Britanie, Japonia şi SUA). De la descoperirea mutaţiilor de la nivelul
genei tripsinogenului cationic, un sistem nou de nomenclatură a mutaţiilor genice umane a fost elaborat
şi acceptat. Astfel s-a schimbat numele mutaţiilor comune, din R117H în R122H şi din N21I în N29I.
Din punct de vedere clinic, pacienţii cu mutaţia R122H au o evoluţie a bolii mai severă şi un debut la
o vârstă mai tânără în comparaţie cu pacienţii ce prezintă mutaţia N29I.
O mutaţie mai puţin frecventă este A16V (substituţia alaninei cu valina în poziţia 16), care a fost
identificată iniţial la trei pacienţi cu pancreatită idiopatică şi un pacient cu pancreatită ereditară.
Mecanismul patogen prin care mutaţia A16V cauzează pancreatită este speculativ şi se referă
la modificarea situsului de clivaj al peptidului semnal (TAP) implicat în procesarea intracelulară a
tripsinogenului4. Mutaţia A16V are penetranţă scăzută şi este înregistrată la pacienţi fără istoric famial
de pancreatită cronică ceea ce sugerează că mutaţiile PRSS1 nu urmează în exclusivitate modelul de
219
transmitere autozomal-dominant3.
Mutaţia N29T, descrisă pentru prima dată de Pfützer et al. în 2002, se asociază cu un fenotip similar
cu cel determinat de mutaţia R122H, caracterizat prin creşterea stabilităţii tripsinei şi autoactivare.
Deoarece autoactivarea crescută a fost asociată cu mutaţiile R122H, N29I şi N29T, iar N29I nu are
nici efect asupra stabilităţii tripsinei, concluzia logică a fost că autoactivarea este mecanismul patogen
comun de declanşare a pancreatitei asociate cu mutaţii PRSS11;4.
Au mai fost descrise şi alte mutaţii PRSS1 a căror semnificaţie rămâne încă neclară: -28 delTCC,
D22G, K23R, P36R, G83E, K92N etc.
În fig.18.1.3.5 se poate observa harta mutaţiilor de la nivelul genei care codifică tripsinogenul cationic
(PRSS1)1.
Fig.18.1.3.5 Harta lineară a mutaţiilor asociate cu pancreatita ereditară în cadrul structurii primare a
tripsinogenului cationic uman; poziţiile aminoacizilor afectaţi sunt marcate cu asterics; sunt indicate
prin săgeţi poziţiile celor mai frecvente mutaţii (R122H şi N29I); este prezentată o parte din secvenţa
TAP împreună cu mutaţiile întâlnite în această regiune; este subliniat motivul tetra-aspartat înalt
conservat din cadrul moleculei TAP
TAP – peptidul de activare a tripsinogenului
(Adaptare după Hereditary chronic pancreatitis. In Orphanet Journal of Rare Diseases, 2:1, 2007)
Frecvenţa reală a mutaţiilor PRSS1 la pacienţii cu pancreatită idiopatică nu poate fi stabilită cu precizie.
O metaanaliză indică o prevalenţă medie de 1.9%, cu variaţii între 0.2 % şi 10%3.
Witt şi colaboratorii au descris pentru prima dată o asociaţie între mutaţia genei ce codifică inhibitorul
serin-proteazic Kazal tip 1 (SPINK1) şi pancreatita cronică. SPINK1 este un inhibitor potent al tripsinei
intrapancreatice. La incubarea unor cantităţi echivalente de tripsină şi SPINK1 se constată formarea
unei legături covalente între reziduurile catalitice de serină ale tripsinei şi gruparea carboxil a lizinei
din situsul reactiv al SPINK1. După incubare prelungită, activitatea tripsinei reapare în timp, lucru ce
se explică prin faptul că SPINK1 este degradată de tripsină. Gena SPINK1 este localizată pe braţul
lung al cromozomului 5: 5q32; are o lungime de ~7.5 Kb şi prezintă 4 exoni1;4.
Mutaţia cea mai frecvent observată la nivelul genei SPINK1 este N34S (o mutaţie missens ce are
la bază substituţia asparaginei cu serina la nivelul codonului 34). Se estimează că 15-40% dintre
pacienţii cu pancreatită idiopatică poartă mutaţia N34S pe una sau ambele alele. N34S se află într-un
dezechilibru de linkaj complet cu alte 4 variante de secvenţe intronice: IVS-37T>C, IVS2+286A>G,
220
18
IVS3-604G>A, IVS-66-65 insTTTT.

Au mai fost identificate şi alte mutaţii SPINK1: o mutaţie homozigotă a promotorului (-215G-A şi 215
G-T), o mutaţie la nivelul codonului start care distruge unicul codon de iniţiere a translaţiei SPINK1
(M1T), precum şi alte mutaţii descrise doar la pacienţi sau familii singulare.
Spre deosebire de mutaţiile PRSS1 care generează un „câştig” funcţional, mutaţiile SPINK1 cauzează
o „pierdere” funcţională ce se reflectă în scăderea inhibiţiei proteazice.
Mutaţia N34S a fost asociată şi cu pancreatita cronică alcoolică, precum şi cu cea tropicală. Astfel,
conform unui studiu, s-a înregistrat o frecvenţă de 5.8% la pacienţii cu pancreatită alcoolică; de
asemenea această mutaţie a fost depistată şi la 20% dintre pacienţii cu cu pancreatită tropicală
calcificată şi la 55% dintre pacienţii diabet pancreatic fibrocalculos3.
Deoarece 1-2% din pacienţii din loturile control din studiile efectuate prezintă mutaţia N34S, aceasta
nu este suficientă pentru a explica patogeneza pancreatitei cronice la purtătorii mutaţiei. În plus, o
analiză funcţională cu inhibitor proteazic recombinant cu mutaţie N34S a arătat o funcţie neschimbată
a inactivatorului precum şi o susceptibilitate nemodificată faţă de tripsină. Aceasta indică faptul că
alte mecanisme decât schimbarea conformaţională a N34S ar putea sta la baza predispoziţiei de a
dezvolta pancreatită cronică la purtători.
Manifestările clinice ale pacienţilor cu pancreatită ereditară se caracterizează prin episoade recurente
de durere abdominală severă, care pot dura de la câteva zile la câteva săptămâni. Nivelurile plasmatice
ale amilazei şi lipazei pot fi crescute pe parcursul episoadelor acute, dar în mod obişnuit sunt normale.
Evoluţia clinică în timpul unui atac acut poate varia de la forma uşoară (forma edematoasă) până la
cea severă, inflamaţie necrotizantă a pancreasului. Din punct de vedere histopatologic pancreasul
prezintă scleroză cu distrugere focală, segmentară sau difuză a parenchimului. Frecvent se pot
observa dilataţii, stricturi sau obstrucţii în sistemul canalicular pancreatic. Iniţial, pancreatita cronică
se caracterizează printr-o etapă de episoade recurente de pancreatită acută (stadiu incipient), apoi
se trece către disfuncţie progresivă pancreatică cu sau fără prezenţa calcificărilor (stadiu avansat).
Aceşti pacienţi pot dezvolta deseori calcificări pancreatice, diabet zaharat şi steatoree şi, în plus, au
un risc ridicat de carcinom pancreatic. Pentru ameliorarea durerii se poate realiza uneori decompresie
ductală. Apariţia unor simptome asemănătoare la rudele pacienţilor cu pancreatită trebuie să ridice
suspiciunea unei boli pancreatice ereditare1;3;4.
De menţionat este faptul că la copii simptomul cardinal este apariţia unei dureri epigastrice bruşte şi
recurente. Spre deosebire de adulţi, durerea prelungită nu este o constantă în manifestările clinice
comune la copii. De asemenea pot apărea greaţă, vărsături şi presiune abdominală. Unii copiii
dezvoltă insuficienţă pancreatică cu steatoree şi diabet zaharat insulinodependent1;3.
Testarea genetică este indicată la pacienţii cu:
- două sau mai multe atacuri separate de pancreatită acută de etiologie neprecizată;
- pancreatită cronică idiopatică;
- istoric familial de pancreatită acută de etiologie neprecizatã la rudele de gradul I sau II;
- pancreatita acută de etiologie neprecizată la copil, care necesită spitalizare1;3.
Diagnosticul de certitudine se stabileşte în cazul pancreatitei ereditare prin secvenţiere genică. Cele
mai multe laboratoare şi-au concentrat testele asupra exonilor 2 şi 3 din gena PRSS1, care au fost
asociate până în prezent fără ambiguitate cu pancreatitele determinate genetic. Cu toate acestea,
221
este posibil ca noi mutaţii să fie identificate în regiunea exonilor 1, 4 şi 5, în regiunea intronică sau
promotorului. De asemenea triplicarea unui segment conţinând gena PRSS1 a fost evidenţiată la
anumiţi pacienţi cu pancreatită cronică1.
sunt solicitate motivele testării, sunt discutate cunoştinţele individuale ale pacientului despre forma
cu debut precoce şi posibilul impact al rezultatelor testelor pozitive sau negative. Cei care doresc
testarea ar trebui să fie consiliaţi cu privire la eventualele probleme pe care le pot întâmpina legate de
sănătate, invaliditate, educaţie, discriminare, interacţiune socială şi familială.
De menţionat este faptul că testele genetice la copii sunt o problemă complexă, deoarece, în funcţie
de vârsta copilului, acesta nu poate fi întotdeauna inclus în procesul de luare a deciziei de testare
genetică. Prin urmare consilierea genetică extinsă este necesară.
Un alt aspect important îl reprezintă faptul că astfel de teste nu sunt utile pentru estimarea vârstei de
debut, severităţii, tipului de simptome sau modalităţii de progresie a bolii.
Deoarece penetranţa mutaţiilor genei PRSS1 este incompletă şi manifestările clinice ale bolii sunt
variabile în majoritatea familiilor, diagnosticul prenatal nu ar trebui încurajat. Chiar şi în studiile recent
publicate cu privire la testarea genetică în pancreatita ereditară autorii au avut rezerve în ceea ce
priveşte diagnosticul prenatal, dar subliniază că acesta nu poate fi refuzat unui pacient care este
informat şi a consimţit. Părinţii care solicită acest test ar trebui informaţi că în majoritatea cazurilor o
evoluţie dureroasă a bolii este autolimitată la câţiva ani.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutaţie PRSS1 este posibil prin analiza
ADN-ul extras din celule fetale obţinute prin amniocenteză, efectuată de obicei la aproximativ 15-18
săptămâni de gestaţie sau biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-12 săptămâni de gestaţie.
Mutaţiile cauzatoare de boală trebuie să fie identificate înainte de testarea prenatală la un membru
afectat al familiei1;3;4.
hemolizate2.
Metodă - secvenţierea tuturor exonilor PRSS1 şi SPINK1 + analiza deleţiilor/duplicaţiilor MLPA2.
Un rezultat negativ este definit prin absenţa mutaţiilor în genele SPINK1 şi PRSS1.
Mutaţiile R122H, N29I şi A16V sunt responsabile de peste 90% din mutaţiile PRSS1. Persoanele
cu un rezultat pozitiv pentru mutaţiile majore trebuie consiliate cu privire la modul de transmitere
autozomal-dominant, penetranţa incompletă, evoluţia clinică variabilă şi strategiile de prevenţie
a episoadelor de pancreatită acută evitând factorii de risc asociaţi: alcool, medicamente, tulburări
metabolice. Pacienţii cu fenotipul de pancreatită ereditară trebuie evaluaţi radiologic şi endoscopic
pentru a identifica şi trata factorii de risc, în special litiaza coledociană şi alţi factori obstructivi, care pot
contribui la declanşarea atacurilor de pancreatită acută. Având în vedere riscul de cancer pancreatic
la pacienţii purtători ai mutaţiilor R122H sau N29I aceştia trebuie să fie consiliaţi să renunţe la fumat.
Diferitele mutaţii SPINK1 pot conduce la modele de transmitere variabile. Deoarece mutaţia M1T
222
18
distruge codonul start şi generează o alelă nulă, aceasta se transmite autozomal-dominant. Pe de

altă parte mutaţia N34S care reduce capacitatea SPINK1 dă naştere unei tare recesive sau complexe.
Astfel, în stare homozigotă această mutaţie poate determina pancreatită, în timp ce la heterozigoţi
poate cauza o reducere subliminală a SPINK1, necesitând factori exogeni sau endogeni pentru a
declanşa manifestările clinice3.
Faptul că testele sunt negative pentru mutaţiile tripsinogenului cationic sau SPINK1 nu exclude
diagnosticul de pancreatită ereditară, fiind cunoscut faptul că 30-40% din pacienţii cu pancreatită
ereditară sunt negativi pentru aceste mutaţii1;3;4.
Bibliografie
1. Jonas Rosendahl, Hans Bödeker, Joachim Mössner, Niels Teich. Hereditary chronic pancreatitis.
In Orphanet Journal of Rare Diseases, 2:1, 2007.
3. Mircea Grigorescu, Mircea Dan Grigorescu. Genetic Factors in Pancreatitis. In Romanian
Journal of Gastroenterology, 2005, 14(1):53 - 61
4. Richard M Charnley, Hereditary pancreatitis. In World J Gastroenterology 9(1):1-4, 2003.
18.1.3.6 Boala Gaucher
Boala Gaucher este o boală monogenică, descrisă pentru prima dată de medicul francez Philippe
Gaucher, în 1882. Se transmite autozomal recesiv şi este cauzată de mutaţii la nivelul unei gene situate
pe cromozomul 1, ce codifică enzima glucocerebrozidaza (β–glucozidaza acidă, glicozilceramidaza).
Enzima localizată la nivelul lizozomilor are rolul de a descompune glicozilceramidele în glucoză şi
ceramide. Deficitul enzimatic conduce la acumularea substratului metabolic nedegradat în lizozomii
celulelor sistemului reticulo-endotelial (macrofage). Aceste celule de dimensiuni mari, cu nucleu
excentric, care prezintă în citoplasmă depozite de glicozilceramidă, au fost denumite celule Gaucher
şi sunt markerul bolii. Deoarece celulele sistemului monocito-macrofagic sunt răspândite în tot
organismul, deficitul de β–glucozidază acidă va avea consecinţe multiple, dând bolii un caracter
multiorganic (celulele Küpfer din ficat şi macrofagele splenice determină hepatosplenomegalie,
osteoclastele cauzează osteoporoză, osteoliză şi necroză avasculară, macrofagele din măduva
hematopoietică duc la apariţia pancitopeniei, macrofagele alveolare induc afectare pulmonară. Deci
boala Gaucher este o afecţiune lizozomală ce se caracterizează prin acumulare de glicozilceramide
(substanţe de natură lipidică) în special în ficat, splină şi măduva osoasă, dar depozitele pot fi găsite
de asemenea în sistemul limfatic, piele, plămâni, ochi, rinichi, inimă şi în sistemul nervos central.
223
Această afecţiune face parte din categoria tezaurismozelor sau bolilor de “depozitare”, fiind cea mai
frecventă dintre acestea1;2;4.
BG are caracter panetnic, statisticile existente menţionând o prevelenţă de 1/50000 – 1/200000
locuitori, excepţie făcând evreii Ashkenazi, la care BG are o incidenţă raportată de 1/500 – 1/1000
nou-născuţi, fiind considerată cea mai frecventă boală genetică. Incidenţa bolii în România este de
1/100000 în populaţia generală.
Gena care codifică sinteza β–glucozidazei acide (GBA) este localizată pe braţul lung al cromozomului
1 (1q.21), unde există o genă activă formată din 11 exoni şi o pseudogenă. Până în prezent la nivelul
genei s-au descris peste 200 mutaţii: mutaţii punctiforme, inserţii, deleţii sau alele complexe şi
recombinante (cu pseudogena). Cele mai frecvente mutaţii observate sunt: două mutaţii punctiforme
(N370S; L444P) şi o mutaţie joncţională (84 GG)2;4.
Glucocerebrozidaza este o glicoproteină lizozomală asociată membranei, responsabilă pentru
hidroliza glicozilceramidelor în glucoză şi ceramide. Este alcătuită din 497 aminoacizi, cu patru
lanţuri oligozaharidice cuplate la reziduurile de asparagină specifice. Conformaţia tridimensională a
proteinei este stabilizată prin formarea a trei punţi disulfurice. Activitatea enzimatică este stimulată
de interacţiunea cu fosfatidilserinele şi saposinul C. Analiza structurală a enzimei indică faptul că
reziduurile de glutamină 235 şi 340 joacă un rol cheie în activarea glicozilceramidazei. Proteina este
sintetizată iniţial sub formă inactivă fiind alcătuită din 536 aminoacizi, ce include o secvenţă semnal
de 39 AA, care este clivată mai târziu, după ce peptidul este direcţionat spre reticulul endoplasmatic.
Mutaţiile genei care codifică glucocerebrozidaza determină apariţia unei proteine trunchiate, modificată
conformaţional, cu activitate enzimatică alterată2.
Mutaţiile BGA au fost numerotate pe baza succesiunii nucleotidelor care codifică glicozilceramidaza
matură, în care secvenţa de nucleotide (GCC), care codifică alanina a fost considerată numărul 1.
Această convenţie este utilizată şi în momentul de faţă, deşi nu este conformă cu standardele actuale
de nomenclatură.
Patru mutaţii (variantele N370S, 84GG, IVS2+1G>A şi L444P) sunt responsabile pentru aproximativ
90% dintre alelele cauzatoare de boală în populaţia evreilor Ashkenazi (tabelul 1). Frecvenţele
genotipurilor asociate cu alela N370S sunt enumerate în tabelul 22.
Tabel 1. Testarea genetică moleculară folosită în boala Gaucher:

Frecventa detectării
Metoda de testare Mutaţiile detectate mutaţiilor prin metodele
de testare
4 mutaţii comune ale GBA: N370S, L444P,
89%*
84GG, IVS2+1G>A
Analiza ţintită a 11 mutaţii ale GBA: N370S, L444P, 84GG,
mutaţiilor IVS2+1G>A ca şi mutaţiile rare: V394L, D409H,
~98%
D409V, R463C, R463H, R496H, deleţia 55-bp
(exonul 9)
Secvenţiere mutaţiile GBA ~99%
224
18
* procentul persoanelor cu mutaţii GBA: N370S, L444P, 84GG, IVS2+1G>A
Mutaţii % persoane afectate

N370S/N370S 29%
N370S/? 20%
N370S/L444P 16%
N370S/84GG 12%
L444P/L444P 6%
L444P/? 3%
N370S/IVS2+1G>A 3%
Tabel 2
Genotip % evreii Ashkenazi % populaţiile de altă origine
N370S/N370S 41% 9%
N370S/L444P 3% 19%
N370S/c84-85insG 23% 0%
N370S/IVS2+1G>A 6% 2%
N370S/V394L 8% 0%
N370S/RecNciI 0% 4%
Frecvenţa alelei N370S este mai mare printre iberici (portughezi: 63%; spanioli: 46%) decât printre
alte populaţii de origine non-evreiască din Europa de Vest, Centrală şi de Est. Pe de altă parte, N370S
şi alelele 84GG nu au fost identificate la japonezii şi chinezii cu boală Gaucher. Apariţia anumitor
alele la japonezi, de exemplu, L444P (frecvenţa alelei 41%) şi F213I (14%) şi chinezi L444P (54%) şi
RecNci (25%) ar putea explica incidenţa mai mare a formei neurologice a bolii în aceste populaţii.
La populaţiile de origine non-evreiască, variantele N370S, 84GG, IVS2+1G>A şi L444P sunt
responsabile de aproximativ 50%-60% dintre alelele cauzatoare de boală. Indivizii de origine non-
evreiască tind să fie heterozigoţi compuşi, prezentând o mutaţie de tip comun şi o mutaţie de tip rar,
sau pot prezenta doar o mutaţie unică.
În România, conform Centrului de Diagnostic al Bolilor Lizozomale Cluj, următoarele genotipuri sunt
frecvente: N370S/N370S; L444P/L444P; N370/recNcil; N370S/? şi L444P/?.
Deleţia 55-bp (exonul 9) se suprapune cu mutaţia N370S. Astfel, indivizii care sunt heterozigoţi
compuşi, prezentând asocierea N370S şi deleţia 55-bp, pot apare drept homozigoţi pentru mutaţia
N370S. În practică, aceşti indivizi sunt recunoscuţi atunci când părinţii sunt testaţi simultan şi alela
N370S este confirmată doar la unul dintre părinţi (cu excepţia cazurilor de paternitate alternativă)2.
Boala se exprimă în stare de homozigot sau heterozigot compus, ceea ce înseamnă că un pacient
are pe cei 2 cromozomi ai perechii 1 aceeaşi mutaţie în primul caz (de exemplu, N370S/N370S), sau
două mutaţii diferite în cel de al doilea caz (de exemplu, N370S/L444P)2.
Boala Gaucher cuprinde o simptomatologie bogată pornind de la forme asimptomatice şi ajungând
până la tulburări perinatale cu posibilă evoluţie letală. Severitatea variază în limite largi, unii pacienţi
225
putând prezenta aproape toate complicaţii bolii în copilărie, în timp ce alţii rămân asimptomatici până
în al optulea deceniu al vieţii1.
Tabloul clinic permite diferenţierea bolii Gaucher în 3 fenotipuri (tipuri) majore (1, 2 şi 3) şi 2 subtipuri
(perinatal letal şi cardiovascular):
- tipul 1 (descris în 1882 de către Gaucher) - cronic nonneuronopatic - cel mai comun
(92%), caracterizat prin prezenţa semnelor clinice sau radiologice de boală osoasă
(osteopenie, focare litice sau leziuni sclerotice şi osteonecroză), hepatosplenomegalie,
anemie şi trombocitopenie, afectare pulmonară şi absenţa simptomatologiei de la
nivelul sistemului nervos central;
- tipul 2 (descris în 1921 de către Kraus şi Rusca) - acut neuronopatic (1%) şi
- tipul 3 (descris în 1959 de către Hillboig) - subacut neuronopatic (7%), caracterizate
prin prezenţa simptomatologiei neurologice primare. În trecut diferenţa dintre aceste
2 tipuri se făcea după vârsta de debut şi rata progresiei bolii, dar aceste modalităţi de
diferenţiere nu sunt absolute. Tipul 2 este considerat a fi afecţiunea care debutează
înaintea vârstei de 2 ani, cu limitarea dezvoltării psihomotorii şi progres rapid soldat
cu moartea copilului până la vârsta de 2-4 ani, în timp ce indivizii cu manifestări
caracteristice tipului 3 au debutul bolii înaintea vârstei de 2 ani şi prezintă o rată de
progresie mai lentă cu supravieţuire până în decadele a 2-a sau chiar a 4-a de viaţă.
- foma perinatală letală este asociată cu ichtioza, colodionul tegumentar sau cu
hidropsul fetal nonimun;
- forma cardiovasculară este caracterizată prin calcificări ale valvelor aortică şi mitrală,
splenomegalie uşoară, opacifiere corneeană şi oftalmoplegie supranucleară.
Complicaţiile cardiopulmonare au fost descrise în cadrul tuturor formelor clinice deşi variază ca
frecvenţă şi severitate1;2;4.
Afectarea primară a Boala
Tipuri/Subtipuri Alte afectări
SNC osoasă
Splenomegalie
Hepatomegalie
Tip 1 Nu Da
Citopenie
Boli pulmonare
Hepatomegalie
Semne bulbare Splenomegalie
Tip2
Semne piramidale Nu Citopenie
(acut sau infantil)
Depreciere cognitivă Boli pulmonare
Modificări dermatologice
Apraxie oculomotorie Hepatomegalie
Tip 3 (subacut; Convulsii Splenomegalie
Da
juvenil) Epilepsie mioclonică Citopenie
progresivă Boli pulmonare
226
18
Foma perinatală Ichtioza, colodionul tegumentar

Semne piramidale Nu
letală hidropsul fetal nonimun
Calcificări ale valvelor aortică şi mitrală
Forma
Apraxie oculomotorie Da Opacifiere corneeană
cardiovasculară
Splenomegalie moderată2
Boala Gaucher - tipul 1

Poate debuta la orice vârstă, dar are o prevalenţă mai mare la persoanele adulte, cu o medie în
jurul vârstei de 20 ani la momentul diagnosticului. Este cea mai frecventă formă de boală şi se
caracterizează prin: hepatosplenomegalie, leziuni osoase şi pulmonare, afectare hematologică. Boala
se poate prezenta uneori şi ca formă asimptomatică, elementele care atrag atenţia fiind astenia, un
retard de creştere sau o întârziere în apariţia pubertăţii.
Leziunile osoase, dovedite atât clinic cât şi radiologic, sunt prezente la 70-100% din persoanele
afectate de boala Gaucher - tipul 1. Afecţiunea osoasă variază de la osteopenie asimptomatică până
la focare litice sau leziuni sclerotice şi osteonecroză. Boala osoasă, ce poate conduce la dureri osoase
acute sau cronice, fracturi patologice şi artrita degenerativă secundară, este de cel mai multe ori
aspectul cel mai debilitant al acestei forme de BG.
Crizele acute de durere osoasă sau episoadele de durere osoasă profundă sunt de obicei limitate la o
articulaţie şi sunt adesea însoţite de febră şi leucocitoză, dar hemoculturile sunt sterile.
Boala osoasă nu se corelează cu gravitatea afectării hematologice sau viscerale.
Deşi persoanele cu BG tipul 1 nu prezintă manifestări neurologice primare, anumite complicaţii
(sindrom de compresie a rădăcinilor nervilor) pot apărea secundar afectării osoase (osteopenie
severă cu compresie vertebrală; embolia determinată de fracturi ale oaselor lungi) sau coagulopatie
(hematomielia).
Splenomegalia este impresionantă, volumul acestui organ putând creşte de la 15-200 cm3 în condiţii
normale până la 1500-3000 cm3. Se asociază cu hipersplenism cu apariţia pancitopeniei (anemie,
leucopenie şi trombocitopenie). Ficatul poate creşte de asemenea în dimensiuni (hepatomegalie)
putând depăşi uneori de 8 ori volumul său normal. Mărirea în dimensiuni a splinei şi ficatului determină
creşterea volumului abdominal, compresia organelor din abdomen şi din torace (prin ascensiunea
diafragmei) şi durere în etajul abdominal superior. Durerea poate fi cronică/recidivantă sau acută, în
acest ultim caz datorându-se infarctelor splenice sau hepatice. Se mai pot asocia saţietate precoce
şi gust amar. Afectarea hepatică poate evolua în timp spre ciroză metabolică, dar acest lucru se
întâmplă doar în 10% din cazuri.
Citopenia este o prezenţă nelipsită din BG netratată, modul de apariţie depinzând de gradul de
afectare a splinei. Anemia, trombocitopenia, leucopenia pot fi prezente simultan sau independent.
Trombocitopenia, cea mai frecventă modificare hematologică (la 75% din pacienţi), cauzată de
hipersplenism, infiltrarea sau infarctul măduvei, determină apariţia hemoragiilor cutanate şi mucoase.
Pacienţii pot prezenta peteşii, echimoze, epistaxis, gingivoragii spontane sau la periaj, menometroragii
şi hemoragii posttraumatice sau apărute în cursul intervenţiilor chirurgicale prelungite sau a sarcinii.
Acestea se opresc doar la administrarea de masă trombocitară. Riscul hemoragiilor poate fi crescut
în prezenţa anomaliilor de coagulare.
227
Anemia poate fi determinată de hipersplenism, hemodiluţie, deficit de fier sau vitamina B12, iar în
stadiile avansate ale bolii apare ca urmare a scăderii eritropoiezei, cauzată de infiltrarea măduvei
osoase cu celule Gaucher sau infarct medular. De obicei este moderată şi se manifestă la aproximativ
50% pacienţi cu paloare, oboseală la efort, tahicardie şi polipnee.
Leucopenia, prezentă la aproximativ 1/3 dintre pacienţi, este rareori severă încât să necesite
intervenţie; poate creşte riscul pentru infecţii recidivante.
Următoarele tipuri de afectare pulmonară pot fi observate:
- boală pulmonară interstiţială;
- consolidare alveolară sau lobară;
- hipertensiune pulmonară, bine documentată la persoanele cu afecţiuni hepatice, este
probabil rezultatul incapacităţii ficatului de a detoxifia factori derivaţi din intestin care
afectează în mod direct endoteliul pulmonar cu apariţia hipertensiunii pulmonare. Cu toate
acestea au fost descrise cazuri de prezenţă a hipertensiunii la persoane cu BG cu funcţie
hepatică normală.
Cu excepţia femeilor cu hipertensiune pulmonară semnificativă, sarcina nu este contraindicată în BG.
Sarcina poate afecta cursul evoluţiei BG atât prin exacerbarea simptomelor preexistente cât şi prin
declanşarea unor simptome noi, cum ar fi durerea osoasă. Femeile cu trombocitopenie severă şi/sau
anomalii de coagulare pot avea un risc crescut de sângerare înainte de naştere.
La unele femei diagnosticul de BG este stabilit pentru prima dată în timpul sarcinii ca urmare a
exacerbării manifestărilor hematologice.
Litiaza biliară apare într-un procent semnificativ la adulţii cu BG (21/66 cazuri).
Complicaţiile cardiace şi renale sunt rare.
Unele studiile epidemiologice au sugerat existenţa unui risc crescut pentru bolnavii cu BG de apariţie
a unor tumori maligne, cum ar fi: mielomul multiplu, carcinomul hepatocelular, limfoamele non-
Hodgkin, melanomul malign şi cancerul pancreatic. Alte studii însă nu au reuşit să găsească asociaţii
semnificative statistic între BG şi aceste forme de cancer.
BG este asociată cu un nivel seric scăzut de adiponectină şi insulină.
La unele persoane cu BG se pot întâlni anumite anomalii ale concentraţiei diverşilor markerilor osoşi
atât în ser (osteocalcina, fosfataza alcalină osoasă, proteina-1 alfa şi beta inhibitoare a macrofagelor)
cât şi în urină (hidroxiprolină urinară, deoxipiridinolină liberă, calciu); cu toate acestea, utilitatea
acestor constatări în practica clinică este necunosută1;2;4.
Este forma cea mai severă, cu debut precoce la 3-6 luni. Se manifestă prin hepatosplenomegalie
însoţită de simptomatologie neurologică precoce şi severă, caracterizată prin semne de afectare a
centrilor bulbari care includ stridor şi dificultăţi la deglutiţie, paralizii de oculomotor cu strabism bilateral
fix, semne piramidale: opistotonus, retroflexie, trismus, spasticitate progresivă şi mişcări coreo-
atetozice. Tardiv în cursul evoluţiei apar convulsii generalizate tonico-clonice şi epilepsie mioclonică
progresivă rezistente la tratamentul specific. În fazele terminale ale bolii neurologice cronice pacienţii
dezvoltă demenţă şi ataxie. Prognosticul este prost, moartea survenind frecvent înaintea vârstei de
2 ani.
228
18
Majoritatea pacienţilor cu această formă de boală prezintă semne şi simptome moderate de afectare
multiorganică, însoţite de oftalmoplegie ca simptom unic neurologic.
Formele severe de boală se asociază cu oftalmoplegie orizontală supranucleară, epilepsie mioclonică
progresivă, ataxie cerebeloasă, spasticitate şi demenţă2.
Forma perinatală letală este asociată cu hepatosplenomegalie, pancitopenie şi modificări
microscopice ale pielii (anomalii în stratul cornos atribuite raportului glucosilceramide/ceramide
modificat) şi pot prezenta clinic ichtioză, colodionul tegumentar sau hidrops fetal nonimun. Artrogrifoza
şi modificările faciale specifice pot fi observate la 35-43% din cazuri. Moartea survine in utero sau
precoce după naştere.
O altă variantă rară şi severă a BG se caracterizează prin hidrocefalie, opacităţi corneene, deformări
ale degetelor de la picioare, reflux gastroesofagian şi îngroşări fibroase ale capsulelor splenice şi
hepatice1;2;4.
Forma cardiovasculară - persoanele cu forma homozigotă a alelei D409H prezintă un fenotip
dominant de boli cardiovasculare cu calcificarea valvelor aortică şi mitrală. De asemenea aceşti
pacienţi mai prezintă uşoară splenomegalie, opacităţi corneene şi oftalmoplegie supranucleară2.
Diagnosticul bolii Gaucher se bazează iniţial pe simptomatologie dar necesită confirmare prin teste
microscopice, enzimatice şi moleculare. Testele microscopice evidenţiază celulele Gaucher în măduva
osoasă; testele enzimatice arată deficitul glucocerebrozidazei. Analiza moleculară a ADN-ului va arăta
defectele structurale genice. Diagnosticul poate fi efectuat şi prenatal prin amniocenteză.
Deoarece boala Gaucher se transmite autozomal recesiv, în momentul concepţiei un frate ale
persoanei afectate are 25% şanse să fie purtător şi să prezinte afecţiunea, 50% şanse să fie purtător
asimptomatic şi 25% şanse să fie nepurtator şi să nu fie afectat.
Testul de confirmare al bolii îl reprezintă măsurarea activităţii enzimatice a glucocerebrozidazei în
leucocite sau alte celule nucleate. Deoarece diagnosticul BG poate fi confirmat prin testare biochimică
pe leucocitele din sângele periferic, nu este necesară examinarea în paralel a măduvei osoase.
Testele genetice prin care se identifică alelele patogene furnizează informaţii adiţionale pentru
confirmarea diagnosticului, dar nu se vor folosi în locul testării biochimice.
Testul de genetică moleculară la o persoană la care afecţiunea a fost confirmată prin metode biochimice
este efectuat doar în scop de consiliere genetică şi pentru a identifica mutaţiile cauzatoare de boală
care să permită depistarea purtătorilor printre rudele cu risc crescut2.
Testarea prenatală a gravidelor cu risc genetic se face folosind măsurarea activităţii glucocerebrozidazei
şi testarea genetică moleculară atunci când există 2 mutaţii genetice patogene la nivel familial. Aceste
teste se efectueză pe celule fetale obţinute prin biopsia vilozităţilor coriale prelevate la aproximativ 10-
12 săptămâni de gestaţie sau prin amniocenteză, de obicei la circa 15-18 săptămâni de gestaţie.
Cu excepţia cazurilor în care un membru al familiei a fost afectat de BG forma neurologică (tipurile 2
sau 3), nu este posibilă identificarea gravităţii fenotipului în cazul unei sarcini cu risc. Persoanele cu
BG cu manifestări neurologice acute (tipul 2) tind să aibă o evoluţie similară al bolii. Cu toate acestea
trebuie remarcat faptul că persoanele cu BG şi implicare neurologică cronică (tipul 3) pot prezenta rate
variabile de progresie a bolii, chiar şi atunci când sunt membri ai aceleiaşi familii1;2;4.
229

hemolizate3.
Metodă – secvenţiere completă a genei GBA3.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate în gena BGA şi genotipul respectiv3.
Bibliografie
1. Ellen Sidransky. Gaucher Disease. www.emedicine.medscape.com, Ref Type: Internet
Communication.
2. Gregory M Pastores, Derralynn A Hughes. Gaucher Disease. Gene Reviews, 2008
4. Paula Grigorescu-Sido, Boala Gaucher, www.boalagaucher.ro.
18.1.3.7 Diagnosticul genetic al diabetului zaharat MODY
O subgrupă a diabetului zaharat este „maturity-onset diabetes of the young” (MODY), cu debut juvenil
şi transmitere autozomal-dominantă. Mutaţiile a şase gene diferite dau naştere la tablouri clinice
diferite. Dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetică a făcut posibilă identificarea genelor responsabile,
mai uşor decât în cazul diabetului de tip 1 sau de tip 2, unde componenta etiologică ereditară este
poligenică şi implică de asemenea şi factori de mediu. Cazurile MODY pot reprezenta până la 5% din
cazurile interpretate clinic ca diabet zaharat tip 1 sau 2. Penetranţa defectului este ridicată la aproape
toate formele: 80-95% dintre heterozigoţi vor dezvolta în decursul vieţii un diabet zaharat şi de obicei
sunt afectate mai multe generaţii ale unei familii. Copilul cu un părinte cu MODY are un risc de 50%
de a fi purtător al mutaţiei.
În timp ce ţinta terapeutică este aceeaşi, indiferent de tip, în cazul diabetului MODY este posibil ca
administrarea de insulină să nu fie necesară.
Genele implicate sunt exprimate în celulele beta pancreatice şi mutaţiile lor duc la tulburări ale secreţiei
de insulină. Cinci gene codifică factorul de transcripţie ”hepatic nuclear factor” (HNF) - alfa 1 (MODY
3), HNF - beta 1 (MODY 5), HNF - alfa 4 (MODY 1), „insulin promoter factor-1” (IPF-1) (MODY 4),
NeuroD/beta 2 (MODY 6) şi o genă codifică enzima glucokinază, senzorul intracelular pancreatic
pentru glucoză (MODY 2).
230
18
Cele mai frecvente tipuri de MODY sunt MODY 3 (69%) şi MODY 2 (14%).
În cazurile de MODY 3 s-au depistat multiple mutaţii cu diferite localizări în gena HNF-alfa 1. Gena
HNF-alfa 1 este exprimată şi la nivel renal şi prezintă importanţă pentru schimbul de anioni. Pacienţii
cu MODY 3 prezintă o reabsorbţie redusă a glucozei la nivel renal, de unde rezultă un „prag renal”
redus şi glicozurie ridicată.
Studiile au arătat că o parte a pacientelor cu diabet gestaţional sunt purtătoare de mutaţii ale HNF-alfa
1.
MODY 2 se manifestă în copilărie sau la vârsta adultă, de exemplu în timpul sarcinii şi este cauzat de
mutaţia genei glucokinazei. În celulele beta pancreatice glucokinaza catalizează fosforilarea glucozei
în glucozo-6-fosfat. La nivel hepatic joacă rol în depozitarea glicogenului în faza postprandială. Au
fost descrise 130 mutaţii diferite, care influenţează activitatea enzimei în mod diferit. Fiziopatologic se
constată o depozitare redusă a glicogenului, o gluconeogeneză crescută în ficat şi o sensibilitate redusă
a celulelor beta faţă de glucoză. Din punct de vedere clinic este vorba de obicei de o hiperglicemie
uşoară. Deoarece mutaţia duce la o sensibilitate redusă faţă de glucoză, epuizarea celulelor beta
pe termen lung este puţin probabilă şi nu s-a observat o reducere severă a secreţiei de insulină. La
majoritatea pacienţilor este suficientă dieta, fără tratament medicamentos, iar complicaţiile bolii sunt
rare. Condiţia foarte rară de homozigot pentru mutaţia genei glucokinazei manifestă pe lângă un retard
în creştere un deficit mare de insulină şi se manifestă din primele zile de viaţa. Este indicată terapia cu
insulină. Confirmarea diagnosticului de diabet MODY necesita testare genetică specifică1;2;3;4.
Recomandări pentru determinarea genetică a diabetului MODY 2 şi 3 – diagnosticul diferenţial cu
diabetul de tip 1 şi de tip 2.
Următoarele caracteristici sugerează posibilitatea existenţei unui diabet MODY:
- diabet cu debut juvenil (sub vârsta de 25 ani), noninsulinodependent;
- transmitere autozomal-dominantă: criteriul minim este prezenţa diabetului la cel puţin două generaţii,
deşi de obicei sunt mai multe generaţii afectate;
- absenţa anticorpilor specifici şi absenţa altor patologii autoimune;
- absenţa obezităţii (deşi nu este criteriu de excludere) sau a sindromului metabolic;
- diabet neonatal sau un aparent diabet tip 1 cu debut înaintea vârstei de 6 luni1;2;3;4.
Pregătire pacient - nu necesită pregătire specială2.
Metodă – secvenţiere completă a celor 6 gene + analiza deleţiilor/duplicaţiilor (MLPA)2.
Esenţial în identificarea unei forme MODY este faptul că diagnosticul permite efectuarea unei scheme
terapeutice precise; acest lucru este important pentru că pacienţii cu MODY 2 şi 3 nu trebuie neapărat
trataţi cu insulină. MODY 2 poate fi de obicei controlat prin dietă, iar pacienţii cu MODY 3 au o mare
sensibilitate faţă de antidiabetice orale2.
231
Cele şase subtipuri identificate până în prezent acoperă aproximativ 90% din cazurile depistate pe
criterii clinice, sugerând că există încă forme şi cauze neidentificate1;2;4.
Bibliografie
1. Hans-Cristoph Fehmann, Mathias Strowski-Diabetes mellitus mit monogen determinierter

Storung der Beta-Zell Function: Maturity-onset Diabetes of the Young. In Aerzteblatt. de
2004;101(13).
3. Mukhtar I. Khan, Ruth S. Weinstock. Carbohydrates. In Henry’s clinical diagnosis and
management by laboratory methods, Ed., 2007, 185-191.
4. Stefan S.Fajans, Graeme I.Bell,Kenneth Polansky. Molecular mechanisms and clinical
pathophisiology of Maturity-onset diabetes of the Young, in The New England Journal of
Medicine,2001/13,vol.345:971-980.
18.1.3.8 Galactozemia
Galactozemia este o boală cu transmitere autosomal recesivă, caracterizată prin perturbarea
metabolismului galactozei cu apariţia unor complicaţii ce pot pune viaţa nou-născutului în pericol5.
Galactoza este o componentă a lactozei, glicolipidelor, glicoproteinelor şi proteoglicanilor; metabolizarea
acesteia realizându-se cu precădere la nivelul ficatului şi rinichiului. Conversia galactozei la glucoză
implică următoarele etape (vezi figura 18.1.3.8.1):
1. fosforilarea galactozei cu formarea galactozo-1-fosfatului, reacţie ce se realizează cu
ajutorul galactokinazei;
2. transferul restului galactozil pe UDP-glucoză sub acţiunea UDP-glucozo-galactozo-1-
fosfat-uridil-transferaza (GALT);
3. interconversia între glucoză şi galactoză are loc la nivelul nucleozid-difosfaţilor,
presupune inversarea configuraţiei stereochimice a grupării 4’ hidroxil şi este catalizată
de UDP-glucozo-4-epimeraza; această etapă contribuie la regenerarea UDP-glucozei
şi astfel asigură continuitatea ciclului de metabolizare a galactozei.
Glucozo-1-fosfatul generat poate fi izomerizat în glucozo-6-fosfat care deţine un rol important în
procesul de glicoliză şi în biosinteza inozitolului.
Galactoza poate fi transformată în galactitol sub acţiunea aldoz-reductazei, în prezenţa NADPH
(sau NADH), aceasta reprezentând o cale alternativă de metabolizare a galactozei la pacienţii cu
galactozemie. De asemenea poate fi oxidată sub acţiunea galactozo-dehidrogenazei, conducând la
formarea acidului galactonic şi CO21.
232
18
Fig. 18.1.3.8.1 Metabolismul galactozei (calea Leloir)
Hipergalactozemia este asociată cu 3 deficienţe enzimatice:

- tipul I (GALT) – modificarea activităţii enzimatice a galactozo-1-fosfat-uridil-transferazei
(GALT), ce este responsabilă pentru galactozemia ereditară şi este cel mai comun
deficit enzimatic;
- tipul II (GALK1) – modificarea activităţii enzimatice a galactokinazei, ce converteşte
galactoza la galactozo-1-fosfat; este o deficienţă rară;
- tipul III (GALE) – modificarea activităţii enzimatice a uridin-difosfat-glucozo-4-
epimerazei, care epimerizează UDP galactoza la UDP glucoză şi este, de asemenea,
puţin frecventă3.
Tipul Gena Locus Enzima Nume

galactozo-1-fosfat-uridil-
1 GALT 9p13 Galactozemia clasică
transferaza
2 GALK1 17q24 galactokinaza Deficienţa de galactokinază
1p36- Deficienţa de UDP-galactozo-4-
3 GALE UDP-galactozo-4-epimeraza
p35 epimerază
Forma clasică (tipul I) a bolii şi de altfel şi cea mai severă este determinată de mutaţii ale genei
care codifică enzima galactozo-1-fosfat-uridil-transferaza (GALT). Este cea mai frecventă (1/48000
nou-născuţi) afecţiune monogenică care interesează metabolismul carbohidraţilor. Homozigoţii pentru
alela galactozemiei clasice (genotip G/G) au o activitate enzimatică scăzută sub 5%, ceea ce împiedică
conversia eficientă a galactozei în glucoză. Deficienţa GALT duce la acumulare de galactozo-1-fosfat
233
şi galactoză în ţesuturi, în special ficat, creier sau rinichi. Se crede că afectarea hepatică (ciroza) şi
retardul mental induse de galactozemia clasică depind de cantitatea de galactozo-1-fosfat depusă în
aceste ţesuturi. Galactoza este convertită la galactitol în celule şi produce efecte osmotice, cum ar fi
edemaţierea fibrelor cristalinului ce poate conduce la cataractă şi a neuronilor, care poate determina
pseudotumor cerebri. Ca şi în forma asociată cu deficienţa galactokinazei, cataracta se dezvoltă
secundar acumulării de galactitol la nivelul cristalinului. La femeile homozigote riscul de a dezvolta
hipogonadism hipergonadotrop cu apariţia insuficienţei ovariene este crescut şi se manifestă la o
vârstă fragedă chiar dacă tratamentul dietetic este instituit prompt. Cu toate acestea, femeile afectate
pot avea copii.
Heterozigoţii (genotip G/N, N fiind alela normală) sunt asimptomatici, prezentând o scădere la jumătate
a activităţii enzimei faţă de persoanele ce nu prezintă mutaţii3;5.
Gena ce codifică enzima GALT este situată pe braţul scurt al cromozomului 9 şi este compusă din 11
exoni (vezi figura 18.1.3.8.2). Au fost identificate peste 180 mutaţiii ale genei; un număr de 8 mutaţii
cauzatoare de boală (G) sunt întâlnite în mod obişnuit la pacienţii cu galactozemie clasică. Cea
mai frecventă este mutaţia punctiformă la nivelul exonului 6 care determină substituţia glutaminei
cu arginina (Q188R; p.Gln188Arg) şi care este responsabilă de 60-70% din cazurile de boală la
caucazieni. Mutaţia S135L (p.Ser135Leu) care determină substituţia serinei cu leucina este cel
mai frecvent întâlnită la populaţia de rasă neagră fiind asociată cu peste 50% din cazurile de boală la
această categorie de persoane. Mutaţia K285N (p.Lys285Asn) care determină substituţia lizinei cu
asparagina în exonul 9 ocupă locul doi ca frecvenţă în cadrul alelelor asociate cu boala la caucazieni
(28%). Mutaţia L195P (p.Leu195Pro) care înlocuieşte leucina cu prolina este înregistrată în 5-7% din
cazurile de galactozemie clasică6;7.
Fig. 18.1.3.8.2 Localizarea genei GALT pe cromozomul 9

(www.wiki.medpedia.com/Galactoso-1-phosphate uridylyltransferase)
În plus faţă de forma clasică, există varianta Duarte a galactozemiei - o condiţie asimptomatică sau
însoţită de manifestări clinice uşoare – ce rezultă ca urmare a afectării parţiale a enzimei GALT.
Această variantă se caracterizează printr-o heterozigoţie compusă pentru o alelă clasică G ce
determină scăderea marcată GALT şi o alelă Duarte D-2 (D2; uneori denumită D) ce induce o afectare
GALT parţială. Hemolizatele provenite de la pacienţi cu galactozemie GALT demonstrează în medie
234
18
o activitate enzimatică de ~ 25%, deşi sunt descrise variaţii individuale mari. La electroforeza cu
focalizare izoelectrică se obţine un aspect caracteristic de mobilitate alterată a izoenzimei GALT.
Studiile anterioare au indicat faptul că alelele D sunt purtătoare ale unei mutaţii missens p.N314D
(c.940A>G) ce determină înlocuirea în poziţia 314 a asparaginei cu acidul aspartic. Fenotipurile Duarte
(D/N, D/D şi D/G) prezintă aproximativ 75, 50 şi respectiv 25% din activitatea normală a GALT şi apar
cu o prevalenţă de aproximativ 6% în populaţia albă. Substituţia N314D este complet responsabilă de
alterarea mobilităţii enzimatice însă nu explică afectarea parţială a activităţii GALT. Mai mult, această
mutaţie se regăseşte şi pe alelele Duarte-1 (D1, denumite de asemenea Los Angeles sau LA) care
asociază o activitate enzimatică normală sau crescută, fiind considerată din acest motiv o variantă
comună sau un polimorfism al genei GALT. Studii ulterioare ale alelelor D1 şi D2 au arătat că N314D
se găseşte într-un dezechilibru de linkaj cu alte variante de secvenţe nucleotidice, iar acestea diferă
între D1 şi D2.
Astfel, alelele D1 prezintă în mod specific o schimbare de nucleotide c.652C>T ce determină o
substituţie silenţioasă la nivelul codonului 218 (CTA →TTA, p.L218, denumită uneori şi L218L), în timp
ce alelele D2 prezintă o deleţie 5’ de 4 bp a promotorului (c.-119_-116delGTCA) alături de 3 modificări
de baze intronice. Ambele alele D1 şi D2 poartă de asemenea o secvenţă extinsă de nucleotide A
la nivelul intronului 10. Diferenţa între cele 2 alele în ceea ce priveşte activitatea enzimatică GALT
a rămas pentru mult timp un subiect de controversă. Un studiu recent indică existenţa unei expresii
reduse a ARNm la nivelul alelei D2 care contribuie la compromiterea funcţiei GALT; mai mult, deleţia
5’ de 4 bp a promotorului ar reprezenta o mutaţie cauzală în galactozemia Duarte2.
Deficienţa galactokinazei (tipul II) poate fi suspectată la persoanele care au cataractă, galactozemie şi
creşterea excreţiei urinare a galactitolului, dar nu prezintă alte manifestări clinice.
Prevalenţa deficitului de GALK este necunoscută, dar este probabil mai mică 1:100000. Detectarea
unui nivel redus de activitate al galactozokinazei este un element important pentru stabilirea
diagnosticului, dar confirmarea se face prin evidenţierea mutaţiilor genei care codifică enzima.
Poate fi limitată doar la nivelul eritrocitelor şi leucocitelor şi se asociază cu dezvoltarea cataractei, dar
nu determină retard în creştere, retard mintal sau afectare hepatică.
Administrarea de lactoză la femeile însărcinate cu deficit de galactokinază poate determina apariţia
cataractei fetale5.
Deficitul de UDP-galactozo-4-epimerază (GALE) (tipul III) trebuie suspectat la persoanele care
prezintă afecţiuni hepatice, surditate neurosenzorială asociate cu valori crescute ale galactozo-1-
fosfatului eritrocitar şi niveluri normale ale GALT. Diagnosticul se stabileşte pe baza detectării unui
nivel scăzut de activitate al UDP-galactozo-4-epimerazei şi se confirmă prin evidenţierea mutaţiilor
genei care codifică enzima. Deficienţa UDP-galactozo-4-epimerazei are o prevalenţă estimată de
1:23000 în Japonia şi este necunoscută în alte populaţii3;5.
Manifestările clinice ale galactozemiei clasice apar la sugar, la câteva zile sau săptămâni de la
naştere şi sunt determinate de ingestia laptelui matern sau a diverselor formule de lapte ce conţin
lactoză. Acestea constau în incapacitate de înghiţire şi vomă, lipsa creşterii, leziuni hepatocelulare
(hepatomegalie cu insuficienţă hepatică), icter, hipoglicemie, hiperamoniemie, sângerare şi sepsis.
Retardul mental devine evident după 6-12 luni şi este, de cele mai multe ori ireversibil. Nou-născuţii
cu formă clasică de galactozemie sunt susceptibili la infecţii bacteriene generalizate (în special cu
235
Escherichia coli) care pot cauza şoc şi moarte în perioada neonatală. Dacă însă este instituită precoce
o dietă fără lactoză simptomele se remit rapid şi complicaţiile (insuficienţa hepatică, sepsisul, decesul
neonatal) pot fi prevenite. Cataracta nu apare în mod obişnuit la naştere, dar se dezvoltă treptat, fiind
vizibilă în termen de căteva săptămâni sau luni. În ciuda tratamentului adecvat, copii cu galactozemie
prezintă pe termen lung un risc crescut de dezvoltare a retardului de creştere şi mental, a problemelor
de vorbire (dispraxie verbală), cirozei hepatice macronodulare şi insuficienţei ovariane la femei.
Prognosticul este în general rezervat şi variabil la pacienţi diferiţi3;5;6.
Galactozemia este o afecţiune care poate fi depistată prin screening neonatal. Clinitestul este cel
mai simplu test screening şi se bazează pe determinarea galactozei într-o probă de urină. Acesta
se efectuează după 24-36 ore de la administrarea unui preparat ce conţine lactoză. În unele ţări se
foloseşte testul dintr-o picătură de sânge recoltată pe hârtie de filtru standardizată (card Guthrie)
prin care se determină galactoza totală (galactoza şi galactozo-1-fosfat) şi/sau activitatea enzimei
GALT. La copiii cu risc crescut se poate determina galactozo-1-fosfat din sângele recoltat din cordonul
ombilical. Un test de screening ideal este acela care măsoară activitatea GALT3;5.
Testarea genetică în vederea depistării mutaţiilor GALT este utilizată pentru confirmarea diagnosticului
de galactozemie la copiii cu screening neonatal pozitiv. De asemenea este utilă pentru diferenţierea
alelelor Duarte D2 de cele LA.
Astfel, testarea genetică defineşte genotipul şi permite stabilirea prognosticului.
Testarea rudelor apropiate pentru depistarea statusului de purtător asimptomatic se poate efectua în
urma sfatului genetic şi numai după identificarea mutaţiilor cauzatoare de boală în familie. Întrucât
galactozemia este transmisă autozomal recesiv părinţii unui copil cu galactozemie clasică sunt
obligatoriu heterozigoţi pentru o alelă mutantă G, iar fraţii asimptomatici ai acestuia au un risc de 2/3
de a fi purtători de alelă G. De asemenea fraţii părinţilor au un risc de 50% de a fi purtători.
Fraţii unui copil cu galactozemie Duarte au în momentul concepţiei un risc de de 25% de galactozemie
D/G dacă părinţii au genotipurile D/N şi G/N şi un risc de 25% de galactozemie clasică G/G dacă
părinţii prezintă genotipurile D/G şi G/N; din acest motiv este justificată testarea genetică a părinţilor.
Diagnosticul prenatal pentru fetuşii care prezintă un risc de 25% de galactozemie clasică (G/G) este
posibil prin analiza ADN-ul extras din celule fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei efectuată
la aproximativ 15-18 săptămâni de gestaţie sau biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-12
săptămâni de gestaţie. Şi în aceste cazuri trebuie identificate în prealabil alele G din familie5.
hemolizate4.
Metodă – secvenţiere completă a genei GALT + analiza deleţiilor/duplicaţiilor (MLPA); pot fi astfel
depistate atât mutaţiile asociate cu galactozemia clasică cât şi variantele Duarte1.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate în gena GALT şi genotipul respectiv4.
236
18
Bibliografie
1. David L. Nelson, Michael M. Cox. Glycolysis, Gluconeogenesis, and the Pentose Phosphate
Pathway. In Lehninger Principles of Biochemistry, fifth edition, 2008, W. H. Freeman and
Company, 545-546.
2. Amanda E. Carney, Rebecca D. Sanders, Kerry R. Garza, Lee Ann McGaha, Lora J. H. Bean,
Bradford W. Coffee, James W. Thomas, David J. Cutler, Natalie L. Kurtkaya, Judith L. Fridovich-
Keil. Origins, distribution and expression of the Duarte-2 (D2) allele of galactose-1-phosphate
uridylyltransferase. In Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, No.9, 1624-1632.
3. Gerard T Berry, George A Anadiotis, Galactose-1-Phosphate Uridyltransferase Deficiency
(Galactosemia) www.emedicine.medscape.com, Ref Type: Internet Communication.
5. Louis J Elsas II. Galactosemia. Gene Reviews, 2000, www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type:
Organizations. Galactosemia Gene Analysis, Known Mutation. www.mayomedicallaboratories.
com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
7. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). Galactose-1-Phosphate Urydylyltransferase.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
8. Valeriu Popescu, Alis Antrasian, Andrei Zamfirescu. Screeningul neonatal în bolile genetice de
metabolism. În Revista Română de Pediatrie, volum LVIII, nr.4, 2009.
18.1.3.9 Gena colagen 1A1 (mutaţia G2046T)

Scheletul osos suferă constant un proces de remodelare care este esenţial pentru echilibrul osului.
Procesul de remodelare începe cu resorbţia osoasă a osului vechi realizată de osteoclaste care este
urmată de formarea de os nou de către osteoblaste. Masa osoasă atinge un maximum după încetarea
creşterii şi pubertate. După 35 ani masa osoasă scade continuu cu 0.5% pe an la ambele sexe,
deoarece resorbţia osoasă începe să depăşească formarea osoasă, fenomen care devine evident la
femei după menopauză.
Osteoporoza se dezvoltă atunci când resorbţia osoasă apare prea rapid sau când formarea osoasă
este prea lentă. Osteoporoza este cea mai comună afecţiune metabolică osoasă şi este caracterizată
prin scăderea matricei osoase organice şi modificări ale microarhitecturii ţesutului osos. Consecinţele
sunt deformări ale scheletului şi risc crescut de fracturi. 80% din cazurile de osteoporoză apar la femei
după menopauză şi 30% dintre acestea dezvoltă manifestări clinice. După vârsta de 70 ani apare
osteoporoza senilă, femeile şi bărbaţii fiind afectaţi în proporţie de 1:24.
Procesele de formare şi resorbţie osoasă se găsesc atât sub controlul factorilor genetici, cât şi ai
237
celor de mediu (fumat, alcool, consum excesiv de cafea, medicamente)1. Predispoziţia genetică
influenţează apariţia şi severitatea osteoporozei. Deoarece în prezent nu există un tratament curativ al
osteoporozei, ci în cel mai bun caz o stabilizare medicamentoasă, depistarea precoce a predispoziţiei
are mare importanţă clinică. Aceasta permite evitarea altor factori de risc şi intervenţia profilactică de
scădere a riscului individual de osteoporoză2.
Au fost detectate variaţii ale genelor implicate în metabolismul osos (polimorfisme genetice) asociate
cu o densitate minerală osoasă scăzută şi risc crescut de fracturi.
Colagenul de tip 1, componenta proteică majoră a matricei osoase, prezintă două subunităţi alfa1
şi 2 codificate de genele COL1A1 (colagen tip 1, alfa 1) şi COL1A2 (colagen tip 1, alfa 2) localizate
pe braţul lung al cromozomului 17 şi, respectiv, al cromozomului 7. Mutaţiile apărute în regiunea de
codificare a acestor gene care conduc la sinteza unui lanţ alfa al colagenului anormal determină o
afecţiune genetică rară, denumită osteogenesis imperfecta, caracterizată prin „oase de sticlă”, statură
scurtă si fracturi frecvente în perioada copilăriei4.
Gena COL1A1 prezintă în afara regiunii de codificare a colagenului un număr de situsuri polimorfice
şi cercetătorii au examinat asocierea între aceste alele şi osteoporoză. Unul din polimorfismele
studiate este situat în regiunea reglatoare a genei COL1A1, la nivelul situsului de legare a factorului
de transcripţie Sp1. Înlocuirea guaninei G (alela S) cu timina T (alela s) în poziţia 2046 conduce la
o scădere a transcripţiei şi implicit a sintezei de proteine. Alela s este asociată cu densitate minerală
osoasă scăzută şi risc crescut de fracturi. Polimorfismul G→T a fost descris în 1996 de către Grant
şi colaboratorii; în urma studiului efectuat s-a constatat că genotipurile nefavorabile Ss şi ss au fost
mai frecvente la pacienţii cu osteoporoză severă şi fracturi vertebrale (50%) decât la lotul de control,
ceea ce corespunde unui risc relativ de 2.97 pentru fracturi vertebrale la persoanele purtătoare ale
alelelor s3;4.
Un studiu multicentric recent care a inclus 20786 persoane a demonstrat că polimorfismul G→T
COL1A1 este asociat cu densitate minerală osoasă scăzută şi poate predispune femeile la fracturi
incidentale vertebrale independent de valoarea densităţii minerale osoase. Cu toate acestea asocierea
constatată este modestă, ceea ce demonstrează importanţa efectuării de studii mai detaliate
capabile să cuantifice efectul unor variante genetice comune asupra unor boli complexe, cum este
osteoporoza4.
Pregătire pacient - nu este necesară o pregătire specială2.
hemolizate2.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) şi hibridizare2.
Se va comunica genotipul obţinut în urma analizei polimorfismului G/T în poziţia 2046 a genei COL1A1.
Sunt posibile astfel 3 genotipuri: SS, Ss şi ss.
Frecvenţa genotipului heterozigot S/s în populaţie este de ~35%, iar a cea a genotipului s/s de
~ 3%2.
238
18
Bibliografie
1. Denisa Predeţeanu. Osteoporoza. În Esenţialul în reumatologie, ed. a 2-a revizuita. Editura

Medicală Amalteea, Ed.2, 2007, 501-504.
3. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). Osteoporosis. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Reference Type: Internet Communication.
4. Stuart H. Ralston. Large-scale Evidence for the Effect of the COL1A1Sp1Polymorphism on
Osteoporosis outcomes:The GENOMOS study. In PLoS Med. 2006 April; 3(4): e90.
18.1.3.10 Gena receptorului vitaminei D (polimorfism B/b; Fok1)
Informaţii generale şi recomandări pentru determinarea genei VDR

Receptorul pentru vitamina D (VDR) este o proteină implicată în homeostazia calciului şi de asemenea
în turnover-ul osos; este localizat intracelular, leagă în mod specific 1,25 (OH)2 vitamina D3 (calcitriol)
şi mediază efectele acesteia. Este asemănător din punct de vedere structural cu receptorii hormonilor
tiroidieni.
Gena care codifică VDR este localizată pe braţul lung al cromozomului 12, conţine 11 exoni şi are o
lungime de 75 kb; primul exon nu este transcris, exonii 2 şi 3 sunt implicaţi în legarea ADN-ului, iar
exonii 7,8 şi 9 în legarea vitaminei D.
Studiile referitoare la rolul polimorfismelor genei VDR în stabilirea densităţii minerale osoase (BMD)
au dat rezultate contradictorii. Astfel, în 1992 Morrison a prezentat dovezi potrivit cărora nivelul
osteocalcinului din sânge (principala proteină non-colagenică a osului, a cărei sinteză este indusă
de calcitriol) ar fi influenţat de polimorfismul VDR. Acelaşi autor a descris 3 polimorfisme în regiunea
genei VDR situate între exonii 8 şi 9 care sunt recunoscute utilizând enzimele de restricţie Bsml, Apal
şi Taql. În urma unui studiu, Morrison şi colaboratorii săi au raportat în 1994 o strânsă asociaţie între
polimorfismul VDR identificat cu endonucleaza de restricţie BmsI şi BMD măsurată la nivelul capului
femural şi coloanei lombare. Absenţa situsului de acţiune al enzimei identifică alelele B, iar prezenţa
acestui situs alelele b. Conform autorilor, genotipul BB ar fi asociat cu BMD scăzută şi risc crescut
de fracturi la populaţia vârstnică, iar genotipul bb cu BMD crescută, sugerând o protecţie împotriva
osteoporozei. Distribuţia acestor genotipuri în populaţia caucaziană este următoarea: bb 36%, Bb
46%, iar BB 18%. În 1995, în urma unui studiu efectuat în Coreea, Lim a constatat că nici un pacient
cu osteoporoză nu prezenta genotipul BB. De asemenea în 1996 Garnero şi colaboratorii săi nu au
găsit nici o corelaţie între genotipul VDR şi masa osoasă, turnover-ul osos sau pierderea osoasă
într-un grup de 268 femei în perioada postmenopauză la care nu se inţiase încă un tratament. Într-un
grup de pacienţi bărbaţi Ferrari şi colaboratorii (1999) au constatat că subiecţii cu genotip BB asociază
o densitate minerală osoasă semnificativ scăzută doar la cei care prezintă alela f a polimorfismului
239
Fok1. Uitterlinden (2001) a descoperit că prezenţa haplotipului reprezentat de polimorfismele genei

VDR şi de cel al genei COL1A1 (mutaţia G2046T) exercită o influenţă combinată asupra riscului de
fracturi osteoporotice independent de BMD4. Acelaşi autor, în 2006, într-un studiu multicentric cu
peste 26000 persoane înrolate, a raportat absenţa unei asocieri între polimorfismele genei VDR şi
BMD la nivelul coloanei lombare şi capului femural5.
Un alt polimorfism VDR a fost identificat de Gross în 1996 cu ajutorul enzimei de restricţe FokI. În
alelele care prezintă situsul de acţiune al enzimei FokI, desemnate f, translaţia este iniţiată la nivelul
codonului de start ATG, în timp ce la nivelul alelelor care nu prezintă acest situs, desemnate F, translaţia
se iniţiază la 3 codoni diferenţă faţă de primul codon. Mai exact, acest polimorfism descrie o diferenţă
de 3 aminoacizi în lungimea VDR între cele 2 alele, care poate afecta funcţia proteinei. Sunt posibile
genotipuri: ff, Ff şi FF cu o frecvenţă aproximativă în populaţie de 11,6%, 48% şi, respectiv, 40.4%2;3.
Asocierea polimorfismului Fok1 cu BMD este controversată. Câteva studii au indicat o asociere a
genotipului ff cu densităţi minerale osoase mai scăzute în comparaţie cu genotipul FF, însă altele nu.
Într-un studiu publicat în 2005 a fost descrisă o corelaţie semnificativă între absorbţia intestinală a
calciului, fixarea calciului la nivelul scheletului şi polimorfismul Fok1; se pare că polimorfismul Fok1
afectează direct mineralizarea osului în perioada pubertăţii prin influenţarea abosrbţiei calciului; în
cazul genotipului ff s-a înregistrat un deficit în fixarea calciului de 63 +/- 20 mg/zi în comparaţie cu
genotipul FF1. Conform unui studiu recent, efectuat în Iran pe un lot de 312 femei cu vârste cuprinse
între 20 şi 75 ani, polimorfismul Fok1 ar putea să modifice răspunsul la vitamina D şi să aibă valoare
predictivă asupra turnover-ului osos2.
În concluzie, există multe date contradictorii privind legătura dintre polimorfismele genei VDR
şi osteoporoză. Este posibil ca aceste discrepanţe să fie explicate de o modificare a influenţei
componentelor genetice în funcţie de vârstă şi dietă1;2.
hemolizate3.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ şi analiza polimorfismului lungimii fragmentelor de restricţie
(PCR - RFLP)3.
Se vor comunica genotipurile obţinute în urma analizei celor 2 polimorfisme B/b şi Fok1 ale genei
VDR. Sunt posibile astfel următoarele genotipuri: BB, Bb şi bb; FF, Ff şi ff3.
Bibliografie
1. Abrams SA, Griffin IJ, Hawthorne KM, Chen Z, Gunn SK, Wilde M, Darlington J, Shypailo RJ,
Ellis KJ. Vitamin D receptor Fok1 polymorphisms affect calcium absorption, kinetics, and bone
mineralization rates during puberty. In J Bone Miner Res. 2005 Jun; 20(6): 945-53.
240
18
2. Hossein-Nezhad A., Ahangari G., Behzadi H., Maghbooli Z., Larijani B. Vitamin D Receptor gene
polymorphism may predict response to vitamin D intake and bone turnover. In DARU vol.17,
Suppl.1, 2009.
4. OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man). Vitamin D Receptor, VDR. http://www.ncbi.nlm.
nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
5. Uitterlinden AG et al. The association between common vitamine D receptor Gene variations and
osteoporosis:a participant -level meta-analysis. In Ann Intern Med, 2006, Aug 15; 145(4), 255-64.
18.1.3.11 Hipercolestorelemia familială
Hipercolesterolemia familială este o afecţiune genetică care asociază nivele extrem de ridicate de
LDL – colesterol. Boala se poate transmite:
- autozomal dominant (majoritar), mutaţiile ce determină această formă fiind identificate în
genele care codifică:
- receptorul LDL (LDLR);
- ligandul receptorului LDL - apoB;
- un modulator al endocitozei hepatice: PCSK9 (proproteina convertază subtilisin/kexin
tip 9);
- autozomal recesiv, mutaţiile cauzatoare fiind evidenţiate în gena LDLRAP1 ce codifică
proteina adaptoare 1 a receptorului LDL necesară internalizării mediată de clatrină a
receptorilor LDL în hepatocite1.
Cele mai multe (60–75%) cazuri de hipercolesterolemie familială (HF) se datorează mutaţiilor genei
LDLR transmise autozomal dominant, cu un efect doză-genă. Forma heterozigotă are o prevalenţă
de aproximativ 1:500 de persoane, iar cea homozigotă de 1:1000000 în întreaga lume. Excesul seric
de LDL se depozitează în tot organismul şi determină apariţia de xantoame, accidente vasculare
cerebrale, ateroscleroză şi boli cardiovasculare cu debut precoce. Deoarece se asociază cu un
risc crescut pentru boala coronariană prematură, diagnosticul precoce şi managementul agresiv de
reducere a nivelului de LDL-colesterol ajută la prevenirea sau încetinirea progresiei aterosclerozei
coronariene5.
HF indusă de mutaţiile LDRL este o tulburare determinată de absenţa sau funcţionarea
necorespunzătoare a receptorului LDL. Gena receptorului LDL este situată pe braţul scurt al
cromozomului 19 şi cuprinde 18 exoni. Sudhof et al. au constatat că 13 din cei 18 exoni ai genei ce
codifică receptorul LDL au secvenţe omoloage cu alte gene care codifică proteine diferite. Astfel, 5
exoni codifică o secvenţă similară cu componenta C9 a complementului; 3 codifică o secvenţă similară
cu o regiune repetitivă a precursorului factorului de creştere epidermală - EGF (engl. epidermal growth
241
factor) şi a altor 3 proteine plasmatice ale sistemului de coagulare - factorul IX, factorul X şi proteina
C, iar 5 exoni codifică secvenţe nonrepetitive comune cu precursorul EGF.
Receptorul LDL este o proteină transmembranară de 839 aminoacizi, caracterizată prin următoarele
domenii:
- domeniul de legare (aproximativ 292 aminoacizi, codificat de exonii 2-6);
- domeniu similar cu EGF (aproximativ 400 aminoacizi, codificat de exonii 7-14);
- domeniul bogat în carbohidraţi (aproximativ 58 aminoacizi, codificat de exonul 15);
- domeniul transmembranar (circa 22 aminoacizi, codificat de exonul 16);
- domeniul citoplasmatic (aproximativ 50 aminoacizi).
gena LDLR
nr exon
LDLR
domeniul similar domeniul TM domeniul

peptida domeniul de legare citoplasmatic
semnal bogat în cisteina cu precursorul EGF bogat în
carbohidraĠi
Fig. 18.1.3.11 Modul de organizare al genei ce codifică LDLR

(Adaptare după Mechanisms of Disease: genetic causes of familial hypercholesterolemia, Anne K Soutar
and Rossi P Naoumova, Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine (2007) 4, 214-225)
Proteina este sintetizată la nivelul reticulului endoplasmatic rugos sub forma unui precursor de
120 kDa, se maturizează în aparatul Golgi ajungând la 160 kDa şi este apoi transportată la nivelul
membranei celulare prin intermediul veziculelor acoperite de clatrină.
Goldstein şi Brown au fost primii care au descris receptorul LDL şi tot ei au stabilit că HF este cauzată
de o mutaţie autosomal dominantă. De atunci mai mult de 700 mutaţii cu impact semnificativ asupra
funcţiei receptorului au fost identificate. Majoritatea se localizează la nivelul domeniului care codifică
regiunea de legare a receptorului sau în domeniul omolog cu factorul de creştere epidermal (EGF),
în regiunea 5’ a genei. Cele mai multe mutaţii genice sunt reprezentate de inserţii, deleţii sau mutaţii
punctiforme şi mai rar (aproximativ 10-15% cazuri) aceste mutaţii se datorează unor rearanjări mari,
cum ar fi deleţiile exonice sau duplicaţiile5.
Cinci clase de mutaţii au fost definite după cum urmează:
- Clasa 1 cuprinde alelele nule care au ca rezultat absenţa completă a receptorilor LDL.
- Clasa 2 cuprinde mutaţii ale alelor ce sunt implicate în transportul receptorilor (determină
afectarea modului de pliere a receptorului şi cauzează eşecul transportului la suprafaţa
celulelor sau transportul se realizează cu succes, dar receptoriii prezintă mutaţii).
o Clasa 2a: mutaţiile blochează complet transportul receptorilor de la reticulul
endoplasmatic la aparatul Golgi.
o Clasa 2b: mutaţiile blochează parţial transportul de la reticulul endoplasmatic la
complexul Golgi.
242
18
- Clasa 3 cuprinde alelele deficiente ce afectează legarea receptorului la ligand (LDL şi, în
unele cazuri, VLDL).
- Clasa 4 cuprinde alelele deficiente ce afectează internalizarea receptorilor în vezicule
acoperite de clatrină la nivelul hepatocitelor.
- Clasa 5 cuprinde alelele deficiente care împiedică disocierea receptorului de ligand şi astfel
reciclarea receptorului2.
În hipercolesterolemia familială funcţia receptorilor LDL variază de la absenţă totală la aproximativ
25% din activitatea receptorilor normali.
Circa 70% din LDL circulant este captat de ficat prin intermediul receptorului LDL şi apoi metabolizat.
Capătul amino-terminal al receptorului LDL este situat extracelular şi conţine în situsul de legare 7
domenii repetitive formate din aproximativ 40 aminoacizi (cisteina este abundentă), cu rol în medierea
ataşării lipoproteinelor. Doi liganzi, apolipoproteina B-100 (apoB-100) şi apoE (se găseşte în VLDL,
IDL, HDL şi chilomicroni), se leagă de receptorul LDL şi determină activarea acestuia. Interacţiunea
se realizează în prezenţa calciului şi implică existenţa unor aminoacizi încărcaţi negativ. Domeniul
repetitiv 5 este esenţial pentru legarea apoE, în timp ce regiunile 2-7 sunt necesare pentru ataşarea
unor liganzi mai mari, cum este apoB1.
Un sindrom aproape imposibil de diferenţiat de forma heterozigotă a hipercolesterolemiei familiale
este determinat de apariţia unor mutaţii la nivelul genei care codifică apolipoproteina B-100. Această
formă – deficienţa ligandului apo-B (FDBL) reprezintă aproximativ 15% din cazurile de HF, se transmite
autozomal dominant şi are o penetranţă de aproape 100%5.
Apolipoproteina B este componenta principală a chilomicronilor şi a lipoproteinelor cu densitate mică
(LDL). Apare în plasmă sub 2 forme, apo B48 şi apo B100, prima fiind sintetizată exclusiv la nivelul
intestinului, iar a doua de către ficat. Apo B100 este o proteină mare de 550 kDa (4536 aminoacizi)
codificată de o genă situată pe braţul scurt al cromozomului 2 (2p24-p23) şi compusă din 26 exoni.
Trei mutaţii în exonul 26 sunt asociate cu acest tip de hipercolesterolemie. Marea majoritate a cazurilor
este cauzată de mutaţia la nivelul codonului care codifică aminoacidul 3500 (R3500Q), ce determină
substituţia glutaminei cu arginina. Această mutaţie determină apariţia unor modificări conformaţionale
la nivelul domeniului de legare la receptor, iar lipoproteinele cu acest tip de apoB au afinitate scăzută
(doar 10%) pentru receptorii LDL. Deşi numărul şi funcţia receptorilor LDL sunt normale, LDL este
preluat ineficient, fapt ce determină apariţia unor nivele serice crescute de LDL-colesterol. Mutaţia
are o frecvenţă estimată la 1:500 indivizi în Europa. Cea de a doua mutaţie, ce constă în substituţia
argininei cu cisteina în poziţia 3531 (R3531C), a fost diagnosticată la două familii cu origini etnice
diferite. Această mutaţie produce un defect de afinitate la nivelul receptorilor, dar care determină o
scădere cu 30% mai mică decât cea observată la mutaţia din poziţia 3500. O a treia mutaţie, mai puţin
frecventă, ce apare la nivelul aceluiaşi codon constă în substituţia triptofanului cu arginina (R3500W)
şi este mai frecventă în Asia, dar a fost identificată şi în rândul populaţiei scoţiene.
Prevalenţa acestor mutaţii diferă în rândul populaţiei, majoritatea cazurilor găsindu-se în populaţiile
caucaziene. De fapt, cea mai mare incidenţă a acestui defect se află în Europa Centrală şi Elveţia
(1:200 adulţi), iar frecvenţa scade treptat în bazinul mediteranean şi în populaţiile europene nordice.
În Germania, Marea Britanie şi SUA prevalenţa variază între 1:500 şi 1:700 adulţi4;5.
Manifestările clinice ale acestei forme de hipercolesterolemie asociate cu mutaţii la nivelul genei
243
care codifică apoB (FDBL) sunt explicate prin acumularea serică de LDL. Aceşti pacienţi prezintă
un risc crescut de apariţie precoce a bolilor cardiovasculare şi leziunilor cutanate similare cu cele ale
pacienţiilor cu formă heterozigotă de HF, determinată de mutaţii în gena care codifică LDLR. Deoarece
receptorii LDL funcţionează normal, concentraţiile plasmatice de VLDL, IDL se găsesc în intervalul
de referinţă.
Nivelele serice crescute de colesterol determină endocitarea acestuia de către monocite şi macrofage,
care se vor transforma în celule spumoase şi vor contribui la formarea plăcilor ateromatoase la nivelul
endoteliului, cu apariţia prematură a bolilor cardiovasculare. De asemenea colesterolul se acumulează
în special la nivelul pielii, formând xantelasme şi xantoame.
Pacienţii cu forma homozigotă a HF prezintă xantoame cutanate la naştere sau precoce în copilărie.
Mai multe tipuri de xantoame sunt de obicei evidente în primul deceniu de viaţă şi acestea includ:
- xantoame plane (mâini, coate, fese sau genunchi), care sunt elemente de diagnostic
pentru forma homozigotă şi se caracterizează prin culoarea lor galben-portocalie;
- xantoame tuberculate (mâini, coate sau genunchi);
- xantoamele tendoanelor (în special pe tendoanele extensorilor mâinilor sau tendonului lui
Achile), care apar mai târziu2.
Copiii cu formă homozigotă de boală pot prezenta simptome de cardiopatie ischemică, boli vasculare
periferice, boli cerebrovasculare sau stenoză aortică. De asemenea pacienţii pot avea simptome
articulare, cum ar fi tendinită sau artralgii, istoric de leziuni neobişnuite ale pielii sau arc corneean,
care uneori poate fi circumferenţial2.
Cei mai mulţi adulţi nu supravieţuiesc după vârsta de 30 ani, cu excepţia cazurilor tratate prin metode
extreme, cum ar fi transplantul de ficat, afereza LDL sau by-pass ileal, care determină o scădere
dramatică a nivelului LDL-colesterolului. Istoricul familial al acestor pacienţi prezintă numeroase
cazuri de hipercolesterolemie severă şi afecţiuni cardiace premature2.
Copiii cu formă heterozigotă nu prezintă simptome cardiovasculare, dar au un părinte cu
hipercolesterolemie severă şi, probabil, antecedente personale sau familiale de afecţiuni cardiace
dezvolate prematur. Statistic, deoarece gena pentru HF se transmite autozomal dominant, jumătate
din fraţii acestui pacient vor avea de asemenea forma heterozigotă a bolii. După vârsta de 30 ani
mai mult de 60% dintre pacienţii netrataţi cu HF dezvoltă xantoame tendinoase, de obicei la nivelul
tendonului lui Ahile şi tendoanelor extensoare metacarpiene sau interfalangiene de la mâini. Majoritatea
manualelor sugerează că xantoamele de la nivelul tendoanelor la pacienţii heterozigoţi sunt evidente
la inspecţie, dar, din păcate, acest lucru nu este vizibil în cele mai multe cazuri. Atenta palpare, mai
degrabă decât inspecţia simplă, poate fi necesară pentru detectarea acestora la nivelul tendonului lui
Ahile sau a articulaţiilor metacarpofalangiene. Un tendon difuz îngroşat sau cu neregularităţi discrete
este sugestiv pentru xantoame2.
Adulţii cu formă heterozigotă au o istorie de îndelungată de hipercolesterolemie gravă datând
din copilărie. Chiar dacă până în prezent pacientul nu a suferit niciun eveniment coronarian acut,
simptomele bolii cardiace ischemice sunt frecvente, mai ales dacă se asociază şi alţi factori de risc
cardiovascular (în special fumatul). Bolnavii prezintă de asemenea simptome de tendinită recurentă
şi artrită. Bolile cardiovasculare precoce şi hipercolesterolemia severă sunt prezente la una sau mai
multe rude de gradul întâi2.
244
18
În general heterozigoţii HF au creşteri plasmatice de 2 ori mai mari faţă de valorile de referinţă şi dezvoltă
ateroscleroză coronariană după 30 ani. Persoanele homozigote au valori mari ale colesterolului, în
general >650 mg/dL, cu prezenţa xantoamelor cutanate înainte de 4 ani, bolii coronariene în copilărie
şi moarte prin infarct miocardic înainte de 20 ani.
Aproximativ 40% din bărbaţii şi 20% din femeile cu o mutaţie apoB vor dezvolta boli coronariene. În
comparaţie cu FH persoanele cu FDBL au manifestări mai puţin severe5. Pentru purtătorii acestui tip
de mutaţie hipercolesterolemia este o caracteristică generală, dar există un grad ridicat de variabilitate
în ceea ce priveşte vârsta de debut şi severitatea simptomelor clinice, deşi într-o familie există un
grad mai mare de similitudine, sugerând că factorii genetici şi de mediu sunt de asemenea implicaţi în
dezvoltarea bolilor cardiovasculare în aceste familii6.
Diagnosticul hipercolesterolemiei, atât forma homozigotă cât şi cea heterozigotă, se bazează în
principal pe constatarea creşterii severe a nivelului seric de LDL-colesterol în absenţa cauzelor
secundare de hipercolesterolemie, cu valori ale trigliceridelor cuprinse în intervalul de referinţă sau
uşor crescute. Un diagnostic probabil al formei heterozigote a HF se poate face în cazul în care nivelul
LDLc este mai mare de 330 mg/dL sau dacă există xantoame tendinoase. Diagnosticul de confirmare
însă se stabileşte numai prin analiză genetică. Acesta este important pentru depistarea precoce a
membrilor de familie afectaţi, în special a subiecţilor tineri.
Diagnosticul molecular al HF conduce la creşterea proporţiei de pacienţi care încep sau intensifică
terapia anticolesterolemiantă şi, în consecinţă, la o scădere adecvată a concentraţiei LDL-
colesterolului.
Screening-ul bolilor genetice la copii este o problemă delicată şi trebuie efectuată în conformitate cu
reglementările speciale din diferitele ţări. În ţările nordice numai copiii cu vârstă mai mare de 16 ani pot
participa la programul naţional de screening genetic. În Norvegia screening-ul copiilor mai mici este
posibil după obţinerea acordului prealabil al părinţilor.
După o evaluare atentă a riscurilor şi beneficiilor individuale, s-a stabilit că numai copiii cu cel mai mare
risc de a dezvolta hipercolesterolemie ar trebui luaţi în considerare pentru tratamentul cu statine6.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutaţie LDLR sau apoB este posibil prin
analiza ADN-ul extras din celule fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei efectuată la aproximativ
15-18 săptămâni de gestaţie, sau biopsia vilozităţilor coriale la aproximativ 10-12 săptămâni de
gestaţie. Mutaţiile cauzatoare de boală trebuie să fie identificate înainte de testarea prenatală la un
membru afectat al familiei.
Conform recomandărilor actuale diagnosticul prenatal nu este adecvat pentru HF, cu excepţia unei
sarcini cu risc de HF homozigotă. Exceptând aceste familii nu există motive pentru întreruperea unei
sarcinii cu făt heterozigot HF, deoarece în această tulburare simptomele clinice au debut tardiv, iar
hiperlipemia şi riscul de apariţie a bolilor cardiovasculare pot fi modificate prin stilul de viaţă şi sunt
tratabile prin diverse terapii. Forma homozigotă a HF are o prevalenţă de 1 la 1000000 naşteri vii, deşi
în anumite grupuri etnice (în care căsătoriile între rude sunt numeroase) frecvenţa este mai mare. În
astfel de familii identificarea unui copil cu formă homozigotă se face de obicei după ce acesta a fost
deja născut6.
Recomandări pentru testarea genetică - diagnosticul hipercolesterolemiei familiale (asociată
cu mutaţii la nivelul genelor care codifică LDLR şi apoB-100) la persoanele cu valori crescute ale
245
colesterolului şi diferenţierea acesteia de alte cauze de hiperlipemie5.

hemolizate3.
Metodă – sunt disponibile 2 tipuri de teste:
a) pentru mutaţiile LDLR: secvenţiere completă a genei + analiza deleţiilor/duplicaţiilor MLPA;
b) pentru mutaţiile ligandului apo-B: secvenţiere exon 26 pentru depistarea mutaţiilor R3500Q,
R3531C, R3500W3.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate în genele LDLR şi/sau apoB-1003.
Bibliografie
1. Anne K Soutar, Rossi P Naoumova. Mechanisms of Disease: genetic causis of familial

hypercholesterolemia. In Nature Clinical Practice – Cardiovsacular Medicine, April 2007, Vol.4,
Nr.4.
2. Elena Citkowitz. Hypercholesterolemia, Familial www.emedicine.medscape.com, Ref Type:
4. Ludivina Robles-Osorio, Ma. Luisa Ordoñez, Carlos A. Aguilar-Salinas, Moisés Aurón-
Gómez, Ma. Teresa Tusié-Luna, Francisco J. Gómez-Pérez and Juan A. Rull-Rodrigo Familial
Hypercholesterolemia Due to Ligand-Defective Apolipoprotein B100. First Case Report in a
Mexican Family. In Archives of Medical Research 34:70–75, 2003.
5. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Familial Hypercholesterolemia/Autosomal
Dominant Hypercholesterolemia Genetic Testing Reflex Panel. www.mayomedicallaboratories.
com. Ref Type: Internet Communication
6. S.E. Humphries, D. Galton and P. Nicholls. Genetic testing for familial hypercholesterolaemia:
practical and ethical issues, Q J Med 90:169–181, 1997.
246
18
18.1.3.12 Intoleranţa ereditară la fructoză (mutaţii ale genei aldolazei B)
Sinonime - fructozemie; deficit de fructozo-1-fosfat aldolază.

Această afecţiune, descrisă pentru prima dată în 1956, constituie cea mai cunoscută tulburare
ereditară în metabolismul fructozei, având o frecvenţă de 1 caz la 20 000 naşteri. Defectul se transmite
autozomal recesiv; deşi se manifestă în primul an de viaţă, consecinţele sale clinice pot să nu fie
recunoscute până în perioada adolescenţei sau chiar a vârstei adulte.
Dacă diagnosticul este stabilit înainte de apariţia complicaţiilor viscerale, intoleranţa ereditară la
fructoză răspunde complet la dieta de eliminare a acestui monozaharid.
Persoanele afectate sunt asimptomatice până în momentul ingestiei de alimente care conţin fructoză.
La sugarii homozigoţi manifestările clinice debutează după administrarea de formule care conţin
sucroză (dizaharid alcătuit din glucoză şi fructoză). Fructoza se găseşte în majoritatea fructelor şi
legumelor şi este parte a dizaharidului zaharoză (zahărul obişnuit).
Manifestările principale ale bolii sunt reprezentate de vărsături, diaree, dureri abdominale şi hipoglicemie
instalate în decurs de 30 minute de la consumul unor alimente, băuturi sau medicamente ce conţin
fructoză sau zaharuri înrudite (sucroză sau sorbitol). Poate să se dezvolte o tulburare metabolică
generalizată cu acidoză lactică şi hiperuricemie. Hipoglicemia induce iritabilitate, tremurături şi tulburări
cognitive. Atacurile sunt însoţite de paloare, transpiraţii şi, în cazuri severe, de pierderea cunoştinţei
şi convulsii generalizate. Expunerea cronică la fructoză este asociată cu disfuncţie tubulară (sindrom
Fanconi), afectare hepatică până la ciroză şi tulburări de coagulare. Sugarii refuză alimentaţia şi apare
un retard de creştere. Supravieţuirea depinde de modul în care mama recunoaşte efectele adverse
legate de consumul de fructe şi zahăr.
Sugarii care reuşesc să depăşească momentul critic al diversificării alimentaţiei dezvoltă o aversiune
puternică faţă de alimentele dulci, legume şi fructe, care oferă o protecţie faţă de efectele negative ale
acestora. Afecţiunea poate să nu fie diagnosticată în perioada copilăriei, astfel că există oricând riscul
de manifestări severe dacă în dietă apare un aliment „interzis”2;3.
Au fost descrise câteva cazuri letale de intoleranţă ereditară la fructoză la adulţi de vârstă medie
declanşate de perfuzii cu sorbitol şi fructoză5.
Caracteristic pentru copiii şi adulţii cu intoleranţă ereditară la fructoză este reducerea drastică sau
chiar absenţa cariilor dentare.
În mod normal, fructoza este metabolizată la nivel hepatic iar enzima aldolaza B deţine un rol esenţial în
acest proces prin scindarea fructozo-1-fosfatului în glicerolaldehidă şi dihidroxiacetonfosfat. Aldolaza
B este exprimată exclusiv în ficat, rinichi şi intestin; în cazul unui deficit enzimatic se produce o depleţie
a pool-lului intracelular de fosfat anorganic (prin sechestrarea sa sub formă de fructozo-1-fosfat) cu
modificarea dramatică a raportului între adenozin trifosfat (ATP) şi adenozin monofosfat (AMP) şi
accelerarea producţiei de acid uric. Astfel se explică hiperuricemia obsevată în cursul atacurilor acute.
Competiţia între urat şi lactat pentru excreţia tubulară renală este responsabilă de acidemia lactică.
De asemenea, nivelul ridicat de fructozo-1 fosfat într-un mediu în care fosfatul anorganic liber
este redus perturbă glicogenoliza şi gluconeogeneza, ceea ce explică hipoglicemia care însoţeşte
intoleranţa ereditară la fructoză.
247
O altă consecinţă a nivelului crescut de fructozo-1 fosfat este inhibiţia fructokinazei printr-un mecanism
de feed-back şi creşterea concentraţiei de fructoză liberă în sânge.
Cauza disfuncţiei hepatice severe rămâne necunoscută dar poate fi o manifestare a degenerescenţei
citoplasmatice focale sau a toxicităţii celulare a fructozei. Cauza afecţiunii tubulare renale este de
asemenea neclară; pacienţii prezintă acidoză tubulară proximală complictă cu aminoacidurie,
glucozurie şi fosfaturie.
În prezenţa manifestărilor clinice sugestive testul intravenos de provocare cu fructoză poate fi util
în stabilirea diagnosticului, în special la adulţi. Astfel, se administrează în perfuzie o soluţie de
fructoză 20% (0.25g/kg) şi se recoltează la un interval de 2 ore probe de sânge pentru electroliţi
(potasiu, magneziu, fosfat) şi glucoză. În cursul încărcării cu fructoză se produce hipoglicemie însoţită
de tulburări electrolitice importante: hipokaliemie, hipofosfatemie şi hipermagneziemie. Testul este
riscant deoarece pot să apară dureri abdominale severe şi comă hipoglicemică. Hipoglicemia indusă
nu răspunde la glucagon.
Testul oral de provocare cu fructoză trebuie evitat deoarece poate declanşa dureri abdominale intense
şi şoc.
Deficitul de aldolază B este pus în evidenţă prin analiza enzimatică a probelor de biopsie prelevate din
ficat sau de la nivelul mucoasei intestinale.
Prin identificarea unor mutaţii la nivelul genei aldolazei B a devenit posibil un diagnostic genetic direct
la persoanele suspectate de intoleranţă ereditară la fructoză2;3.
Gena aldolazei B este localizată pe braţul lung al cromozomului 9 şi este alcătuită din 9 exoni. În
intoleranţa ereditară au fost descrise mai multe tipuri de mutaţii: missens, nonsens, deleţii, inserţii şi
în regiunea de splicing. Mutaţiile reduc activitatea enzimatică şi afectează stabilitatea structurală a
aldolazei B. Mutaţiile A149P, A174D şi N334K sunt cele mai frecvente în Europa şi sunt responsabile
de 90% din cazuri. Restul de 10% este reprezentat de mutaţii mai rare. Defectul se transmite autozomal
recesiv, adică este manifest la pacienţii care au 2 mutaţii (homozigoţi, sau heterozigoţi compuşi)1;4.
Pentru a împiedica manifestările bolii şi a asigura o dezvoltare a copiilor afectaţi trebuie să se excludă
aproape complet din dietă sucroza, fructoza şi sorbitolul. Datorită prezenţei ubicuitare a fructozei
este adesea dificil de stabilit un regim alimentar adecvat şi este de preferat să se apeleze la un
nutriţionist.
Alimente contraindicate:
- zahăr
- toate fructele şi preparatele pe bază de fructe
- sorbitol
- miere
- melasă şi sirop de melasă
- ciocolată, şerbet
- gemuri, marmelade
- produse pentru diabetici
- brânză topită; brânză de vaci cu fructe; lapte şi iaurturi aromate
- cereale pentru micul dejun, tărâţe, germeni de grâu, orez brun
- esenţă de cafea, lapte praf
248
18
- băuturi dulci carbonatate

- nuci, cocos, unt de arahide
- maioneză, murături, sosuri de salate, ketchup
- majoritatea legumelor
- unii cartofi (în special cartofii noi).
Alimente permise:
- alimente ce conţin glucoză, dextroză, lactoză, maltoză, manoză, galactoză, dextrine,
pectine, amidon
- îndulcitori ca: aspartam, ciclamat, zaharină, thaumatin2.
Recomandări pentru efectuarea testului genetic
- istoric familial de intoleranţă la fructoză;
- vărsături/hipoglicemie la introducerea fructelor în alimentaţia sugarilor;
- aversiune faţă de alimente dulci;
- insuficienţă hepatică acută infantilă la pacienţi care au primit fructoză sau sorbitol4.
Metodă – PCR (reacţie de polimerizare în lanţ) şi secvenţiere ADN; se analizează exonii 5, 9 ai genei
aldolazei B precum şi exonili/intronii marginali; se caută ţintit mutaţiile A149P, A174D şi N334K4.
Se comunica prezenţa sau absenţa celor 3 mutaţii testate; în cazul rezultatelor pozitive se precizează
statusul homozigot sau heterozigot.
Diagnosticul este puţin probabil în absenţa oricărei mutaţii.
Diagnosticul este confirmat dacă se depistează cel puţin 2 mutaţii. În cazul în care se detectează o
singură mutaţie se recomandă secvenţierea întregii gene pentru a se identifica mutaţii mai rare4.
Manifestări clinice de intoleranţă la fructoză pot să apară şi la pacienţii care prezintă malabsorbţie a
fructozei. Simptomele (diaree, meteorism, dureri abdominale) se manifestă atât la copil cât şi la adult
după ingestia de alimente bogate în fructoză sau în sorbitol şi se remit de obicei după excluderea
acestor zaharuri din dietă. Se poate dezvolta de asemenea, ca şi în cazul intoleranţei ereditare la
fructoză, o aversiune faţă de alimentele dulci. Adesea se asociază tulburări de dispoziţie şi depresie.
Afecţiunea este destul de frecvent întâlnită în populaţie.
Această malabsorbţie poate să apară datorită lezării epiteliului intestinal consecutiv unei intoleranţe
ereditare a fructozei, dar poate fi şi independentă de aceasta. Alte cauze posibile sunt:
- o anomalie ereditară sau dobândită a proteinei transportoare a fructozei la nivelul
enterocitului (GLU-5);
- administrarea excesivă a sucurilor de fructe la copilul mic;
- existenţa unei flore bacteriene intestinale care degradează în exces fructoza;
- sindrom dumping;
- boala celiacă.
249
Malabsorbţia fructozei poate fi evidenţiată printr-un test respirator cu fructoză (se administrează o masă
bogată în fructoză şi se determină în aerul expirat cantitatea de hidrogen rezultată din degradarea
fructozei incomplet absorbită la nivelul intestinului).
Deoarece un test oral de încărcare cu fructoză poate declanşa crize metabolice periculoase la pacienţii
cu intoleranţă ereditară la fructoză se recomandă mai întâi excluderea prin testul genetic a mutaţiilor
genei aldolazei B4.
Bibliografie
1. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology.

2. David A. Warell, Timothy M. Cox, John D. Firth. Inborn Errors of Fructose Metabolism. In Oxford
Textbook of Medicine, Oxford University Press, Fourth Edition, 2005, 40-44.
3. Karl S Roth. Fructose 1-Phosphate Aldolase Deficiency (Fructose Intolerance): Treatment &
Medication emedecine.medscape.com. Ref Type: Internet Communication, 2009.
5. Yasawy M, Folsch U, Schmidt W, Schwend M. Hereditary Fructose Intolerance. In World Journal
Of Gastroenterology, 2009 May;15(19):2412-2413.
18.1.3.13 Intoleranţa la lactoză (test genetic)
Intoleranţa la lactoză, cea mai frecventă formă de intoleranţă alimentară, este o afecţiune caracterizată
prin incapacitatea de a digera şi absorbi lactoza, care se manifestă clinic prin simptome gastrointestinale
induse de consumul de lapte şi de derivaţi ai acestuia.
În mod normal, dizaharidul din lapte - lactoza - este scindat în intestinul subţire în glucoză şi galactoză
sub acţiunea enzimatică a lactazei. Doar aceste monozaharide pot fi absorbite prin mucoasa
intestinului subţire. În cazul unui deficit de lactază moleculele de lactoză ramân nescindate şi nu pot fi
absorbite. Lactoza trece în intestinul gros unde va suferi un proces de fermentaţie sub acţiunea florei
bacteriene.
Intoleranţa la lactoză este cel mai răspândit deficit enzimatic şi este condiţionat genetic.
Intoleranţa la lactoză este provocată de o activitate enzimatică redusă sau absentă a lactazei. Din
punct de vedere al cauzei deficitului enzimatic se descriu 3 forme de intoleranţă la lactoză:
- intoleranţa congenitală la lactoză: o afecţiune foarte rară cu o modalitate de transmitere
autozomal-recesivă, caracterizată prin incapacitatea de a sintetiza lactaza; se manifestă
clinic prin diaree apoasă la iniţierea alimentaţiei naturale;
- intoleranţa primară la lactoză: rezultă ca urmare a reducerii fiziologice progresive, odată
cu vârsta, a activităţii lactazei din enterocite. Acest proces care este caracteristic tuturor
mamiferelor nu se aplică în totalitate la om (ca urmare a unui fenomen de adaptare), astfel
250
18
că, la o parte din populaţie (în special cea din nord-vestul Europei) activitatea enzimatică
persistă şi la vârsta adultă şi se asociază cu o bună toleranţă a preparatelor lactate. La
persoanele care nu prezintă persistenţa lactazei, declinul activităţii enzimatice începe de
obicei la vârsta preşcolară (2-6 ani), însă se poate înregistra şi un debut tardiv, la orice
vârstă. Momentul şi rata de reducere a nivelului de lactază sunt determinate genetic,
prin existenţa unui polimorfism T/C în poziţia 13910 a genei lactazei care condiţionează
cantitatea de lactază din intestin. Prin analiza acestui polimorfism s-a depistat o variantă
genetică asociată cu lipsa de persistenţă a lactazei la adult. Persoanele care prezintă acest
genotip sunt predispuse la intoleranţă primară la lactoză şi asociază de asemenea un risc
crescut de osteoporoză şi fracturi ca urmare a unei densităţi minerale osoase scăzute.
Astfel, printr-un test de biologie moleculară se poate depista predispoziţia genetică pentru
intoleranţa primară şi poate fi efectuat diagnosticul diferenţial cu intoleranţa secundară la
lactoză. Se estimează o prevalenţă globală de 75% a deficitului de lactază; pot fi afectate
persoane aparţinând oricărei rase, însă prevalenţă cea mai ridicată se înregistrează în
rândul populaţiei asiatice, sud-americane şi africane. Trebuie subliniat faptul că nu în toate
cazurile deficitul de lactază este însoţit de manifestări clinice. În Europa procentul populaţiei
afectate variază de la 2% în Scandinavia pâna la 70% în sudul Italiei şi Turcia.
- intoleranţa secundară la lactoză: apare în urma unei afecţiuni acute ( gastroenterită) sau
cronice (de exemplu, boala Crohn sau boala celiacă), iar deficitul de lactază se manifestă
temporar şi este reversibil după regenerarea epitelului intestinal.
Simptomatologia este foarte variabilă. Produsele obţinute în urma fermentaţiei bacteriene a moleculelor
de lactoză în intestinul gros (CO2, acizi graşi, apă şi metan) conduc la apariţia de simptome cum ar
fi: senzaţie de plenitudine, meteorism, dureri abdominale colicative. De asemenea, efectul osmotic al
dizaharidelor poate provoca diaree. Mai mult, absorbţia scăzută a glucozei în intestinul subţire poate
induce temporar o stare de hipoglicemie şi oboseală. Simptomele debutează de obicei într-un interval
de 30 minute până la 2 ore de la consumul alimentelor care conţin lactoză. Severitatea simptomelor
depinde de mai mulţi factori: toleranţa individuală, rata de digestie, vârstă, grup etnic.
Studiile au arătat că 75% din pacienţii cu intoleranţă la lactoză au concomitent şi intoleranţă la fructoză.
Această asociere conduce la o exacerbare a simptomatologiei descrise1;3.
Testul de încărcare cu lactoză, respectiv testul hidrogenului expirat erau până acum teste standard
pentru evidenţierea unei digestii deficitare a lactozei. Testul genetic pentru intoleranţa la lactoză este
o alternativă foarte simplă pentru pacient. Acesta nu este influenţat de momentul recoltării sau de
bolile asociate iar bolnavul nu trebuie sa fie încărcat cu lactoză. În plus, testul genetic poate face
diferenţierea între intoleranţa primară şi cea secundară.
Prin determinarea genotipului C/T se poate stabili predispoziţia genetică pentru intoleranţa la
lactoză:
Genotip - 13910 C/C (homozigot): predispoziţie genetică clară pentru intoleranţa la lactoză.
Genotip - 13910 T/C (heterozigot): rareori se asociază cu o intoleranţă primară, adesea compensată;
simptomele sunt uşoare.
Genotip - 13910 T/T (homozigot): nu există o predispoziţie genetică pentru intoleranţa la lactoză.
În cazul unei intoleranţe la lactoză clinic manifeste, cu test genetic pozitiv, se recomandă dietă fără
251
lactoză. Dacă se recurge la aportul de lactoză se poate administra suplimentar un preparat care
conţine lactază. În cazul unei diete fără lapte se recomandă monitorizarea calcemiei. Obţinerea unui
rezultat negativ la testul genetic, în prezenţa manifestărilor clinice, impune diagnosticul diferenţial cu
alte forme de intoleranţă la lapte determinate de:
- alergia la lapte şi alte produse lactate;
- alte alergii alimentare;
- deficitul de diaminoxidază (DAO);
- boli inflamatorii intestinale.
Alimente care conţin lactoză
- orice lapte de origine animală (chiar fiert) şi produse lactate
- mezeluri preambalate
- brânză proaspătă, iaurt
- supe la plic şi sosuri
- făină
- prăjituri, torturi, produse de patiserie
- îngheţată, ciocolată
- ketchup, muştar, maioneză
- margarină
- îndulcitori.
Iaurtul şi untul au un conţinut redus de lactoză şi de obicei sunt tolerate; de asemenea şi caşcavalul (de
ex. Emmentaler) poate fi consumat de persoanele cu intoleranţă la lactoză (cu cât este mai maturat,
cu atât este mai sărac în lactoză)2.
Recomandări pentru testul genetic

- suspiciune de intoleranţă la lapte;
- meteorism abdominal, diaree, colici, greaţă, vărsături, senzaţie de oboseală şi cefalee după consum
de produse care conţin lactoză;
- diagnosticul diferenţial între intoleranţa primară şi secundară (celiachie, boală Crohn, colită
ulceroasă);
- simptome aparţinând sindromului de colon iritabil;
- hipoglicemie de cauză neprecizată2.
Metodă - PCR: reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie prin electroforeza acizilor nucleici2.
Se va comunica genotipul obţinut în urma analizei polimorfismului T/C în poziţia 13910 a genei
lactazei. În funcţie de genotipul obţinut se vor adăuga următoarele comentarii:
1. Genotipul homozigot C/C confirmă predispoziţia genetică pentru intoleranţa primară la lactoză.
252
18
Aceasta înseamnă că producţia enzimei care scindează lactoza scade în cursul vieţii. Un rezultat
pozitiv C/C în copilărie indică o predispoziţie genetică, dar nu şi diagnosticul că în acest moment
s-ar fi dezvoltat o intoleranţă la lactoză. Diagnosticul de certitudine se poate face printr-un test
de încărcare cu lactoză. La copii trebuie luat în considerare şi diagnosticul diferenţial cu alergia
la alimente. Pentru părinţii şi fraţii unui copil homozigot C/C există posibilitatea ca şi aceştia să
prezinte/dezvolte intoleranţă la lactoză.
2. Genotipul homozigot T/T infirmă predispoziţia genetică pentru intoleranţă primară la lactoză.
3. În cazul genotipului heterozigot C/T o intoleranţă primară la lactoză este improbabilă. Totuşi, în
această situaţie poate deveni manifestă o intoleranţă la lactoză de cauză secundară, deoarece
capacitatea de compensare este redusă la pacienţii heterozigoţi. Se vor lua în considerare
pentru diagnosticul diferenţial, pe lângă formele de intoleranţă secundară la lactoză, şi o alergie
alimentară sau un deficit de diaminoxidază2.
Bibliografie
1. Enattah NS, Sahi T, Savilahti E, Terwilliger JD, Peltonen L, Jarvela I. Identification of a variant
associated with adult-type hypolactasia. In Nat Genet 2002;30:233-237.
3. Obermayer-Pietsch BM, Bonelli CM, Walter DE, Kuhn RJ, Fahrleitner-Pammer A, Berghold A,
et al. Genetic predisposition for adult lactose intolerance and relation to diet, bone density, and
bone fractures. In J Bone Miner Res 2004;19:42-47
253
18.1.4 BOLI ASOCIATE CU SISTEMUL HLA
18.1.4.1 Sistemul HLA şi asocierea cu diverse boli
Genetica complexului major de histocompatibilitate
Complexul major de histocompatibilitate (MHC) reprezintă un grup de gene situat pe braţul scurt al
cromozomului 6, care produce markeri celulari de suprafaţă ce deţin un rol important în procesul de
recunoaştere a self-ului: molecule de clasa I şi de clasa II. La om moleculele MHC de clasa I includ
antigenele leucocitare (HLA = human leukocyte antigen) HLA-A, HLA-B şi HLA-C, în timp ce moleculele
MHC de clasa II includ HLA-DR, HLA-DQ şi HLA-DP. Aceste molecule constituie antigenele clasice
implicate în transplant. La nivelul MHC mai sunt codificate şi molecule de clasa III: componentele
legate de MHC ale complementului (C2, C4 şi Bf), 21-hidroxilaza (CYP21), proteina de şoc termic
(Hsp) 70 şi factorul de necroză tumorală (TNF).
MHC se întinde pe o lungime de 3600 kb şi include 224 de gene identificate, dintre care este
prevăzută exprimarea unui număr de 128; aproximativ 40% dintre genele exprimate au o funcţie
legată de sistemul imun. Genele HLA sunt localizate în 6 sub-regiuni care se succed în următoarea
ordine: HLA-A, HLA-C, HLA-B, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-A fiind distal de centromer. Fiecare
sub-regiune codifică cel puţin o glicoproteină de suprafaţă (vezi figura 18.1.4.1.1).
Cromozom 6
braĠ q braĠ p
Clasa II Clasa I
Figura 18.1.4.1.1: Succesiunea genelor HLA I şi II pe cromozomul 6
Cu o singură excepţie, genele HLA se caracterizează printr-un polimorfism înalt, mai exact fiecare genă
prezintă alele multiple în populaţie. Având în vedere rolul important al sistemului HLA în răspunsul
imun, se pare că acest polimorfism este esenţial pentru supravieţuirea speciilor şi este menţinut în
populaţie prin selecţie.
Genele MHC sunt strâns asociate între ele (linkate), adică segregă în bloc în cursul meiozei. Complexul
de gene linkate care sunt localizate pe una din perechile de cromozomi omologi şi care segregă în
bloc la urmaşi este denumit haplotip. Fiecare individ moşteneşte două haplotipuri HLA – câte unul de
254
18
la fiecare părinte – şi are astfel două alele pentru fiecare genă ce se exprimă codominant (vezi figurile
18.1.4.1.2, 18.1.4.1.3).
HLA - Clasa I HLA - Clasa II
Figura 18.1.4.1.2: Alele-perechi moştenite de la mamă şi tată pentru fiecare locus HLA
Observaţia că alelele de pe diverse locusuri genetice apar în populaţie în cadrul aceluiaşi haplotip,
cu o frecvenţă semnificativ mai mare decât cea prevăzută numai pe baza întâmplării, defineşte
dezechilibrul de linkaj - caracteristica sistemului HLA - care se întinde de la HLA-A până la HLA-DQ
inclusiv. Cel mai cunoscut dezechilibru de linkaj este haplotipul A1, Cw7, B8, DR17(3), DR52, DQ2
întâlnit în populaţia caucaziană cu o frecvenţă de 4 ori mai mare decât cea aşteptată2.
Mama TatĄl
Copiii
Figura 18.1.4.1.3: Modul de transmitere a haplotipurilor HLA la copiii unei familii
Rolul moleculelor HLA clasa I şi II

Moleculele clasice aparţinând clasei I MHC, denumite la om HLA-A, HLA-B şi HLA-C, sunt heterodimeri
alcătuiţi dintr-un polipeptid transmembranar glicozilat asociat cu β2-microglobulina, ce se exprimă pe
toate celulele nucleate şi deţin roluri-cheie în răspunsul imun:
● Prezintă antigene peptidice derivate din proteine citoplasmatice (de exemplu, un virus sau o proteină
255
anormală dintr-o celulă malignă) receptorilor clonali specifici fiecărui peptid ai limfocitelor T CD8+.
Aceste peptide rezultă în urma digerării proteinelor la nivelul lizozomilor, având în general o lungime
de aproximativ 9 aminoacizi. Fiecare alotip MHC I îşi selectează celulele T proprii; astfel există 6
subseturi de celule T, fiecare fiind specializat pentru alotipurile HLA-A, HLA-B şi HLA-C de provenienţă
maternă sau paternă. În urma recunoaşterii peptidelor celulele T CD8+ lizează celulele-ţintă.
● Exprimarea lor pe suprafaţa celulelor exercită o funcţie protectoare în cadrul răspunsului imun
înnăscut prin împiedicarea lizării celulelor-ţintă de către celulele NK („natural killer”). În mod specific,
NK pot recunoaşte şi liza celulele ţintă care nu exprimă pe suprafaţa lor moleculele HLA de clasa I,
deţinând astfel un rol important în supravegherea împotriva virusurilor şi celulelor tumorale. Nivelul
exprimării moleculelor HLA de clasa I pe suprafaţa celulelor este maxim pe celulele limfoide; în cursul
răspunsului imun exprimarea este crescută sub acţiunea citokinelor (interferon γ şi TNF); pe de altă
parte, tumorile şi anumite virusuri (cum ar fi HIV) pot suprima exprimarea HLA I.
Alături de genele clasice, în regiunea MHC I mai sunt incluse gene cu un polimorfism redus desemnate
ca HLA-E, HLA-F şi HLA-G2;8.
Moleculele aparţinând clasei II MHC, HLA-DR, HLA-DQ şi HLA-DP, sunt heterodimeri alcătuiţi din
două glicoproteine transmembranare asociate non-covalent - un lanţ α (33-35 kDa) şi un lanţ β (26-28
kDa).
Fiecare din cele 3 sub-regiuni, DR, DQ şi DP, include cel puţin o genă A (care codifică lanţul α) şi o
genă B (care codifică lanţul β). Sub-regiunea DR codifică fie una, fie două molecule DR, în funcţie de
haplotip. Conţine o singură genă DRA exprimată care este similară în mai multe haplotipuri. Gena DRB
cea mai apropiată de centromer, DRB1, codifică un lanţ β extrem de polimorf care, asociat cu lanţul
α, formează molecula de clasa II ce predomină pe suprafaţa celulelor şi care exprimă specificităţile
serologice DR1-DR18. Cea de a doua genă DRB exprimată, care este prezentă doar în anumite
haplotipuri, este localizată între locusurile DRB1 şi DRA şi, în funcţie de alelele DRB1 exprimate, este
denumită DRB3, DRB4 sau DRB5. Moleculele DR rezultate poartă specificităţile serologice DR52,
DR53 şi respectiv DR51. Sub-regiunea DQ include genele polimorfe DQA1 şi DQB1 care codifică
heterodimerul DQ ce poartă specificităţile serologice DQ1-9. Sub-regiunea DP conţine 2 seturi de
gene A şi B: un set DPA1 şi DPB1 cu polimorfism înalt, codifică produsul proteic DP; celălalt set este
alcătuit din pseudogene2.
Spre deosebire de moleculele clasei I, cele din clasa II sunt exprimate numai pe suprafaţa celulelor
prezentatoare de antigen (APC): monocite, macrofage, celule dendritice, limfocite B şi, în plus, pe
limfocitele T activate şi celulele epiteliale timice8.
Moleculele clasei II prezintă limfocitelor T helper CD4+ fragmente antigenice peptidice procesate din
antigene exogene, cum ar fi bacteriile. Receptorii pentru antigen ai limfocitelor T CD4+ interacţionează
cu complexul fragment antigenic-molecule HLA clasa II şi declanşează activarea celulelor. Ca şi în
cazul clasei I, recunoaşterea fragmentului antigenic de către celulele T efectoare este influenţată
de polimorfismul alelelor MHC. Astfel, celula T efectoare este specifică pentru peptidul antigenic în
conjuncţie cu produsul alelic particular de clasa II care a prezentat iniţial antigenul (restricţie MCH).
În urma recunoaşterii antigenului fiecare celulă T CD4+ activată stimulează diferenţierea celulelor B
în plasmocite producătoare de anticorpi şi facilitează diferenţierea altor limfocite T în celule citotoxice
sau cu funcţii supresoare.
256
18
HLA - Clasa II HLA - Clasa I
Celula T
Celula T
Receptorul Celulei T
Figura 18.1.4.1.4: Prezentarea fragmentelor antigenice celulelor T

de către moleculele HLA I şi II exprimate pe APC
Atât moleculele de clasa I cât şi cele de clasa II pot lega alternativ peptide proprii („self”) provenite
din degradarea fiziologică a proteinelor celulare. În mod obişnuit acestea nu declanşează activarea
limfocitelor T deoarece sunt tolerate de sistemul imun individual; în unele situaţii însă se pot declanşa
reacţii imune care iniţiază un proces de distrugere a self-ului ce conduce la autoimunitate2.
Nomenclatura HLA
Nomenclatura HLA este elaborată de către un comitet OMS constituit în acest sens. Identificarea
iniţială a moleculelor HLA a implicat folosirea de aloseruri umane obţinute ca urmare a aloimunizării
produse în cursul sarcinii sau a efectuării diverselor transplante. Astfel, nomenclatura rezultată reflectă
istoria acestui efort de descoperire, aceasta fiind stabilită în cadrul unor workshop-uri internaţionale.
Alotipurile au fost desemnate prin numere, cum ar fi HLA-A2, HLA-B27 şi HLA-Cw6, iar numerele
antigenelor HLA-A şi HLA-B nu se suprapun (vezi figura 18.1.4.1.5). Litera „w” folosită iniţial pentru a
desemna o anume categorie de workshop a fost păstrată pentru alotipurile HLA-C cu scopul de a le
distinge de componentele complementului C2 şi C4 care de asemenea sunt mapate în cadrul MHC8.
Figura 18.1.4.1.5: Tipaj HLA serologic
257
La testarea serologică unele aloseruri interacţionează cu mai mult de un produs alelic HLA, fenomen
denumit reactivitate încrucişată. În cazul produşilor alelici corespunzători locusurilor HLA-A şi HLA-B
acest fenomen a fost mult studiat şi utilizat pentru a clasifica moleculele în grupuri antigenice care
reacţionează încrucişat (CREGs). Moleculele de clasa I din cadrul unui CREG au în comun unul
sau mai mulţi determinanţi antigenici care nu se regăsesc la nivelul moleculelor unui alt CREG. Un
determinant antigenic (epitop) care este întâlnit la membrii unui CREG este denumit specificitate
publică (de exemplu: HLA-Bw4 şi HLA-Bw6)2.
Metodele serologice de tipaj HLA sunt înlocuite din ce în ce mai mult cu metode de biologie
moleculară (electroforeză de acizi nucleici, tehnici de hibridizare, precum şi de secvenţiere), care
au condus la modificarea nomenclaturii prin luarea în considerare a alelelor ADN. Astfel, o singură
specificitate definită serologic poate fi exprimată de două sau mai multe (>25) alele diferite (vezi figura
18.1.4.1.6).
Serologie
Alele ADN
antigene
Biologie
molecularĄ
Figura 18.1.4.1.6: Tipaj HLA – de la serologie la biologie moleculară
În cadrul nomenclaturii bazate pe ADN fiecare alelă HLA este desemnată prin numele locusului genei
urmat de un asterisc * şi un număr de 4-7 cifre care indică alela (de exemplu, A*0201 este o alelă
a genei HLA-A şi B*2701 este o alelă a genei HLA-B). Primele 2 cifre în denumirea fiecărei alele se
bazează frecvent pe tipul serologic al moleculei rezultate şi/sau similaritatea secvenţelor nucleotidice
la alte alele din cadrul grupului (vezi figura 18.1.4.1.7).
Gene polimorfe
Figura 18.1.4.1.7: Tipaj HLA prin biologie moleculară
258
18
Unele alele diferă prin secvenţa ADN a exonilor, dar nu şi prin secvenţa de aminoacizi rezultată
(datorită unor substituţii silenţioase sau sinonime); aceste alele sunt identificate prin adăugarea unei
a 5-a cifre la cele 4 cifre comune (de exemplu, B*27051 şi B*27052). În plus, cifrele 5-7 adăugate în
denumire indică faptul că 2 alele diferă numai prin secvenţe la nivelul intronilor (de exemplu, DRB4*
0103101 şi DRB4* 0103102). În exemplul dat DRB4* 0103102 prezintă un situs de splicing al ARN-
ului modificat care conduce la pierderea expresiei alelei; alelele care nu se exprimă ca proteine pot
avea un N adăugat la numele lor (de exemplu, A*215N şi DRB4* 0103102N)2;3.
Spre deosebire de tehnicile serologice, tipajul HLA bazat pe ADN prezintă net avantaje:
● este specific (fiecare reactiv pentru tipaj este clar definit şi se bazează pe o secvenţă nucleotidică
specifică);
● este flexibil (pe măsură ce sunt descoperite alele noi pot fi preparaţi reactivi noi);
● este mai robust decât alte tehnici (nu necesită limfocite viabile);
● poate fi aplicat pe scară largă;
● poate face o discriminare între alelele ADN care specifică proteine HLA ce nu pot fi diferenţiate
serologic; de exemplu, o persoană care prezintă alela DRB1* 0401 are acelaşi tip serologic DR4 ca şi
un individ care este purtător al alelei DRB4* 04122.
Prin tehnicile moleculare sunt identificate la ora actuală 4447 alele HLA clasa I şi II: 965 HLA-A,
1543 HLA-B, 626 HLA-C, 9 HLA-E, 21 HLA-F, 46 HLA-G, 855 HLA-DRB, 35 HLA-DQA1, 107 DQB1,
28 HLA-DPA1, 138 HLA-DPB3. Noille alele descoperite sunt prezentate în rapoarte periodice ale
Comitetului OMS, iar secvenţele nucleotidice ale tuturor alelelor sunt depozitate într-o bază de date
computerizată (GenBank, EMBL, IMGT/HLA databases)2.
Din aprilie 2010 intră în vigoare o modificare în nomenclatura HLA: ca urmare a numărului de alele
HLA în creştere s-a decis să se introducă „:” în denumirea alelor pentru a delimita câmpuri separate.
Astfel:
A*01010101 → A*01:01:01:01
A*260101 →A*26:01:01
A*3301 → A*33:01
B*0808N → B*08:08N
DRB1*01010101 → DRB1*01:01:01:01
Sunt de asemenea preconizate şi alte modificări, printre care şi aceea că litera „w” va fi scoasă din
denumirea alelelor HLA-C, dar va fi menţinută în cea a antigenelor HLA-C4.
Boli asociate cu sistemul HLA
Există un număr semnificativ de afecţiuni care prezintă o asociere cu genele MHC; în cele mai multe
cazuri este vorba de boli autoimune care nu au un mod de transmitere mendelian clasic. De exemplu,
spondilita ankilopoietică se asociază în 95% din cazuri cu HLA-B27.
O problemă majoră în legătură cu asocierile de gene MHC este penetranţa lor incompletă, ceea ce
face ca studiile formale de segregare şi linkaj să fie foarte dificil, dacă nu imposibil, de efectuat. O altă
necunoscută este numărul alelelor predispozante pentru o anumită boală într-o populaţie specifică; se
259
pare că multe boli asociate cu sistemul HLA sunt poligenice.

Asocierea genetică este reflectată în termenul de „risc relativ”, care reprezintă raportul statistic între
riscul individual de boală la purtătorii unui marker genetic şi riscul la indivizii aceleiaşi populaţii care
nu au acest marker. Un risc relativ mai mare decât 1 indică o asociere pozitivă între HLA şi boala
respectivă6.
Printre afecţiunile asociate cu HLA care au fost studiate extensiv se numără diabetul zaharat tip 1.
Cea mai puternică asociere este cea cu alelele clasei II HLA DR şi DQ. Genotipul heterozigot DR3/
DR4 conferă cel mai mare risc de diabet, urmat de genotipurile homozigote DR4 şi DR3.
La caucazieni heterodimerii HLA-DQ (lanţurile alfa DQA1 şi lanţurile beta DQB1) codificaţi de alelele
DQA1*0301, DQB1*0302, DQA1*0501, DQB1*0201 prezintă cea mai mare asociere cu diabetul de
tip 1. S-a observat că DQB1*0302 diferă de DQB1*0301 în poziţia 57, unde lipseşte un rest de acid
aspartic. Aceeaşi lipsă a acidului aspartic în poziţia 57 apare şi la alela DQB1*0201 şi s-a sugerat că
restul de aminoacid ar fi implicat în mecanismul molecular al susceptibilităţii faţă de diabet3.
Alte haplotipuri ale genelor HLA clasa II au rol protector faţă de dezvoltarea diabetului: DQA1*0102/
DQB1*0602/DRB1*1501. În special alela DQB1*0602 conferă protecţie, chiar şi la rudele de gradul I
ale pacienţilor diabetici care prezintă anticorpi anti-celule insulare pancreatice9.
Riscul absolut pentru diabet zaharat tip 1 în funcţie de genotipul HLA este prezentat în tabelul de
mai jos1:
DR3/DR3 1/125
DR3/DRX 1/500
DR4/DR4 1/147
DR4/DRX 1/476
DR3/DR4 1/42
DRX/DRX 1/5565
Testarea HLA este utilă pentru evaluarea riscului de a dezvolta diabet zaharat la persoane cu istoric
familial pozitiv.
Pacienţii purtători ai markerilor HLA DQB1*0201 şi/sau *0302 sau ai alelelor predispozante DR4
(DRB1*0405, DRB1*0402) ar trebui urmăriţi biochimic şi imunologic5.
Ca urmare a introducerii tehnicilor bazate pe ADN în tipajul HLA au fost depistate câteva asocieri
clare între progresia infecţiei HIV-1 către sindromul imunodeficienţei dobândite (SIDA) şi unele
antigene HLA clasa II. Astfel, în prezenţa HLA-B27 se constată o absenţă a progresiei către SIDA
pe termen lung, în timp ce asocierea cu HLA-B35 denotă o progresie rapidă. Diferenţa între cele 2
alele constă în numărul diferit de peptide virale care se pot lega de cele 2 molecule HLA-B exprimate;
molecula HLA-B27 leagă 15 tipuri diferite de peptide provenite din anvelopa virusului, pe când nici un
peptid viral nu conţine secvenţe de aminoacizi care să se lege preferenţial de HLA-B35. Prin urmare,
încărcarea moleculelor HLA cu peptide în vederea prezentării antigenului constituie o etapă critică.
Infecţia HIV este controlată de către celulele T CD8+ o perioadă de timp variabilă; mărimea acestei
perioade depinde de numărul peptidelor virale recunoscute8.
260
18
În ceea ce priveşte asocierea HLA cu borrelioza, conform datelor din literatura sunt raportate:
- HLA asociate cu boala Lyme refractară la tratament, adică cu autoimunitate indusă de agentul
patogen:
DR1 (HLA-DRB1*0101)
DR2 (HLA-DRB1*1501)
DR4 (HLA-DRB1*0401,*0402,*0403,*0404,*0405,*0407)
- HLA asociate cu producţie scazută de anticorpi specifici de Borrelia, în prezenţa infecţiei certe:
alele DR1 (HLA-DRB1*0101,*0102,*0103,*0104,*0105).
În concluzie, determinarea antigenelor HLA poate fi folosită astăzi ca marker pentru diagnosticul
diferenţial al multor afecţiuni. În tabelul de mai jos sunt prezentate exemple de afecţiuni asociate cu
anumite constelaţii HLA, împreună cu riscul relativ de boală7.
Boală Antigen HLA Risc relativ

Alergia la latex DR4, DQB1*0302 (DQ3) 2.4
Alergia la insulină B7, B21 5.4
Alopecia areata B12 5.4
Alveolita alergică exogen-allergischexogenă DR6 16.5
Anemia aplastică DR2 2.2
Anemia pernicioasă DR5 5.4
DR8 8.0
Artrita cronică juvenilă
DR5 3.3
B27 10.7
Artrita psoriazică
B38 9.1
Artrita reactivă - infecţii cu: Shigella, Yersinia,
B27 40.0
Salmonella
Artrita Lyme (infectie cu Borrelia) DR2/DR4 22.0
Astm indus de aspirină DQ2 4.1
Boala Addison (idiopatică) DR3 6.3
Boala Alzheimer B7/Cw3 28.0
Boala Basedow DR3 4
Boala Behcet B51 6.3
Boala Behcet (forma muco-cutanată) B12 5.6
Boala Bechterew B27 87.4
Boala celiacă DQ2/DQ7/DQ8 52.0
Boala Crohn DR1, DR4, DR7 2.0-7.0
Boală mixtă de ţesut conjunctiv DR4 3
Ciroza biliară primară (PBC) DR3, DRB1*0803 (DR8) 3-6.8
Corioretinopatie “birdshot” A29 224
261
Colangita sclerozanta primitivă (CSP) DR3, DR8 4.5-15

Dermatita herpetiformă DR3/DR7 17.3
Dermatomiozita DR3/DR52 5
DQ2/DQ3 subtipuri
> 50
Diabet zaharat tip I DRB1*0405 (DR4)DQ*0602
Protectiv
(DQ6)DQB1*0602 (DQ6)
Deficit selectiv de IgA, DR3 17.0
Glomerulonefrita membranoasă idiopatică DR3 12.0
Granulomatoza Wegener DR9 6.7
Hemocromatoza idiopatică A3/B7/B14 90.0
4.7
Hepatita cronică autoimună DR3, DR4, DR8, DR52
Hepatita B, evoluţie cronică B35 158.0
Ag Hbs - purtători sănătoşi B41 11.2
B47 15.4
Hiperplazia CSR congenitală
DR3 6.3
HIV - hipersensibilitate la Abacavir B * 5701 117
B27 Protector
HIV - evolutie lentă
B57 Protector
Lichen plan DR1 11.8
Litiaza biliară A19 131
Lupus eritematos sistemic (LES) DR2/DR3 5.8
Lupus iatrogen DR4 5.6
DR3 3.9
Miastenia gravis
DR5 3.6
Narcolepsie DQB1*0602, DRB1*1501 130.0
Nefrită lupică DR2/DQ1 14.0
Nefropatia IgA DR4 5.5
Nefropatia membranoasă idiopatică DR3 3-12
Panencefalita sclerozantă subacută (SSPE) A29 3.6
Pemfigus vulgar DR3, DR4 14.4
Pemfigus foliaceu DR1 7.3
Poliartrita reumatoidă DR1/DR4 subtypes 10.2
DR3 2.3
Polimialgia reumatică
DR4 5.7
Polimiozită DR3/DR52
262
18
B17, B37 6.7

Psoriazis vulgar
Cw6 33.0
Purpura trombocitopenică autoimună DR2 9.2
Sindrom Reiter B27 37.0
Retinopatia diabetică B8 4.0
B7/B8
Sarcoidoză 8.5
DR2, DR3, DR5
Sarcom Kaposi DR5 5.3
A9/B27 11.9
Schizofrenie
A2/A11 9.8
DR3 16.7
Sclerodermie (PSS)
DR5 10,0 10.0
Scleroza multiplă DR2/DQ6 subtypes 4.1
Sindrom androgenital – forma cu debut tardiv B14 48.5
Sindrom androgenital – forma cu pierdere de
B47 51.0
sare
Sindrom antifosfolipidic DR4, DR7 5.1
Sindrom astmatiform indus de analgezice A1/B8/DR3 28.9
Sindrom CREST DR5 8.1
Sindrome Goodpasture DR2 15.9
Sjögren-SyndromSindrom Sjögren DR2/DR3 9.7
Stomatita, aftoza recurentă B7 6.0
Tiroidita Hashimoto DR3, DR5 3.2
Tiroidita de Quervain (subacută) B35 13.7
Tiroidita postpartum DR4/DR5 8.0
Trombocitopenia neonatală aloimună DR3 9.2
Uveita anterioară acută B27 10-50
Pregătire pacient - nu este necesară o pregătire specială; pe formularul de trimitere se va preciza

afecţiunea suspectată pentru care se solicită testarea HLA7.
Cauze de respingere a probei - folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate;
probe refrigerate sau congelate7.
agaroză /tehnica Dynal SSP (primeri cu secvenţă specifică)7.
263
Rezultatul pozitiv la un antigen HLA asociat cu o anumită afecţiune arată o predispoziţie genetică.
Rezultă un risc relativ al purtătorului de a se îmbolnăvi, comparativ cu populaţia „normală” (vezi
tabelul). În cazul suspiciunii unei anumite afecţiuni, evidenţierea antigenului HLA reprezintă un criteriu
de diagnostic7.
Bibliografie
1. E. Albert Reece, Donal R.Coustan, Steven G.Gabe. Diabetes in Women, ed.3, 2004, 61-62.
2. H. Davis, Richard A. McPherson. Human Leukocyte Antigen: The Major Histocompatibility
Complex of Man. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods,
Saunders-Elsevier, 21st Edition, 2007, 876-886.
3. HLA Nomenclature. IMGT/HLA database. www.ebi.ac.uk/imgt/hla/nomenclature/index.html. Ref
4. HLA Nomenclature Changes Effective April 1, 2010. www.ashi-hla.org. Ref Type: Internet
Communication.
5. Jacob Sten Petersen. Antigen-based Prediction and Prevention of Type 1 Diabetes. In Danish
Medical Bulletin nr.4/2006 418-437.
6. Julio C. Delgado, Edmond J. Yunis. The Major Histocompatibility Complex and Disease. In
Edition, 8, 894-902.
8. Robert J. Winchester. The Major Histocompatibility Complex. In Clinical Immunology. Principles
and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 79-89.
9. V. Radha, K.S.Vimaleswaran, R.Deepa, V. Mohan. The genetics of diabetes mellitus. In Indian J
Med Res 117/2003 225-238.
18.1.4.2 HLA DR4/DR1 - shared epitope

Asocierea dintre polimorfismul specific HLA şi afecţiunile reumatice este bine cunoscută de multă
vreme. Până în anii 1980 cele mai multe studii corelau prezenţa specificităţilor serologice HLA cu
polimorfismul genelor HLA. Studiile mai recente, utilizând tehnici moleculare, au identificat gene
specifice sau haplotipuri răspunzătoare de modificările din bolile reumatice. Asocierea genetică este
reflectată în termenul de „risc relativ”, care reprezintă raportul statistic între riscul individual de boală
la purtătorii unui marker genetic şi riscul la indivizii aceleiaşi populaţii care nu au acest marker. Un risc
264
18
relativ mai mare decât 1 indică o asociere pozitivă între alela HLA şi boala respectivă6.
Mecanismele prin care unele alele HLA conduc sau favorizează apariţia unei boli nu sunt complet
elucidate. După toate aparenţele, nu există un mecanism unic de producere a tuturor bolilor reumatice
şi, respectiv, autoimune prin intermediul HLA. Există mai multe ipoteze în acest sens:
● Alele HLA de risc pentru o anumită boală se asociază printr-un dezechilibru de linkaj cu adevărata
mutaţie care determină boala.
● Moleculele HLA corespunzătoare unor anumite alele acţionează ca receptori pentru diferiţi patogeni
cu rol de trigger.
● Moleculele HLA corespunzătoare unor anumite alele au afinitate crescută pentru peptide
artritogene.
● Moleculele HLA corespunzătoare unor anumite alele au asemănări structurale cu molecule ale
agenţilor patogeni, ceea ce conduce la reacţii încrucişate.
● Anumite alele HLA influenţează răspunsul imun la diferite antigene, inclusiv autoantigene.
● Anumite haplotipuri HLA conservate în diferite populaţii, probabil prin conferirea de avantaje de
selecţie, se asociază mai frecvent cu apariţia de boli reumatice autoimune; este posibil ca aceste
haplotipuri să conserve mutaţii multiple, favorizând apariţia bolii5.
Poliartrita reumatoidă (PR) este asociată frecvent cu HLA-DR4. La caucazieni, de exemplu, alelele
DR4 cel mai frecvent asociate cu PR sunt DRB1*0401 şi DRB1*0404, în timp ce la pacienţii din
Japonia, Israel şi China predomină alela DRB1*0405.
Şi alte specificităţi serologice HLA-DR sunt asociate cu PR: DR1 a fost raportat la caucazieni şi la
pacienţi proveniţi din Japonia, Spania, Grecia, Israel; DR3 este întâlnit în Kuweit, DR6 la indienii
Yakima din America, DR9 în Chile şi DR10 în Spania, Grecia şi Israel.
Pentru a explica spectrul larg al diferitelor asocieri HLA-DR cu PR s-a presupus ca ar fi implicată o
secvenţă peptidică înalt conservată, comună mai multor alele HLA-DRB1 sau o variantă a acesteia,
denumită „shared epitope” sau epitop comun, care conferă predispoziţia faţă de PR2. Studiile au
arătat că alelele HLA-DRB1 asociate cu PR codifică în poziţiile 70-74 ale regiunii hipervariabile
3 a lanţului beta secvenţele de aminoacizi QKRAA (*0401), QRRAA (*0404, *0405, *0408, *0101,
*0102) sau RRRAA (*1001). Aceste reziduuri de aminoacizi pot afecta legarea peptidelor antigenice
şi prezentarea acestora limfocitelor T (TCR)2;3;4. La debutul răspunsului imun, rolul primar al moleculei
de HLA este de a lega antigenul peptidic şi de a-l prezenta receptorului celular al limfocitului T (TCR)1.
Regiunea din jurul poziţiei 70 este implicată în formarea “şanţului” care leagă catena laterală a
peptidului antigenic şi de asemenea interacţionează direct cu TCR.
Conform acestui model structural care explică susceptibilitatea pentru PR, epitopul comun controlează
natura interacţiunii trimoleculare între TCR, peptidul antigenic şi molecula HLA prin crearea unei
potriviri între elemente, care va conduce în final la activarea limfocitului T. Astfel, controlul se poate
exercita prin influenţarea secvenţei specifice a peptidului antigenic captat în “şanţul” moleculei HLA, a
recunoaşterii directe a complexului HLA-peptid antigenic de către TCR sau a ambelor6.
Dacă ar exista un peptid artritogen acesta s-ar lega preferenţial de epitopul comun. Totuşi acesta nu
a fost identificat până în prezent. O explicaţie alternativă implică un mimetism molecular între epitopul
comun şi secvenţele antigenice ale patogenului care induce PR. În acest sens, a fost constată o
omologie a secvenţelor între epitop şi o proteină de şoc termic (HSP) provenită de la E. coli2.
265
Recent un grup de cercetători a reconsiderat ipoteza epitopului comun şi a formulat o nouă clasificare
a alelelor HLA-DRB1 valabilă pentru populaţia caucaziană. Conform investigaţiilor efectuate, riscul de
dezvoltare a poliartritei reumatoide depinde de localizarea secvenţei RAA în poziţiile 72-74 precum şi
de tipul aminoacizilor din poziţiile 71 şi 70. Astfel, în cazul acestor alele RAA asocierea lizinei (K) în
poziţia 71 conferă cel mai mare risc, cea a argininei (R) un risc intermediar şi cea a alaninei (A) sau
a acidului glutamic (E) riscul cel mai scăzut. Glutamina (Q) sau arginina (R) din poziţia 70 conduc la
un risc mai mare decât acidul aspartic (D). Ţinând cont de aceste constatări alelele HLA-DRB1 pot
fi clasificate în două grupuri în funcţie de prezenţa sau absenţa secvenţei RAA în poziţiile 72-74,
respectiv alelele S şi X. Alelele S pot fi subîmpărţite în trei categorii în funcţie de tipul aminoacidului
din poziţia 71: S1 atunci când este vorba de alanină sau acid glutamic (secvenţe A-RAA şi E-RAA),
S2 în prezenţa lizinei (secvenţa K-RAA) şi S3 atunci când este prezentă arginina (secvenţa R-RAA).
La rândul lor alelele S3 pot fi împărţite în funcţie de tipul aminoacidului din poziţia 70 astfel: S3D care
codifică secvenţa D-R-RAA şi S3P care codifică secvenţele Q-R-RAA sau R-R-RAA. Deoarece alele
S2 pot avea aminoacizii Q sau D în poziţia 70 rezultă secvenţele D-K-RAA şi Q-K-RAA (vezi tabelul
18.1.4.2).
Secvenţa de aminoacizi
Clasificarea alelelor Alelele HLA-DRB1
din poziţia 70-74
*0103, *0402, *1102, *1103, *1301,
S1 D-E-RAA
*1302, *1304, *1323
Q-A-RAA *15
S2 Q-K-RAA *0401
D-K-RAA *1303
*1101, *1104, *12, *1305, *1306,
S3D D-R-RAA
*1325, *1422, *16
S3P Q-R-RAA *0101, *0102, *0404, *0405, *0408
R-R-RAA *1001
X Q-K-RGR *03
Q-R-RAE *0403, *0407, *0411
D-R-RGQ *07
D-R-RAL *08
R-R-RAE *0901, *1401, *1404
Tabel 18.1.4.2: Clasificarea alelelor HLA-DRB1
Studiul efectuat a dus la următoarele constatări:

- alelele S1, S3D şi X sunt asociate cu risc scăzut (denumite din acest motiv alele L);
- prin combinarea alelelor menţionate rezultă următoarele 6 genotipuri, prezentate în ordinea
descrescătoare a riscului relativ de dezvoltare a PR: S2/S3P (risc relativ 22.2), S2/S2 (risc
relativ 20.5), S3P/S3P (risc relativ 8.2), S2/L (risc relativ 5.9), S3P/L (risc relativ 4) şi genotipul
266
18
L/L (de referinţă).

Această clasificare a alelelor HLA-DRB1 ar putea contribui la descifrarea componentei genetice a PR
dacă diferenţele semnificative dintre genotipuri vor fi corelate cu mecanisme fiziopatologice distincte.
Studii recente au indicat că asocierea epitop comun-PR este limitată la artrita reumatoidă cu anticorpi
anti-CCP pozitivi.
În concluzie, evidenţierea epitopului comun este asociată cu un risc crescut de dezvoltare a PR şi
poate ajuta diagnosticul în faza precoce a bolii. Prezenţa unui “shared epitope” este mai ales un
marker prognostic pentru evoluţia şi severitatea bolii, deoarece progresia rapidă şi severă a eroziunii
articulare se corelează cu statusul HLA-DRB1 şi tipul epitopului. A fost demonstrat şi un efect de
doză-genă: pacienţii care au 2 alele ce codifică un epitop comun prezintă o evoluţie mai severă decât
pacienţii purtători ai unei singure alele sau a nici uneia. În special epitopii comuni de pe alelele
DR4 sunt predictivi pentru o formă progresivă şi distructivă de boală, cu manifestări extraarticulare.
Genotipul HLA-DRB1*0401/0401 este asociat cu sindromul Felty.
Referitor la terapia medicamentoasă, s-a demonstrat că pacienţii homozigoţi pentru DR4-shared
epitope sau pacienţii cu 2 alele ce codifică un epitop comun răspund mai bine la etanercept (sau la alţi
agenţi biologici) decât la metotrexat.
Testul efectuat în laboratorul nostru permite:
- tipajul alelelor HLA-DRB1: DRB1*01 (DR1), DRB1*04 (DR4) şi DRB1*1001, printr-o tehnică
de rezoluţie joasă;
- diferenţierea alelelor HLA-DRB1*01 şi DRB1*04 în alele pozitive sau negative pentru
“shared epitope”, printr-o tehnică de înaltă rezoluţie;
- tipajul secvenţelor de aminoacizi din “shared epitope”: QKRAA, QRRAA sau RRRAA;
- precizarea statusului heterozigot sau homozigot pentru “shared epitope”4.
Recomandări pentru efectuarea testului
- identificarea şi diferenţierea cazurilor clinic incerte de PR;
- stabilirea prognosticului bolii la pacienţii diagnosticaţi cu PR;
- identificarea pacienţilor cu risc de a dezvolta PR pentru ca la apariţia manifestărilor clinice să se
intervină terapeutic precoce şi agresiv (alegerea/optimizarea terapiei)4.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) urmată de analiza produşilor de amplificare prin revers-
hibridizare pentru detectarea epitopului comun QKRAA/QRRAA/RRRAA4.
Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor
Epitop comun QKRAA/QRRAA/RRRAA: Negativ.
În cazul unui rezultat pozitiv se va comunica dacă este vorba de o singură alelă sau de 2 alele care
codifică un epitop comun; se va preciza de asemenea tipul alelelor HLA-DRB14.
267
Bibliografie
1. Jean Roudier. HLA-DRB1 genes and extraarticular rheumatoid arthritis. In Arthritis Research &
Therapy 2006, 8:103.
2. Julio C. Delgado, Edmond J. Yunis. The Major Histocompatibility Complex and Disease. In
Edition, 2007, 900-901.
3. Laëtitia Michou, Pascal Croiseau, Elisabeth Petit-Teixeira, Sophie Tezenas du Montcel, Isabelle
Lemaire, Céline Pierlot, José Osorio, Wafa Frigui, Sandra Lasbleiz, Patrick Quillet, Thomas
Bardin, Bernard Prum, Françoise Clerget-Darpoux, François Cornélis and the European
Consortium on Rheumatoid Arthritis Families. Validation of the reshaped shared epitope HLA-
DRB1 classification in rheumatoid arthritis. In Arthritis Research & Therapy 2006, 8:R79.
5. Mihai Bojincă. Aspecte genetice în boli reumatice. În Esentialul în Reumatologie. Editura
Amaltea, 2007, 60-66.
6. Ravinder N Maini, Nathan J Zvaifle. Rheumatoid artritis and other synovial disorders-section 5-
r.1998 Ed.Mosby.
18.1.4.3 HLA-B27

Testul are drept scop să stabilească dacă este prezent sau nu pe suprafaţa leucocitelor antigenul
HLA-B27, pentru a evalua posibilitatea existenţei unei boli autoimune asociate cu acest marker5.
Antigenul HLA-B27 este întâlnit la 90-95% din pacienţii cu spondilită ankilopoietică, deţinând un rol
important în apariţia bolii, în timp ce incidenţa sa în populaţia generală este de aproximativ 8%.
Rudele de gradul întâi HLA-B27 pozitive ale pacienţilor cu spondilită ankilopoietică au într-un procent
de 10-20% simptome clinice şi radiologice de boală sau numai modificări radiologice. Studiile pe
gemenii monozigoţi arată o concordanţă a bolii de 60%; pentru cei dizigoţi concordanţa este de 20-
25%4.
HLA-B27 este extrem de heterogen descriindu-se peste 35 subtipuri moleculare (HLA-B*2701 –
B*2736). Subtipurile HLA-B27 diferă prin anumiţi aminoacizi care foarte probabil sunt implicaţi în
legarea peptidelor antigenice specifice. Subtipurile asociate în mod cert cu spondilita ankilopoietică,
sunt HLA-B*2705, HLA-B*2702, HLA-B*2704, HLA-B*2707, HLA-B*2714. Pentru HLA-B*2706
şi HLA-B*2709, care sunt întâlnite la persoane din sud-estul Asiei şi Sardinia, nu s-a demonstrat
asocierea cu spondilartropatiile seronegative. Celelalte subtipuri de HLA-B27 sunt prea rare pentru a
fi stabilită o asociere cu boala. La subtipul HLA-B*2722 s-a constatat o eroare de secvenţiere, motiv
pentru a care a fost retras din clasificare1.
HLA-B27 deţine un rol dublu în ceea ce priveşte recunoaşterea antigenului de către limfocitul T. Pe
268
18
de o parte are rol în alegerea repertoriului receptorului pentru antigen al limfocitului T citotoxic CD8+
în timus, selectând în special unele grupe de celule T CD8+ cu proprietăţi artritogene. Pe de altă
parte, HLA-B27 este implicat în legarea şi prezentarea antigenului către limfocitul T citotoxic CD8+
în ţesuturile periferice4.
Între HLA-B27 şi o proteină a agentului infecţios Klebsiella pneumoniae există un mimetism molecular,
ceea ce ar putea implica existenţa unei patogenii bacteriene a spondilitei ankilopoietice. Este posibil ca
această similitudine antigenică să permită dezvoltarea unui răspuns imun încrucişat, cu selecţionarea
de limfocite T CD8+ faţă de celule ce exprimă HLA-B27, sau să favorizeze persistenţa agentului
infecţios prin toleranţă imună3;4.
Alte afecţiuni autoimune asociate cu HLA-B27 sunt:
- sindromul Reiter (artrita reactivă): incidenţa HLA-B27 este de 60-80%;
- artrita idiopatică juvenilă: incidenţa HLA-B27 este de 50% în forma de debut cu artrită
asociată entesitei;
- artrita psoriazică: incidenţa HLA-B27 este de 50% la pacienţii care asociază afectare
axială;
- bolile inflamatorii ale intestinului: incidenţa HLA-B27 este de 50% la pacienţii care asociază
spondilită4;5.
hemolizate2.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) cu detecţie colorimetrică după hibridizarea cu sonde
specifice pe stripuri; testul detectează următoarele subtipuri HLA-B27: 02-17, 19-21, 24, 25, 27, 28,
30, 32-362.
Valori de referinţă - HLA-B27 negativ2.
HLA-B27 nu este un test screening pentru o spondilartropatie seronegativă. Rezultatul trebuie
interpretat întotdeauna în contextul clinic al pacientului2;3.
Testul nu detectează următoarele subtipuri de HLA-B27: 01, 18, 23, 26, 29, 312.
Bibliografie
1. John D. Reveille. Spondyloarthritis. In In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby,

Elsevier,Third Edition, 2008, 839-842.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. HLA-B27.
4. Ruxandra Ionescu. Spondilartropatii seronegative. În Esenţialul în reumatologie, ed. a 2-a
269
revizuita. Editura Medicală AMALTEA, 2007, 281-312.

5. www.labtestsonline.org. HLA-B27. Reference Type: Internet Communication.
18.1.4.4 Predispoziţie genetică boala celiacă (tipaj HLA-DQ)
Boala celiacă (numită şi celiachie, intoleranţă la gluten, enteropatie glutenică, sprue celiac sau
sprue nontropical) este o afecţiune inflamatorie digestivă cronică, cauzată de ingestia de gluten, ce
împiedică absorbţia nutrienţilor, vitaminelor şi mineralelor de către intestin. Se caracterizează printr-o
sensibilitate menţinută pe tot parcursul vieţii la fracţiunile solubile în alcool ale glutenului: gliadinul din
grâu şi prolaminele din orz, secară şi ovăz, sensibilitate întâlnită la persoanele predispuse genetic.
Dintre fracţiunile glutenului, gliadinul reprezintă cel mai toxic component. Nu este vorba despre o
alergie, ci de o boală autoimună mediată de către limfocitele T, în care transglutaminaza tisulară din
intestinul subţire formează cu gliadinul alimentar autoantigenul propriu-zis. Deoarece numai anumite
antigene HLA leagă gliadinul şi-l prezintă sistemului imun, boala apare la purtătorii acestor antigene.
Astfel se explică caracterul familial al acestei afecţiuni, înregistrându-se o prevalenţă de 10% la rudele
de gradul I ale persoanelor afectate şi o concordanţă a bolii de până la 70% la gemenii monozigoţi.
Boala celiacă este destul de frecvent întâlnită în populaţie, în Europa având o prevalenţă de 1:200-
1:500. Femeile sunt de 2-3 ori mai afectate decât bărbaţii3.
Ca şi în cazul altor boli inflamatorii autoimune în patogenia bolii celiace sunt incriminaţi factori genetici
(prezenţa anumitor antigene HLA), încărcarea cu gluten a organismului, precum şi alţi factori insuficient
caracterizaţi care favorizează apariţia manifestărilor la unele persoane cu predispoziţie genetică1.
Susceptibilitatea faţă de boala celiacă este conferită de anumite alele HLA de clasa a 2-a din regiunea
HLA-DQ. Astfel, cei mai mulţi pacienţi (90-95%) prezintă heterodimerul HLA-DQ2 codificat de alelele
DQA1*05 şi DQB1*02, în timp ce ~5% prezintă heterodimerul HLA-DQ8 codificat de alelele DQA1*03
şi DQB1*0302. Majoritatea pacienţilor prezintă haplotipul DR3-DQ2 (DRB1*0301-DQA1*0501-
DQB1*0201) sau sunt heterozigoţi pentru DR5-DQ7/DR7-DQ2 (DRB1*11/12-DQA1*0505-
DQB1*0301/DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0202). Aceasta înseamnă că molecula dimerică DQ2
alcătuită dintr-un lanţ α şi un lanţ β poate fi codificată de alele DQA1*0501 şi DQB1*0201 situate pe
acelaşi cromozom (configuraţie cis – fig. 18.1.4.4.1A) sau de către alele DQA1*0505 şi DQB1*0202
situate pe cromozomi diferiţi (configuraţie trans – fig. 18.1.4.4.1B). Pacienţii negativi pentru DQA1*05
şi DQB1*02 sunt adesea pozitivi pentru haplotipul DRB1*04-DQA1*03- DQB1*0302 (haplotip DR4-
DQ8). Molecula DQ8 alcătuită de asemenea dintr-un lanţ α şi un lanţ β este codificată de alele situate
pe acelaşi cromozom (configuraţie cis – fig. 18.1.4.4.1C). Foarte rar pacienţii poartă fie numai lanţul
α (*0501 sau *0505), fie numai lanţul β (*0201 sau *0202) al heterodimerului DQ2 (jumătate din
heterodimerul DQ2)1;4.
270
18
Fig.18.1.4.4.1 Formarea moleculelor DQ2 şi DQ8

(Adaptare după Celiac Disease, Gene Reviews)
Susceptibilitatea faţă de boală legată de genotipul HLA-DQ2 este transmisă autozomal-dominant sau
autozomal recesiv în funcţie de genotipurile HLA predispozante ale părinţilor (vezi fig. 18.1.4.4.2A).
Susceptibilitatea faţă de boală legată de genotipul HLA-DQ8 este transmisă autozomal-dominant
(vezi fig. 18.1.4.4.2B).
Fig. 18.1.4.4.2 Modul de transmitere a susceptibilităţii legate de DQ2 (A) şi DQ8 (B) în familiile în
care unul din părinţi prezintă haplotipul HLA predispozant respectiv, iar celălalt nu prezintă acest
haplotip. Varianta HLA-DQB1*0302 este moştenită întotdeauna împreună cu secvenţa HLA-DQA1*03
ca urmare a dezechilibrului de linkaj. (Adaptare după Celiac Disease, Gene Reviews)
271
Deoarece 30% din populaţia generală prezintă una dintre alelele HLA asociate cu boala celiacă
(care codifică heterodimerii DQ2 şi/sau DQ8) şi numai 3% dintre cei care prezintă unul sau ambii
heterodimeri dezvoltă boala, identificarea acestor alele nu stabileşte diagnosticul ci indică numai un
risc crescut. Pe de altă parte însă, absenţa oricărei alele HLA asociate cu boala celiacă exclude
practic acest diagnsotic1.
Diagnosticul de boală celiacă se confirmă prin efectuarea biopsiei de mucoasă intestinală, la care
se constată modificări caracteristice (leziuni ce variază ca severitate, de la atrofie până la dispariţia
vilozităţilor intestinale).
Anumite boli, mai ales cele autoimune, apar la pacienţii cu celiachie de 10 ori mai frecvent decât în
populaţia generală. La apariţia lor concomitentă, de multe ori celiachia este asimptomatică: dermatita
herpetiformă Duhring, deficit selectiv de Ig A, ciroza biliară primitivă, sindrom Sjögren, diabet zaharat
de tip I, sindrom Down sau Turner, boala Crohn, colita ulceroasă, osteoporoza, tiroidita autoimună3.
Expunerea la gluten este obligatorie pentru ca boala celiacă să se manifeste la persoanele cu
susceptibilitate genetică. Acest fapt este dovedit prin absenţa leziunilor şi simptomelor la persoanele
cu boală celiacă la care s-a instituit dieta fără gluten.
Proteinele din structura glutenului se caracterizează printr-un conţinut crescut de prolină şi glutamină
care le conferă o rezistenţă relativă faţă de degradarea enzimatică şi le permite astfel să se menţină
la dimensiunea necesară pentru se lega de moleculele DQ2 sau DQ8 de pe suprafaţa macrofagelor
şi de a stimula celulele T CD4+. Într-adevăr au fost izolate din mucoasa pacienţilor cu boală celiacă
celule T ce reacţionează cu peptidele glutenului în prezenţa moleculelor DQ2 sau DQ8. Pe de altă
parte celulele T izolate din mucoasa normală nu sunt reactive faţă de gluten chiar la persoanele
DQ2+.
Există argumente foarte convingătoare cu privire la rolul important al celulelor T CD4+ din lamina
propria în patogenia bolii celiace (vezi fig.18.1.4.4.3). Deoarece celulele T sunt separate de peptidele
de gluten prin stratul epitelial, peptidele trebuie să traverseze mucoasa, iar mecanismul acestei
translocaţii este neclar. În lamina proprie transglutaminazele tisulare acţionează asupra peptidelor
glutenului pentru a le deamida, transformând glutaminele selectate în acid glutamic încărcat negativ.
S-a demonstrat că peptidele de gliadin deamidate au capacitatea de a se lega mai bine de “şanţul”
moleculei HLA de tip DQ2 sau DQ8 care prezintă “buzunare” încărcate pozitiv. De fapt, celulele T
CD4+ din lamina propria a mucoasei afectate recunosc în principal peptide de gliadin deamidate.
Deşi există o mare variabilitate a secvenţelor peptidice specifice care activează celulele T izolate de
la persoane diferite, a fost identificat un “motiv“ peptidic care poate activa un număr mare de clone
de celule T izolate din mucoasa celiacă. Acest “motiv“ poate fi relaţionat cu “şanţul” DQ2 de legare a
antigenului, a cărui structură cristalină este cunoscută. S-a estimat că numărul proteinelor din grâu,
orz, secară care prezintă “motive“ corecte de legare DQ2 sau DQ8 reprezintă doar o mică fracţiune
din totalul secvenţelor potenţial prezente în aceste cereale. Celulele T CD4+ gliadin-specifice din
lamina proprie a pacienţilor cu celiachie secretă interferon gamma (INF-γ), ceea ce sugerează că
acestea sunt polarizate către un fenotip efector Th1. Aceste celule activează o varietate de citokine
inflamatorii, metaloproteinazele tisulare care se presupune că generează leziunile histopatologice
locale. INF-γ creşte permeabilitatea intestinală şi facilitează translocaţia unui număr şi mai mare de
peptide, întreţinând astfel un cerc vicios. Evenimentul care declanşează întreaga cascadă nu este
272
18
încă precizat, dar infecţiile gastrointestinale cu virusuri enterice au fost de mult suspectate ca fiind un
trigger crucial. Lamina proprie conţine celule T reglatoare (Tregl) dar rolul acestora în boala celiacă
este puţin cunoscut2.
REACğII IMUNE
Ac-antigliadin
Gluten (Gliadin) Ac anti-transglutaminază
HLA
LIMFOCIT T
GLIADIN-SPECIFIC
MACROFAG
HLA-DQ2
HLA-DQ8
Histopatologic
Infiltrat limfocitar
Atrofie vilozităĠi intestinale
Fig. 18.1.4.4.3 Patogenia bolii celiace
Transglutaminaza tisulară (tTG) a fost identificată ca fiind autoantigenul major în boala celiacă. În
condiţii patologice transglutaminaza (tTG) eliberată extracelular poate forma complexe cu proteine
(sau cu peptide rezultate din hidroliza lor) cu un conţinut crescut în glutamină, ca cele din grâu.
Aceste complexe reprezintă neonatigene ce pot stimula de asemenea producţia de anticorpi
specifici; din punct de vedere diagnostic, anticorpii anti-tTG au o sensibilitate şi specificitate de peste
95% pentru boala celiacă3.
Recomandări pentru determinarea alelelor HLA de predispoziţie
• pacienţi simptomatici cu niveluri echivoce de anticorpi anti-tTG sau cu un rezultat neconcludent la
biopsia de mucoasă intestinală;
• pacienţi anterior simptomatici care au devenit asimptomatici după instituirea dietei fără gluten şi care
nu doresc să efectueze testul de provocare cu gluten;
• pacienţi simptomatici care nu răspund la dieta fără gluten;
• diagnosticul diferenţial la un pacient care prezintă simptome similare bolii celiace;
• rudele de gradul 1 şi 2 ale pacienţilor cu boala celiacă;
• evaluarea pacienţilor din grupele de risc amintite mai sus.
În concluzie, testul este util pentru excluderea unei celiachii şi identificarea pacienţilor cu risc1;3.
273

Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) cu detecţie prin electroforeză în gel de agaroză/tehnica
Dynal SSP (primeri cu secvenţă specifică); sunt determinate genotipurile HLA-DQA1 şi HLA-DQB1
pentru a detecta prezenţa sau absenţa alelelor asociate cu boala celiacă HLA-DQA1*0501, HLA-
DQA1*0505, HLA-DQB1*0201, HLA-DQB1*0202 şi HLA-DQB1*03023.
Un rezultat negativ pentru alelele de predispoziţie HLA DQ2 şi DQ8 exclude virtual diagnosticul de
boală celiacă şi indică un risc extrem de scăzut (<1%) de a dezvolta boala în cursul vieţii, indiferent
de dietă1;4.
Identificarea unei alele HLA predispozante la o persoană conferă un risc cumulat de 3% de a dezvolta
boala celiacă.
O rudă de gradul I a unei persoane cu boală celiacă care poartă aceeaşi alelă predispozantă prezintă
un risc de până la 40% de a dezvolta boala.
Persoanele care prezintă numai genotipul HLA DQ8 au un risc mult mai mic decât cele care prezintă
doar genotipul HLA DQ2.
Nu există o diferenţă în ceea ce priveşte severitatea bolii între pacienţii care prezintă numai genotipul
HLA DQ8 şi cei care poartă doar genotipul HLA DQ2.
Persoanele care prezintă ambele genotipuri HLA-DQ2 şi HLA-DQ8 nu au un risc mai mare de boală
în comparaţie cu cele care prezintă doar genotipul HLA DQ2; pe de altă parte, aceste persoane au o
probabilitate mai mare de a dezvolta boală faţă de cele care prezintă doar genotipul HLA DQ8.
Homozigoţia faţă de o alelă DQB1*02 la o persoană DQ2+ conferă un risc de cinci ori mai mare
pentru boala celiacă în comparaţie cu restul persoanelor DQ2+. De asemenea homozigoţia faţă de
o alelă DQB1*02 este raportată mai frecvent la persoanele cu tablou clasic de boală celiacă decât la
cele cu manifestări atipice, precum şi în cazurile de sprue refractar sau de limfom cu celulă T asociat
enteropatiei (Enteropathy-associated T-cell lymphoma = EATL).
Persoanele care prezintă numai jumătate din heterodimerul DQ2 - numai o variantă HLA-DQA1 (*0501
sau *0505) sau HLA-DQB1 (*0201 or *0202), dar nu ambele - pot dezvolta boala celiacă însă riscul
este foarte mic comparativ cu cei care prezintă heterodimerul complet.
Persoanele la care s-a depistat o alelă HLA predispozantă vor fi monitorizate serologic la un interval
de 3-5 ani1.
Identificarea unei alele HLA predispozante nu dovedeşte existenţa bolii celiace4.
Bibliografie
1. Cara L Snyder, Danielle O Young, Peter HR Green, Annette K Taylor. Celiac Disease. Gene
Reviews, 2008. www.ncbi.nlh.gov. Reference Type: Internet Communication.
2. Charles O. Elson III, Philip D. Smith. Immunologic Disease of the Gastrointestinal Tract. In
Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 1106-1109.
274
18
Organizations. Celiac-Associated HLA-DQ Alpha 1 and DQ Beta 1 High-Resolution DNA Typing,
Blood www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
275
18.1.5 AFECŢIUNI NEUROLOGICE
18.1.5.1 Atrofia musculară spinală
Atrofia musculară spinală (AMS) este o boală neuromusculară progresivă cu transmitere autosomal
recesivă, caracterizată prin slăbiciune musculară şi atrofie cauzate de degenerescenţa neuronilor
motori din măduva spinării şi din nucleii trunchiului cerebral. Este a doua afecţiune ereditară ca
frecvenţă după fibroza chistică, având o incidenţă de aproximativ 1 la 10000 nou-născuţi pentru forma
acută (AMS tip I) şi 1 la 24000 naşteri pentru formele cronice de boală (AMS tip II şi III). În peste 95%
din cazuri această boală este determinată de anomalii ale genei SMN1 (Survival Motor Neuron 1), ce
antrenează un deficit major al proteinei SMN1;3.
La începutul anilor 1980, Werdnig şi Hoffman au descris o tulburare caracterizată prin slăbiciune
musculară progresivă apărută în copilărie care a determinat moarte timpurie, iar din punct de vedere
histopatologic s-a evidenţiat pierderea neuronilor din coarnele anterioare ale măduvei spinării.
În 1995, a fost descrisă şi gena implicată în apariţia atrofiei musculare spinale. Aceasta codifică o
proteină neuronală specifică, proteina de supravieţuire a neuronilor (SMN). Boala este determinată
de mutaţii care apar la nivelul genei SMN1 (Survival Motor Neuron), iar severitatea se crede că este
modulată de gene precum SMN2, NAIP (Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein) sau PLS3 (Plastin
3). Regiunea SMN de pe cromozomul 5q12.2-q13.3, formată din aproximativ 500 kb, este neobişnuit
de complexă, cu secvenţe repetitive, pseudogene, elemente retrotranspozabile, deleţii, duplicaţii sau
inversii. Persoanele neafectate au două copii ale genei SMN aranjate în tandem pe fiecare cromozom:
SMN1 (copie telomerică - telSMN, SMNt sau SMNT) şi SMN2 (copie centromerică - cenSMN, SMNc,
BCD541 sau SMNC). Ambele gene conţin 9 exoni şi diferă prin 8 nucleotide (cinci sunt intronice şi trei
sunt exonice, situate la nivelul exonilor 6, 7 şi 8). Exprimarea genei SMN1 produce proteina SMN full-
length (completă), în schimb, expresia SMN2 determină apariţia unei versiuni trunchiate a polipeptidei
din care lipsesc 16 aminoacizi de la capătul carboxi-terminal.
Persoanele cu AMS sunt fie homozigote pentru deleţia exonului 7 din SMN1 (Δ7 SMN1), fie heterozigoţi
compuşi pentru Δ7 SMN1 şi o mutaţie intragenică a SMN1. Deleţia copiei telomerice a SMN (SMN1)
este direct implicată în AMS, deoarece absenţa exonului 7 sau a exonilor 7 şi 8 este detectabilă la mai
mult de 95% din persoanele afectate indiferent de forma clinică de manifestare3.
La pacienţii cu mutaţii, aproximativ 70-80% din produsul genei SMN este sub forma proteinei trunchiate.
Toţi pacienţii cu atrofie musculară spinală păstrează cel puţin o copie a SMN2, însă aceasta este
capabilă să genereze doar 10% din cantitatea de SMN full-length necesară, comparativ cu SMN1.
Cei cu forma AMS tip I au mai puţin de 9% din cantitatea normală de SMN full-length (fl-SMN), cei cu
AMS tip II au 14%, iar cei cu AMS tip III, aproximativ 18%. La un nivel al fl-SMN reprezentând 23%
din concentraţia normală, funcţia motorie pare normală. Purtătorii asimptomatici au de obicei 45-55%
din nivelul normal de fl-SMN.
Tot în 1995, a fost identificată gena NAIP care codifică proteina NAIP (proteina inhibitoare neuronală
276
18
a apoptozei). Deleţia acestei genei, care este apropiată de gena SMN, este asociată cu AMS, fapt
dovedit prin prezenţa mutaţiilor homozigote ale genei NAIP la 45% dintre pacienţii cu AMS tip I şi la
18% din pacienţii cu AMS tip II sau III.
Această proteină aparţine unei clase de proteine inhibitoare ale apoptozei (AIPs – apoptosis inhibitory
proteins) intens conservate, care ajută la reglarea morţii celulare programate. Eliminarea acestei gene
pare să fie asociată cu fenotipurile severe de AMS.
15% dintre pacienţii cu AMS prezintă mutaţii la nivelul genei BFT2p441.
În funcţie de vârsta de debut, speranţa de viaţă, distribuţia hipotoniei musculare şi dezvoltarea motorie
pe etape a pacienţilor, au fost descrise mai multe fenotipuri ale AMS (vezi tabelul de mai jos), dintre
care cele mai importante sunt: infantil acut (AMS tip I sau boala Werdnig-Hoffman), infantil cronic
(AMS tip II), juvenil cronic (AMS tip III sau boala Kugelberg-Welander) şi forma adultă (AMS tip IV).
Alături de acestea mai sunt descrise: forma prenatală (SMA 0), neuropatia axonală congenitală şi
atrofia musculară spinală asociată cu artrogripoză congenitală1;3.
AMS I (atrofia spinală musculară acută sau boala Werdnig-Hoffmann) apare în jurul vârstei de 6
luni şi se caracterizează prin atrofii musculare şi paralizii de origine spinală. Peste 95% din pacienţi
prezintă slăbiciune musculară simetrică, progresivă şi hipo- sau atonie înainte de vârsta de 3 luni.
Histopatologic se constată o degenerescenţă a neuronilor motori din coarnele anterioare ale măduvei
şi din nucleii trunchiului cerebral; fibrele simpatice şi fasciculele piramidale sunt mai puţin afectate.
La naştere pot fi observate cianoză, artrogripoză sau deformări ale scheletului (scolioză) şi ale
articulaţiilor, ca rezultat al hipotoniei prezente încă din viaţa intrauterină.
Atrofia şi paralizia evoluează rapid, apar iniţial la nivelul musculaturii spatelui, apoi trec progresiv la
muşchii centurilor, interesând în final părţile distale ale membrelor. Atrofia musculară poate fi mascată
uneori de ţesutul adipos specific copiilor.
Pacienţii nu prezintă afectarea muşchilor extraoculari, iar slăbiciunea musculaturii faciale este adesea
minimă sau absentă.
La nivelul muşchiului cardiac nu se evidenţiază leziuni, dar o modificare specifică a ritmului
electrocardiografic de bază a fost atribuită fasciculaţiei membrelor şi a muşchilor peretelui toracic.
La copil sau nou-născut fasciculaţiile sunt adesea limitate la limbă şi sunt dificil de diferenţiat de
mişcările normale aleatorii. Un tremor postural al degetelor este observat doar ocazional în AMS I.
Reflexele osteotendinoase sunt abolite în urma leziunii neuronului motor periferic.
La câteva luni sau la câţiva ani de la debutul bolii apar leziunile bulbare, fapt ce determină incapacitatea
copilului de a suge sau de a înghiţi şi în final insuficienţă respiratorie şi moarte.
Cele mai multe persoane mor înainte de vârsta de doi ani, dar uneori indivizii care au forme de boală
cu debut clinic după vârsta de 6 luni pot supravieţui până în adolescenţă sau la maturitate.
În unele cazuri, boala poate provoca slăbiciune musculară fulminantă în primele zile de viaţă. Astfel de
manifestări severe asociate şi cu disfuncţie bulbară precoce au o medie de supravieţuire de 5.9 luni.
În 95% din cazuri copiii mor din cauza unor complicaţii ale bolii până la vârsta de 18 luni, însă în cazul
în care primesc suport respirator pot trăi mai mult de doi ani1;3.
AMS tip II sau atrofia musculară spinală cronică (boala Dubowitz) este cea mai comună formă de
atrofie musculară spinală. Se manifestă între 6 şi 12 luni şi evoluează lent.
Simptomatologia debutează cu senzaţie de slăbiciune în musculatura membrelor inferioare şi a
277
trunchiului. Treptat senzaţia de slăbiciune se accentuează, iar copilul începe să prezinte dificultăţi la
mers. Muşchii membrelor superioare sunt afectaţi într-o măsură mai mică. Respiraţia devine din ce în
ce mai dificilă ca rezultat al afectării muşchilor respiratori. În mod obişnuit muşchii laringelui şi muşchii
maseteri nu sunt afectaţi.
O caracteristică neobişnuită a bolii este tremorul postural care afectează degetele. Acest lucru este
considerat a fi legat de fasciculaţiilor muşchiilor scheletici.
În cursul bolii pot părea pseudohipertrofia gastrocnemianului şi deformări musculo-scheletale.
Ritmul de dezvoltare fizică este normală, la fel ca şi dezvoltarea funcţiilor mentale.
Durata de viaţă a pacienţilor cu SMA tip II variază de la 2 până la 30 ani, infecţiile respiratorii fiind
cauza principală a deceselor1;3.
AMS tip III sau atrofia musculară spinală juvenilă (boala Wohlfart-Kugelberg-Welander) apare după
vârsta de 18 luni şi are o evoluţie mai blândă decât primele două.
Persoanele cu AMS III pot merge în mod autonom, dar pot avea frecvent probleme la urcatul sau
coborâtul scărilor, la vârsta de 2-3 ani. Membrele inferioare sunt mai grav afectate decât braţele.
Prognosticul se corelează, în general, cu funcţia motorie maximă atinsă. Persoanele cu AMS III la
care afecţiunea a debutat înainte de a învăţa să meargă pierd capacitatea de merge pe jos până
la jumătatea adolescenţei, în schimb persoanele care au dezvoltat abilitatea normală de mers pe
jos înainte de debutul slăbiciunii musculare pot menţine această capacitate până la al treilea sau al
patrulea deceniu de viaţă.
Prognosticul este în general bun1;3.
AMS tip IV debutează cu slăbiciune musculară, de obicei în decada a doua sau a treia de viaţă.
Manifestările clinice seamănă cu cele din AMS tip III. În ansamblu cursul bolii este benign, iar pacienţii
au o speranţă de viaţă normală1;3.
Neuropatia axonală congenitală are debut prenatal caracterizat prin slăbiciune musculară severă,
contracturi articulare, diplegie facială, oftalmoplegie şi insuficienţă respiratorie care necesită intubaţie
endotraheală imediată şi ventilaţie. Polihidramniosul şi reducerea mişcărilor fetale sunt manifestări
comune ale bolii3.
Atrofia musculară spinală asociată cu artrogripoză congenitală (artrogripozis congenita multiplex) se
manifestă prin slăbiciune musculară severă cu debut prenatal (contracturi articulare congenitale care
implică cel puţin două articulaţii). Scăderea mişcărilor fetale, polihidramniosul şi prezentaţia pelviană
sunt frecvente. De obicei, copiii prezintă mişcări doar la nivelul musculaturii extraoculare şi faciale.
Moartea apare din cauza insuficienţei respiratorii în prima lună de viaţă3.
Vârsta de Durata de
Fenotip Manifestări
debut supravieţuire
SMA 0 (Prenatal) Prenatal 2-6 luni
Atrofia musculară Contracturi articulare
spinală asociată Lipsa mişcărilor fetale
cu artrogripoză Diplegie facială
Prenatal zile
congenitală Oftalmoplegie
278
18
Contracturi articulare
Slăbiciune musculară facială
minimă sau absentă
SMA I Înainte de 6 luni maxim 2 ani Variate grade de dificultate la
supt şi înghiţit
Tremor postural al degetelor

70% trăiesc până
SMA II 6-18 luni
la 25 ani
După 12 luni Normal

SMA III
SMA IV Adulţi Normal
Evidenţierea SMN1 în regiunea 5q11.2-13.3 ca genă determinantă a bolii a reprezentat elementul

esenţial pentru diagnosticarea pacienţilor cu AMS. Identificarea homozigoţilor cu deleţia exonilor 7 şi
8 din gena SMN1 este un criteriu important pentru stabilirea diagnosticului de certitudine, având în
vedere că aproximativ 95% dintre subiecţii diagnosticaţi prezintă această mutaţie. Un procent de 2-5%
dintre pacienţi sunt heterozigoţi compuşi pentru o deleţie a exonilor 7 şi 8 şi o mutaţie punctiformă
SMN1.
Numeroase date indică faptul că severitatea bolii este influenţată şi de numărul de copii ale genei
SMN2 (care poate varia de la 0 la 5), de aceea stabilirea acestui număr face parte din strategia de
testare3.
- confirmarea diagnosticului de SMA la persoanele afectate;
- identificarea stării de purtător (heterozigot) prin testarea adulţilor asimptomatici cu risc
crescut; aceasta constă în stabilirea numărului de copii ale genei SMN1 ce conţin exonul
7 prezente într-un genotip; trebuie menţionat faptul că testarea nu prezintă utilitate pentru
estimarea vârstei de debut, severităţii, tipului de simptome sau modalităţii de progresie a
bolii1;3;
- diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutaţie SMN1; se efectuează prin
analiza ADN-ul extras din celule fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei efectuată la
aproximativ 15-18 săptămâni de gestaţie sau biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-
12 săptămâni de gestaţie; mutaţiile cauzatoare de boală trebuie să fie identificate înainte de
testarea prenatală1;3.
hemolizate2.
279

Metode – sunt disponibile mai multe modalităţi de testare:
1) analiza deleţiilor/duplicaţiilor MLPA pentru identificarea deleţiilor exonilor 7 şi 8 ale genei SMN1;
2) secvenţierea întregii gene SMN1 pentru identificarea mutaţiilor intragenice;
3) PCR cantitativ pentru stabilirea numărului de copii ale genei SMN2;
4) analiza dozajului genic PCR-bazată pentru identificarea numărului de copii ale genei SMN1 şi
depistarea stării de purtător asimptomatic.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate în gena SMN1 şi genotipul respectiv1.
Nu există nici o corelaţie între deleţia exonilor 7 şi 8 SMN1 şi severitatea bolii. Studiile arată că
prezenţa a trei sau mai multe copii ale genei SMN2 se corelează cu un fenotip de boală mai puţin
sever. Astfel, s-a constatat că unele persoane homozigote pentru deleţii SMN1 care prezintă 5 copii
ale genei SMN2 sunt asimptomatice; din acest motiv se consideră că prezenţa a 5 copii SMN2 poate
compensa absenţa genei SMN1.
Deoarece AMS se transmite autozomal recesiv, în momentul concepţiei fiecare frate al unui individ
afectat are 25% şanse să fie purtător şi să prezinte afecţiunea, 50% şanse să fie purtător asimptomatic
şi 25% şanse să nu fie purtator şi să nu fie afectat.
Aproximativ 98% dintre părinţii unui copil afectat sunt heterozigoţi şi, prin urmare, au o mutaţie
cauzatoare de boală în gena SMN1, restul de 2% nu sunt purtători de mutaţii, iar anomaliile genetice
ale copiilor lor sunt apărute de novo .
Secvenţierea nu poate stabili dacă o mutaţie punctiformă este situată în cadrul genei SMN1 sau
SMN2 decât în situaţiile în care una din aceste două gene este absentă. Identificarea unei mutaţii
raportate anterior la mai mult de o persoană afectată de boală dovedeşte că mutaţia este localizată
în gena SMN1.
Un procent de până la 4% din populaţia generală prezintă două gene SMN1 pe acelaşi cromozom.
În cazul unei astfel de situaţii analiza dozajului genic nu va putea identifica starea de purtător
asimptomatic al bolii3.
Bibliografie
1. Bryan Tsao, Carmel Armon. Spinal Muscular Atrophy. www.emedicine.medscape.com, Ref Type:
3. Thomas W Prior, Barry S Russman, Spinal Muscular Atrophy, Gene Reviews, 2006.
280
18
18.1.5.2 Boala Alzheimer (testare genetică)
Boala Alzheimer este o boală neurologică degenerativă comună care evoluează cu atrofie cerebrală
progresivă difuză, manifestată clinic prin pierderea funcţiilor cognitive şi tulburări comportamentale.
Apare, în general, după vârsta de 60-65 de ani (subtipul 2), dar există şi forme care debutează precoce
(subtipurile 1, 3 şi 4). Aproximativ 25% din cazuri sunt familiale, iar dintre acestea 95% sunt forme
cu debut tardiv (cu vârsta >60-65 ani), iar 5% cu debut precoce (vârsta <65 ani). 1% din cazuri sunt
reprezentate de pacienţii cu sindrom Down (trisomia cromozomului 21), care după vârsta de 40 ani
evoluează aproape invariabil cu boală Alzheimer.
Cauză Frecvenţă %
Sindrom Down <1%
Forma familială ~25%
-cu debut tardiv (AD2) 15%-25%
-cu debut precoce BA (AD1, AD3, AD4) <2%
Forma sporadică ~75%
Boala Alzheimer (BA) este o afecţiune caracterizată prin demenţă, care de obicei începe cu
modificări minime ale memoriei, confuzie, capacitatea de judecată alterată, tulburări de limbaj, de
comportament, de personalitate, pierderea abilităţii de a gândi corect şi de a efectua activităţile zilnice,
agitaţie, halucinaţii, care devin din ce în ce mai severe şi, în cele din urmă, incapacitante. Ocazional,
se poate manifesta prin convulsii, creşterea tonusului muscular, mioclonii, incontinenţă, mutism sau
caracteristici comune Parkinson-ului. Durata tipică a bolii este 8-10 ani, cu variaţii de la 1 la 25 ani.
Stabilirea diagnosticului de boală Alzheimer se bazează pe evaluarea clinică şi neuropatologică.
Gold standard-ul în diagnosticul bolii Alzheimer rămâne, din păcate, examinarea neuropatologică
necroptică. Cu toate acestea, diagnosticul clinic este corect în aproximativ 80-90% din cazuri şi se
bazează pe:
- semne clinice: demenţă lent progresivă;
- neuroimagistice: - atrofie corticală pe CT sau RMN;
- hipometabolism cerebral difuz pe PET;
- examenul lichidul cefalorahidian (LCR): scăderea amiloidului Aβ şi creşterea proteinei
tau.
În urma examenului anatomo-patologic putem identifica:
- atrofia scoarţei cerebrale cu micşorarea circumvoluţiilor, predominant în
regiunile frontală, parietală şi temporală, hidrocefalie externă şi internă la
examenul macroscopic;
- leziuni caracteristice, evidenţiate prin tehnici speciale de colorare şi
impregnare argentică la examenul microscopic:
- plăcile senile vizibile printre celulele nervoase, care reprezintă o
281
acumulare de β-amiloid, localizat în special la nivelul terminaţiilor

presinaptice ale neuronilor, formând plăci insolubile şi împiedicând astfel
transmiterea influxului nervos;
- degenerescenţa neurofibrilară ce constă în formarea la nivelul
perikarionilor a unor fascicule dense dispuse ca nişte ghemuri, constituite
în principal dintr-o proteină asociată microtubulilor, numită tau; în boala
Alzheimer, proteinele tau sunt anormale, microtubulii sunt afectaţi, iar
neuronii nu mai pot funcţiona normal;
- degenerescenţă granulo-vacuolară - vacuole ce conţin granule de
natură încă neprecizată, prezente în citoplasma neuronilor, în special în
hipocamp.
Cauza bolii Alzheimer este necunoscută, dar tot mai mulţi cercetători cred că anumiţi factori de risc,
care includ vârsta înaintată, prezenţa alelei e4 a genei APOE, obezitatea, rezistenţa la insulină,
factori vasculari, dislipidemie, hipertensiune arterială şi factori inflamatori declanşează o cascadă
fiziopatologică care conduce la apariţia bolii Alzheimer şi demenţă.
Mutaţii în genele care codifică proteinele: APP (pe cromozomul 21), PSEN1 – presenilina 1
(pe cromozomul 14), PSEN2 – presenilina 2 (pe cromozomul 1) determină fără echivoc, boala
Alzheimer.
Proteina precursoare a β-amiloidului (APP) este o proteină transmembranară de tip I, ce joacă un rol
central în patogeneza bolii. Clivarea secvenţială a APP de către β şi γ-secretază generează β-amiloidul
(Aβ), care se depozitează în creierul pacienţilor afectaţi sub formă de plăci senile şi reprezintă unul
din principalele semne patologice. γ-secretaza este un complex proteolitic care scindează domeniul
transmembranar al APP până când acesta este suficient de redus pentru a permite eliberarea de Aβ din
membrană. Peptidele generate de clivajul γ-secretazei diferă prin capătul carboxi-terminal. Produsul
majoritar este Aβ40, în timp ce Aβ38 şi Aβ42 reprezintă categoriile minore. Aβ42, peptid neurotoxic şi
predispus la agregare, este considerat a fi agentul cauzal al iniţierii cascadei de evenimente patogene,
care determină moarte neuronală, alterarea sinapselor, formarea de ghemuri neurofibrilare şi plăci
senile şi, în cele din urmă, neurodegenerescenţă şi demenţă. Creşterea producţiei de Aβ42 stă la
baza mutaţiilor asociate cu BA familială care se manifestă cu debut precoce. Majoritatea mutaţiilor din
formele familiale au fost găsite în PSEN1, ce codifică subunitatea catalitică a γ-secretazei (presenilina
1), în timp ce doar câteva mutaţii au fost găsite în PSEN2. Puţine forme familiale au fost asociate cu
mutaţii la nivelul genei APP şi determină o creştere a producţiei de Aβ42.
În general, toate persoanele cu sindrom Down dezvoltă semne distinctive neuropatologice de BA
după vârsta de 40 ani, iar 50% prezintă şi semne clinice de declin cognitiv. Asocierea dintre BA şi
sindrom Down se datorează supraexpresiei genei APP de pe cromozomul 21, ce codifică proteina
precursoare a amiloidului (APP). Acumularea de β-amiloid începe în cazul acestor pacienţi în prima
decadă de viaţă. Există 2 studii care nu au găsit nici o asociere între prezenţa genei APOE şi vârsta de
debut a demenţei la persoanele cu sindromul Down, dar există şi studii care asociază vârsta debutului
demenţei cu polimorfismul genei APP.
Schupf et al. au constatat un risc crescut inexplicabil de BA la mamele care au născut copii cu sindrom
Down înainte de vârsta de 35 ani.
282
18
Asocierea alelei e4 a genei APOE cu BA este semnificativă. Apolipoproteina E (APOE) joacă un rol
important în metabolismul lipoproteinelor şi homeostaziei colesterolului în creier. Există 3 izoforme ale
proteinei: E2, E3, E4, care sunt codificate de 3 alele diferite e2, e3 şi e4. Purtătorii alelei e4 a genei
APOE au riscul cel mai mare de a dezvolta BA. Homozigoţii pentru alela e4 a genei APOE dezvoltă
de obicei BA la o vârstă mai mică faţă de heterozigoţi. Genotiparea APOE nu este nici specifică, nici
sensibilă şi poate avea un rol adjuvant în diagnosticul BA la persoanele simptomatice, dar se pare
că în testarea persoanelor asimptomatice rolul este minor. Astfel, prezenţa alelei e4 nu este nici
necesară, nici suficientă pentru a dezvolta BA.
S-a sugerat că mai mult de 50-60% din cazurile de BA sunt forme determinate multifactorial. Recent,
modificări la nivelul cromozomilor 1, 9, 10, 12 şi 13 au fost evidenţiate în forma cu debut tardiv.
Studiile efectuate până în prezent au sprijinit ideea că BA forma cu debut tardiv este o tulburare
complexă care poate implica mai multe gene. Bertram et al (2007) a efectuat o analiză a acestor date
şi în acest moment sunt disponibile următoarele informaţii:
• este bine documentată asocierea formei cu debut tardiv cu alela e4 a genei APOE.;
aceasta, prin mecanisme încă necunoscute, afectează vârsta de debut determinând
un debut mai precoce;
• o serie de alte potenţiale gene sunt în curs de investigare:
o SORL1 pe cromozomul 11q23, o proteină implicată în traficul de proteine
APP;
o A2M pe cromozomul 12;
o GST01 şi GST02 pe cromozomul 10;
o GAB2 pe cromozomul 11q14 interacţionează cu alela e4 de pe gena
APOE;
o CALHM1 pe cromozomul 10q24; CALHM1 influenţează homeostazia
calciului şi se asociază cu debut tardiv;
o TOMM40 situată pe cromozomul 19q foarte aproape de locusul ApoE;
TOMM40 a fost implicată în forma de boală cu debut tardiv;
o clusterina (CLU, APOJ);
o CR1 şi PICALM;
• studii genetice efectuate într-o populaţie olandeză sugerează o legătură între BA şi
cromozomii 1q22, 3q23, 10q22 şi 11q254.
Trei forme familiale cu debut precoce, cauzate de mutaţii în una din cele trei gene: APP (21q21),
PSEN1 (14q24.3) sau PSEN2 (21q31-q42), sunt recunoscute:
1. boala Alzheimer subtipul 1 (FAD1) – reprezintă 10-15% din cazuri şi este determinată
de mutaţia genei APP, care codifică β amiloidul A4;
2. boala Alzheimer subtipul 3 (FAD3) - reprezintă 30-70% din cazurile cu debut precoce
şi este cauzată de mutaţia genei PSEN1, care codifică presenilina-1;
3. boala Alzheimer subtipul 4 (FAD4) - reprezintă mai puţin de 5% din totalul formelor cu
debut precoce şi este cauzată de mutaţii ale genei PSEN2.
Forma familială cu debut precoce este transmisă autozomal dominant, ceea ce semnifică un risc de
îmbolnăvire pentru rudele de gradul I de 50%. Această afecţiune este diagnosticată în familiile care au
283
mai mult de un membru cu BA (de obicei mai multe persoane afectate în generaţie), la care vârsta de
debut este constant mai mică de 60-65 ani şi de cele mai multe ori apare înainte de 55 ani.
Localizare pe Număr de mutaţii

Gena Proteina codificată
cromozom
PSEN2 1q31-q42 Presenilina-2 8
APP 21q21 Amiloidul β A4 20
PSEN1 14q24.3 Presenilina-1 124
Procentul de forme cu debut precoce Frecvenţa depistării

Gena Mutaţii detectate
atribuite mutaţiilor din genă mutaţiei
Deleţia exonului 9 ~2%
PSEN1 30%-70%
Variante secvenţiale ~98%
PSEN2 Variante secvenţiale <5% ~100%
Modificări în exonii 16
~100%
şi 17
APP 10%-15%
Duplicare genică
Necunoscută
parţială sau totală
Boala Alzheimer subtipul 1 (FAD1) - este o demenţă observată în familiile cu mutaţii APP şi are un
aspect tipic de BA cu debut de obicei la 40–50 de ani (ocazional 60 ani).
Gena APP este alcătuită din 19 exoni şi codifică o proteină precursoare mare, formată din 695-770
aminoacizi. Aceasta este clivată proteolitic şi formează β-amiloidul. Amiloidul Aβ este de asemenea
codificat de exonii 16 şi 17.
Cea mai frecventă mutaţie la nivelul genei APP este p.Val717Ile. Substituţii cu fenilalanină şi glicină
pot să apară, de asemenea, la acest codon. Modificări ale unor nucleotide în exonul 16 (c.2010G>T
şi c.2011A>C) pot produce aşa-numita mutaţie suedeză.
Duplicarea genei APP a fost raportată la câteva familii.
Cele mai frecvente mutaţii apărute în gena APP sunt menţionate în tabelul alăturat4:
Modificări nucleotidice Modificări deAA

c.2149G>A p.Val717Ile
c.2010G>T p.Lys670Asn
c.2011A>C p.Met671Leu
c.2075C>G p.Ala692Gly
c.2078A>G p.Glu693Gly
284
18
Boala Alzheimer subtipul 3 (FAD3) - apare de obicei în decada a 4-a sau a 5-a de viaţă, dar au
fost raportate cazuri de debut la 30 ani sau după 60 ani (debutul după 65 ani este considerat o formă
rară). Progresia este relativ rapidă (6-7 ani) şi se asociază cu convulsii, mioclonii, tulburări de vorbire
şi paraplegie spastică.
Gena PSEN1 codifică o proteina alcătuită din 467 aminoacizi ce cuprinde între 7 şi 10 (probabil 8)
domenii hidrofobe transmembranare.
Presenilina-1 este o proteină asemănătoare cu presenilina-2, regiunile diferite găsindu-se la capătul
amino-terminal şi la nivelul domeniului citosolic. Proteina acţionează ca parte a complexului proteolitic
gama-secretaza, ce duce la formarea β-amiloidului. Presenilina-1 prezintă omologie funcţională şi
cu o proteină aparţinând C. Elegans, SEL-12, care facilitează semnalizarea mediată de receptorul
familiei Notch/LIN-12. Şoareci knock-out PSEN1 mor in utero deoarece prezintă tulburări scheletale
severe.
Regiunea de codificare a presenilinei-1 este formată din zece exoni numerotaţi de la 3 la 12. Exonul 8
şi o parte din exonul 3 se pot îmbina, determinând apariţia unor izoforme proteice scurte. Uneori între
exonii 10 şi 11 poate fi introdus un nou exon.
Alterări în gena PSEN1 duc la creşterea producţiei unei izoforme de dimensiuni mai mari de β-amiloid,
care este neurotoxică şi predispusă la autoagregare.
Mutaţiile PSEN1 au fost raportate în familii de japonezi, afro-americani şi africani. Mutaţia p.Ala431Glu
a fost raportată în familiile mexicane, iar mutaţia p.Glu280Ala în familiile columbiene.
Mai mult de 40 mutaţii care au ca rezultat apariţia formelor cu debut precoce au fost descrise în mai
mult de 50 de familii4.
Modificări nucleotidice Modificări de AA
c.236C>T p.Ala79Val
c.265G>T p.Val89Leu
c.338T>C p.Leu113Pro
c.415A>G p.Met139Val
c.436A>C p.Met146Leu
c.509C>T p.Ser170Phe
c.548G>T p.Gly183Val
c.697A>G p.Met233Val
c.767A>C p.Tyr256Ser
c.839A>C p.Glu280Ala
c.1175T>C p.Leu392Pro
c.1292C>A p.Ala431Glu
Boala Alzheimer subtipul 4 (FAD4) – are un debut ce variază de la 40 la 75 ani, dar pot exista cazuri
cu apariţie după vârsta de 80 ani. Durata medie a bolii este de 11 ani.
Gena PSEN2 include 12 exoni şi codifică o proteină de 448 AA, care prezintă omologie cu presenilina-1.
Presenilina-2 este o proteină cu 8 domenii transmembranare. Primii 2 exoni codifică regiunea 5’
netranslatată.
285
Mutaţiile genelor PSEN1 sau PSEN2 determină depunerea excesivă de β amiloid asociată cu
degenerescenţa neurofibrilară, ce constă în formarea la nivelul neuronilor a unor fascicule dense
dispuse ca nişte ghemuri şi angiopatie amiloidă.
Mutaţia p.Asn141Ile se întâlneşte la o populaţie germană de pe Volga, iar mutaţia p.Met239Val a fost
raportată într-o populaţie italiană4.
Modificări nucleotidice Modificări deAA

c.422A>T p.Asn141Ile
c.717G>A p.Met239Val
Majoritatea indivizilor diagnosticaţi cu forme de boală cu debut precoce au avut un părinte afectat.
Deoarece debutul este de obicei la maturitate şi progresia este rapidă, părinţii nu mai sunt în viaţă la
data diagnosticării copiilor lor.
Ocazional, nici unul din părinţi nu este identificat ca având boala, dar o rudă de gradul doi (unchi,
mătuşi şi/sau bunici) are sau a avut BA cu debut precoce.
Deoarece BA este genetic heterogenă, consilierea genetică a persoanelor cu BA şi a membrilor
familiilor lor trebuie să fie adaptată la informaţiile disponibile pentru această familie. În forma
determinată multifactorial, riscul de îmbolnăvire la rudele unui pacient se poate aprecia numai empiric,
iar cu ocazia consultului trebuie informat pacientul că BA este o afecţiune comună şi că riscul global
pentru orice individ de a dezvolta demenţă pe parcursul vieţii este de aproximativ 10-12%. Rudele de
gradul I al unui pacient cu BA (un singur caz într-o familie) au un risc cumulativ de apariţie a bolii de
aproximativ 15-30%. Acest risc este de aproximativ 2.5 ori mai mare decât riscul de fond (~27% vs
10.4%).
Pentru testarea adulţilor asimptomatici cu risc sunt disponibile în laboratorul nostru teste pentru
mutaţii la nivelul genelor PSEN1, PSEN2 şi APP. Astfel de teste nu sunt utile pentru estimarea vârstei
de debut, severităţii, tipului de simptome sau modalităţii de progresie a bolii.
debut precoce, posibilul impact al rezultatelor testelor pozitive sau negative şi este evaluat statusul
neurologic. Cei care doresc testarea ar trebui să fie consiliaţi cu privire la eventualele probleme pe
care le pot întâmpina legate de sănătate, invaliditate, educaţie, discriminare, interacţiune socială şi
familială.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutaţie PSEN1 este posibil prin analiza
Mutaţiile cauzatoare de boală trebuie să fie identificate înainte de testarea prenatală la un membru
afectat al familiei1;3;4.
Recomandări pentru efectuarea testului genetic
● stabilirea diagnosticului la persoanele afectate (se recomandă să se înceapă cu testarea pentru
mutaţiile PSEN1);
● testarea rudelor adulte cu risc crescut în scop predictiv (penetranţa mutaţiilor PSEN1 este
286
18
completă până la vârsta de 65 ani; penetranţa mutaţiilor PSEN2 este de ~95%);

● diagnostic prenatal.
hemolizate5.
Metodă – secvenţierea tuturor exonilor genelor PSEN1, PSEN2 şi APP + analiza deleţiilor/duplicaţiilor
MLPA5.
Bibliografie
1. KOWALSKA A. Genetic basis of neurodegeneration in familial Alzheimer’s disease. In Pol. J.

Pharmacol, 2004, 56, 171–178.
3. Thomas D Bird, MD. Alzheimer Disease Overview. Gene Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov.
4. Thomas D Bird, MD. Early Onset Familial Alzheimer Disease Overview, Gene Reviews, 2007.
18.1.5.3 Boala Parkinson (testare genetică)

Boala Parkinson a fost descrisă pentru prima dată în 1817 de către medicul englez James Parkinson
şi este o tulburare neurodegenerativă progresivă asociată cu pierderi de neuroni dopaminergici.
Este recunoscută ca una dintre cele mai frecvente tulburări neurologice, care afectează aproximativ 1%
din persoanele de peste 60 ani. Boala Parkinson are o evoluţie progresivă, iar semnele şi simptomele
se acumulează în timp. Deşi această afecţiune este potenţial invalidantă, evoluţia este lentă, astfel
încât pacienţii pot duce o viaţă activă mulţi ani după stabilirea diagnosticului. Semnele cardinale ale
bolii sunt: tremorul de repaus, rigiditatea, bradikinezia şi instabilitatea posturală (aceasta din urmă
apare după 8 ani de evoluţie). Demenţa apare în aproximativ 20% din cazuri. Manifestările psihice,
care includ depresie şi halucinaţii vizuale, sunt comune, dar nu sunt prezente la toţi pacienţii.
În general, persoanele la care debutul bolii este înainte de vârsta de 20 ani sunt considerate a avea
forma juvenilă de boală Parkinson, cele cu debut înainte de 50 ani sunt clasificate ca forme precoce,
iar cele cu debut după vârsta de 50 ani sunt considerate forme tardive.
287
Diagnosticul de boală Parkinson se bazează pe semne clinice: debut cu implicare asimetrică a

membrelor, tremor, rigiditate, bradikinezie şi răspuns pozitiv la tratamentul cu levodopa.
Tehnici imagistice funcţionale, cum ar fi tomografia cu emisie de pozitroni (PET) sau tomografia
computerizată cu emisie de fotoni (SPECT), folosind liganzi radioactivi pentru neuronii dopaminergici
presinaptici, pot sprijini diagnosticul, dar de obicei sunt limitate la studii de cercetare.
Caracteristica morfopatologică principală a bolii Parkinson este pierderea de neuroni dopaminergici în
substanţa neagră, în special în regiunea ventro-laterală cu apariţia unor incluziuni intracitoplasmatice,
corpii Lewy. Aproximativ 60-80% din neuroni sunt distruşi înainte de apariţia semnelor motorii de boală
Parkinson. Corpii Lewy sunt incluziuni citoplasmatice concentrice, eozinofile, cu halou periferic clar
şi miez dens, formaţi din α-sinucleină şi ubiquitină. Prezenţa acestor corpi în neuronii din substanţa
neagră este caracteristică, dar nu patognomonică. De asemenea corpii Lewy se întâlnesc în cortex,
nucleul bazal, locus ceruleus sau tracturile intermediolaterale ale măduvei spinării. Corpii Lewy au
fost găsiţi post-mortem la pacienţi fără semne clinice de parkinsonism şi s-a constatat că prevalenţa
acestora creşte cu vârsta. A fost emisă ipoteza conform căreia prezenţa acestor corpi reprezintă faza
presimptomatică a bolii Parkinson. Studii recente demonstrează că în boala Parkinson apariţia corpilor
Lewy începe în bulbul olfactiv şi trunchiul cerebral inferior. Aceste stadii incipiente sunt asociate cu
simptome cum ar fi pierderea mirosului, mişcări oculare rapide şi tulburări de comportament. Afectarea
neuronală urcă spre trunchiul cerebral şi implică neuronii dopaminergici. Această etapă se corelează
cu debutul fazei motorii a bolii, iar pacienţii pot prezenta bradikinezie, rigiditate şi tremor. Afectarea
neuronilor se extinde şi afectează cortexul, iar pacienţii prezintă disfuncţie cognitivă şi demenţă.
În mod tradiţional, prezenţa corpilor Lewy a fost necesară pentru confirmarea bolii Parkinson; însă
odată cu descoperirea unor noi subtipuri de boală Parkinson (PARK2), a fost recunoscut faptul că
patologia substanţei negre poate să apară şi în lipsa corpilor Lewy.
Deoarece diagnosticul bolii Parkinson se stabileşte pe baza semnelor şi simptomelor clinice şi este
confirmat post-mortem de prezenţa corpilor Lewy, unele incertitudini de diagnostic sunt inevitabile.
Aplicarea riguroasă a criteriilor de diagnostic obţinute din studiile clinicopatologice existente poate
creşte valoarea predictivă pozitivă în ceea ce priveşte diagnosticul la peste 95%. Pe de altă parte,
prin maximizarea specificităţii criteriilor, sensibilitatea scade dramatic, excluzând astfel mai mult de o
treime din cazurile reale. Deşi aceste criterii de diagnostic sunt ideale pentru studii de cercetare, ele
nu pot fi întotdeauna utile pentru stabilirea unui diagnostic clinic.
Cauza apariţiei bolii Parkinson rămâne deocamdată necunoscută, dar cercetătorii consideră că
etiologia acestei afecţiuni implică o asociere între factorii de mediu şi cei genetici.
Factorii de mediu includ: expunerea precoce sau prelungită la substanţe poluante chimice sau la
pesticide (ierbicide şi insecticide), consumul unui drog (MPTP) care poate cauza semnele şi simptomele
bolii Parkinson (drogul are un efect similar pesticidelor), medicamentele neuroleptice (fenotiazina)
sau substanţele care blochează receptorii de dopamină, intoxicaţia cu monoxid de carbon sau cu
mangan, hidrocefalia, tumorile craniene, hematoamele subdurale, boala Wilson, tulburările idiopatice
degenerative.
Cauzele genetice cunoscute explică mai puţin de 5% din cazurile de Parkinson. Afectarea genetică
implică 2 moduri de transmitere: autozomal dominant (AD) şi autozomal recesiv (AR).
288
18
Locus Gena/proteina Cromozom Transmitere ⁄ fenotip clinic

PARK1 ⁄ PARK4 α-sinucleina 4q21 AD şi sporadic ⁄ BP - forme cu debut
precoce
PARK2 Parkin 6q25.2-q27 AR şi sporadic ⁄ BP - forme cu debut
precoce
PARK3 necunoscută 2p13 AD ⁄ BP - forme cu debut tardiv
Nu a fost identificată gena cauzală
PARK5 UCH-L1 4p14 AD ⁄ BP - forme cu debut tardiv
PARK6 PINK1 1p35-p36 AR şi sporadic ⁄ BP - forme cu debut

precoce
PARK7 DJ-1 1p36 AR ⁄ BP - forme cu debut precoce
PARK8 LRRK2 12p11.2-q13.1 AD şi sporadic ⁄ BP - forme cu debut

tardiv
PARK9 ATP13A2 1p36 AR ⁄ BP - forme cu debut precoce
PARK10 Necunoscută 1p32 ?AD

PARK11 GIGYF2 2q36-q37 AD ⁄ BP - forme cu debut tardiv
PARK12 Necunoscută Xq21-q25 Necunoscut

Nu a fost identificată gena cauzală
PARK13 HTRA2 2p13 Necunoscut Patogenitate necunoscută
PARK14 PLA2G6 22q13.1 AR ⁄ răspuns la L-dopa

Sunt necesare date suplimentare
PARK15 FBX07 22q12-q13 AR ⁄ parkinsonism–sindrom piramidal
Sunt necesare date suplimentare
UCHL1, ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1; PINK1, PTEN-induced kinase 1; ATP13A2, ATP-aza
tip 13A2; GIGYF2, GRB10-interacting GYF protein 2; HTRA2, HtrA serine peptidase 2; PLA2G6,
group VI phospholipase A2; FBX07, F-box protein 7.
289
Boala Parkinson cu transmitere autozomal dominantă

% de indivizi Populaţia Numele
Gena Locus Proteina codificată
afectaţi cu mutaţii locusului
Italia, Grecia,
Rar PARK1 SNCA 4q21 α-sinucleina
Germania
Necunoscut Germania PARK3 — 2p13 —
Hidrolaza capătului C-terminal al
Rar Germania PARK5 UCHL1 4p14
ubiquitinei L1
Serin/treonin kinază cu regiuni
2%-7% Japonia PARK8 LRRK2 12q12
bogate în leucină
PARK1. Prima genă descoperită (SNCA), la nivelul căreia s-au observat mutaţii ce determină boală
Parkinson, este o genă ce codifică proteina alfa-sinucleina, considerată de mulţi cercetători un element
cheie în etiologia bolii. Această proteină este abundent exprimată în citosol şi se crede că are un rol
important în maturarea veziculelor presinaptice şi că funcţionează ca un reglator negativ în procesul
de eliberare al neurotransmiţătorilor. Formele fibrilare fosforilate de α-sinucleină se găsesc în cantităţi
considerabile la nivelul corpilor Lewy. Cu toate acestea, identificarea speciilor proteice neurotoxice
in vivo şi etapele critice ale procesului de alterare funcţională rămân domenii de cercetare intensă.
Persoanele cu boală Parkinson care au o mutaţie în gena SNCA au manifestări clinice similare cu ale
pacienţilor cu forme idiopatice şi răspund asemănător la tratamentul cu levodopa, dar vârsta medie
de debut este de 46 de ani.
Aceeaşi mutaţie (p.Ala53Thr în exonul 4) în gena SNCA a fost observată atât la familii de origine
italiană, cât şi la 9 familii de origine elenă.
Ulterior, o altă mutaţie în gena SNCA (p.Ala30Pro în exonul 3) a fost identificată la o familie germană,
dar aceasta nu este o cauză comună a cazurilor familiale de boală Parkinson.
În prezent este cunoscut faptul că familiile cu boală Parkinson autosomal dominantă, considerate
anterior ca având mutaţii legate de cromozomul 4p15 şi încadrate ca forme PARK4, au de fapt o
triplare a unei regiuni cromozomiale care conţine SNCA.
Studii genetice aprofundate au furnizat dovezi conform cărora variabilitatea lungimii alelei dintr-o
secvenţă dinucleotid repetitivă din gena SNCA (denumită SNCA REP1) este asociată cu un risc
crescut de boala Parkinson.
PARK3. Simptomele clinice sunt similare cu cele din boala Parkinson idiopatică, cu o medie a vârstei
de debut de 59 ani.
PARK4. Mutaţia genetică din această formă de boală este similară cu cea din PARK1.
PARK5. Simptomele apărute în această formă de boală, caracterizată prin mutaţia p.Ile93Met în
gena UCHL1, la un singur caz dintr-o familie germană au fost similare cu cele observate în cazurile
idiopatice şi au inclus, de asemena, un răspuns pozitiv la levodopa. Vârsta de debut este de 49 - 50
de ani. Testarea genetică moleculară a sute de persoane nu a identificat mutaţia p.Ile93Met sau orice
altă mutaţie în gena UCHL1; astfel, constatarea raportată de Leroy et al (1998) poate fi o simplă
coincidenţă sau efectul polimorfismului genic.
290
18
PARK8. Boala Parkinson tip 8 este o afecţiune ce poate fi determinată de mai multe mutaţii diferite
în gena LRRK2; cea mai frecventă, p.Gly2019Ser, este asociată cu aproximativ 5-7% din cazurile de
boală Parkinson familială, transmisă autosomal dominant.
Gena LRRK2 codifică o serin/treonin kinază cu regiuni bogate în leucină, de 2527 AA (286 KD), care
prezintă omologie funcţională cu familia de proteine Roco. Având în vedere dimensiunea, compoziţia
şi organizarea domeniului Lrrk2, precum şi potenţialul de a interacţiona cu alte proteine, este foarte
probabil ca această proteină să fie parte a unui complex cu greutate moleculară mare implicat în
procese de semnalizare celulară. Monomerii Lrrk2 dimerizează şi adoptă conformaţii asemănătoare
cu majoritatea protein-kinazelor şi Ras GTP-azelor.
Mutaţii în gena LRRK2 determină sinteza unei proteine modificate care augmentează activitatea
MAPK, cu efecte toxice celulare.
Mutaţia p.Gly2019Ser se află în exonul 41 şi determină activarea MAPK, care este asociată cu o
creştere de două până la de trei ori a fosforilării intra-şi intermoleculare. Rămâne însă o problemă
controversată dacă activitatea crescută in vivo a kinazei reprezintă o trăsătură comună a tuturor
variantelor Lrrk2 patogene
Debutul este insidios, iar boala este lent progresivă. Vârsta la debutul bolii este variabilă (de la 35
la 78 ani, cu o medie de 60 ani), chiar în cadrul aceleiaşi familii, bărbaţii şi femeile fiind afectaţi în
mod egal. În ciuda manfestărilor clinice aparent tipice pentru boală, indivizii cu mutaţie p.Gly2019Ser
prezintă variaţii neuropatologice, chiar şi în cadrul unei familii în care toate persoanele sunt purtătoare
ale aceleiaşi mutaţii LRRK2. Frecvenţa acestei mutaţii este mai mare la evreii Ashkenazi şi arabii
din Africa de Nord. Homozigoţii şi heterozigoţi pentru mutaţia p.Gly2019Ser au caracteristici clinice
similare şi ambele genotipuri prezintă penetranţă redusă.
PARK 8 se caracterizează prin tremor de repaus, bradikinezie, rigiditate musculară, instabilitate
posturală şi tulburări de mers. Afectarea este iniţial asimetrică.
Simptomele non-motorii pot include constipaţie, seboree, hiposmie/anosmie, denervarea simpatică a
inimii, declin cognitiv şi demenţă. Ele se pot manifesta înainte de apariţia tulburărilor motorii sau pe
parcursul progresiei bolii. Demenţa sau depresia sunt elemente comune, ce pot apărea la 40% din
persoanele afectate.
Manifestările clinice ale membrilor unei familii care a prezentat mutaţia p.Tyr1699Cys au inclus
depresie, anxietate, simptome atipice de demenţă şi amiotrofie.
Boala Parkinson cu transmitere autozomal recesivă

% de indivizi Numele
Gena Locus Proteina codificată
afectaţi locusului
50% PARK2 PARK2 6q25.2-q27 Parkin
Necunoscut PARK6 PINK1 1p36 PTEN
Necunoscut PARK7 PARK7 1p36 Proteina DJ-1
PARK2. Boala Parkinson cu debut juvenil, iniţial descrisă la japonezi, se caracterizează prin manifestări
tipice de boală: rigiditate, bradikinezie şi tremor de repaus, de multe ori asociate cu distonie la nivelul
membrelor inferioare şi apariţie între 20 şi 40 ani. Semnele clinice variază, hipereflexia fiind un
291
element comun. Comportamentul anormal şi/sau manifestările psihiatrice sunt frecvente şi pot apărea
înainte de debutul parkinsonismului. Progresia bolii este lentă şi evoluţia poate dura uneori mai mult
de 50 ani. Tratamentul susţinut cu levodopa are efecte benefice, dar uneori se poate observa apariţia
precoce a unor complicaţii severe (diskinezie).
Deoarece această formă de boală se transmite autozomal recesiv, la concepţie fiecare copil al unei
persoane afectate are 25% şanse să fie afectat, 50% să fie purtător şi 25% să nu fie nici afectat, nici
purtător.
Diagnosticul de boală Parkinson cu debut juvenil poate fi confirmat doar atunci când mutaţiile
cauzatoare de boală sunt identificate pe ambele alele PARK2.
Mutaţiile genei PARK2 includ mutaţii punctiforme, dar şi rearanjamente la nivelul exonilor, inclusiv
deleţii şi duplicaţii. O singură mutaţie la nivelul genei PARK2 poate creşte susceptibilitatea pentru
boala Parkinson sau poate determina uneori o transmitere de tip autozomal dominant. Această
variabilitate privind penetranţa şi corelaţia genotip/fenotip face consilierea genetică dificilă.
PARK6. Forma juvenilă, transmisă autozomal recesiv, a bolii Parkinson de tip 6 (PINK1) se
caracterizează prin combinaţii variabile de rigiditate, bradikinezie şi tremor de repaus, ce o face de
cele mai multe ori imposibil de diferenţiat din punct de vedere clinic de forma idiopatică.
Gena PINK1 codifică o serin/treonin kinază de 581 AA, PTEN, ce se găseşte la nivelul membranei
mitocondriale externe cu domeniul C-terminal în citoplasmă şi capătul N-terminal în interiorul
mitocondriilor, cu rol în fosforilarea unor proteine mitocondriale apărute ca răspuns la stres-ul celular.
Mutaţiile descrise până în prezent la nivelul acestei gene determină apariţia unei proteine modificate
cu scăderea potenţialului membranei mitocondriale în condiţii de stres.
Debutul bolii este, de obicei, în jurul vârstei de 35 ani, femeile şi bărbaţii fiind afectaţi în mod egal.
Boala are o evoluţie lent progresivă, cu semne clinice variabile care includ hipereflexia, distonia,
comportament anormal şi/sau manifestări psihiatrice, depresie, halucinaţii şi anxietate, care pot apărea
chiar înainte de debutul parkinsonismului. Tratamentul susţinut cu levodopa are efecte benefice, dar
uneori se poate observa apariţia precoce a unor complicaţii severe (diskinezie).
PARK7. Aproximativ 1-2% din cazurile de boală Parkinson cu debut precoce sunt asociate cu mutaţii
în gena PARK7 sau DJ1. Gena PARK7 codifică o proteină ubiquitară, înalt conservată, ce joacă un rol
important în stres-ul oxidativ. Două mutaţii au fost descrise la nivelul acestei gene: deleţia mai multor
exoni, care împiedică sinteza proteinei, şi o mutaţie punctiformă, care determină sinteza unei proteine
mai puţin stabile ce este degradată la nivelul proteozomului, reducând astfel cantitatea de DJ-1 la
niveluri scăzute sau absente.
PARK9. Apariţia bolii Parkinson tip 9 este legată de o mutaţie la nivelul genei ATP13A2 pe cromozomul
1p36. ATP13A2 codifică o proteină omoloagă cu ATP-azele tip P, care funcţionează ca pompe
ionice.
Sindromul Kufor-Rakeb progresează rapid şi debutează de obicei în al doilea deceniu de viaţă.
Se manifestă în mod obişnuit cu tulburări de comportament, akinezie, rigiditate, disfuncţii ale
tractului piramidal, demenţă şi este, în general recunoscută ca fiind o tulburare palidopiramidală cu
heterogenitate fenotipică considerabilă.
Pentru testarea adulţilor asimptomatici cu risc sunt disponibile în laboratorul nostru teste pentru mutaţii
la nivelul genelor SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2 şi ATP13A2. Astfel de teste nu sunt utile pentru
292
18
estimarea vârstei de debut, severităţii, tipului de simptome sau modalităţii de progresie a bolii.
debut precoce, posibilul impact al rezultatelor testelor pozitive sau negative şi este evaluat statusul
neurologic. Cei care doresc testarea ar trebui să fie consiliaţi cu privire la eventualele probleme pe
care le pot întâmpina legate de sănătate, invaliditate, educaţie, discriminare, interacţiune socială şi
familială.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut este posibil prin analiza ADN-ul extras din celule
fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei efectuată la aproximativ 15-18 săptămâni de gestaţie, sau
biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-12 săptămâni de gestaţie. Mutaţiile cauzatoare de boală
trebuie să fie identificate înainte de testarea prenatală la un membru afectat al familiei1;3;4;5.
hemolizate5.
Metodă – secvenţiere a tuturor exonilor genelor SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2 şi ATP13A2 +
analiza deleţiilor/duplicaţiilor MLPA5.
Bibliografie
1. Brice Alexis, Dürr Alexandra, Lücking Christoph, Parkin Type of Juvenile Parkinson Disease
PARK2-Related Juvenile Parkinsonism, Gene Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference
2. Hauser Robert A, Pahwa Rajesh, Parkinson Disease www.emedicine.medscape.com, Ref Type:
4. Pankratz Nathan D, Wojcieszek Joanne, Foroud Tatiana, Parkinson Disease Overview, Gene
Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
5. Schneider Susanne A, Klein Christine, PINK1 Type of Young-Onset Parkinson Disease, Gene
Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
293
18.1.5.4 Coreea Huntington
Coreea Huntington este o afecţiune neurodegenerativă progresivă, cu transmitere autozomal
dominantă, caracterizată fenotipic prin mişcări involuntare, distonie, declin cognitiv şi tulburări
comportamentale.
Prevalența bolii este 5-10:100000 cazuri. În mod tipic, primele simptome apar între 35 şi 50 ani însă
afecţiunea poate debuta la orice vârstă. Din cauza apariţiei tardive a simptomelor, o persoană afectată
de coreea Huntington poate avea copii înainte de a şti că suferă de această boală1;6.
Boala a fost descrisă pentru prima dată în 1872 de către medicul american George Huntington.
Termenul „coree” îşi are originea în cuvântul grec khoreia = dans şi caracterizează mişcările
involuntare rapide, nerepetitive, ample şi bruşte specifice bolii; aceste mişcări pot varia în severitate,
de la agitaţie însoţită de o exagerare intermitentă uşoară a gesturilor şi expresiei, mişcări nervoase
ale mâinilor, mers ondulant instabil până la un flux continuu de mişcări violente, invalidante. Coreea
este prezentă la peste 90% dintre pacienţi şi se agravează în cursul primilor 10 ani de evoluţie. Pe
măsură ce boala avansează coreea este înlocuită treptat de distonie şi manifestări parkinsoniene,
cum ar fi bradikinezia, rigiditatea, instabilitatea posturală. În stadiile tardive se instalează un sindrom
akinetic-rigid, în care mişcările coreice sunt minime sau absente. Afectarea funcţiei motorii voluntare
reprezintă un semn precoce de boală; dizartria şi tulburările oculomotorii se dezvoltă de asemenea în
stadiile iniţiale, în timp ce disfagia apare târziu.
Boala Huntigton juvenilă (varianta Westfal; 5-10% din cazuri) debutează înainte de vârsta de 20 ani
şi se caracterizează prin manifestări parkinsoniene, distonie, demenţă, epilepsie şi coree uşoară sau
chiar absentă2;5.
Toate persoanele afectate de coreea Huntington prezintă un declin global progresiv al funcţiilor
cognitive. Sindromul de demenţă include în stadiile iniţiale iritabilitate, neglijenţă, pierderea interesului;
încetinirea procesului de gândire şi tulburările de memorie apar mai târziu. Acest tablou clinic este
caracteristic demenţei subcorticale (diferită de cea care apare în boala Alzheimer), despre care se
crede că reflectă disfuncţia circuitului neuronal fronto-subcortical.
Tulburările comportamentale sunt reprezentate în principal de boala afectivă. Depresia este mai
prevalentă; doar un număr mic de pacienţi prezintă atacuri maniacale caracteristice bolii bipolare. Se
poate înregistra o rată mai mare de suicid; persoanele afectate pot dezvolta de asemenea psihoză,
simptome obsesiv-compulsive, tulburări sexuale, afectarea somnului şi modificări de personalitate2;6.
Trăsăturile neuropatologice ale coreei Huntington includ degenerescenţa neuronală selectivă din
caudat şi putamen. Afectarea preferenţială a neuronilor spinoşi mijlocii GABA-ergici ai căii indirecte
de control al mişcărilor din ganglionii bazali constituie baza neurobiologică a coreei (deteriorarea
sistemelor colinergice şi GABA-ergice din corpii striaţi afectează inhibiţia GABA-ergică a celulelor
din globus pallidus); interneuronii striatali nu sunt în general afectaţi; alte regiuni cerebrale ce pot
fi implicate sunt: substanţa neagră, hipocampul, precum şi alte zone din cortex. Au fost propuse
mai multe mecanisme pentru distrugerea neuronală, cum ar fi exotoxicitatea (efectul neurotoxic al
aminoacizilor excitatori în prezenţa activării excesive a receptorilor postsinaptici), stres-ul oxidativ,
perturbarea metabolismului energetic şi apoptoza2;5.
294
18
HTT (HD) este singura genă asociată cu boala Huntington; unica mutaţie descrisă constă în
expansiunea repetiţiilor trinucleotidului CAG; Nancy Wexler, având experienţa bolii în propria familie,
a descoperit în 1983 localizarea genei HD pe braţul scurt al cromozomului 4 (4p16.3).
Gena HTT (numită şi IT15) are o lungime de aproximativ 200 kb, cu 67 exoni şi o regiune codantă de
10366 bp. La nivelul primului exon se găsesc în alelele normale 8-26 triplete CAG, în timp ce la indivizii
afectaţi de coreea Huntington numărul repetiţiilor depăşeşte 36 (numărul maxim cunoscut până acum fiind
de 250), ceea ce duce la o „alunecare” a ADN-polimerazei în timpul replicării3;5. Coreea Huntington juvenilă
se manifestă atunci când numărul de repetiţii depăşeşte 60. În cazul în care defectul este transmis de la
tată, numărul tripletelor este mai mare decât în cazul transmiterii de la mamă (datorită fenomenului de
amprentare). Sunt descrise 2 tipuri de alelele cauzatoare de boală:
• cu penetranţă completă (sunt asociate întotdeauna cu boala), care prezintă > 40 triplete CAG;
• cu penetranţă redusă, caracterizate prin 36-39 repetiţii CAG, care conferă un risc crescut de boală
Huntington, dar nu toţi purtătorii devin simptomatici.
Alături de alele cauzatoare de boală mai există şi alele intermediare (alele „mutabile”), cu 27-35 repetiţii
CAG, care nu se asociază cu riscul de a dezvolta simptome de boală, dar care datorită instabilităţii
şirului repetitiv CAG, transmis de la o generaţie la alta, sunt predispuse la expansiune şi pot induce
un risc crescut de a da naştere unui copil cu alelă cauzatoare de boală. Aceşti copii sunt consideraţi
ca având o mutaţie “de novo”6.
Gena HTT codifică o proteină – huntingtina; există numeroase polimorfisme ale genei care conduc
la un număr variat de reziduuri de glutamină (aminoacid codificat de tripletul CAG) ce sunt aliniate
monoton la capătul aminoterminal al proteinei. Pe de altă parte, din gena mutantă rezultă un număr
mai mare de reziduuri de glutamină în comparaţie cu gena normală (vezi figura 18.1.5.4), cauza fiind
probabil o mutaţie de tip „gain of function”; aceasta înseamnă că proteina sintetizată este funcţională,
dar are însă în plus efecte „toxice” datorită unei alterări a proprietăţilor structurale şi biochimice1;6. Date
recente sugerează că interferarea lanţului poliglutamic alungit cu transcripţia CBP (CREB binding
protein), un mediator esenţial al semnalelor de supravieţuire în neuronii maturi, ar constitui o “funcţie”
dobândită genetic2.
Proteina normală
Fig. 18.1.5.4 Gena HTT normală şi mutantă

împreună cu proteinele asociate
(Adaptare după publications.nigms.nih.
Gena cu 8-26 triplete
repetitive
Triplete repetitive
Gena mutantă govfindingssept08imageshunt_gene_big.
cu peste 36 triplete
repetitive jpg)
Proteina anormală
Huntingtina suferă modificări posttranslaţionale care constau în clivarea acesteia în aval de lanţul
poliglutamic (de către enzimele denumite caspaze); fragmentul aminoterminal rezultat este citotoxic şi
295
provoacă apoptoză2;3. Acumularea intracelulară de fragmente aminoterminale de huntingtină agregate

(incluzii intraneuronale) reprezintă una din caracteristicile neuropatologice ale coreei Huntington6.
- confirmarea diagnosticului de coree Huntington la persoanele afectate;
- testarea în scop predictiv a adulţilor asimptomatici cu risc crescut (50%); necesită o consiliere
foarte atentă pre- şi post-testare, deoarece nu este disponibil un tratament specific al bolii;
- diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut (50%); se efectuează prin analiza ADN-ul
extras din celule fetale obţinute prin amniocenteză, de obicei efectuată la aproximativ 15-18
săptămâni de gestaţie, sau biopsia vilozităţilor coriale, la aproximativ 10-12 săptămâni de
gestaţie; diagnosticul trebuie să fie confirmat în familie prin tehnici moleculare, înainte de
testarea prenatală5.
hemolizate4.
Metodă – reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) pentru detectarea ţintită a alelor cu până la 115 repetiţii
CAG4.
Va fi comunicat numărul de repetiţii CAG în gena HTT4.
Alelele care conţin ≥ 36 repetiţii CAG sunt considerante ca fiind cauzatoare de boală şi conferă riscul
de a dezvolta boala. În timp ce alelele cu 36-39 repetiţii CAG au penetranţă incompletă, cele cu ≥ 40
repetiţii CAG sunt asociate întotdeauna cu dezvoltarea bolii.
Corelaţii genotip-fenotip
Există o corelaţie inversă semnificativă între numărul de repetiţii CAG şi vârsta de debut a coreei
Huntington:
• persoanele cu debut la vârsta adultă prezintă de obicei un număr de repetiţii CAG cuprins între 36
şi 55;
• persoanele cu debut juvenil prezintă de obicei un număr de repetiţii CAG ≥60.
Mai multe informaţii cu privire la vârsta de debut în funcţie numărul de repetiţii CAG se pot găsi pe
website-ul: www.cmmt.ubc.ca.
De asemenea există o corelaţie negativă semnificativă între dimensiunea segmentului de repetiţii
CAG şi variabilitatea debutului, în sensul că asocierea dintre dimensiunile CAG mai mici şi debutul
tardiv al bolii este mai puţin precisă. În medie, mărimea repetiţiilor CAG este responsabilă de până la
70% din variabilitatea vârstei de debut, în timp ce alţi factori moşteniţi sunt responsabili de 10-20%
din variabilitatea reziduală.
Rata deteriorării motorii, cognitive şi a indicilor funcţionali se corelează direct cu mărimea repetiţiilor
CAG. Se pare însă că progresia tulburărilor comportamentale nu este asociată cu numărul repetiţiilor
CAG.
Homozigoţii pentru alelele HTT cu penetranţă completă au o vârstă de debut a bolii similară cu cea a
296
18
heterozigoţilor, dar pot prezenta o rată accelerată de progresie a bolii.

Consilierea genetică
Coreea Huntington este o boală cu transmitere autozomal dominantă; din acest motiv copiii unei
persoane afectate au un risc de 50% de a moşteni alela cauzatoare de boală. Dacă persoana afectată
este homozigotă pentru expansiunea repetiţiilor CAG, fiecare copil al său va moşteni alela cauzatoare
de boală.
La fraţii persoanei afectate riscul de a face boala depinde de statusul genetic al părinţilor:
• dacă un părinte este afectat sau are o alelă HTT cu ≥ 40 repetiţii CAG riscul este de 50%;
• dacă tatăl are o alelă HTT intemediară riscul de a moşteni o alelă cauzatoare de boală este de până
la 5%; cu cât segmentul de repetiţii CAG este mai mare cu atât este mai predispus la expansiune;
nu a fost descris nici un caz de expansiune a unei alele intermediare materne; alelele intermediare
expansionate sunt transmise preferenţial de bărbaţii cu vârstă paternă avansată;
• un frate care moşteneşte o alelă HTT cu penetranţă scăzută poate sau nu să facă boala.
Deşi majoritatea persoanelor afectate de coree Huntington au un părinte afectat, există unele situaţii
în care istoricul familial este negativ:
• afecţunea nu a fost diagnosticată corect la membri familiei;
• deces prematur al persoanei cu alela mutantă, înainte de debutul simptomelor;
• prezenţa unei alele intermediare sau a unei alele cu penetranţă redusă la un părinte asimptomatic;
• debut tardiv al bolii la părintele afectat.
Testarea genetică este recomandată la părinţii unei persoane care prezintă o mutaţie aparent de
novo6.
În cazuri foarte rare pot fi depistate persoane vârstnice asimptomatice având un număr de 36-39
repetiţii CAG.
Deşi există o corelaţie importantă între vârsta de debut a bolii şi mărimea repetiţiilor, CAG testarea
genetică a persoanelor asimptomatice poate să nu ofere întotdeauna o estimare adecvată a vârstei
de debut, a severităţii simptomelor sau a ratei de progresie a acestei afecţiuni6.
Bibliografie
1. Francis O Walker. Huntington’s Disease. In The Lancet, 2007; 369:218-28.

2. Fredy J Revilla, Jaime Grutzendler, Travis R Larsh. Huntington Disease. www.emedicine.
medscape.com, Ref Type: Internet Communication.
3. HTT Gene. Gene cards. www.genecards.org. Reference Type: Internet Communication.
5. Rolf Knippers. Chorea Huntington. In Molekulare Genetik, 9. Auflage 2006, amazon.de.
6. Simon C Warby, Rona K Graham, Michael R Hayden. Huntington Disease. Gene Reviews,
2010. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
297
18.1.5.5 Distrofia neuroaxonală infantilă

Distrofia neuroaxonală infantilă (DNAI) este o tulburare neurodegenerativă rară, transmisă autozomal
recesiv, cu debut în primii doi ani de viaţă. Boala se caracterizată clinic prin regresie psihomotorie
şi hipotonie, care progresează spre tetraplegie spastică, deteriorare vizuală sau demenţă, iar
histopatologic prin existenţa unor formaţiuni sferoide, dilataţii axonale de origine necunoscută, ce se
găsesc atât în sistemul nervos central cât şi periferic3;4.
În 2006 au fost identificate atât gena PLA2G6 situată pe cromozomul 22q13.1, cât şi una dintre
mutaţiile care stau la baza apariţiei bolii. Gena este formată din 17 exoni şi codifică mai multe izoforme
ale aceleiaşi enzime, o fosfolipază calciu-independentă, iPLA2-VIA (forma activă este un tetramer).
Această familie de fosfolipaze (A2), catalizează hidroliza glicerofosfolipidelor, generând un acid gras
liber (de obicei acidul arahidonic) şi un lizofosfolipid. Se crede că proteina codificată este implicată în
remodelarea fosfolipidelor, eliberarea acidului arahidonic, sinteza de leukotriene şi prostaglandine şi
activarea apoptozei pe calea receptorului Fas. Enzimele iPLA2 joacă un rol important în homeostazia
membranelor celulare, fiind implicate în reglarea nivelului de fosfolipide. Deficienţe în funcţia iPLA2-
VIA ar putea conduce la o creştere a concentraţiei fosfolipidelor în membrană sau alterarea proporţiilor
diferitelor componente membranare cu apariţia unor anomalii structurale secundare (formaţiuni
sferoide), care pot contribui la patologia axonală observată în DNAI3;4;5.
La nivelul genei PLA2G6 au fost identificate aproximativ 44 mutaţii unice la persoanele cu distrofie
neuroaxonală infantilă (mutaţii nonsens, deleţii, care determină eliminarea de aminoacizi sau deleţii
mari). Unele mutaţii au fost identificate în mai multe familii neînrudite, dar care aveau aceeaşi origine
etnică1.
Ambele forme enzimatic active ale fosfolipazei codificate de gena PLA2G6 sunt afectate de toate
mutaţiile raportate până în prezent.
Clinic, distrofia neuroaxonală infantilă (DNAI) se prezintă sub două forme: clasică şi atipică.
Forma clasică debutează, de obicei, între şase luni şi trei ani, cu hipotonie, tulburări de mers, întârziere
psihomotorie progresivă şi semne de afectare simetrică a tractului piramidal. O caracteristică specifică
de progresie a distrofiei neuroaxonale infantile este înlocuirea hipotoniei musculare (de la nivelul
trunchiului) observată încă de la debutul bolii cu tetrapareza spastică.
Mulţi copii afectaţi nu vor învăţa niciodată să meargă sau vor pierde această capacitate la scurt timp
după învăţare.
Semnele şi simptomele vizuale sunt frecvente: strabismul şi nistagmusul sunt caracteristicile precoce
ale bolii, iar atrofia optică apare mai târziu la majoritatea pacienţilor. La examenul RM se pot observa
paloarea nervului optic (semn precoce de atrofie optică), tracturi optice subţiri sau modificări ale
chiasmei optice.
La un număr mic de pacienţi în fazele terminale pot apărea convulsii.
Progresia bolii este rapidă. Spasticitatea severă, scăderea progresivă a funcţiilor cognitive, precum
şi deficienţele de vedere conduc în final la apariţia unui status vegetativ. Moartea apare ca rezultat
al bolilor secundare, cum ar fi pneumonia de aspiraţie, asociată cu disfuncţie bulbară. Mulţi copii nu
supravieţuiesc dincolo de primul lor deceniu de viaţă, dar există şi persoane care au ajuns până la
298
18
adolescenţă sau chiar mai târziu. Tratamentul de susţinere poate contribui la creşterea duratei de
viaţă prin reducerea riscului de apariţie a infecţiilor sau a altor complicaţii1.
Manifestările clinice ale formei atipice sunt destul de variate comparativ cu cele ale formei clasice
(care sunt relativ omogene). În general, debutul în cazurile atipice este în copilăria timpurie, dar poate
fi şi către sfârşitul adolescenţei.
Persoanele afectate prezintă semne de instabilitate la mers, ataxie (ca în forma clasică), întârziere
în vorbire sau caracteristici asemănătoare bolnavilor de autism, care sunt, uneori, singura dovadă de
boală timp de un an sau mai mult, având în vedere că progresia formei atipice este lentă. Evoluţia
bolii este relativ stabilă în prima parte a copilăriei, dar este urmată de deteriorare neurologică între 7
şi 12 ani.
Deşi tetrapareza este prezentă în fazele finale de boală, aceasta nu este neapărat precedată de
hipotonie. În comparaţie cu forma clasică, manifestările extrapiramidale (distonie sau dizartrie)
predomină la pacienţii cu caracteristici atipice. Semnele şi simptomele oculare sunt similare la cele
două forme de boală. Tulburările neuropsihice, impulsivitatea, lipsa atenţiei, hiperactivitatea sau
labilitatea emoţională sunt, de asemenea, manifestări comune ale afecţiunii.
Cazurile atipice de DNAI sunt rare, durata de viaţă este necunoscută, dar cu toate acestea este de
aşteptat să fie mai mare decât cea observată în boala clasică1.
Din punct de vedere histopatologic DNAI se caracterizează prin leziuni distrofice ale axonilor
(formaţiuni sferoide axonale). Pe fragmentele tisulare obţinute prin biopsie de la nivelul conjunctivei,
tegumentului, muşchilor, nervului sural sau rectului, la microscopul electronic se pot observa: formaţiuni
membranotubulare, agreagate mitocondriale, creşterea diametrului axonal şi subţierea membranei.
Deoarece formaţiunile sferoide axonale se acumulează cu vârsta şi nu pot fi evidenţiate în toate
ţesuturile, persoanele cu DNAI necesită mai multe biopsii de-a lungul timpului, înainte ca elementele
histopatologice specifice să fie identificate. Prin urmare, o biopsie negativă nu poate exclude DNAI,
iar biopsia pozitivă este considerată ca având valoare diagnostică.
Înainte de 2006, diagnosticul de DNAI era stabilit pe baza elementelor clinice şi histopatologice. De
la descoperirea genei PLA2G6, cunoscută a fi singura genă asociată cu DNAI, testarea moleculară a
fost folosită pentru confirmarea diagnosticului eliminând în multe cazuri necesitatea biopsiei tisulare1.
Testarea moleculară detectează aproximativ 85% din mutaţiile persoanelor diagnosticate clinic cu
DNAI. Din întreaga populaţie a persoanelor pozitive pentru anomalii ale genei PLA2G6, aproximativ
10% au o singură mutaţie identificată.
Toate persoanele cu forma clasică de boală prezintă două alele nule ale genei PLA2G6, iar fenotipul
atipic apare la heterozigoţii compuşi pentru mutaţii missens.
Deoarece DNAI se transmite autozomal recesiv, în momentul concepţiei fiecare frate al unui individ
afectat are 25% şanse să fie purtător şi să prezinte afecţiunea, 50% şanse să fie purtător asimptomatic
şi 25% şanse să fie nu fie purtător şi să nu fie afectat.
Diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutaţie PLA2G6 este posibil prin analiza
Mutaţii cauzatoare de boală trebuie să fie identificate înainte de testarea prenatală la ambii părinţi.
Pentru stabilirea diagnosticului de certitudine, statusului de purtător sau testarea prenatală a femeilor
299
gravide cu risc crescut (în familie în care mutaţiile cauzatoare de boală sunt cunoscute) este disponibil
în laboratorul nostru testul pentru identificarea mutaţiilor de la nivelul genei PLA2G61.
hemolizate2.
Metodă - secvenţierea completă a genei PLA2G6 (se pot identifica ~ 85% din mutaţii)2.
Vor fi comunicate mutaţiile depistate în gena PLA2G6 şi genotipul respectiv2.
Bibliografie

1. Allison Gregory, Susan J Hayflick, Infantile Neuroaxonal Dystrophy, Gene Reviews, 2008, www.
ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication.
3. Nardo Nardocci, Infantile Neuroaxonal Dystrophy, www.orpha.net/data/patho/GB/uk-INAD.pdf,
2004, Reference Type: Internet Communication
4. Neil V Morgan, Shawn K Westaway, Jenny E V Morton, Allison Gregory, Paul Gissen, Scott
Sonek, Hakan Cangul, Jason Coryell, Natalie Canham, Nardo Nardocci, Giovanna Zorzi,
Shanaz Pasha, Diana Rodriguez, Isabelle Desguerre, Amar Mubaidin, Enrico Bertini, Richard
C Trembath, Alessandro Simonati, Carolyn Schanen, Colin A Johnson, Barbara Levinson, C
Geoffrey Woods, Beth Wilmot, Patricia Kramer, Jane Gitschier, Eamonn R Maher, and Susan
J Hayflick, PLA2G6, encoding a phospholipase A2, is mutated in neurodegenerative disorders
with high brain iron. In Nat Genet, 38(7): 752–754, 2006
5. Shareef Khateeb, Hagit Flusser, Rivka Ofir, Ilan Shelef, Ginat Narkis, Gideon Vardi, Zamir
Shorer, Rachel Levy, Aharon Galil, Khalil Elbedour, and Ohad S. Birk, PLA2G6 Mutation
Underlies Infantile Neuroaxonal Dystrophy. In The American Journal of Human Genetics, 79,
2006
300
18
18.2 TESTE DE FARMACOGENETICĂ
18.2.1 Genotipare DPD (toxicitate 5-fluorouracil)
Dihidropirimidin dehidrogenaza (DPD) este enzima care determină rata de metabolizare a bazelor
pirimidinice, uracil şi timidină. DPD catalizează de asemenea detoxifierea agenţilor chimioterapici pe
bază de pirimidină, 5-fluorouracil (5-FU) şi capecitabin, fiind responsabilă de eliminarea a ~80% din
doza administrată3.
5-FU este un agent citostatic utilizat de câteva decenii în tratamentul tumorilor solide: colorectale,
mamare, de cap şi gât. Modul său de acţiune se bazează pe efectul de antimetabolit al fluoropirimidinelor,
care determină un deficit de timidină prin inhibarea timidilat sintazei şi conduce în final la împiedicarea
sintezei ADN-ului4.
Activitatea DPD scăzută este asociată cu mielosupresie severă, uneori letală, la administrarea unor
doze standard de 5-FU. Astfel, sindromul deficitului DPD se manifestă prin diaree severă, mucozită,
neurotoxicitate şi, în unele cazuri, deces. Acesta reprezintă un sindrom farmacogenetic real, deoarece
nu poate fi identificat din punct de vedere clinic decât în mometul expunerii la agentul chimioterapic5.
Deficitul enzimatic este cauzat în ~50% din cazuri de o mutaţie la nivelul genei DPD de pe cromozomul
1, denumită IVS14+1G>A sau DPYD*2A. Mutaţia constă într-un schimb de baze G>A la nivelul
joncţiunii de splicing a intronului 14 ce conduce la „omiterea” exonului 14 de la transcripţie şi, astfel, la
o deleţie de 165 bp din DPD ARNm (vezi figura 18.2.1.1). Genotipul DPYD*2A homozigot conduce la
un dficit enzimatic complet, în timp ce genotipul heterozigot este asociat cu un deficit parţial4;5.
ADN
ARNm
Proteina funcĠională Proteina defectă
ToleranĠă 5-FU Toxicitate 5-FU
Figura 18.2.1.1 Reprezentare schematică a genei DPD, a mutaţiei care duce la „omiterea” exonului
14 şi a consecinţelor funcţionale (Adaptare după Birgit Busse, Dihydropyrimidine dehydrogenase
(DPD) - 5-FU therapy, www.medical-genetics.de)
În populaţia caucaziană sunt raportate următoarele frecvenţe pentru alela IVS14+1G>A: 0.91% pentru
statusul homozigot şi 1.8% pentru statusul heterozigot2.
Măsurarea directă a activităţii catalitice a DPD este destul de dificilă, deoarece singurul ţesut care
301
conţine o cantitate suficientă de enzimă este ţesutul hepatic, iar efectuarea biopsiei constituie o
manevră invazivă pentru pacient. Alternativ au fost dezvoltate teste care determină activitatea DPD
în limfocitele din sângele periferic dar şi acestea prezintă protocoale de lucru laborioase, iar valorile
obţinute nu se corelează întotdeauna cu toxicitatea 5-FU; mai este posibilă şi măsurarea ratei de
generare a metabolitului 5-FU în urma administrării unei doze test de citostatic.
Genotiparea DPD constituie o potenţială oportunitate diagnostică pentru îmbunătăţirea eficacităţii şi
siguranţei terapiei cu 5-FU sau capecitabin. Totuşi, având în vedere faptul că activitatea DPD ar putea
fi influenţată pe lângă factorii genetici şi de vârstă, sex, stilul de viaţă, medicaţia asociată, este nevoie
de studii mai mari pentru adoptarea universală a screening-ului genetic pre-tratament combinat cu
determinarea directă a activităţii enzimatice.
Până în prezent nu există recomandări precise privind atitudinea terapeutică la pacienţii cu deficit
de DPD; un pas în această direcţie l-au efectuat Volk şi colaboratorii care au raportat că pacienţii cu
activitate DPD foarte scăzută au fost trataţi cu succes printr-o terapie alternativă4.
Recomandări pentru genotiparea DPD
- identificarea pacienţilor cu risc de a dezvolta toxicitate la administrarea de 5-FU sau
capecitabin;
- stabilirea necesităţii ajustării dozelor sau selectării unei terapii alternative3.
Pregătire pacient - nu este necesară o pregătire specială; pe biletul de trimitere către laborator va fi
precizat medicamentul pentru care se solicită testarea1.
hemolizate2.
Metodă – secvenţiere exon14 pentru identificarea mutaţiei IVS14+1G>A1.
Se va raporta prezenţa sau absenţa mutaţiei IVS14+1G>A; în cazul unui rezultat pozitiv se va
comunica statusul heterozigot/homozigot1.
Testul detectează numai mutaţia IVS14+1G>A a genei DPD. Alte mutaţii nu pot fi identificate1.
Bibliografie
2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. DPD
5Fluorouracil Toxicity. www.labcorp.com, 2010. Ref Type: Internet Communication.
3. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Dihzdropzrimidine Dehydrogenase (DPD)
Gene Mutation Analysis. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
4. M. Eidens, S. Prause, A. Weise, M. Klemm, M.M. Weber, A. Pfützner, Dihydropyrimidine
Dehydrogenase Genotyping and Phenotyping for 5-Fluorouracil Dysmetabolism: Moving
Towards Personalized Chemotherapy in Patients with Cancer. In Current Pharmacogenomics
302
18
and Personalized Medicine, 2009, 7, 275-283.

5. M.W. Saif, hanny Ezzeldin, Katisha Vance, Sandra Sellers, Robert B. Diasio. DPYD*2A
mutation: the most common mutation associted with DPD deficiency. In Cancer Therapy and
Pharmacology, Vol.60, No.4, 503-507, 2007.
18.2.2 Genotipare TPMT (toxicitate 6-mercaptopurină, azatioprină)
Tiopurinele (azatioprina, 6-mercaptopurina şi 6-tioguanina) sunt folosite în tratmentul pacienţilor cu
leucemie, afecţiuni reumatismale, boli inflamatorii intestinale şi transplant de organe solide.
Pentru a-şi exercita efectul terapeutic (citotoxic) este nevoie ca aceste medicamente să fie convertite
în nucleotide tioguaninice; această conversie poate fi blocată prin metilare sau oxidare. Căile de
metilare depind de activitatea tiopurin-metiltransferazei (TPMT), ce cunoaşte variaţii interindividuale
importante: aproximativ 90% prezintă activitate normală, 10% activitate intermediară, iar 0.3%
activitate nedecelabilă3;4.
Nucleotidele tioguaninice se pot acumula la pacienţii cu activitate TPMT redusă şi pot induce toxicitate
hematopoietică (mielosupresie) la doze standard de tiopurină. Micşorarea dozelor poate reduce
toxicitatea la aceşti pacienţi.
Activitatea TPMT scăzută este cauzată de polimorfisme la nivelul genei TPMT localizată pe
cromozomul 6. Studiile moleculare au identificat 4 alele care sunt responsabile de >95% din activitatea
TPMT redusă: TPMT*2 (238G>C), TPMT*3A (460G>A şi 719A>G), TPMT*3B (460G>A) şi TPMT*3C
(719A>G). Persoanele care prezintă două astfel de de variante alelice au o activitate TPMT foarte
scăzută sau chiar absentă; cele cu 1 alelă prezintă o activitate TPMT intermediară. Alela normală
de tip sălbatic este denumită TPMT*1; persoanele homozigote pentru alele TPMT*1 au activitate
enzimatică normală.
Genotiparea TPMT are valoare predictivă asupra toxicităţii induse de tiopurine. Spre deosebire de
metodele folosite pentru determinarea activităţii TPMT în eritrocite care se pot asocia atât cu rezultate
fals crescute (în urma transfuziilor de sânge), cât şi fals scăzute (ca urmare a „îmbătrânirii” hematiilor),
genotiparea prin tehnici de biologie moleculară nu este influenţată de aceste variabile4.
Un studiu recent şi-a propus să examineze cost-eficienţa genotipării TPMT înaintea începerii
tratamentului cu 6-mercaptopurină la copiii cu leucemie acută limfoblastică. Au fost revizuite date din
literatură şi au fost consultaţi experţi din 4 ţări (Olanda, Germania, Marea Britanie şi Irlanda). Concluzia
bazată pe informaţiile legate de costul genotipării, frecvenţa deficitului TPMT, rata mielosupresiei
induse de mercaptopurină la persoanele cu activitate TPMT redusă şi costurile asociate cu spitalizarea
datorată mielosupresiei în cele patru ţări, a fost că genotiparea TPMT pre-terapeutică la toţi pacienţii
cu leucemie acută limfoblastică este cost-eficientă5.
303
În ceea ce priveşte practica reumatologică sunt date care sugerează că genotiparea TPMT înaintea
începerii tratamentului cu azatioprină este eficientă în reducerea numărului de episoade de neutropenie
severă; este nevoie însă de studii prospective mai mari care să demonstreze impactul testării asupra
eficacităţii şi siguranţei administrării medicamentului1.
Recomandări pentru genotiparea TPMT
- identificarea pacienţilor cu risc de a dezvolta toxicitate la administrarea medicamentelor
tiopurinice;
- stabilirea necesităţii ajustării dozelor sau selectării unei terapii alternative4.
precizat medicamentul pentru care se solicită testarea2.
hemolizate2.
Metodă – secvenţiere exoni 4, 6 şi 9 TPMT pentru detectarea principalelor variante alelice asociate cu
activitate enzimatică redusă şi a altor variante mai rare situate la nivelul exonului 92.
Se va comunica genotipul TPMT obţinut.
Genotipul TPMT*1/ TPMT*1 este asociat cu cu o activitate enzimatică normală; este puţin probabil ca
dozele standard de tiopurine să fie toxice la persoanele cu acest genotip.
Heterozigoţii cu o alelă normală TPMT*1 şi variantă alelică prezintă o activitate TPMT intermediară, au
un risc crescut de toxicitate hematologică şi necesită reducerea dozelor de tiopurine.
Pacienţii cu două variante alelice prezintă o activitate enzimatică foarte scăzută sau absentă şi au risc
de toxicitate hematologică potenţial letală la dozele standard de tiopurine. La aceşti pacienţi se va
recurge la o terapie aternativă sau se vor reduce mult dozele.
Alela TPMT*3A conţine 2 polimorfisme (460G>A şi 719A>G) întâlnite la alelele TPMT*3B (460G>A)
şi TPMT*3C (719A>G),; din acest motiv testul nu poate diferenţia genotipul TPMT*1/ TPMT*3A
(asociat cu activitate enzimatică intermediară) de genotipul TPMT*3B/ TPMT*3C (asociat cu activitate
enzimatică absentă). Ultimul genotip are o frecvenţă foarte redusă în populaţie4.
Bibliografie
1. K. Payne. TPMT testing in rheumatology: any better than routine monitoring? In Oxford Journals,
Rheumatology, vol 46, 727-729.
3. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Prometheus TPMT Genetics. www.
mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
4. Quest Diagnostics. TPMT Genotype. Clinical Focus. www.questdiagnostics.com. Reference
304
18

5. van den Akker-van Marle ME, Gurwitz D, Detmar SB, Enzing CM, Hopkins MM, Guttierez de
Mesa E, Ibarreta M. Cost-effectiveness of pharmacogenomics in clinical practice: a case study
of thiopurine methyltransferase genotyping in acute lymphoblastic leukemia in Europe. In
Pharmacogenomics 2006 Jul;7(5):783-92.
18.2.3 Genotipare CYP2C19
Numeroase medicamente şi substanţe chimice sunt metabolizate la nivelul citocromului P450
(CYP450), o familie mare de enzime localizată în microzomii multor ţesuturi - în special ficat şi
intestin - ce include peste 50 izoforme cu activitate oxidativă/dealchilantă. Diferenţele individuale în
activiatea CYP450 au ca rezultat modificări în metabolizarea medicamentelor, de la absenţa totală
a metabolizării până la degradarea ultrarapidă a acestora. Aceste variaţii pot determina fie reacţii
adverse semnificative, fie lipsa răspunsului terapeutic la doze standard de medicament3;4.
CYP2C19 constituie una din enzimele CYP450 ce este responsabilă de metabolizarea a 15% dintre
medicamentele administrate, printre care se numără clopidogrel, propafenonă, omeprazol, sertralină,
citalopram, diazepam3.
Au fost identificate polimorfisme specifice al genei care codifică enzima CYP2C19 ce induc alterări ale
activităţii enzimatice. Frecvenţa acestor polimorfisme variază semnificativ în cadrul principalelor grupuri
etnice. Astfel, polimorfismele CYP2C19 care produc enzime cu activitate scăzută (“metabolizatori
lenţi”) sunt întâlnite cu frecvenţe de 2-5% la caucazieni, 4% la americanii de origine africană, 13-23%
la asiatici şi 38-79% la polinezieni şi micronezieni.
În tabelul de mai jos este ilustrată legătura dintre polimorfismele genei CYP2C19 detectate în cadrul
acestui test şi efectul asupra activităţii enzimatice:
Alela CYP21C19 Modificarea nucleotidică Efectul asupra activităţii enzimatice

*1 Alela de tip „sălbatic” Activitate normală
*2 c.681G->A Activitate absentă
*4 c.1A->G Activitate absentă
*7 IVS5+2T->A Activitate absentă
*8 c.358T->C Activitate foarte redusă (70-90%)
*17 c.-806C->T Activitate crescută
Persoanele care nu prezintă polimorfisme inactivatoare au fenotipul de “metabolizator extensiv”
305
(normal), iar alela corespunzătoare, de de tip „sălbatic”, este denumită CYP2C19*1.

Toate polimorfismele identificate sunt autozomal recesive, astfel că numai indivizii homozigoţi sau
heterozigoţi compuşi pentru aceste polimorfisme sunt “metabolizatori lenţi”. Persoanele heterozigote,
cu o alelă normală şi una polimorfică vor prezenta un fenotip metabolic intermediar, între cel de
“metabolizator extensiv” şi cel de “metabolizator lent”.
Din aceste motive, dozajul medicamentelor ce sunt metabolizate de către enzima CYP2C19 necesită
o ajustare individuală pentru a obţine efectul terapeutic scontat, cu un risc minim de reacţii adverse.
Pacienţii care sunt “metabolizatori lenţi” pot beneficia de modificarea dozelor sau de înlocuirea cu
medicamente similare ce nu sunt metabolizate la nivelul CYP2C19.
Principalele clase de medicamente metabolizate de către CYP2C19:
• antiagregante: clopidogrel (Plavix);
• anticonvulsivante: mefenitoin, fenitoin, diazepam, primidonă;
• antidepresive: amitriptilină, citalopram, S-citalopram, clomipramină;
• citostatice: ciclofosfamidă;
• antiretrovirale: nelfinavir;
• inhibitori de pompă protonică: lansoprazol, pantoprazol, omeprazol;
• altele: progesteron, propranolol, R-warfarină (izomerul mai puţin activ), proguanil.
Coadministrarea poate scădea rata de eliminare a altor medicamente metabolizate de către
CYP2C19.
Medicamente care cresc activittaea CYP2C19:
• carbamazepină;
• prednison;
• rifampicină.
Coadministrarea acestor medicamente induce o sinteză crescută CYP2C19 şi măreşte astfel rata de
eliminare a medicamentelor metabolizate de către CYP2C19.
Medicamente care reduc activittaea CYP2C19:
• cloramfenicol;
• cimetidină;
• felbamat;
• fluoxetin;
• fluvoxamin;
• indometacin;
• carbamazepină;
• prednison;
• ketoconazol;
• lansoprazol, omeprazol;
• modafinil;
• probenecid;
• ticlopidină;
• topiramat.
Coadministrarea va reduce rata de eliminare a medicamentelor metabolizate de către CYP2C19 şi va
creşte astfel riscul de reacţii adverse, în special la persoanele heterozigote4.
306
18
Clopidogrelul este un antiagregant palchetar larg utilizat în tratamentul pacienţilor care au suferit în
antecedente un eveniment cardiovascular, cât şi pentru profilaxia trombozei în urma implantării unui
stent. Totuşi, studiile arată că acest medicament este mai puţin eficient la circa 30% dintre caucazieni,
40% dintre africani şi >55% dintre persoanele de origine est-asiatică în asociere cu fenotipul CYP2C19
de “metabolizator lent”5.
Clopidogrelul este un promedicament care este metabolizat în compusul său activ de către anumite
enzime CYP450, dintre care CYP2C19 deţine rolul esenţial2;4;5. Alelele care determină pierderea sau
reducerea severă a activităţii enzimatice (*2, *3, *4, *6, *7, *8) sunt asociate cu o inhibiţie plachetară
mai redusă şi cu un risc crescut de complicaţii cardiovasculare, cum ar fi infarctul miocardic, tromboza
de stent, accidente vasculare cerebrale şi/sau deces, în comparaţie cu persoanele homozigote pentru
fenotipul „sălbatic” (*1/*1). Pe de altă parte, persoanele purtătoare ale alelei *17 sunt considerate
“metabolizatori rapizi” şi prezintă un risc crescut de sângerări în cursul administrării de clopidogrel6.
Recomandări pentru genotiparea CYP2C19
- identificarea activităţii enzimatice alterate înaintea începerii tratamentului (preferabil!) cu un
medicament metabolizat de către CYP2C19;
- identificarea pacienţilor care prezintă rezistenţă la tratamentul cu clopidogrel sau, dimpotrivă,
au un risc mare de sindrom hemoragipar4.
precizat medicamentul sau medicamentele pentru care se solicită testarea1.
hemolizate1.
specifice pe stripuri1.
Se va comunica genotipul CYP2C19 obţinut şi fenotipul de metabolizare asociat (conform tabelului
de mai sus)1.
Testul detectează doar alelele menţionate în tabel; alte alele mai rare asociate cu alterarea activităţii
enzimatice nu vor fi identificate1.
Înaintea de iniţierea unei terapii noi trebuie ţinut cont de faptul că există şi alţi factori care pot influenţa
metabolismul medicamentelor cum ar fi: dieta, absorbţia digestivă, medicaţia asociată şi, nu în ultimul
rând, complianţa inadecvată a pacientului2.
Bibliografie
2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Clopidogrel
CYP2C19 Genotyping. www.labcorp.com, 2010. Ref Type: Internet Communication.
307
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Cytochrome

P450 2C19 Genotyping. www.labcorp.com, 2010. Ref Type: Internet Communication.
4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: . Cytochrome P450 2C19 Genotyping by
Sequence Analysis. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. Quest Diagnostics. AccuTypeTM CP, Clopidogrel CYP2C19 Genotype (*2, *3, *4, *5, *6, *7, *8) .
Clinical Focus. www.questdiagnostics.com. Reference Type: Internet Communication.
6. Simon T, Verstuyft C, Mary-Krause M, et al. Genetic Determinants of Response to Clopidogrel
and Cardiovascular Events. In N Engl J Med, 2009, 360(4):363-375.
18.2.4 Genotipare CYP2D6 (tratament cu tamoxifen)
CYP2D6 este o enzimă ce face parte din marea familie a citocromului P450 (familia 2, subfamilia D)
implicată în metabolizarea a 25% dintre medicamentele administrate, printre care se numără codeina,
antidepresivele triciclice (de exempu, nortriptilină), inhibitori selectivi ai recaptării serotoninei (SSRI:
fluvoxamin), inhibitori ai recaptării serotoninei-norepinefrinei (SSNRI: venlafaxină), antipsihotice
clasice (haloperidol), beta-blocante. Anumite variante ale acestei enzime influenţează şi metabolismul
tamoxifenului la femeile cu cancer mamar în perioada de postmenopauză2.
Tamoxifenul este larg utilizat în terapia hormonală a pacientelor cu tumori mamare pozitive pentru
receptorii estrogenului (ER). Beneficiul său clinic a fost constatat de mai bine de trei decade, atât în
tratamentul adjuvant al formelor avansate de boală debutate înainte de menopauză cât şi ca opţiune
validă, alături de inhibitorii de aromatază, în perioada de postmenopauză. Totuşi, aproximativ o treime
din pacientele tratate cu tamoxifen prezintă o recurenţă a bolii în decurs de 15 ani de la intervenţia
chirurgicală. Se descrie de asemenea o variaţie inter-individuală semnificativă atât în ceea ce priveşte
efectul terapeutic cât şi reacţiile adverse4.
Tamoxifenul este un modulator selectiv al receptorului pentru estrogen (SERM). Date recente au
indicat faptul că eficacitatea tamoxifenului depinde de biotransformarea, predominant cu ajutorul
enzimei CYP2D6, în metabolitul său activ endoxifen care are o afinitate mai mare pentru receptorul
estrogenului şi un efect anti-estrogenic mai potent decât tamoxifenul. La râdul său, activitatea CYP2D6
este extrem de variabilă ca urmare a polimorfismului genei care codifică enzima şi a inhibitorilor
CYP2D6 utilizaţi ca medicaţie asociată4.
CYP2D6 se exprimă în principal la nivel hepatic; au fost descrise până în prezent peste 100
polimorfisme - variante alelice - asociate cu activitate enzimatică crescută, scăzută sau absentă (vezi
tabelul 18.2.4.1).
308
18
Alele CYP2D6 Activitate enzimatică

*1, *2, *33, *35 Normală
*3,*4,*5,*6,*7,*8,*11-*16, *18,
*19,*20,*21, *36, *38,*40, *42, *44, Absentă
*56, *62, 4xn, 6xn, 36xn
*9,*10, *17, *29, *41, *69, 29xn and
Scăzută
41xn
*22,*23-*28, *30-*32, *34,*37,*39,
Necunoscută
*43,*45-*68, *70-*75
*1xn, *2xn,*35xn Crescută
Tabel 18.2.4.1 Alelele CYP2D6 şi efectul acestora asupra activităţii enzimatice
Acestea conferă diferite fenotipuri cu următoarea prevalenţă în populaţia caucaziană: metabolizator

lent (7-10%), intermediar (10-15%), ultrarapid (10-15%) şi extensiv (normal). Activitatea crescută
rezultă prin duplicaţia genei CYP2D6, în timp ce activitatea redusă/absentă este consecinţa unor
deleţii, mutaţii ale codonului STOP sau defecte de splicing4.
Polimorfismele asociate cu fenotipul de „metabolizator lent” sunt autozomal recesive; din acest motiv
numai statusul homozigot sau heterozigot compus pentru aceste polimorfisme conferă fenotipul de
„metabolizator lent” asociat cu niveluri inadecvate de endoxifen la pacientele cu cancer mamar care
primesc tratament cu tamoxifen şi, din acest motiv, cu un risc mai mare de recurenţă a bolii3.
Cele mai frecvente variante alelice sunt CYP2D6*4 (12–21% la caucazieni), CYP2D6*5 (~ 2–7% în
diferite populaţii), CYP2D6*10 (>50% la asiatici, 5-9% la africani), CYP2D6*17 (20–35% la africani şi
americani de origine africană).
Prima evidenţă clinică a asocierii statusului de „metabolizator lent” cu răspunsul suboptimal la
tratamentul cu tamoxifen a fost raportat de Goetz et al în 2005 în urma unui studiu efectuat pe 223
femei cu cancer mamar ER pozitiv în perioada postmenopauză, tratate cu tamoxifen. Deşi a fost
subestimată frecvenţa metabolizatorilor lenţi, prin includerea doar a alelelor CYP2D6*4 şi CYP2D6*6,
autorii au arătat că alela CYP2D6*4 a fost asociată cu un risc crescut de recădere şi cu o incidenţă
mai scăzută a bufeurilor la pacientele postmenopauză (o reacţie adversă frecvent întâlnită în cursul
tratamentului cu tamoxifen) datorită nivelurilor mai scăzute de metaboliţi activi.
Din 2005 până în prezent au fost publicate câteva studii privind impactul genotipului CYP2D6 asupra
evoluţiei pacientelor aflate sub tamoxifen care însă au raportat rezultate contradictorii. Pentru a explica
aceste discrepanţe au fost propuse mai multe explicaţii: numărului redus de persoane incluse în unele
studii, populaţii disparate de paciente, diferenţe în ceea ce priveşte doza şi durata tratamentului
cu tamoxifen, lipsa de informaţii despre medicaţia asociată, metode diferite pentru genotiparea
CYP2D6.
În ultimii 25 ani, tamoxifenul a fost considerat „gold-standard” pentru tratamentul hormonal al
cancerului mamar ER pozitiv. Totuşi, rezultatele unor studii clinice recente au demonstrat că, în unele
situaţii, inhibitorii de aromatază de generaţia a 3-a (anastrozol, letrozol, exemestan) sunt mai eficace
309
decât tamoxifenul în tratmentul pacientelor postmenopauză. Goetz et al au examinat un set de femei

postmenopauză tratate în cadrul studiului ABCSG-8 şi au evaluat efectul înlocuirii tamoxifenului
administrat timp de 2 ani cu anastrozol pe o perioadă de 3 ani. Printre pacientele tratate timp de cinci
ani numai cu tamoxifen, metabolizatorii lenţi au avut un risc de 3.8 ori mai mare de recurenţă a tumorii
în comparaţie cu metabolizatorii extensivi. La pacientele care au fost trecute pe anastrozol după 2
ani de tamoxifen nu s-a constatat un risc crescut de recădere în cazul fenotipului de „metabolizator
lent”, ceea ce sugerează că beneficiul comutării pe anastrozol ar fi mai pronunţat la persoanele cu
deficit enzimatic CYP2D6. Alegerea optimă pentru terapia endocrină adjuvantă s-ar putea baza astfel
pe genotipul CYP2D6. Presupunând că metabolismul inhibitorilor de aromatază este independent de
CYP2D6, studiile au arătat că la pacientele cu genotip sălbatic CYP2D6 rata de supravieţuire este
similară sau chiar superioară cu tamoxifen, în comparaţie cu inhibitorii de aromatază. S-ar putea institui
astfel o terapie personalizată bazată pe farmacogenetică în cazul pacientelor care sunt preocupate de
relativa toxicitate a anastrozolului sau pentru a reduce costurile asociate cu administrarea de inhibitor
de aromatază ca terapie iniţială.
Recent, analiza unor cohorte mari din SUA, Germania şi Marea Britanie a întărit ipoteza potrivit căreia
există o corelaţie între genotipul CYP2D6 şi evoluţia clinică sub tamoxifen. Dimpotrivă, analiza ITPC
(International Tamoxifen Pharmacogenetics Consortium) a demonstrat că nu există nici o asociere între
genotipul CYP2D6 şi rata de supravieţuire a pacientelor cu cancer mamar aflate sub tamoxifen. Deşi
ITPC a colectat cele mai multe de date privind genotipul CYP2D6 în terapia adjuvantă cu tamoxifen,
aceasta reprezintă doar o analiză preliminară în care un număr mare de persoane au fost excluse
din evaluarea primară ca urmare a unor probleme metodologice, a lipsei de informaţii privind dozele,
durata tratamentului cu tamoxifen precum şi a co-medicaţiei sau a urmăririi inadecvate a pacientelor.
Din acest motiv, sunt aşteptate cu interes rezultatele viitoare ale ITPC împreună cu cele ale trialurilor
randomizate tamoxifen versus inhibitori de aromatază, deoarece acestea vor putea stabili, cu precizie
mai mare, valoarea determinării genotipului CYP2D6 în tratmentul adjuvant personalizat4.
Recomandări pentru genotiparea CYP2D6 - stabilirea genotipului CYP2D6 înaintea începerii
tratamentului cu tamoxifen3.
hemolizate1.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) şi secvenţiere a genei CYP2D61.
Se va comunica genotipul CYP2D6 obţinut şi fenotipul de metabolizare asociat (conform tabelului de
mai sus)1.
Numeroase medicamente sau metaboliţi ai acestora sunt inhibitori ai activităţii catalitice CYP2D6:
• unele antidepresive triciclice sau SSRI (în special fluoxetin şi paroxetin);
• chinidină, amiodaronă;
310
18
• cimetidină;
• celecoxib;
• ritonavir.
Asocierea tamoxifenului cu medicamente inhibitorii CYP2D6 poate induce un fenotip de „metabolizator
lent” chiar dacă genotipul CYP2D6 sugerează o activitate enzimatică normală sau intermediară. Din
acest motiv este foarte important ca interpretarea rezultatelor să se efectueze în contextul medicaţiei
asociate. Deoarece antidepresivele sunt recomandate adesea pentru calmarea bufeurilor este
important să se administreze medicamente care nu compromit activitatea CYP2D6 şi nu reduc astfel
eficacitatea tamoxifenului3.
Înaintea de iniţierea unei terapii noi trebuie ţinut cont de faptul că există şi alţi factori care pot influenţa
metabolismul medicamentelor cum ar fi: dieta, absorbţia digestivă, medicaţia asociată şi, nu în ultimul
rând, complianţa inadecvată a pacientului2.
Bibliografie
2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Tamoxifen
P450 Genotyping. www.labcorp.com, 2010. Ref Type: Internet Communication.
3. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: . Cytochrome P450 2D6 Genotyping
for Tamoxifen Hormonal Therapy. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet
Communication.
4. Roberta Ferraldeschi, William G. Newman. The Impact of CYP2D6 Genotyping on Tamoxifen
Treatment. In Pharmaceuticals 2010, 3, 1122-1138.
18.2.5 Gena VKORC1 (analiză polimorfism genetic)

Gena VKORC1 localizată pe cromozomul 16 a fost recent identificată ca fiind un element cheie în ciclul
vitaminei K. Produsul său, subunitatea 1 a epoxid-reductazei vitaminei K, reprezintă ţinta moleculară
a tratamentului anticoagulant cu derivaţi cumarinici. VKORC1 intervine în regenerarea formei reduse
a vitaminei K, cofactor esenţial în procesul de γ-carboxilare a proteinelor dependente de vitamina K,
printre care se numără şi factorii de coagulare II, VII, IX şi X. Derivaţii cumarinici inhibă VKORC1 şi
reduc astfel producţia factorilor de coagulare dependenţi de vitamina K.
La nivelul promotorului genei VKORC1, în poziţia 1639 a fost descrisă o mutaţie punctiformă G > A
care este asociată cu o expresie scăzută a enzimei VKORC1 şi cu necesitatea unei doze terapautice
311
mai mici de warfarină. Astfel, autorii unui studiu au comunicat următoarele valori ale dozei terapeutice
medii zilnice la persoanele cu genotipuri VKORC1 GG, GA şi AA: 6.7 mg, 4.3 mg şi respectiv 2.7 mg.
Aceste diferenţe în doza medie zilnică în funcţie de genotipul VKORC1 sunt semnificative statistic.
Concluzia studiului a fost că genotiparea VKORC1 alături de cea CYP2C9 (gena care codifică
enzima implicată în metabolizarea S-warfarinei) poate contribui împreună cu caracteristicile fizice ale
pacienţilor la dozarea mai adecvată a warfarinei, cu un risc mai mic de reacţii adverse8.
Frecvenţa alelei A a polimorfismului G > A VKORC1 este de aproximativ 40% în populaţia
caucaziană1.
International Warfarin Pharmacogenetics Consortium (2009) a constatat că un algoritm de stabilire
a dozelor de warfarină bazat pe analiza polimorfismului genelor CYP2C9 şi VKORC1 identifică un
procent mai mare de pacienţi care necesită doze săptămânale ≤ 21 mg şi ≥ 49mg pentru obţinerea
valorilor INR ţintă (49.4% vs 33.3% dintre cei care necesită ≤ 21 mg/săptămână şi 24.8% vs 7.2%
dintre cei care necesită ≥ 49 mg/săptămână)4.
Un studiu recent care a inclus 1015 participanţi a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unui
algoritm farmacogenetic la iniţierea terapiei cu warfarină. Pentru a facilita utilizarea algoritmelor clinice
şi farmacogenetice autorii au dezvoltat un website non-profit www.warfarindosing.org; în formularul
de pe site se introduc datele pacientului (vârstă, sex, greutate, înalţime, rasă, fumat, afecţiuni
hepatice, afecţiunea care necesită anticoagulare, valorile INR bazal şi ţintă, tratamente cu statine şi
amiodaronă, tratamente antibiotice sau antifungice, genotipuri CY2C9 şi VKORC1 – în cazul în care
sunt disponibile) după care se estimează doza de încărcare şi doza terapeutică zilnică. Dacă după
3-4 administrări de warfarină se revine la website şi se introduce valoarea INR obţinută se va efectua
o ajustare a dozelor3.
În ceea ce priveşte tratamentul cu acenocoumarol, utilizat în România şi în alte ţări din Europa, a fost
raportată aceeaşi asociere a necesităţii unor doze scăzute de anticoagulant la persoanele purtătoare
ale alelelor A ale polimorfismului G > A VKORC17.
Într-un studiu efectuat în Franţa s-a constatat că testarea farmacogenetică poate să identifice un risc
crescut de supradozare la 25% dintre persoanele care vor începe terapia cu acenocoumarol (purtătorii
alelei VKORC1 1639A şi CYP2C9*3). Îmbunătăţirea management-ului tratamentul anticoagulant este
semnificativă clinic datorită utilizării pe scară largă a acestor medicamente6.
În concluzie, studiile efectuate indică validitatea clinică a testelor farmacogenetice (CYP2C9 şi
VKORC1) şi susţin corelaţia dintre anumite variante genetice şi dozele terapeutice de anticoagulante
cumarinice. Cu toate acestea nu există încă dovezi suficiente privind cost-eficienţa testării de rutină
înaintea iniţierii terapiei cu anticoagulante orale. Până când vor fi disponibile rezultatelor studiilor clinice
prospective (ex. COAG sau EU-PACT) testarea genetică este recomandată la pacienţii cu risc crescut
de sângerare şi pentru elucidarea cauzei unui răspuns terapeutic neobişnuit: necesitatea unor doze
de întreţinere foarte mici sau persistenţa unor valori INR mari la doze standard de anticoagulant2.
312
18
hemolizate5.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) urmată de genotipare prin analiza curbei de topire; va
fi cercetată mutaţia 1639 G > A5.
Comunicarea rezultatelor
Se va comunica genotipul VKORC1 obţinut5. Doza terapeutică medie zilnică de derivat cumarinic este
cu 20% mai mică la persoanele purtătoare ale unei singure copii ale alelei A., în comparaţie cu cei la
care nu este prezenta mutaţia G > A VKORC11.
Doza optimă de anticoagulant cumarinic nu se poate stabili numai pe baza testului farmacogenetic ci
prin coroborarea cu datele clinice ale pacientului.
Testarea genetică nu are scopul de a înlocui monitorizarea periodică a INR – ului5.
Bibliografie
1. ARUP Consult.The Physician”s Guide to Laboratory Test Selection and Interpreation. Warfarin
Sensitivity. www.aruplab.com. Ref Type: Internet Communication.
2. Flockart DA, et al. Pharmacogenetic testing of CYP2C9 and VKORC1 alleles for warfarin. In
Genet Med 2008, 10(2), 139-50.
3. Gage BF, et al. Use of pharmacogenetic and clinical factors to predict the therapeutic dose of
warfarin. In Clin Pharmacol Ther 2008, Sep;84(3):326-31.
4. International Warfarin Pharmacogenetics Consortium (2009). Estimation of the warfarin dose
with clinical and pharmacogenetic data. New Eng. J. Med. 360: 753-764, 2009.
6. Laurent Bodin et al. Cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) and vitamin K epoxide reductase
(VKORC1) genotypes as determinants of acenocoumarol sensitivity. In Blood, 2005.
7. Ramon Montes et al. The c.−1639G > A polymorphism of the VKORC1 gene is a major
determinant of the response to acenocoumarol in anticoagulated patients. In British Journal of
Haematology, Volume 133, Number 2, April 2006 , pp. 183-187(5).
8. Yusheng Yu et al. Estimation of Warfarin Maintenance Dose Based on VKORC1 (_1639 G_A)
and CYP2C9 Genotypes. In Clinical Chemistry 53:7, 1199–1205 (2007).
313
18.2.6 Variante enzimatice CYP2C9 (analiză polimorfism genetic)

CYP2C9 constituie una din izoenzimele principale ale citocromului P450 cu rol în metabolismul
medicamentelor. Astfel, CYP2C9 este responsabilă de metabolizarea a 5% din medicamentele
prescrise, cele mai importante fiind glipizida, fenitoina şi derivaţii cumarinici.
Gena care codifică enzima CYP2C9 este localizată, împreună cu alte gene CYP2C, pe braţul
scurt al cromozomului 10 (10q24). Analiza polimorfismului genetic CYP2C9 poate fi utilizată pentru
identificarea variantelor enzimatice cu activitate alterată care afectează metabolismul medicamentelor
şi care se asociază în cursul tratamentului cu un risc crescut de reacţii adverse.
Genotiparea CYP2C9 este legată în principal de administrarea anticoagulantelor orale (derivaţi
cumarinici) care sunt utilizate în mod frecvent în profilaxia şi terapia afecţiunilor tromboembolice. Chiar
în prezenţa unei monitorizări corecte a tratamentului se înregistrează variaţii individuale foarte mari ale
răspunsului la primele doze administrate, iar încercarea de a menţine nivelurile în intervalul terapeutic
îngust este adesea dificilă şi poate fi însoţită de reacţii adverse majore8;11. Astfel, se consideră că
incidenţa anuală a hemoragiilor majore (hemoragii pentru care s-a putut documenta o pierdere de cel
puţin două unităţi de sânge sau care au dus la spitalizare) este de 6.8% la pacienţii anticoagulaţi a la
long iar rata letalităţii anuale ca efect secundar al acestui tratament de 0.88%.
Urmărirea tratamentului în “clinici de anticoagulare” specializate ar reduce aceste accidente la 2.7%
pe an şi respectiv la 0.4% pe an1.
Anumite alele ale genelor CYP2C9 şi VKORC1 (subunitatea C1 a epoxid-reductazei vitaminei K –ţinta
tratamentului anticoagulant) explică 30-50% din variaţiile interindividuale ale sensibilităţii la warfarină;
din acest motiv testarea polimorfismului acestor gene ar putea contribui la o conducere mai adecvată
a tratamentului cu anticoagulante orale.
Warfarina este administrată sub forma unui amestec racemic de enantiomeri R şi S. S-warfarina este
răspunzătoare de ~80% din activitatea anticoagulantă a acestui preparat şi este metabolizată hepatic
printr-un proces de hidroxilare în care este implicată enzima CYP2C9. În plus faţă de alela sălbatică
CYP2C9*1 care codifică o variantă enzimatică cu activitate normală au fost descrise 2 alele care au
la bază mutaţii punctiforme ale genei CYP2C9: CYP2C9*2, responsabilă de substituţia argininei cu
cisteina la nivelul aminoacidului 144, şi CYP2C9*3, cea are drept consecinţă substituţia izoleucinei
cu leucina în poziţia 359. Ambele alele sunt asociate cu perturbarea moderată (CYP2C9*2 reduce
cu 30% metabolismul warfarinei) sau severă (CYP2C9*3 reduce cu 80% metabolismul warfarinei) a
hidroxilării S-warfarinei, iar pacienţii purtători ai acestor variante enzimatice, care metabolizează lent
warfarina, au risc crescut de complicaţii hemoragice majore la iniţierea terapiei anticoagulante2;11.
Cele 3 alele se pot combina în 6 genotipuri: *1*1, *1*2, *1*3, *2*2, *2*3 şi *3*3 cu următoarea prevalenţă
în populaţia caucaziană:
- genotip *1*1: 65.3%
- genotip *1*2: 20.4%
- genotip *1*3: 10.6%
- genotip *2*2: 0.9%
314
18
- genotip *2*3: 1.4%

- genotip *3*3: 0.4%1.
În populaţia africană frecvenţa alelelor *2 şi *3 este mult mai redusă decât în populaţia caucaziană şi
asiatică11.
Într-o metaanaliză care a inclus 9 studii (2775 pacienţi) Sanderson şi colaboratorii săi au concluzionat
că pacienţii purtători ai alelelor CYP2C9*2 şi CYP2C9*3 necesită doze terapeutice medii zilnice mai
scăzute comparativ cu cei care prezintă alela sălbatică CYP2C9*1 şi au un risc crescut de sângerări.
Astfel, în cazul alelei CYP2C9*2 doza terapeutică medie zilnică a fost cu 17% mai mică iar pentru alela
CYP2C9*3 s-a constatat că este necesară o reducere a dozei cu 37%. Riscul de sângerări majore
este de 5.3 ori mai mare decât normalul în perioada de inducţie a tratmentului şi de 2.2 mai mare
după stabilizare13.
International Warfarin Pharmacogenetics Consortium (2009) a constatat că un algoritm de stabilire
a dozelor de warfarină bazat pe analiza polimorfismului genelor CYP2C9 şi VKORC1 identifică un
procent mai mare de pacienţi care necesită doze săptămânale ≤ 21 mg şi ≥ 49 mg pentru obţinerea
valorilor INR ţintă (49.4% vs 33.3% dintre cei care necesită ≤ 21 mg/săptămână şi 24.8% vs 7.2%
dintre cei care necesită ≥ 49 mg/săptămână)6.
Un studiu recent care a inclus 1015 participanţi a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unui
algoritm farmacogenetic la iniţierea terapiei cu warfarină. Pentru a facilita utilizarea algoritmelor clinice
şi farmacogenetice autorii au dezvoltat un website non-profit www.warfarindosing.org; în formularul
de pe site se introduc datele pacientului (vârstă, sex, greutate, înalţime, rasă, fumat, afecţiuni
hepatice, afecţiunea care necesită anticoagulare, valorile INR bazal şi ţintă, tratamente cu statine şi
amiodaronă, tratamente antibiotice sau antifungice, genotipuri CY2C9 şi VKORC1 – în cazul în care
sunt disponibile) după care se estimează doza de încărcare şi doza terapeutică zilnică. Dacă după
3-4 administrări de warfarină se revine la website şi se introduce valoarea INR obţinută se va efectua
o ajustare a dozelor5.
În ceea ce priveşte tratamentul cu acenocoumarol, utilizat în România şi în alte ţări din Europa, mai
multe studii au arătat în prezenţa alelelor CYP2C9*2 sau CYP2C9*3 există un risc mai mare de
sângerări şi sunt necesare doze mai mici de anticoagulant pentru atingerea valorii INR ţintă10;12. Un
singur studiu raportează dozele de întreţinere pentru acenocumarol în funcţie de genotip; astfel pentru
obţinerea unui INR terapeutic de 2.5 doza zilnică de întreţinere pentru acenocoumarol este de 2.44
mg pentru genotipul *1*1, 2.06 mg pentru genotipul *1*2 şi 1.57 mg pentru genotipul *1*33. Pe baza
acestor valori stabilite experimental, un grup de cercetători români a implementat un simulator care
a permis studierea efectului unor scheme uzuale de anticoagulare asupra evoluţiei INR în funcţie de
genotipul CYP2C9 şi greutatea corporală1.
Într-un studiu efectuat în Franţa s-a constatat că testarea farmacogenetică poate să identifice un risc
crescut de supradozare la 25% dintre persoanele care vor începe terapia cu acenocoumarol (purtătorii
alelelor VKORC1 1639A sau 1173T şi CYP2C9*3). Îmbunătăţirea management-ului tratamentului
anticoagulant este semnificativă clinic datorită utilizării pe scară largă a acestor medicamente9.
În concluzie, studiile efectuate indică validitatea clinică a testelor farmacogenetice (CYP2C9 şi
VKORC1) şi susţin corelaţia dintre anumite variante genetice şi dozele terapeutice de anticoagulante
cumarinice. Cu toate acestea nu există încă dovezi suficiente privind cost-eficienţa testării de rutină
315
înaintea iniţierii terapiei cu anticoagulante orale. Până când vor fi disponibile rezultatelor studiilor clinice
prospective (ex. COAG sau EU-PACT) testarea genetică este recomandată la pacienţii cu risc crescut
de sângerare şi pentru elucidarea cauzei unui răspuns terapeutic neobişnuit: necesitatea unor doze
de întreţinere foarte mici sau persistenţa unor valori INR mari la doze standard de anticoagulant2;4.
hemolizate7.
specifice pe stripuri; vor fi cercetate cele 2 mutaţii CYP2C9 corespunzătoare alelelor CYP2C9*2 şi
CYP2C9*32.
Se va comunica genotipul CYP2C9 obţinut7.
Doza optimă de anticoagulant cumarinic nu se poate stabili numai pe baza testului farmacogenetic ci
prin coroborarea cu datele clinice ale pacientului.
Testarea genetică nu are scopul de a înlocui monitorizarea periodică a INR – ului7.
Bibliografie
1. A.D Corlan, I. Corlan, C. Constantinescu. Consecinţe cantitative ale modelului farmacologic

al acţiunii anticoagulantelor orale explorate prin simulare computerizată. În Terapeutică,
Farmacologie şi Toxicologie Clinică, vol. 7, nr. 3, pp. 39–53, 2003.
2. Charles Eby. Warfarin Dosing. Should Labs Offer Pharmacogenetic Testing? In Clinical
Laboratory News, June 2009, Vol 35, Number 6.
3. Dolors Tassies et al. Pharmacogenetics of acenocoumarol: cytochrome p450-cyp2c9
polymorphisms influence dose requirements and stability of anticoagulation. In Haematologica,
87:1185–1191, 2002.
4. Flockart DA, et al. Pharmacogenetic testing of CYP2C9 and VKORC1 alleles for warfarin. In
Genet Med 2008, 10(2), 139-50.
5. Gage BF, et al. Use of pharmacogenetic and clinical factors to predict the therapeutic dose of
warfarin. In Clin Pharmacol Ther 2008, Sep;84(3):326-31.
6. International Warfarin Pharmacogenetics Consortium (2009). Estimation of the warfarin dose
with clinical and pharmacogenetic data. New Eng. J. Med. 360: 753-764, 2009.
8. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Cytochrome
P450 2C9 Genotyping. www.labcorp.com, 2010. Ref Type: Internet Communication.
316
18
9. Laurent Bodin et al. Cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) and vitamin K epoxide reductase
(VKORC1) genotypes as determinants of acenocoumarol sensitivity. In Blood, 2005.
10. Mark L. et al. Cytochrome P450 2C9 polymorphism and acenocoumarol therapy. In Kardiol. Pol
2006 Apr;64(4):397-402.
11. OMIM. CYTOCHROME P450, SUBFAMILY IIC, POLYPEPTIDE 9; CYP2C9. www.ncbi.nih.gov.
Ref Type: Internet Communication.
12. RB Saraeva et al. Pharmacogenetics of acenocoumarol: CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2,
CYP3A4, CYP3A5 and ABCB1 gene polymorphisms and dose requirements. In Journal of
Clinical Pharmacy and Therapeutics, 2008, 33(1).
13. Sanderson S, Emery J, Higgins J. CYP2C9 gene variants, drug dose, and bleeding risk in
warfarin-treated patients: a HuGEnet systematic review and meta-analysis. In Genet Med, 2005.
Feb;7(2):97-104.
18.2.7 Polimorfismul genei KIF6 (tratamentul cu statine)
Boala coronariană ischemică şi complicaţiile acesteia constituie una dintre cele mai importante
probleme de sănătate. În ultimile două decenii numeroase studii au încercat să stabilească o asociere
între anumite variaţii ale secvenţelor ADN (polimorfisme genetice) şi riscul de boală coronariană.
Printre aceste variaţii se numără şi polimorfismul nucleotidic unic al unei gene care codifică o proteină
din familia kinezinelor („kinesin family member 6”, KIF-6), care are drept rezultat înlocuirea triptofanului
cu arginina în poziţia 719 a secvenţei de aminoacizi (Trp719Arg).
Gena KIF6, localizată pe cromozomul 6p21.2, codifică o kinezină, membră a familiei de proteine
motorii implicate în transportul „cargo-ului” (încărcăturii) celular - organite, complexe proteice, ARNm
- de-a lungul microtubulilor. Kinezinele sunt constituite dintr-un domeniu motor, conservat, cu rol în
transport, ATP-dependent şi un domeniu neconservat care se leagă de „cargo”, având o structură
“coil-coiled” ce facilitează interacţiunile proteice (vezi figura 18.2.7). Conform datelor actuale, gena
KIF6 nu este exprimată la nivel vascular, ci la un nivel redus în ţesutul conjunctiv, colon, ochi, faringe,
creier, tegument, testicul, organe şi ţesuturi care nu sunt implicate în ateroscleroză. Polimorfismul
Trp719Arg este localizat la nivelul primului nucleotid al codonului 719 şi este definit prin schimbul non-
conservativ de aminoacizi, care înlocuieşte un rest nepolar cu un rest bazic, afectând situsul de legare
al „cargo” -ului. Este cunoscut faptul că multe kinezine sunt implicate în patogeneza unor afecţiuni
cronice ca diabetul zaharat de tip 2 şi boala Alzheimer.
317
Încărcătură
“Cargo”
Coadă
KIF6 Trp719Arg 2 porĠiuni

“îngustate”
Peduncul
Domenii motorii
Microtubul
Fig. 18.2.7 Structura proteinei KIF6 (Adaptare după Asbury et al. Science 302: 2130, 2003)
Această variantă a genei KIF6 este prezentă la ~60% din populaţia caucaziană; 7 studii prospective
(3 studii de cohortă şi 4 trialuri randomizate, de tip „dublu-orb” cu două tipuri de statine) care au
inclus peste 50 000 persoane au demonstrat o asociere strânsă între varianta genetică Trp719Arg
KIF-6 şi creşterea cu 55% a riscului de boală coronariană, în mod independent de alţi factori de risc
cardiovascular; pe de altă parte, acestea au arătat că terapia intensivă cu statine reduce semnificativ
numărul de evenimente coronariene la purtătorii acestei variante dar nu şi la non-purtători1;2.
Un exemplu de astfel de studiu este WHS (Women Health Study) la care au participat 25 283 femei
caucaziene cu vârstă ≥ 45 ani, iniţial sănătoase ce au fost testate în vederea depistării polimorfismului
rs20455 (Trp719Arg) şi monitorizate timp de 12 ani pentru evenimente cardiovasculare. În această
perioadă, un număr de 953 femei au dezvoltat pentru prima dată un eveniment coronarian (infarct
miocardic, revascularizare coronariană, deces de cauză cardiovasculară) sau accident vascular
cerebral. Studiul a arătat că purtătoarele alelei Arg719 a genei KIF6 prezintă un risc cu 34% mai mare
de infarct miocardic şi cu 24% de boală coronariană ischemică în general, comparativ cu femeile care
nu prezintă această alelă. Riscul asociat cu prezenţa alelei Arg719 a fost estimat după ajustarea în
funcţie de vârstă şi de existenţa factorilor de risc tradiţionali. Nu a fost demonstrată asocierea variantei
genetice KIF6 cu riscul crescut de accident vascular cerebral6.
Asocierea dintre polimorfismul KIF6 şi tratamentul cu statine reprezintă o deschidere importantă către
medicina personalizată. Astfel, această constatare poate fi utilă în efortul de a personaliza tratamentul
şi de a motiva complianţa pacienţilor purtători ai alelei Arg719KIF6.
Atât studiul CARE (Cholesterol and Recurrent Events) cât şi WOSCOPS (West of Scotland Coronary
Prevention Study) au indicat un beneficiu semnificativ al tratamentului cu pravastatin la purtătorii alelei
Arg719KIF6, înregistrându-se o reducere a riscului absolut de 4.89% în studiul CARE şi de 5.49%
în studiul WOSCOPS. La persoanele care nu prezintă această variantă genetică nu s-a constatat
318
18
un beneficiu semnificativ statistic al tratamentului cu pravastatin, în sensul reducerii numărului de

evenimente coronariene. În plus, au fost analizate 26 polimorfisme genetice ce flanchează regiunea
KIF6, fără a se constata în cele două studii o asociere cu afecţiunile coronariene3.
Studiul PROSPER (Prospective Study of Pravastatin in Elderly at Risk) – un studiu randomizat, de tip
„dublu-orb”, cu control placebo – a inclus bărbaţi şi femei >70 ani cu boală coronariană preexistentă
sau cu factori de risc majori şi a avut drept scop să testeze ipoteza potrivit căreia tratamentul cu
pravastatin ar putea reduce numărul evenimentelor cardiovasculare majore la această categorie de
persoane. Statusul de purtător al alelei Arg719KIF6 a fost analizat la 5752 pacienţi care au participat
la studiul PROSPER; a fost constatată o diferenţă semnificativă în ceea ce priveşte numărul de
evenimente cardiovasculare între purtătorii variantei genetice Trp719Arg şi non-purtători, deşi a existat
o reducere similară a nivelului de LDL-colesterol în cele două grupuri; terapia cu pravastatin a redus
semnificativ evenimentele cardiovasculare în rândul purtătorilor cu boală vasculară preexistentă, fără
a se constata un beneficiu terapeutic la non-purtătorii cu boală vasculară preexistentă sau la cei fără
boală (purtători sau non-purtători)4.
În cadrul studiului PROVE IT-TIMI 22 (Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infarction Therapy:
Thrombolysis in Myocardial Infarction 22) au fost genotipaţi KIF6 1778 pacienţi cu sindrom coronarian
acut şi a fost investigat efectul tratamentului cu statine în doze diferite la purtătorii Arg719 comparativ
cu non-purtătorii. S-a constatat că purtătorii Arg719KIF6 au beneficiat mai mult de tratamentul intensiv
cu atorvastatin comparat cu tratamentul moderat cu pravastatin decât persoanele fără acest marker
genetic (reducerea riscului absolut cu 10% vs 0.8%). Pacienţii testaţi au prezentat reduceri similare
de LDL-colesterol, trigliceride şi proteină C-reactivă sub tratament, ceea ce indică faptul că beneficiul
se datorează unui mecanism independent5.
Aceste studii trezesc interesul asupra polimorfismului genei KIF6 ca posibil marker genetic al
susceptibilităţii pentru infarctul miocardic, ateroscleroza coronariană precum şi pentru răspunsul clinic
la statine. Cu toate acestea, sunt încă puţine date legate de gena KIF6 şi de proteina codificată de
aceasta care să susţină plauzabilitatea biologică a asocierii cu riscul de boală coronariană.
Determinarea statusului de purtător al variantei Trp719Arg poate ajuta medicul clinician în evaluarea
mai precisă a riscului de afecţiuni cardiovasculare şi în personalizarea tratamentului cu statine. Sunt
necesare în continuarea mai multe dovezi pentru validarea clinică a testului1.
hemolizate2.
Metodă – reacţie de polimerizare în lanţ (PCR)2.
Sunt posibile următoarele genotipuri KIF6: Trp/Trp, Trp/Arg, Arg/Arg2.
Atât în cazul purtătorilor cât şi cel al non-purtătorilor alelelor Arg719 KIF6 estimarea riscului
cardiovascular trebuie să ţină cont şi de factorii de risc clasici (fumat, obezitate, diabet, hipertensiune
arterială)2.
319
Bibliografie
1. Ali J. Surprises of the genome and „personalised” medicine. In Journal of the American College
of Cardiology, 2008, 4:456-8.
3. O. A. Iakoubova et. al. Association of the Trp719Arg Polymorphism in kinesin-like protein 6
with myocardial infarction and coronary heart disease in 2 prospective trials. In Journal of the
American College of Cardiology, 2008, 4:436-442.
4. O. A. Iakoubova et. al. KIF6 Trp719Arg polymorphism and the effect of statin therapy in
elderly patients: results from the PROSPER study. Iakoubova, Olga A. In European Journal of
Cardiovascular Prevention & Rehabilitation: August 2010 - Volume 17 - Issue 4 - pp 455-461.
5. O. A. Iakoubova et. al. Polymorphism in KIF6 gene and benefit from statins after acute coronary
syndromes. In Journal of the American College of Cardiology, 2008, 4:449-455.
6. Shiffmann D, et al. A Kinesin Family Member 6 Variant is associated with coronary heart disease
in the Women’s Health study. In Journal of the American College of Cardiology, 2008, 4:444-
448.
320
18
18.3 TESTE MOLECULARE PENTRU DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR
18.3.1 Borrelia burgdorferi - ADN
Boala Lyme este o afecţiune multisistemică apărută după muşcătura de căpuşă infectată cu Borrelia
burgdorferi. Studiul diferenţelor antigenice dintre tulpinile izolate în America şi Europa a permis
recunoaşterea implicării în patologia umană a trei genospecii care alcătuiesc complexul Borrelia
burgdorferi sensu lato: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ce cuprinde toate tulpinile izolate în America
de Nord), B. garinii şi B. afzelii. În Europa circulă toate cele trei genospecii, dar predomină B. garinii
şi B. afzelii1;2;3;6;7
Tehnicile moleculare reprezintă o alternativă în diagnosticul bolii Lyme şi se bazează pe amplificarea
unei regiuni specifice a genomului bacterian. Acestea au aplicabilitate pentru toate produsele
patologice recoltate în diferite stadii ale infecţiei, dar se recomandă a fi utilizate doar la pacienţii care
au un rezultat pozitiv sau echivoc la testele serologice6.
Recomandări pentru determinarea Borrelia - ADN - diagnosticul bolii Lyme; astfel1:
Stadiul I – biopsie cutanată din eritemul migrator;
Stadiul II – biopsie cutanată din eritemul migrator diseminat sau LCR în caz de neuroborelioză;
Stadiul III – biopsie cutanată în acromodermatita cronică atrofică, lichid sinovial în artrita Lyme sau
LCR în neuroborelioză.
Tehnica PCR are o sensibilitate mai mare decât cultura în cazul prelevatelor bioptice, a sângelui şi a
lichidului articular, spre deosebire de LCR şi urină unde rezultatele nu au fost satisfăcătoare 1;7.
Studii efectuate prin analiza PCR a lichidului articular provenit de la pacienţi cu artrită Lyme au
demonstrat o sensibilitate şi specificitate excelentă (Nocton, 1994; Dumler, 2001). Spre deosebire
de acestea, studiile efectuate pe LCR provenit de la pacienţi cu neuroborelioză acută sau cronică au
demonstrat o îmbunătăţire minimă a sensibilităţii, în comparaţie cu cultura.
În tabelul de mai jos este prezentată sensibilitatea metodei PCR - ADN Borrelia, în funcţie de produsul
patologic examinat şi de stadiul infecţiei6:
PRODUS PATOLOGIC SENSIBILITATE %

Biopsie cutanată (EM si ACA) 50-70
LCR Stadiul I 60
Stadiul II 30
Biopsie articulară 50-70
Sânge < 10
Există laboratoare (inclusiv Synevo) care folosesc această tehnică pentru a extrage materialul genetic
al Borreliei direct din capuşa care a determinat muşcătura, precizând dacă aceasta a fost infectată
sau nu4.
Pregătire pacient - nu este necesară4.
321
Specimen recoltat - a) biopsie cutanată; b) lichid cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară; c) lichid
sinovial; d) sânge venos; e) urină; f) căpuşă extrasă de la locul înţepăturii4.
Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant pentru proba de sânge venos
şi recipient steril pentru celelalte produse biologice4.
Cantitate recoltată - a) fragment de piele; b) 2 mL; c) 2 mL; d) 3 mL; e) 10 mL4.
Prelucrare necesară după recoltare - probele nu vor fi centrifugate4.
Cauze de respingere a probei - cantitate insuficientă; probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea
heparinei ca anticoagulant4.
Stabilitate probă - probele de sânge, produs din leziune, LCR, urină, lichid articular sunt stabile 48
ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor nucleici4.
Metodă - Real-time PCR Light-Cycler: reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a
produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (test calitativ)4.
Borrelia - ADN: nedetectabil4.
Limita de detecţie - 276 copii/ mL4.
Un rezultat pozitiv indică prezenţa de ADN Borrelia în proba recoltată6.
Un rezultat negativ nu exclude infecţia cu Borrelia, în timp ce un rezultat pozitiv în afara contextului
clinic, nu confirmă diagnosticul 3;6;7.
Testul PCR trebuie folosit ca o metodă care îmbogăţeşte paleta de investigaţii în boala Lyme şi nu
poate înlocui celelalte metode. Rezultatele obţinute vor fi corelate obligatoriu cu serologia, datele
clinice şi epidemiologice ale pacienţilor6.
Bibliografie
1. Bettina Wilske, Barbara J. B. Johnson, and Martin E. Schriefer. Borrelia In:Patrick R. Murray et
al. In Manual of Clinical Microbiology” 9th ed. , 2007 , 62: 971- 986.
2. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. The Spirochetes. In Diagnostic
Microbiology, Twelfth Edition, 2007, 48: 533–541.
3. Koneman’s, Spirochetal infections. In Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Sixth
Edition, 2006, 20: 1125-1150.
5. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Lyme Disease (Borrelia burgdorferi),
Molecular Detection, PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet
Communication.
6. Volker von Baehr, Christa Liebenthal, Brita Gaida, Frank- Peter Schmidt, Rudiger von Baehr,
Hans-Dieter Volk. Evaluation of the diagnostic significance of the lymphocyte proliferation test in
patients with Lyme borreliosis. In J Lab Med, 2007; 31(3).
7. P. Rocco La Sala, Michael B. Smith. Spirochete Infections. In Henry’s Clinical Diagnosis and
Management by Laboratory Methods, Twenty-First Edition, 2007, 58, 1059- 1074.
322
18
18.3.2 Chlamydia (Chlamydophila) pneumoniae - ADN
Chlamydia este un parazit procariot obligatoriu intracelular, de dimensiuni mici (0.2-1µm), ce prezintă
atât caracteristici de bacterie (sintetizează ARN şi ADN, au perete şi membrană celulară asemănătoare
bacteriilor Gram negative, este sensibil la antibiotice de tipul ciclinelor), cât şi de virus (se multiplică
doar în celulele vii eucariote, nu–şi poate sintetiza ATP-ul, acesta fiind furnizat de celulele gazdă).
Diferă însă de toate microorganismele prin ciclul particular de creştere, caracterizat prin 2 forme
distincte:
• corpusculul elementar (CE), adaptat existenţei extracelulare;
• corpusculul reticulat (CR), adaptat mediului intracelular (intracitoplasmatic).
Corpusculii elementari sunt foarte infecţioşi şi o dată pătrunşi în organism, se ataşează de membrana
celulară, fiind endocitaţi. Intracelular endosomul nu fuzioneză cu lizozomii, aşa cum se întâmplă
în mod obişnuit cu orice material internalizat, Chlamydia rămânând în vezicula fagocitată pe toată
perioada ciclului de viaţă. La scurt timp de la pătrunderea în celulă, CE se transformă în CR, care
au dimensiuni mai mari, nu pot infecta alte celule şi se divid binar în interiorul vacuolelor (“incluziile
chlamydiene intracitoplasmatice”). După aproximativ 36 ore CR se reorganizează în CE, astfel încât
după 48-72 ore întreaga citoplasmă a celulei poate fi înlocuită de incluzii care conţin sute/mii de CE.
Cu toate că citoplasma celulei este ocupată aproape în întregime de CE, funcţia celulară este afectată
minim. Eliberarea corpusculilor elementari se poate produce prin exocitoza incluziilor sau prin liza
celulelor gazdă. CE sunt în măsură de a infecta noi celule, fie în cadrul aceluiaşi organism, fie într-o
gazdă nouă. Astfel ciclul de viaţă al C. pneumoniae este împărţit între corpusculii elementari, care sunt
capabili să infecteze gazde noi, dar nu se pot reproduce şi corpusculii reticulaţi care se reproduce, dar
nu sunt în măsură să provoace o infecţie nouă.
Clasificări recente împart Chlamydiile în 4 familii, dintre care cea mai importantă în patologia umană
este fam. Chlamydiaceae, care conţine două genuri:
• genul Chlamydia – cel mai important reprezentant fiind C. trachomatis;
• genul Chlamydophila – C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus etc.
Pneumonia şi bronşita sunt cele mai frecvente boli asociate cu C.pneumoniae. Într-o serie de studii
clinice 10% din cazurile de pneumonie şi aproximativ 5% din cele de bronşită şi sinuzită la adulţi au
fost atribuite microorganismului.
Simptomele infecţiei cu C. pneumoniae sunt imposibil de distins de alte cauze de pneumonie şi
acestea includ congestie nazală, tuse, febră, precum şi dispnee. Cele mai multe cazuri de pneumonie
sunt relativ uşoare şi nu necesită spitalizare. Cu toate acestea, chiar şi în cazurile uşoare, recuperarea
completă este lentă, în ciuda antibioticoterapiei adecvate, iar tusea şi starea de rău pot persista timp
de mai multe săptămâni după debutul bolii.
Mai multe boli cronice au fost, de asemenea asociate cu infecţia cu C. pneumoniae. Pacienţii
care au avut în antecedente infecţii respiratorii cu C. pneumoniae au probabilitate mai mare de a
dezvolta bronşite astmatiforme, sugerându-se că aceste microorganisme pot fi un factor important în
dezvoltarea astmului bronşic sau exacerbărilor astmului bronşic1;3.
Tehnicile de cultură pentru izolarea microorganismului sunt laborioase şi consumatoare de timp;
323
testele moleculare constituie o modalitate de depistare rapidă a ADN-ului pentru C. pneumoniae în

diverse secreţii respiratorii, facilitând astfel instituirea precoce a antibioticoterapiei adecvate3. Într-un
studiu recent efectuat la copii cu infecţii respiratorii sensibilitatea şi specificitatea testului PCR faţă de
diagnosticul infecţiei acute au fost de 63.6% şi, respectiv, 100%4.
Recomandări pentru determinarea Chlamydia – ADN - detectarea infecţiilor pulmonare3.
Specimen recoltat – a) exsudat faringian sau nazofaringian; b) lichid obţinut prin spălătură bronşică
sau lavaj bronho-alveolar, aspirat traheal sau bronşic, spută2.
Recipient de recoltare - a) tampon uscat (fără mediu de transport); b) recipient steril2.
Cantitate recoltată – b) minimum 2 mL2.
Prelucrare necesară după recoltare – nu este necesară2.
Cauze de respingere a probei - cantitate insuficientă pentru analiză; contaminarea specimenului;
specimene prea vechi2.
Stabilitate probă - probele sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor nucleici2.
Valori de referinţă - Chlamydia - ADN nedetectabil2.
Limita de detecţie - 200 copii/mL2.
Detecţia Chlamydia - ADN în secreţii respiratorii sugerează un diagnostic clinic de infecţie cu
Chlamydia pneumoniae3.
Cu toate că, PCR-ul este o metodă ce oferă un diagnostic rapid şi fiabil, rezultate fals negative pot să
apară în probele care conţin foarte puţine microorganisme3.
Bibliografie
1. Cho-Chou Kuo, Lisa A. Jackson, Lee Ann Campbell, J. Thomas Graystone, Chlamydia
pneumoniae (TWAR) Clinical Microbiology Reviews, Vol. 8, No. 4, 451–461, 1995.
3. Margaret R. Hammerschlag, Stephan A. kohlhoff, Petra M. Apfalter. Chlamydophila (Chlamydia)
pneumoniae In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases,
7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2467 -2474.
4. Shinobu Otomo et al. Analysis of children with Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae and
Mycoplasma pneumoniae respiratoryinfections by real-time PCR assay and serological tests.
In Acta Pathologica, Microbiologica, Immunologica Scandinavica (APMIS), vol. 116, 477-483,
2008.
324
18
18.3.3 Chlamydia trachomatis - ADN
Chlamydia trachomatis este principalul agent patogen al bolilor cu transmitere sexuală. Grupa de
vârstă cea mai afectată este 15-25 ani, prevalenţa infecţiei fiind între 2 şi 25%3.
Perioada de incubaţie a bolii variază în general între 1 şi 3 săptămâni, ajungând în unele cazuri la 6
săptămâni. O mare parte a infecţiilor evoluează asimptomatic: 75% din infecţiile la femei şi 50% din
infecţiile la bărbaţi. În cazurile simptomatice la bărbat pot apărea uretrită şi proctită în faza acută; în
lipsa tratamentului se poate instala cronicizarea cu epididimită, prostatită şi artrită reactivă. Simptomele
clinice la femeie constau în uretrită, cervicită şi bartolinită care se pot complica cu: endometrită,
salpingită, pelviperitonită precum şi artrită reactivă3;4.
Caracterul asimptomatic al multor infecţii cu Chlamydia trachomatis este responsabil de
subdiagnosticarea acestora, cu importante consecinţe mai ales la femei datorită corelaţiei dovedite
între infecţia netratată şi complicaţii cum ar fi sarcina ectopică şi infertilitatea.
Fiind o boală cu transmitere sexuală evaluarea partenerilor este obligatorie pentru a preveni
răspândirea infecţiei.
Diagnosticul infecţiilor cu Chlamydia trachomatis include izolarea agentului patogen în culturi celulare,
depistarea antigenului prin metode imunologice şi determinarea ADN-ului prin tehnici moleculare.
Deoarece culturile celulare sunt laborioase şi necesită timp nu se folosesc de rutină fiind apanajul
unor laboratoare speciale3.
Studiile clinice au indicat că tehnicile de amplificare ADN detectează cu aproximativ 15% mai multe
înfecţii comparativ cu celelalte metode care nu se bazează pe culturi celulare, cu o specificitate >99%.
În plus, testul ADN poate utiliza probe care nu sunt compatibile cu metodele bazate pe culturi cum ar
fi cele de urină la bărbaţi2.
Testul disponibil în laboratorul nostru utilizează tehnica de amplificare izotermică SDA (“strand
displacement amplification”) pentru detectarea ADN-ului ţintă a C. trachomatis în probe endocervicale,
uretrale şi de urină (bărbaţi). Menţionăm că din aceleaşi tip de probe se poate testa simultan cu
Chlamydia trachomatis-ADN şi Neisseria gonorrhoeae-ADN3.
Pe lângă ADN-ul cromozomial C. trachomatis conţine o plasmidă criptică care este comună tuturor
serovarurilor. În 2006 a fost descrisă pentru prima dată varianta suedeză de Chlamydia trachomatis
ce prezintă prezintă o deleţie de 377 bp în interiorul plasmidei ADN şi care nu este detectată de unele
teste comerciale. Deoarece secvenţa ţintă utilizată în testul nostru este localizată pe plasmida criptică
în afara acestei deleţii acesta poate detecta, pe lângă cele 15 serovaruri, şi varianta suedeză de
Chlamydia trachomatis3;4.
Recomandări pentru determinarea Chlamydia trachomatis ADN – diagnosticul infecţiilor acute
urogenitale, screening-ul infecţiei la persoanele cu risc crescut; screening-ul gravidelor în primul
trimestru de sarcină1.
Specimen recoltat - se vor recolta probe provenite din tractul urogenital: tampon endocervical,
tampon uretral şi urină primul jet (numai pentru bărbaţi); se vor utiliza tampoanele incluse în sistemele
de recoltare furnizate de laborator (vezi figura 18.3.3.1), separat pentru bărbaţi şi femei.
Recoltarea probei endocervicale
325
Înainte de recoltarea propriu-zisă se va îndepărta mucusul în exces de la nivelul orificiul colului cu

ajutorul tamponului de curăţare prevăzut cu burete; se va introduce tamponul de recoltare în canalul
cervical, se va roti 15-30 secunde după care se va retrage uşor, se va evita contactul cu mucoasa
vaginală şi se va introduce în tubul de transport; se va rupe tamponul în dreptul semnului astfel că
numai capătul tamponului va rămâne în tubul de transport ce va închis etanş cu capacul.
Recoltarea probei uretrale
Se inserează blând tamponul pe uretră cca 2-4 cm, se roteşte 3-5 secunde, se retrage uşor şi se
introduce în tubul de transport; se va rupe tamponul în dreptul semnului astfel că numai capătul
tamponului va rămâne în tubul de transport ce va fi închis etanş cu capacul.
Recoltarea probei de urină
Pacientul nu trebuie să urineze timp de 2 ore, apoi se recoltează cel puţin 5 mL din primul jet3.
Fig. 18.3.3.1 Sistem de recoltare a probelor cervicale
Stabilitate probă – 1 săptămână la 2-20ºC pentru probele genitale; 1 săptămână la 2-8ºC pentru
urină3.
Metodă - tehnica de amplificare izotermică SDA (“strand displacement amplification”) şi detecţie în
timp real a produşilor de amplificare prin fluorescenţă; sunt folosite următoarele tipuri de controale:
control de extracţie, control negativ şi control pozitiv (ce conţine aproximativ 2400 copii/mL de plasmidă
linearizată pCTB4)3.
Valori de referinţă - Chlamydia trachomatis (CT) ADN nedetectabil. Limita de detecţie a metodei de
lucru: 15 corpi elementari CT/mL urină sau 30 corpi elementari CT/mL specimen genital; corelarea
corpilor elementari cu unităţie de formare a incluziilor (IFU) sugerează o sensibilitate analitică de 1
IFU/mL3.
Un rezultat negativ nu exclude prezenţa unei infecţii deoarece rezultatul obţinut depinde de calitatea
probei recoltate.
Testul nu detectează variantele de C. trachomatis lipsite de plasmide însă acestea sunt rar întâlnite
în infecţiile genitale.
Testul nu se recomandă pentru aprecierea eficienţei tratamentului antibiotic datorită posibilităţii
persistenţei plasmidei ADN.
Testul nu va fi folosit în practica medico-legală (în cazurile de abuz sexual), cultura celulară fiind
singura metodă acceptată în aceste situaţii3;4.
326
18
Bibliografie
1. Centers for Disease Control and Prevention, “Sexually Transmitted Diseasgkes Treatment
Guidelines 2002,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR6):1-78.
2. Johnson RE, Newhall WJ, Papp JR, et al, “Screening Tests to Detect Chlamydia trachomatis
and Neisseria gonorrhoeae,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR15):1-38.
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Chlamydia/
Gonococcus, Nucleic Acid Amplification (NAA) www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet
Communication.
18.3.4 Citomegalovirus (CMV) - ADN
Virusul citomegalic uman (CMV), un beta-herpes virus, este cel mai mare virus implicat în infecţii la
om; genomul său poate codifica până la 230 proteine, multe dintre acestea având un rol semnificativ
în reglarea răspunsului imun2.
Infecţia cu CMV este extrem de răspândită, astfel că se înregistrează o prevalenţă a anticorpilor
specifici în populaţia adultă de până la 80-100%. Virusul poate fi transmis prin secreţii orale sau
respiratorii, lapte matern, transfuzii de sânge, contact sexual şi vertical (de la mamă la făt)1.
Tabloul clinic este foarte variabil: de la infecţii asimptomatice (foarte frecvente la persoanele
imunocompetente), la un sindrom asemănător mononucleozei infecţioase întâlnit la adultul tânăr, până
la boala CMV a nou-născutului, adesea fatală. La pacienţii care au primit transplant de organe solide
infecţia CMV este asociată cu o morbiditate şi mortalitate semnificativă; la cei care au primit transplant
de măduvă osoasă pneumonia CMV constituie cea mai gravă complicaţie infecţioasă post-transplant.
La pacienţii cu sindromul imunodeficienţei dobândite (SIDA), CMV constituie patogenul viral cel mai
frecvent, iar retinita CMV poate induce cecitate, chiar în condiţiile aplicării terapiei antiretrovirale înalt
active (HAART).
Ca şi în cazul celorlalte virusuri herpetice, CMV induce o infecţie latentă după perioada de infecţie
acută. Mecanismul exact care controlează procesul de latenţă nu este clar, însă virusul poate fi găzduit
într-o stare non-replicativă în celulele polimorfonucleare (PMN), limfocitele T, celulele endoteliului
vascular, celulele epiteliale renale precum şi în glandele salivare.
Infecţia primară cu CMV se produce la pacienţii seronegativi, în timp ce infecţia secundară apare ca
urmare a reactivării unei infecţii latente (în condiţii de imunosupresie indusă de boli sau iatrogen) sau
reprezintă o reinfecţie dezvoltată la persoanele seropozitive2;6.
Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR), care foloseşte pentru amplificare primeri corespunzători
secvenţelor care codifică antigenul CMV precoce sau ADN-polimeraza virală, s-a dovedit a fi o tehnică
327
foarte sensibilă pentru depistarea infecţiei CMV. PCR poate detecta cantităţi mici de CMV-ADN în
toate fluidele organismului.
Referitor la pacienţii cu SIDA, 3 studii mari au publicat date importante referitoare la folosirea PCR
pentru detectarea CMV-ADN în sânge la această categorie de pacienţi. Deşi au fost aplicate tehnici
PCR diferite, studiile au demonstrat o concordanţă remarcabilă în ceea ce priveşte concluzia, şi
anume că prezenţa CMV-ADN în sânge are o valoare predictivă de 60% privind dezvoltarea retinitei
CMV în următoarele luni. Tehnicile PCR cantitative au arătat de asemenea că o viremie CMV mare
se corelează cu o infecţie CMV activă la pacienţii cu SIDA. O dată cu dezvoltarea terapiei antivirale
eficiente, una din ţinte o reprezintă prevenţia bolii CMV, prin detectarea precoce a CMV-ADN în sânge
şi aplicarea tratamentului înaintea apariţiei manifestărilor de organ.
Testele PCR pentru CMV-ADN au revoluţionat şi management-ul bolii CMV la pacienţii cu transplant
de organe solide sau de măduvă osoasă. Conform unor studii recente s-a estimat că o valoare cut-
off pentru CMV-ADN de 40000 copii/mL este specifică pentru boala CMV la pacienţii cu transplant
renal. Sensibilitatea testului corespunzătoare acestui cut-off este însă redusă (maxim 40%); pentru a
fi crescută sensibilitatea la 80% valoarea cut-off care indică riscul de dezvoltare a bolii CMV trebuie
redusă la 1000 copii/mL. Datorită valorii predictive pozitive scăzute, se recomandă totuşi ca pragul de
1000 copii/mL să nu fie folosit decât pentru excluderea bolii CMV la această categorie de populaţie
şi nu pentru a indica un risc crescut de dezvoltare a bolii. La pacienţii cu transplant hepatic sau de
măduvă osoasă se consideră valoarea de 5000 copii/mL ca fiind un cut-off optim pentru a indica riscul
de dezvoltare a bolii CMV2.
Infecţia primară CMV dezvoltată la pacienţii seronegativi care au primit transplant renal de la donatori
seropozitivi prezintă un tablou clinic mai zgomotos în comparaţie cu infecţia secundară. La aceştia se
indică ca metodă de diagnostic a infecţiei determinarea CMV-ADN în urină2.
Infecţiile CMV ale sistemului nervos central se produc cel mai adesea la pacienţii imunodeprimaţi.
Astfel, modificări histologice caracteristice infecţiei CMV au fost identificate în urma examenului
necroptic al ţesutului cerebral la 20-40% dintre pacienţii cu SIDA. La această categorie de pacienţi
manifestarea SNC indusă cel mai frecvent de CMV este poliradiculopatia. Alte manifestări care pot
să apară la gazdele imunodeprimate sunt: encefalita, ventriculita, mielita, polineuropatia inflamatorie.
Infecţii SNC cu CMV (meningoencefalită) au fost raportate uneori şi la pacienţi imunocompetenţi,
în asociere cu sindromul mononucleozic. Manifestările SNC induse de infecţia CMV congenitală
sunt deosebit de grave: microcefalie, tulburări motorii, corioretinită. Pentru infecţiile CMV ale SNC,
detectarea CMV-ADN în lichidul cefalo-rahidian prin PCR reprezintă cea mai sensibilă metodă de
diagnostic2;4;6.
Gravidele prezintă o susceptibilitate crescută faţă de infecţia citomegalică (de 6 ori mai mare,
comparativ cu restul populaţiei adulte). Infecţia se transmite pe cale sexuală, prin transfuzii de
sânge sau se poate produce prin reactivarea unei infecţii latente. Cel mai adesea pacientele sunt
asimptomatice sau prezintă un tablou mononucleozic discret asociat cu o virurie CMV timp de 4-7
zile. În infecţia primară a gravidei (circa 10-60% sunt receptive la vârstă adultă), riscul infecţiei fetale
este maxim (până la 50%)2;3. Transmiterea verticală a infecţiei în cursul primelor 4 luni de sarcină
are consecinţele cele mai grave (hepatită, surditate, microcefalie). În cazurile de reactivare a unei
infecţii latente (0.7-0.9% din gravide) riscul de infecţie fetală este foarte redus sau chiar absent (copiii
328
18
respectivi rămân neafectaţi sau fac infecţii subclinice). Deşi testele PCR care detectează CMV-ADN în
sânge şi-au dovedit utilitatea în diagnosticul bolii CMV la imunodeprimaţi, valoarea lor este limitată în
cazul gravidelor imunocompetente deoarece nu pot oferi informaţii despre riscul transmiterii verticale
a infecţiei. Pentru diagnosticul infecţiei fetale detectarea CMV-ADN în lichidul amniotic reprezintă un
instrument valoros (sensibilitate 80-100%) după săptămâna 21 de sarcină. Cu toate că testul PCR are
o specificitate apropiată de 100%, sensibilitatea este redusă (45%) înainte de săptămâna 211.
Diagnosticul infecţiei neonatale este stabilit cel mai bine prin detectarea CMV-ADN în urină în prima
săptămână de viaţă (sensibilitatea şi specificitatea testului se apropie de 100%)1;2;6.
Recomandări pentru determinarea CMV - ADN
1. CMV – ADN în sânge: monitorizarea pacienţilor imunodeprimaţi în vederea depistării
precoce a cazurilor care prezintă risc crescut de a dezvolta boală CMV; monitorizarea
răspunsului la tratamentul antiviral specific la pacienţii diagnosticaţi cu boală CMV2;
2. CMV – ADN în urină: detectarea infecţiei congenitale în prima săptămână de viaţă;
detectarea infecţiei CMV la pacienţii seronegativi care au primit un transplant renal de la
donatori seropozitivi1;2;6.
3. CMV – ADN în LCR: diagnosticul infecţiilor SNC asociate cu CMV (sensibilitate apropiată
de 100% la pacienţii imunodeprimaţi; sensibilitatea este de 60% în cazul infecţiilor
congenitale)4.
4. CMV – ADN în lichid amniotic: diagnosticul infecţiei fetale cu CMV1.
Specimen recoltat - a) sânge venos; b) o probă de urină spontană; c) lichid cefalorahidian recoltat
prin puncţie lombară; d) lichid amniotic5.
Recipient de recoltare - a) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant; b) eprubetă pentru urină;
c) şi d) recipient steril5.
Cantitate recoltată - a) cât permite vacuumul; b), c) şi d) minimum 2 mL5.
Cauze de respingere a probei - a) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant5.
Stabilitate probă - probele de sânge, urină, LCR sau lichid amniotic sunt stabile 48 ore la 2-4°C
înainte de extracţia acizilor nucleici5.
Metodă - Real-time PCR: reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului PCR
acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (test cantitativ)5.
Valori de referinţă - CMV - ADN nedetectabil5.
Detecţia CMV-ADN în LCR susţine diagnosticul de infecţie SNC cauzată de virus. Obţinerea unui
rezultat pozitiv pentru CMV-ADN în lichidul amniotic confirmă infecţia fetală.
Detecţia CMV-ADN în urina unui nou-născut indică prezenţa infecţiei congenitale.
Nivelul viremiei CMV are valoare prognostică la pacienţii imunodeprimaţi2;6.
Un rezultat negativ pentru CMV-ADN în LCR sau lichidul amniotic nu exclude infecţia CMV6.
329
Bibliografie
1. Ann M. Gronowski. Prenatal Screening and Diagnosis of Congenital Infecţions. In Handbook of

Clinical Laboratory Testing During Pregnancy, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2004, 254-
255.
2. Clyde S. Crumpacker, Jie Lin Zhang. Cytomegalovirus. In Mandell, Douglas, and Bennett’s
Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010,
1971-1985.
3. Gaytant MA et al. Congenital Cytomegalovirus Infection: Review of the Epidemiology and
Outcome. In Obstet. Gynecol Surv, 2002; 57(4): 245-256.
4. Guy Boivin. Diagnosis of Herpesvirus Infections of the Central Nervous System. In HERPES 11,
Supplement, 2004.
6. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Cytomegalovirus (CMV), Molecular
Detection, PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
18.3.5 Enterovirusuri - ARN
Clasificarea convenţională a enterovirusurilor cuprinde virusurile polio, Coxsackie şi ECHO
(enteric cytopathogenic human orphan). Între aceste subgenuri nu există diferenţe semnificative, toate
determinând în mod obişnuit infecţii subclinice (inaparente) ale tractului digestiv, dar şi un spectru larg
de alte sindroame2. Ca urmare a strategiilor eficiente de vaccinare, virusurile polio sălbatice 1-3 circulă
numai într-un număr restrâns de ţări în curs de dezvoltare3.
La rândul lor, virusurile non-polio includ:
- virusuri Coxsackie A, 23 serotipuri: 1-22 şi 24;
- virusuri Coxsackie B, 6 serotipuri: 1-6;
- Echovirusuri, 29 serotipuri: 1-9,11-27, 29-31;
- Enterovirusuri “noi”: toate enterovirusurile descoperite din 1970 au fost incluse în genul
enterovirus serotipurile 68-71 (virusul hepatitei A denumit iniţial enterovirus 72 a fost reclasificat ca
hepadnavirus)1;3.
Infecţiile SNC induse de enterovirusuri includ:
● Meningita aseptică: enterovirusurile constituie cea mai frecventă cauză de meningită aseptică
(80-92%); serotipurile implicate sunt variabile iar manifestările clinice depind de statusul imun al
gazdei; tabloul clinic include invariabil cefalee şi fotofobie; iritaţia meningee durează > 6 săptămâni
la 50% dintre pacienţi dar anomaliile neurologice sunt rare şi evoluţia bolii este bună la pacienţii
imunocompetenţi;
330
18
● Encefalita enterovirală: este mai puţin frecventă dar mai gravă decât meningita aseptică; este
caracterizată prin afectare focală similară encefalitei herpetice; adulţii imunodeprimaţi şi copiii cu
agammaglobulinemie sunt susceptibili să dezvolte meningită cronică sau meningoencefalită;
● Sindromul paralitic: este asociat clasic cu virusurile polio; un sindrom similar poate fi indus de
enterovirusurile 70/71 şi de virusul Coxsackie A7.
Nou-născuţii infectaţi cu enterovirusuri prezintă o morbiditate şi o mortalitate mare. În bolile febrile
afectarea meningiană se produce în 70% din cazuri1.
Diferenţierea enterovirusurilor de alţi agenţi patogeni care determină infecţii SNC este importantă
pentru management-ul corect al pacienţilor.
Clasic, diagnosticul se stabileşte prin izolarea virusului în culturi de celule, care durează în medie 6
zile. La ora actuală se consideră că detectarea ARN-ului viral reprezintă cea mai sensibilă şi rapidă
metodă de diagnostic a infecţiilor SNC cauzate de enterovirusuri5.
În scop epidemiologic ARN-ul viral mai poate fi depistat în probe provenite din tractul respirator
superior precum şi din materii fecale4.
Recomandări pentru determinarea Enterovirusuri - ARN - diagnosticul rapid al infecţiilor SNC
cauzate de enterovirusuri5.
Specimen recoltat - a) lichid cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară; b) exsudat faringian sau
nazofaringian; c) materii fecale sau tampon rectal4.
Recipient de recoltare - a) recipient steril; b) tampon uscat; c) coprorecoltor fără mediu de transport
sau tampon simplu4.
Cantitate recoltată - a) minimum 2 mL; c) 5 g4.
produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (test calitativ); testul poate detecta
toate tipurile de enterovirusuri4.
Valori de referinţă - Enterovirusuri - ARN nedetectabil4.
Limita de detecţie - 10 copii/probă4.
Detecţia Enterovirusuri-ARN în diverse produse patologice susţine diagnosticul clinic de infecţie
cauzată de un tip de enterovirusuri5.
Un rezultat negativ nu exclude posibilitatea unei infecţii SNC cu enterovirusuri5.
Bibliografie
1. ARUP Laboratories. Test Directory: Coxsackie B Virus Antibodies; Echovirus Antibodies. www.
aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
2. Costin Cernescu. Picornaviridae. În Virusologie medicală, Editura medicală ,Bucureşti, 2003, 136.
3. John F. Modlin. Introduction to the Enteroviruses and Parechoviruses. In Mandelll, Douglas and
331
Bennett’s Principles and Practice of INFECTIOUS DISEASES, Seventh Edition, 2009, 2337-
2342.
5. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Enterovirus, Molecular Detection, PCR,
Spinal Fluid. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
18.3.6 ADN viral hepatita B (cantitativ)

Deşi sunt disponibile vaccinuri eficiente, infecţia cu virusul hepatitei B continuă să rămână o problemă
gravă de sănătate publică. Peste 2 miliarde de persoane din întreaga lume prezintă dovada serologică
a infecţiei HBV (în antecedente sau curentă), dintre care 350-400 milioane sunt în stadiul de infecţie
cronică. Hepatita cronică cu virus B reprezintă a 10-a cauza de mortalitate, iar aproximativ 320.000
persoane mor anual datorită carcinomului hepatic asociat cu infecţia HBV.
Au fost raportate 8 genotipuri HBV (notate cu majuscule de la A la H), având distribuţii geografice
diferite8.
Markerii serologici sunt folosiţi adesea ca indicatori de diagnostic şi/sau prognostic ai infecţiei HBV
acute sau cronice. Dintre aceştia, AgHBe reprezintă un marker de infecţiozitate şi un indicator al
replicării virale active, asociat cu boală hepatică progresivă2. Totuşi, existenţa unor tulpini virale care
fie produc AgHBe dar acesta nu este detectabil în ser, fie şi-au pierdut capacitatea de a produce
AgHBe chiar în prezenţa unei infecţii active, limitează utilitatea clinică a acestui marker5.
Cea mai eficientă şi directă metodă, cu valoare prognostică în evoluţia infecţiilor acute sau cronice,
este detectarea cantitativă a ADN-ului HBV din plasmă, prin tehnologia PCR. În plus, această metodă
permite depistarea ADN-HBV în cazurile de hepatită cronică B cu markeri serologici negativi.
Determinarea viremiei este utilă de asemenea pentru monitorizarea eficienţei terapiei antivirale.
Studiile au demonstrat că o scădere rapidă şi susţinută a nivelului ADN-HBV la pacienţii aflaţi sub
tratament cu α-interferon, lamivudină, adefovir sau dipivoxil reprezintă un factor predictiv pentru un
răspuns terapeutic favorabil. Pe de altă parte, monitorizarea viremiei poate avea valoare predictivă în
ceea ce priveşte dezvoltarea rezistenţei la lamivudină7.
Cantitate recoltată - cât permite vacuumul7
Prelucrare necesară după recoltare - se separă plasma în maxim 1 zi de la recoltare prin centrifugare
la 800-1600 x g timp de 20 de minute la temperatura camerei, apoi se transferă intr-o eprubetă de
polipropilen (sunt necesari min. 2mL de plasmă) 7.
Stabilitate probă - plasma separată poate fi păstrată timp de 72 de ore la temperatura camerei, 7
332
18
zile la 2-8°C sau cel puţin 6 săptămâni congelată la -80°C. Probele pot fi congelate/decongelate de
maximum cinci ori fără pierderea ADN-ului VHB7.
Metodă - Real-time PCR (TaqMan): reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului
PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise.
Menţiune: procesarea probelor se face automat7.
Factor de conversie: HBV-DNA (UI/mL) x5.82 = HBV-DNA (copii/mL).
Valori de referinţă - ADN-HBV nedetectabil; limita de detecţie a metodei în domeniul de linearitate
este de 55 UI/mL; sensibiliatatea analitica: 12 UI/mL. Un rezultat «nedetectabil» semnifică faptul că
este vorba fie de o viremie foarte scăzută (sub limita de cuantificare), fie de o viremie absentă7.
•Nivelul viremiei poate fi corelat cu markerii serologici, biochimici şi cu rezultatele biopsiei hepatice,
pentru a indica faza infecţiei cronice HBV1:
Nivelul ADN-HBV Nivelul Examen
Faza infecţiei Status AgHBe
(copii/mL) ALT histologic
Normal sau
Faza de toleranţă imună AgHBe (+) Crescut (>105) Normal
inflamaţie minimă
Faza de activitate imună AgHBe(+)
Crescut (>105) Crescut Inflamaţie cronică
(hepatită cronică) sau antiHBe (+)
Faza non-replicativă AgHBe (-)
Normal sau
(purtător inactiv de Anti-Hbe (+) Scăzut (<105) Normal
inflamaţie minimă
AgHBs)
Observaţie: Deoarece în urma unor studii prospective s-a constatat prezenţa afectării hepatice la un
grup de pacienţi cu viremie scăzută (<105 copii/mL, încadraţi în stadiul de purtător inactiv) s-a propus
ca la pacienţii cu hepatita cronică HBV AgHBe (-) cut-off-ul ADN-HBV pentru inflamaţia hepatică să
se reducă de la 105 copii/mL la 3x104 copii/mL. Acest nou cut-off are o sensibilitate de 93%, iar toate
persoanele cu infecţie VHB inactivă au nivelul ADN-HBV sub 3x104 copii/mL4.
•Nivelurile înalte de ADN-HBV se asociază cu un risc crescut de carcinom hepatocelular6.
•Una din ţintele tratamentului antiviral este obţinerea răspunsului virusologic definit prin scăderea
ADN-HBV sub 105 copii/mL3.
Limite şi interferenţe: Acest tip de test a fost validat doar pentru plasma recoltată pe EDTA. Analiza
altor tipuri de probe poate duce la rezultate fals pozitive sau fals negative. Heparina inhibă metoda
PCR7.
Bibliografie
1 BJ McMahon. Phases of Chronic Hepatitis B. In Semin Liv Dis 2004; 24: 17-21.
2. C. Niederau et al. Long-term follow-up of HBeAg positive patients treated with interferon alfa for
chronic hepatitis. în New England Journal of Medicine 1996; 334: 1422-1427.
3. EASL International Consensus Conference on Hepatitis B. în J Hepatol 2003; 38: 533-540.
4. E.K. Manesis et al. HBV-DNA în HbeAg-negative CHB. în Am J Gastroenterol 2003;
98 :2261- 2267.
333
5. J.L. Brown et al. The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B genome. în
Hepatology, 1992; 15:144-148.
6. K.Ohata et al. Hepatocellular carcinoma în HBV-infection. în J Gastroenterol Hepatol 2004; 19:
670-675.
7. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2006. Ref TypeCatalog.
8. World Health Organization. Hepatitis B. WHO Fact Sheet 204 (revised October 2000).
18.3.7 Virusul hepatitei B (HBV) - genotipare
Informaţii generale şi recomandări ale genotipării HBV

Virusul hepatitei B, un virus ADN, este membru al familiei Hepadnaviridae care se replică prin revers-
transcrierea ARN-ului pregenomic încapsidat cu ajutorul polimerazei virale. Polimeraza nu prezintă
capacitate de “corectare a erorilor de citire” apărute la transcriere astfel că heterogenitatea secvenţelor
este o caracteristică a HBV.
Analiza secvenţelor ADN a genomului viral a condus la identificarea a 4 gene diferite, denumite C, S, P
şi X care codifică AgHBc/HBe, AgHBs, polimeraza şi respectiv proteinele HBx. Expresia acestor gene
este reglată de către 4 promotori (S1p, S2p, Cp şi Xp) şi 2 intensificatori (enhancer I, II)4.
Analiza filogenetică a condus la clasificarea HBV în 8 genotipuri care diferă unul de celălalt în proporţie
de >8% la nivelul secvenţelor nucleotidice ale întregului genom şi în proporţie de >4% la nivelul genei
S. De la prima descriere ale celor 4 genotipuri (A-D) în 1988, au mai fost identificate încă 4 (E-H). În
plus, în cadrul genotipurilor A, B, C şi F au fost descrise subgenotipuri care diferă între ele în proporţie
de >4%.
Cele 8 genotipuri prezintă o distribuţie geografică distinctă. Genotipul A este prevalent în nord-vestul
Europei, America de Nord şi Africa, genotipurile B şi C predomină în Asia, genotipul D are o distribuţie
ubicuitară, dar predomină în zona mediteraneeană. Genotipul E este întâlnit în Africa, genotipul F la
populaţiile aborigene din America de Sud, iar genotipul H este limitat la populaţiile amerindiene din
America Centrală. Distribuţia genotipului G sa este mai puţin clară1;4.
Prima evidenţă a faptului că proprietăţile biologice ale HBV diferă în funcţie de genotip a fost observaţia
că mutaţia ce introduce un codon stop prematur în poziţia 1896 a regiunii pre-core este întâlnită
frecvent în regiunile în care predomină genotipul D şi este absentă în regiunile cu genotipul A. Ulterior,
s-a constatat că heterogenitatea în distribuţia globală a genotipurilor HBV este responsabilă nu numai
de diferenţele în prevalenţa mutaţiilor HBV în diferite populaţii, ci şi de diferenţele în evoluţia clinică a
infecţiei HBV şi în răspunsul la tratamentul antiviral.
Legătura dintre mutaţiile HBV şi genotipuri
Regiunea precore-core a genomului HBV codifică proteina de fuziune precore-core care este modificată
post-translaţional pentru a da naştere AgHBe. Funcţia exactă a AgHBe nu este bine cunoscută; se
crede că deţine un rol în imunomodulare şi poate altera răspunsul gazdei la proteina core. Astfel,
334
18
dezvoltarea mutaţiei Stop Codon 1896 G>A care împiedică exprimarea AgHBe ar reprezenta un
mecanism de evaziune imună. Apariţia mutaţiei 1896 este restricţionată de către structura secundară
a proteinei є asociată cu semnalul de încapsidare şi codificată de aceeaşi regiune a genomului HBV
ca şi AgHBe. Destabilizarea acestei structuri prin dislocarea perechii de baze C-G între codonii 1858 şi
1896 (care ar rezulta ca urmare a mutaţiei G>A în poziţia 1896) ar fi în detrimentul replicării. Din acest
motiv dezvoltarea mutaţiei 1896 depinde de prezenţa sau absenţa unei baze C sau T în poziţia 1858
şi prezintă o variaţie geografică ce poate fi corelată cu distribuţia genotipurilor (vezi figura 18.3.7.1).
Genotipurile B, D şi E prezintă T1858, în timp ce genotipurile A şi H au C1858.
Genotipurile C şi F pot avea fie T1858, fie C1858 : tulpinile având genotipul F din America Centrală ca
şi tulpinile având genotipul C din Japonia se caracterizează exclusiv prin T1858 , în timp ce C1858 este
limitat la purtătorii genotipului C din sud-estul Asiei. În concluzie, mutaţia 1896 este întâlnită mai
frecvent la pacienţii anti-HBe pozitivi infectaţi cu genotipul D şi E, rareori în asociere cu genotipul A şi
doar la o minoritate din pacienţii purtători ai genotipurilor C şi F.
Fig. 18.3.7.1 Structura particulară a secvenţei de încapsidare a regiunii HBV pre-core

(Adaptare după Henry Lik-Yuen Chan et al. Phylogenetic, Virological, and Clinical Characteristics
of Genotype C Hepatitis B Virus with TCC at Codon 15 of the Precore Region. In Journal of Clinical
Microbiology, March 2006, p. 681-687, Vol. 44, No. 3)
Mutaţiile apărute în regiunea promotorului core (BCP = Basic Core-Promoter), transversia A>T
în poziţia 1762, împreună cu tranziţia G>A în poziţia 1764 (T1762A1764) au fost descrise iniţial la pacienţi
japonezi. Prezenţa acestora precede seroconversia AgHBe în cazul genotipului A, dar nu şi în cazul
genotipului D; de asemenea sunt asociate cu niveluri scăzute de ARNm precore şi de expresie a
AgHBe. S-a constatat o asociere semnificativă statistic a acestor mutaţii cu afectare hepatică mai
severă şi vârsta >35 ani.
Au fost descrise diferite mutaţii în regiunea pre-S, de la mutaţii punctiforme, deleţii şi inserţii mici
până la deleţii foarte mari. În două studii independente s-a constatat că variantele cu deleţii pre-S sunt
335
asociate mai frecvent cu genotipul B decât cu C. Dimpotrivă, un alt studiu, deşi a arătat că mutaţiile
pre-S apar mai frecvent la purtătorii de genotip B şi C în comparaţie cu restul genotipurilor, nu a indicat
o diferenţă semnificativă statistic între genotipurile B şi C. Aceste variante sunt detectate cu frecvenţă
mai mare la pacienţii cu afecţiuni hepatice severe (ciroză sau carcinom hepatocelular), deoarece pot
afecta clearance-ul viral şi contribui la cronicitatea infecţiei.
Sunt descrise şi variante HBV care rezultă din încapsidarea şi revers-transcrierea ARN-ului pregenomic
care a suferit splicing-ul - “splice variants”. Studiile au arătat că nu există nici o diferenţă între
variantele dominante de splicing produse de genotipurile D, C şi E, în timp ce variantele minore
de splicing sintetizate de izolatele care aparţin diverselor genotipuri sunt diferite. Splicing-ul poate
contribui la patogenicitatea şi/sau persistenţa virusului.
Legătura dintre progresia bolii şi genotipuri
Deoarece progresia bolii este influenţată de mai mulţi factori, cum ar fi vârsta la care fost contractată
infecţia, calea de transmitere, competenţa imună a gazdei şi factorii de mediu (consumul de alcool,
supraîncărcarea cu fier şi expunerea la aflatoxină), interpretarea rolului exercitat de genotipuri trebuie
să se facă cu multă atenţie.
Majoritatea studiilor asupra efectului genotipurilor HBV asupra progresiei bolii au fost efectuate în
sud-estul Asiei unde HBV este hiperendemic şi predomină genotipurile B şi C.
Pacienţii infectaţi cu genotipul B au o şansă mai mare de a prezenta remisiune biochimică susţinută
după seroconversia AgHBe spontană decât cei infectaţi cu genotipul C. Genotipul C este mai prevalent
la pacienţii cu fibroză sau ciroză şi este asociat cu o afectare histologică a ficatului mai severă în
comparaţie cu genotipurile B sau D. Pacienţii infectaţi cu genotipul C au scoruri mai mari de activitate
necroinflamatorie şi fibroză, precum şi niveluri mai mari ale transaminazelor serice faţă de cei infectaţi
cu genotipurile B, A sau D.
În ceea ce priveşte carcinomul hepatocelular este nevoie de studii longitudinale care să stabilească în
ce măsură genotipurile influenţează incidenţa bolii pe termen lung.
În Occident studiile privind impactul genotipurilor HBV asupra progresiei bolii sunt mai puţin
numeroase. În Europa s-a constatat că evoluţia pe termen lung a infecţiei HBV este diferită în funcţie
de genotipuri. Genotipul A a fost mai prevalent la pacienţii cu hepatită cronică AgHBe pozitivă, în timp
ce genotipul D a predominat la cei anti-HBe pozitivi. Pacienţii având genotipul D, fie că au fost AgHBe
pozitivi sau negativi, au prezentat valori mai mari ale încărcăturii virale, în comparaţie cu genotipurile
A, B şi C. Prognosticul hepatitei cronice B ar fi mai bun la pacienţii infectaţi cu genotipul A faţă de
cei cu genotipul D sau F, deoarece prezintă o rată mai mare de remisiune biochimică susţinută şi de
reducere a viremiei. Genotipul D a fost asociat cu o afecţiune recurentă severă post-transplant1.
România se situează în rândul ţărilor cu o prevalenţă înaltă a purtătorilor de AgHBs (16%). Într-un
studiu publicat recent care a inclus 130 pacienţi, cu un spectru variat al infecţiei HBV, s-a constatat că
genotipul D a avut prevalenţa cea mai mare (66%) şi a fost asociat cu infecţie activă şi evoluţie spre
carcinom hepatocelular. Genotipul A a fost corelat cu statusul de purtător inactiv al AgHBs, în timp
ce infecţia cronică îndelungată a fost asociată în majoritatea cazurilor cu un amestec al genotipurilor
A şi D2.
Legătura dintre răspunsul la tratamentul antiviral şi genotipuri
Într-un studiu efectuat pe pacienţi germani s-a constatat că cei infectaţi cu genotipul A au o rată de
336
18
seroconversie AgHBe mai mare sub tratmentul cu interferon decât cei cu genotipul D. Într-un studiu
desfăşuart în Taiwan rata dispariţiei AgHBe sub interferon a fost semnificativ mai mare la pacienţii cu
genotip B comparativ cu genotipul C.
În ceea ce priveşte răspunsul la lamivudină, genotipul B este asociat cu un răspuns virusologic mai
bun în comparaţie cu genotipul C la pacienţii din Taiwan. Cu toate acestea, ambele genotipuri prezintă
un risc similar de dezvoltare a rezistenţei la lamivudină după un an de terapie. Mutaţiile asociate cu
rezistenţă la lamivudină se dezvoltă mai lent în cazul genotipului D.
Într-un studiu mare efectuat în Japonia rata de apariţie a rezistenţei la lamivudină a fost independentă
de genotipurile A, B şi C. Pe de altă parte, rata a fost semnificativ mai mare la cei cu subgenotipul Ba
decât la cei cu subgenotipul Bj. Acest studiu a sugerat de asemenea că impactul pozitivităţii AgHBe
asupra rezistenţei la lamivudină diferă în funcţie de genotipuri şi că riscul dezvoltării unei hepatite
severe este mai mare la pacienţii infectaţi cu genotipul C1.
În concluzie, datele actuale indică din ce în ce mai evident faptul că genotipul HBV are avea un
rol predictiv asupra răspunsului la diferitele terapii antivirale şi că ar trebui luat în considerare ca o
variabilă înaintea iniţierii tratamentului1;2.
Pregătire pacient - nu este necesară o pregatire specială3.
hemolizate3.
Stabilitate probă – sângele EDTA este stabil 48h la 2-8ºC3.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ urmată de revers-hibridizare cu sonde oligonucleotidice
specifice pe stripuri3.
Efectuarea genotipării HBV nu este recomandată pentru screening-ul sau confirmarea infecţiei HbV.
Testul este posibil numai în cazul existenţei unei viremii B > 1000 UI/mL3.
Bibliografie
1. A. Kramvis, M.C.Kew. Relationship of Genotypes of Hepatitis B Virus to Mutations, Disease

Progression and Response to Antiviral Therapy. In J Viral Hepat. 2005; 12(5): 456-464.
2. Constantinescu I, Nedelcu F, Toader MA. Clical and Therapeutical Importance of HBV
Genotyping in Romania. In J Med Life, 2008 Apr-June;1(2):165-73.
3. Margaret James Koziel, Chloe Lynne Thio. Hepatitis B Virus and Hepatitis D Virus. In Mandell,
Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill
Livingstone, Elsevier, 2010, 2059-2064.
337
18.3.8 Testarea rezistenţei virusului hepatitei B la antivirale
Informaţii generale şi recomandări pentru testarea rezistenţei virusului hepatitei B la

antivirale
Virusul hepatitei B (HBV) este prototipul familiei Hepadnaviridae; replicarea acestui virus ADN prezintă
o serie de particularităţi ce conduc la apariţia variantelor genomice virale, clasificate în 8 genotipuri
(A-H) şi multiple sub-genotipuri2;3;4.
ADN-ul viral se replică prin revers-transcripţia unui ARN intermediar; deoarece revers-transcriptaza
are o capacitate scăzută de verificare – autocorectare a acurateţei procesului de transcripţie, erorile în
replicarea ADN-ului apar mult mai frecvent decât în cazul altor virusuri ADN. Rata anuală de apariţie
a acestor erori este estimată la 1.4-3.2 x 105 substituţii nucleotidice per site, sugerând multitudinea
mutaţiilor ce pot apărea în cazul pacienţilor cu rate înalte de replicare virală. Astfel de pacienţi infectaţi
cronic prezintă o populaţie virală heterogenă care este compusă din proporţii variabile din cvasi-specii
de HBV, iar populaţia majoritară se selectează sub influenţa factorilor endogeni şi exogeni. Astfel de
factori endogeni pot fi: răspunsul imun al gazdei, capacitatea replicativă a variantei virale (capacitatea
sa de a produce variante infecţioase), volumul spaţiului de replicare (numărul de hepatocite ce pot
fi infectate de HBV). Factorii exogeni descrişi pot fi: tratamente antivirale (cu analogi nucleotidici şi
nucleozidici), terapii imunologice (imunoglobulină anti-hepatită B şi vaccinare)3.
Genotipurile HBV au răspândire geografică variată; semnificaţiile clinice sunt diferite de la un genotip
la altul, cu impact major asupra evoluţiei naturale a bolii şi a monitorizării eficienţei tratamentelor
antivirale2.
Genomul VHB
Molecula ADN a HBV are structură mixtă (parţial dublu catenar şi parţial circular), consecinţă a
inegalităţii lungimilor celor 2 catene: catena lungă (L, de sens negativ, 3’ – 5’) are cca 3200 nucleotide,
iar catena scurtă (S, de sens pozitiv, 5’ – 3’) are 1100-2600 nucleotide2. Ajuns în hepatocit, ADN-ul
viral este transportat în nucleul celulei, unde este transformat în ADNccc (engl. covalently closed,
circular, double-stranded DNA, cccDNA), care este un ADN dublu catenar, circular, relaxat (închis
prin legături covalente). Acest ADNccc este în esenţă un epizom care nu se replică, ci constituie
exclusiv matriţa transcripţiilor virale ulterioare5. Genomul viral codifică 4 cadre deschise citirii, ORF-uri
(engl. open reading frames) suprapuse (vezi fig 18.3.8.1), denumite în funcţie de proteinele pe care
le codifică:
C – proteina „core”, a nucleocapsidei (AgHBc);
S – proteina de suprafaţă, AgHBs;
P – ADN polimeraza virală, “pol”, cu funcţie şi de revers-transcriptază, denumită şi
polimeraza/revers-transcriptaza;
X – proteina HBx, cu funcţie neelucidată (posibil implicată in dezvoltarea carcinomului
hepato-celular, prin legarea de p53)2;3;5.
338
18
Fig 18.3.8.1. Structura genomică compactă a HBV. Această structură cu gene suprapuse permite
codificarea mai multor proteine. Gena S codifică proteina “majoră” de suprafaţă, AgHBs. Regiunile
Pre-S1 şi pre-S2 codifică, împreună cu S, două proteine mai mari:
pre-S1+pre-S2+S şi pre-S2+S. Cea mai mare genă - P - codifică ADN polimeraza.
Gena C codifică 2 proteine nucleocapsidice: o proteină solubilă, AgHBe (iniţiată din regiunea “pre-
core”, pre-C, a genei) şi o proteină „core” intracelulară, (iniţiată din regiunea “core”, C, a genei, aflată
după regiunea pre-C). Gena X codifică proteinele (Ag) HBx, care pot transactiva transcripţia genelor
celulare şI virale.
(Adaptare după Fauci AS, Kasper DL, Braunwald E et al., Harrison’s Principles of Internal Medicine,
17th Ed, http://accessmedicine.com)
Sunt definite diferite regiuni ale genomului în funcţie de ARN-urile virale transcrise. Astfel, regiunile
„core” şi „pre-core”, localizate în acelaşi ORF, codifică două ARN-uri, iar regiunea “core promoter”
reglează transcripţia acestor două ARN-uri (vezi fig. 18.3.8.2).
Fig. 18.3.8.2: Reprezentarea schematică a regiunilor ORF-ului C al genomului HBV. De la capătul 3’

spre 5’ sunt figurate regiunile „core”, „pre-core” şi „ core promoter” ale genei C.
(Adaptare după Watcharasak Chotiyaputta and Anna S. F. Lok, „Hepatitis B virus variants”, Nature
Reviews-Gastroenterology & Hepatology. August 2009; Volume 6:453-462).
Regiunea „core” - codifică ARN pregenomic (pgRNA), care serveşte atât ca matriţă pentru revers-
transcripţia ADN-ului viral cât şi ca ARN mesager pentru două proteine: polimeraza virală şi AgHBc
(vezi fig 18.3.8.3). Regiunea „pre-core” - codifică ARN mesager pre-core (precore mRNA), care
339
serveşte ca matriţă pentru o proteină de mari dimensiuni care, procesată ulterior, devine AgHBe (a
cărei funcţie nu este bine precizată, dar pare a fi implicată în procesele de toleranţă imunologică,
contribuind la persistenţa infecţiei cu HBV)3.
Fig. 18.3.8.3: Reprezentarea schematică a genomului HBV. ADN-ul genomic al virionului (în albastru):
cercul interior, complet (3’-5’) reprezintă catena lungă; linia întreruptă indică regiunea genomică
incomplet sintetizată. Săgeţile verzi reprezintă ORF-urile corespunzătoare proteinelor “core”, anvelopei
(AgHBs), polimerazei (“pol”) şi proteinelor HBx. Liniile roşii reprezintă ARN-urile VHB5.
Semnificaţiile mutaţiilor genomului HBV, variantelor HBV şi terapia antivirală

Dezvoltarea biologiei moleculare a condus la definirea mai multor tipuri de mutaţii ale genomului VHB,
în funcţie de localizarea lor, de mecanismul lor de apariţie şi de semnificaţia clinică.
Persistenţa nivelelor serice detectabile de HBV la pacienţi după seroconversia AgHBe a condus la
definirea mutantelor selectate natural; eşecul pe termen lung a profilaxiei cu vaccin anti-HBV şi / sau
cu imunoglobuline a rezultat în definirea condiţiilor de apariţie a fenomenului de evaziune imunologică
intermediată de AgHBe. Importanţa majoră o au acum cercetările privind mutaţiile induse de
tratamentele cu analogi nucleozidici şi nucleotidici pentru a defini cea mai bună opţiune de tratament
în cazul unui pacient infectat cronic cu HBV, care a primit sau nu anterior un astfel de tratament. În
acest ultim caz, s-au definit şi mutaţiile compensatorii, care nu par a influenţa direct răspunsul la
tratamentul antiviral.
Variantele HBV selectate natural – mutaţii la nivelul regiunilor “pre-core” şi „core promoter”
Mutaţiile localizate în regiunile „pre-core” şi „core promoter” sunt cele mai frecvente variante de HBV
cu apariţie şi selecţie naturală, ducând la blocarea, respectiv scăderea sintezei de AgHBe. Tradiţional,
AgHBe era considerat marker de replicare virală şi de infecţiozitate cu HBV, iar seroconversia AgHBe
era folosită ca indicator al încetării replicării virale şi al remisiei bolii hepatice. Totuşi, unii pacienţi
prezentau şi după seroconversia AgHBe semne de afectare hepatică (nivele persistent crescute
ale transaminazei ALT, continuarea procesului de inflamaţie şi necroză hepatică) şi nivele serice
detectabile de ADN HBV. Bazele moleculare ale acestei anomalii s-au dovedit a fi mutaţiile la nivelul
340
18
regiunilor “pre-core” şi „core promoter”.

Cea mai frecventă mutaţie „pre-core” este G1896A (mutaţie punctiformă în nucleotida 1896). Aceasta
converteşte triptofanul din poziţia 28 a regiunii „pre-core” într-un stop codon, blocând producţia de
AgHBe. Această mutaţie este întâlnită cel mai frecvent la VHB genotip D, mai rar la genotipurile B,
C, E. Studii longitudinale au arătat că mutaţia G1896A apare frecvent în perioada seroconversiei
AgHBe. Probabil, scăderea consecutivă a producţiei de AgHBe poate fi mecanismul prin care virusul
se sustrage recunoaşterii imune, ceea ce ar facilita chiar persistenţa sa. Astfel, AgHBe poate funcţiona
atât ca tolerogen, cât şi ca imunogen, depinzând de momentul infecţiei cu HBV. Aceste variante par a
fi asociate cu un risc scăzut de carcinom hepatocelular.
Cea mai frecventă variantă mutantă „core promoter” este de fapt o mutaţie duală: A1762T şi G1764A.
Au mai fost descrise şi alte mutaţii, dar de obicei acestea sunt în asociaţie cu A1762T + G1764A (în
poziţiile 1753-1757, 1766, 1768). Mutaţiile regiunii „core promoter” scad sinteza de ARN pre-core şi,
implicit, de AgHBe. Variantele de tip „core promoter” pot fi găsite la toate genotipurile HBV, cel mai
adesea la genotipul C. Aceste mutaţii tind să fie selectate într-un stadiu mai incipient al infecţiei cu
VHB şi să preceadă seroconversia AgHBe. S-au raportat asocieri ale mutaţiilor „core promoter” cu
hepatita fulminantă, cu boală cronică avansată sau cu activitate înaltă şi, uneori, cu riscul de carcinom
hepatocelular.
Studii clinice recente au arătat că supresia virală în urma tratamentului cu analogi nucleozidici şi
nucleotidici este similară la pacienţii AgHBe pozitivi şi la cei AgHBe negativi, ceea ce indică faptul
că mutaţiile pre-core şi core-promoter nu influenţează nici răspunsul şi nici rezistenţa la aceşti agenţi
antivirali3.
Mutantele HBV asociate cu rezistenţa la tratamentul antiviral cu analogi nucleozidici şi
nucleotidici – mutaţii la nivelul genei P
Aceste variante mutante rezistente la tratamentul antiviral cu analogi nucleozidici şi nucleotidici sunt
selectate în cursul tratamentului cu astfel de analogi, deoarece mutaţia însăşi le conferă avantaj de
supravieţuire faţă de variantele sălbatice. Analogii nucleozidici şi nucleotidici au ca mecanism principal
de acţiune blocarea revers-transcripţiei de la nivelul ARN pregenomic cu formarea de ADN HBV.
Analogi nucleozidici inhibitori ai revers-transcriptazei (NRTIs) pot fi L-nucleozide: Lamivudina
(3TC,LAM) – Zeffix, Epivir, Emtricitabine (FTC) – Emtriva, Telbivudine (LdT) – Tyzeka sau analogi de
dexiguanozină: Entecavir (ETV) – Baraclude. De menţionat că FTC nu este aprobat în Europa pentru
tratamentul infecţiei cronice cu HBV (doar combinaţia TDF + FTC într-o singură tabletă este aprobată
pentru tratamentul infecţiei HIV)
Analogi nucleotidici inhibitori ai revers-transcriptazei (NtRTIs) sunt analogi nucleotidici fosfaţi aciclici:
Adefovir (ADV) – Adefovir dipivoxil – Hepsera (analog nucleotidic difosfat) şi Tenofovir (TDF) –
Tenofovir disoproxil fumarate –Viread (analog nucleotidic monofosfat)4.
Mecanismul de acţiune este acelaşi atât pentru NRTIs, cât şi pentru NtRTIs, aceştia fiind preluaţi de
către rt–VHB şi încorporaţi în lanţul de ADN viral. Includerea acestor analogi nucleotidici/nucleozidici
sintetici poate avea loc în timpul etapei de revers-transcriere a primei catene de ADN viral (catena L-),
precum şi în timpul sintezei celei de-a doua catene (catena S+). Aceşti inhibitori competiţionează cu
dezoxiribonucleotidele naturale necesare sintezei ADN-lui viral şi, din cauza absenţei grupării 3’-OH
de la nivelul dezoxiribozei, nu permit următorului dezoxiribonucleotid inclus să formeze următoarea
341
legătură fosfat diesterică 5’–3’ necesară continuării elongaţiei lanţului de ADN viral. Prin urmare
sinteza ADN-lui viral este oprită, proces denumit “chain termination”.
În cazul NRTIs este necesară activarea lor intracelulară prin adiţia a trei grupări fosfat la nucleul
dezoxiribozei (5’), transformându-se în NRTIs trifosfaţi. Această etapă este realizată cu ajutorul unei
kinaze celulare. NtRTIs sunt deja fosforilati şi aceasta constituie avantajul lor.
ADN-ul care codifică polimeraza HBV este un ORF căruia i se descriu 4 regiuni: o proteină terminală
pentru iniţierea replicării HBV, o regiune “spacer” cu rol neprecizat, o regiune cu funcţie de revers-
transcriptază (ADN polimeraza) denumită “Pol(rt)”, pentru replicarea virală şi o regiune ribonucleazică,
denumită “RNase H”, pentru degradarea ARN pregenomic. Regiunea revers-transcriptazei (rt1-rt344)
este împărţită în 7 domenii, de la A la G3 (vezi fig 18.3.8.4).
Fig. 18.3.8.4: Mutaţiile asociate cu rezistenţa la tratamentul antiviral cu analogi nucleozidici şi

nucleotidici sunt localizate la nivelul ORF-ului care codifică polimeraza HBV. Polimerazei VHB i
se descriu 4 regiuni: proteina terminală, „spacer”, „Pol(rt)” şi “RNase H”. Domeniile cu cele mai
frecvente astfel de mutaţii sunt B,C şi D ale regiunii Pol(rt).
(Adaptare după Watcharasak Chotiyaputta and Anna S. F. Lok, „Hepatitis B virus variants”, Nature
Reviews-Gastroenterology & Hepatology. August 2009; Volume 6:453-462).
Mutantele VHB asociate cu rezistenţa la Lamivudină (LAM)

Mutaţia centrală asociată cu rezistenţa la LAM vizează zona catalitică a regiunii Pol(rt) a HBV
polimerazei, mai precis secvenţa tirozină-metionină-aspartat-aspartat (YMDD). Această mutaţie
implică substituţia metioninei cu valina sau cu izoleucina în poziţia 204 a secvenţei YMDD: rtM204V
sau rtM204I. Această mutaţie scade susceptibilitatea (sensibilitatea) HBV pentru LAM de cca 1000 ori.
Scade, de asemenea, şi capacitatea virală de replicare; însă pot fi selectate adesea o serie de mutaţii
compensatorii (de exemplu substituţia valinei cu leucina în poziţia 173, rtV173L) care restabilesc
capacitatea virală de replicare în cursul tratamentului continuu, prelungit.
Mai sunt descrise mutaţiile rtM204S (în domeniul C) şi rtA181T (în domeniul B)3.
342
18
Mutantele VHB asociate cu rezistenţa la Entecavir (ETV)

Rezistenţa la ETV apare printr-un mecanism dual: un aspect se referă la apariţia uneia dintre mutaţiile
rtM204V sau rtM204I (coincide cu mutaţia centrală din cazul LAM) care scade susceptibilitatea
(sensibilitatea) HBV pentru ETV de cca 10 ori. Al doilea aspect al mecanismului se referă la una
sau mai multe mutaţii localizate în poziţiile rtT184, rtS202, rtM250, caz în care susceptibilitatea
(sensibilitatea) HBV pentru ETV scade de asemenea de cca 10 ori.
Astfel, combinaţia celor două mecanisme conduce la o scădere a susceptibilităţii (sensibilităţii) HBV
pentru ETV de peste 100 ori.
Incidenţa rezistenţei la ETV este scăzută la pacienţi netrataţi anterior cu analogi nucleozidici (1% la
4-5 ani de tratament cu ETV), dar este, dimpotrivă, foarte ridicată în cazurile refractare la LAM (peste
50% la 5 ani de tratament).
Mai sunt descrise mutaţiile rtS202G sau rtS202C (în domeniul C) şi rtT184S / A / I / L / F / G (în
domeniul B) şi rtM250V (în domeniul D)3.
Mutantele VHB asociate cu rezistenţa la Telbivudine (LdT)
Singura mutaţie demonstrată a fi asociată cu rezistenţa la LdT este rtM204I. Incidenţa rezistenţei la
LdT este mai scăzută decât în cazul LAM deoarece LdT are o activitate antivirală crescută şi pentru
că este selectată doar o singură mutaţie (rtM204I, nu şi rtM204V).
Incidenţa rezistenţei la LdT după 1 şi după 2 ani de tratament este de 5% şi, respectiv, 25% la pacienţi
AgHBe pozitivi şi de 2%, respectiv, 11% la pacienţi AgHBe negativi. Această diferenţă apare deoarece
prezenţa AgHBe se asociază cu nivele crescute de ADN HBV şi, implicit, risc mai mare de apariţie a
rezistenţei la tratament3.
Mutantele VHB asociate cu rezistenţa la Adefovir (ADV)
Mutaţiile asociate cu rezistenţa la ADV implică substituţia alaninei cu treonina sau cu valina în poziţia
181 (rtA181T, rtA181V) şi substituţia asparaginei cu treonina în poziţia 236 (rtN236T). Aceste mutaţii
scad susceptibilitatea (sensibilitatea) VHB pentru ADV de cca 5-10 ori.
Incidenţa rezistenţei la ADV s-a raportat a creşte de la 0% (la 48 săptămâni de tratament) până la
cca 30% la 240 săptămâni, în cazul pacienţilor netrataţi anterior cu analogi nucleozidici. Această
incidenţă este chiar mult mai ridicată în cazurile refractare la LAM (cca 6% la 1 an şi cca 25% la 2 ani
de tratament) faţă de doar 4% la 4 ani de tratament combinat LAM + ADV.
A fost descrisă mutaţia rtI233V pentru lipsa de răspuns la ADV (dar această asociaţie trebuie să fie
însă confirmată)3.
Mutantele VHB asociate cu rezistenţa la Tenofovir (TDF)
Până acum nu a fost demonstrată prin studii de fază III rezistenţa genotipică în cazul pacienţilor care
au primit tratament cu TDF timp de până la 2 ani, mai ales pentru că pacienţii cu viremie persistentă
la 72 săptămâni au primit tratament adiţional cu emtricitabine (FTC). Un studiu incipient, cu 2 pacienţi
care prezentau infecţie mixtă HIV + HBV, a raportat o mutaţie rtA194T care ar fi implicată în rezistenţa
la tratamentul cu TDF, dar asociaţia nu a fost confirmată3.
Relaţia dintre cele mai frecvente mutaţii asociate cu rezistenţa la antivirale şi gradul de susceptibilitate
la fiecare medicat aprobat este prezentată în tabelul4 de mai jos:
343
Grad de susceptibilitate
Varianta HBV
LAM LdT ETV ADV TDF
Tip sălbatic S S S S S
M204I R R I S S
L180M + M204V R R I S S
A181T/V I S S R S
N236T S S S R I
L180M + M204V/I + I169T + V173L + M250V R R R S S
L180M+M204V/I + T184G + S202I/G R R R S S
S = susceptibil (sensibil) I = intermediar (susceptibilitate redusă) R = rezistent
Variantele anvelopei HBV – mutaţii la nivelul genei S

Suprapunerea genelor HBV are implicaţii clinice semnificative, mai ales în ceea ce priveşte relaţia
reciprocă dintre genele P (a polimerazei), care se suprapune complet peste gena S (care codifică
AgHBs). În consecinţă, mutaţii apărute la nivelul genei P produc modificări la nivelul genei S şi vice-
versa; implicit, unele mutaţii asociate cu rezistenţa la tratamentul antiviral determină schimbări ale
proteinei de suprafaţă a HBV.
Astfel, mutaţia rtV173L care apare pentru a compensa scăderea capacităţii de replicare asociate cu
mutaţiile rtM204V sau rtM204I (vezi rezistenţa la LAM) induce substituţia sE164D; mutaţia rtA181T
(LAM, ADV) induce apariţia unui stop codon în poziţia sTrp172X a proteinei S. Aceste schimbări scad
capacitatea de legare a AgHBs de anticorpii anti- HBs şi, respectiv, scad secreţia de virioni.
La persoane care au primit vaccin anti-HBV şi la pacienţi cu transplant hepatic cărora li s-a administrat
ser cu imunoglobuline anti-HBV pentru a preveni recurenţa infecţiei HBV s-a observat selecţia unei
variante de HBV cu alterări ale epitopului dominant al AgHBs. Mutaţia cea mai frecventă în astfel
de cazuri a fost G145R, consecinţa fiind alterări ale legăturii AgHBs – AcHBs şi implicit evaziune
imunologică.
Acelaşi fenomen de evaziune imunologică datorat aceleiaşi mutaţii G145R a fost observată la copii
care au primit vaccin anti-HBV cu sau fără imunoglobuline anti-HBV. Imunoprofilaxia a eşuat deşi
AcHBs erau prezenţi3.
În ce situaţii este suspectată apariţia mutantelor rezistente la analogi nucleozidici şi
nucleotidici?
Apariţia rezistenţei la tratamentul antiviral se manifestă iniţial prin creşterea viremiei serice sub
tratament (“virologic breakthrough” definit în funcţie de nivelul de referinţă al viremiei: creşterea de
>1log10 peste nadir sau în mai mult de două ocazii la distanţă de o lună; sau reapariţia ADN HBV
detectabil). Această etapă virologică poate fi urmată de creşterea transaminazelor serice (după
anterioara lor normalizare, “biochemical breakthrough”) şi manifestări clinice de decompensare
hepatică. În aceste situaţii se recomandă identificarea mutaţiilor care conferă rezistenţă la tratmentul
actual şi selectarea unei medicaţii antivirale optime3.
344
18

hemolizate6.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) şi secvenţiere a genelor P şi S; este comunicat de
asemenea genotipul HBV6.
Testarea este posibilă numai în cazul existenţei unei viremii B > 1000 UI/mL.
Bibliografie
1. Akarsu, Mesut; Sengonul, Aylin; Tankurt, Ethem et al, „YMDD Motif Variants in Inactive Hepatitis
B Carriers Detected by Inno-Lipa HBV DR Assay”, Journal of Gastroenterology and Hepatology.
2006; Volume 21 Issue 12: 1783-8. (sursa: http://www.medscape.com/viewarticle/549393)
2. Bouchard M.J. and Schneider R.J. „The Enigmatic X Gene of Hepatitis B Virus”, Journal of
Virology. 2004; Volume 78, Issue 23: 12725–12734.
3. Chotiyaputta, Watcharasak and Lok, Anna S. F. „Hepatitis B virus variants”, Nature Reviews-
Gastroenterology & Hepatology. August 2009; Volume 6:453-462.
4. European Association for the Study of the Liver, „EASL Clinical Practice Guidelines:
Management of chronic hepatitis B”, Journal of Hepatology. 2009; Volume 50:227-242.
5. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 17th Edition, The McGraw-Hill Companies, United
States of America, 2008.
18.3.9 ARN viral hepatita D (cantitativ)
Informatii generale şi recomandări privind efectuarea ARN viral hepatita D (cantitativ)

Hepatita D (delta) este considerată ca fiind cea mai severă formă de hepatită virală la om. Virusul
hepatitei D (HDV) este un virus defectiv care necesită antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B
(AgHBs) pentru replicare completă şi transmitere. Astfel, hepatita D se dezvoltă numai la persoanele
AgHBs pozitive, fie ca o co-infecţie acută, fie ca o suprainfecţie la persoanele care prezintă deja
hepatită cronică B.
Mai multe studii au arătat că infecţia HDV cronică conduce la o afectare hepatică mai severă decât
monoinfecţia cronică HBV, cu o progresie accelerată către fibroză, o decompensare precoce a cirozei
345
şi un risc mai mare de carcinom hepatocelular. Tratamentul cu interferon pegylat induce un răspuns
virusologic susţinut în aproximativ un sfert din cazuri.
HDV a fost descris pentru prima dată în 1977 în Italia şi este un virus ARN circular monocatenar de
dimensiuni mici. Genomul este căptuşit cu proteina de înveliş derivată din antigenele pre-S şi S ale
HBV1;2. ARN HDV are 6 cadre deschise citirii, ORF-uri (engl. open reading frames), 3 fiind situate
pe catena genomică şi celelalte 3 pe catena antigenomică. Un ORF codifică antigenul hepatitei D
(AgHD), în timp ce celelalte ORF-uri nu par să fie transcrise activ.
Replicarea ARN HDV cuprinde următoarele etape: replicarea catenei genomice de către ARN
polimeraza gazdei; rezultă o structură multimerică lineară care este clivată autocatalitic în monomeri
lineari; aceştia sunt ligaţi în ARN HDV viral circular (“double-rolling circular model”)2.
HDV a fost clasificat iniţial în 3 genotipuri, însă analize filogenetice recente sugerează existenţa a cel
puţin 7 genotipuri majore. Genotipul I este cel mai frecvent şi are o distribuţie ubicuitară. Genotipul
II este întâlnit în estul Asiei, în timp ce genotipul III prevalează în America de Sud. Genotipul I se
asociază atât cu afectare hepatică severă cât şi cu forme uşoare, în timp ce genotipul II determină o
boală mai uşoară în cursul unei evoluţii îndelungate1;2.
Datorită legăturii strânse cu HBV, HDV are căi de transmitere similare, în principal parenterală. Infecţia
cu HDV este endemică în ţările mediteraneene, Orientul Mijlociu, Africa Centrală şi regiunile nordice
din America de Sud. În Occident se constată o prevalenţă crescută în rândul consumatorilor de droguri
intravenoase.
Ca urmare a implementării programelor de vaccinare împotriva hepatitei B incidenţa infecţiei HDV a
scăzut semnificativ, însă continuă să reprezinte o problemă gravă de sănătate.
Datele privind patogenia infecţiei HDV sunt limitate. Observaţiile clinice au sugerat existenţa unui
proces mediat imunologic în majoritatea cazurilor. Ocazional a fost suspectat şi un mecanism
citopatic.
În cazul hepatitei D examenul histologic al ficatului nu este diferit faţă de cel asociat cu hepatita B
sau C, cu leziuni necroinflamatorii de însoţire a infecţiei. Este important de menţionat că viremia
HDV nu este direct asociată cu gradul afectării hepatice (Zachou, 2006). Există date care susţin că
atât cantitatea cât şi calitatea răspunsului celular indus de limfocitele T sunt asociate cu un anumit
control al infecţiei. Acest răspuns celular-specific poate avea valoare predictivă asupra răspunsului la
tratamentul cu interferon pegylat.
Co-infecţia cu virusuri hepatitice multiple este asociată cu diferite modele de inhibiţie reciprocă a
replicării virale. S-a constatat frecvent că HDV suprimă replicarea HBV. Aproximativ 70-90% dintre
pacienţii cu hepatită D sunt AgHBe negativi şi cu niveluri scăzute ale viremiei B. Evoluţia pacienţilor
cu hepatită D AgHBe pozitivi nu este însă suficient studiată, însă se pare că aceşi pacienţi au viremie
B nedetectabilă în contextul coinfecţiei HDV. Pe de altă parte, pacienţii cu hepatită D pot dezvolta
mutaţii pre-core de tip stop codon, astfel că pacienţii AgHBe negativi pot prezenta niveluri semnificativ
crescute ale viremiei B care necesită tratament antiviral pentru hepatita B.
Există dovezi că HDV suprimă nu numai replicarea HBV, ci şi replicarea HCV la pacienţii cu infecţie
virală triplă. Cu toate acestea, dominanţa virală se poate schimba în timp, astfel că pacienţii cu infecţie
triplă trebuie atent monitorizaţi şi, dacă este cazul, trataţi pentru virusul dominant2.
Co-infecţia determină apariţia unei hepatite acute, după o perioadă de incubaţie ce variază între 3
346
18
şi 7 săptămâni. Manifestările clinice includ oboseală, letargie şi greaţă şi preced cu o săptămână

apariţia icterului. Replicarea ARN-HDV este limitată, fiind evidenţiată doar în perioada de incubaţie şi
dispare după creşterea transaminazelor serice. În cele mai multe cazuri, vindecarea este completă,
rareori apărând cronicizarea.
Suprainfecţia se caracterizează prin forme severe de hepatită acută, care pot progresa spre infecţie
cronică. Replicarea ARN-HDV este marcată şi prelungită, acidul nucleic fiind detectabil atât în sânge,
cât şi în ţesutul hepatic. Infecţiile fulminante sunt relativ rare, dar pot determina encefalopatie hepatică
cu modificări de personalitate, tulburări de somn, confuzie, somnolenţă şi comă, iar ARN-ul viral seric
se găseşte în cantităţi crescute. Rata de mortalitate în aceste forme acute poate ajunge la 80%.
60-70% din persoanele infectate cu ambele virusuri progresează spre ciroză după un anumit număr
de ani. În această etapă, singurul tratament este transplantul hepatic. Carcinomul hepatocelular poate
fi întâlnit la persoanele cu infecţie cronică cu virus D şi este asociat cu ciroza4.
Fiecare pacient AgHBs pozitiv trebuie testat cel puţin o dată pentru anticorpi anti-HDV. Testarea directă
pentru ARN HDV nu prezintă utilitate în absenţa anti-HD. Pe de altă parte, un rezultat pozitiv pentru anti-
HD nu indică în mod necesar hepatită D activă, astfel că este necesară efectuarea viremiei D pentru
confirmarea unei infecţii active. Dacă se obţine un ARN HDV pozitiv, este necesar să se stabilească
gradul afectării hepatice, să se monitorizeze atent pacienţii pentru carcinomul hepatocelular şi să se
ia în considerare tratamentul antiviral.
Deoarece până în prezent nu sunt date suficiente care să demonstreze corelarea viremiei D cu markeri
clinici ai afectării hepatice, cuantificarea ARN HDV este utilă numai dacă se iniţiază tratamentul
antiviral. Sunt în curs de evaluare reguli de oprire a tratmentului antiviral în funcţie gradul de reducere
a viremiei. Astfel, după unii autori (Erhardt, 2006), pacienţii cu o reducere <3 log a nivelului ARN HDV
după 24 săptămâni de tratment nu vor mai beneficia de terapia antivirală cu PEG-INF α-2b.
În 2004 a fost iniţiat studiul HIDIT-1 (Hep-Net International Delta Hepatitis Intervention Trial) care a
inclus 90 pacienţi cu hepatită cronică D şi boală hepatică compensată. Aceştia au fost randomizaţi
pentru 3 tipuri de terapie: PEG-INF α-2a împreună cu adefovir dipivoxil, PEG-INF α-2a + placebo şi
adefovir izolat pe o perioadă de 48 săptămâni. Concluziile acestui studiu au fost următoarele:
a) PEG-INF α-2a prezintă o eficacitate semnificativă faţă de HDV la >40% dintre pacienţi, 25%
dintre aceştia având o viremie D nedetectabilă după 48 săptămâni;
b) Adefovir dipivoxil prezintă o eficacitate redusă în ceea ce priveşte reducerea viremiei D, dar
poate fi luat în considerare la pacienţii cu replicare HBV semnificativă;
c) terapia combinată PEG-INF α-2a şi adefovir nu prezintă avantaje în ceea priveşte reducerea
ADN HBV sau ARN HDV.
În prezent este studiată eficacitatea PEG-INF α-2a în combinaţie cu tenofovir pentru tratmentul
hepatitei D; de asemenea sunt explorate şi alte opţiuni terapeutice2.
hemolizate3.
347

PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise; limita de detecţie a metodei de lucru: 20 copii/
mL.
Valori de referinţă - ARN-HDV nedetectabil; un rezultat «nedetectabil» semnifică faptul că este vorba
fie de o viremie foarte scăzută (sub limita de cuantificare), fie de o viremie absentă1.
Heparina inhibă PCR-ul, de aceea aceasta nu trebuie folosită ca anticoagulant3.
Bibliografie
1. Bader Faiyaz Zuberi. Hepatitis D: A Review. In JDUHS 2007, Vol.1(1):36-40.

2. Heiner Wedemeyer. Hepatitis D – Diagnostic Procedures and Therapy. www.hepatology.com.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2009. Ref Type: Catalog.
4. Lothar Thomas. Viral Hepatitis. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of
Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1
Ed., 1998, 1278-11281.
18.3.10 ARN viral hepatită C (cantitativ)

Virusul hepatitei C (HCV), membru al familiei Flaviviridae, se transmite în principal pe cale parenterală,
frecvenţa infecţiei HCV fiind mare la pacienţii cu transplant de organe sau transfuzii de sânge, la
persoanele cu abuz intravenos de droguri şi la cei cu dializa renală2;6.
Infecţiile acute sunt în generale uşoare sau asimptomatice, dar progresia către hepatita cronică se
înregistrează în 60-90% din cazuri.
Caracterizarea genomului HCV şi a proteinelor codificate de acesta a permis dezvoltarea atât a
metodelor serologice pentru determinarea anticorpilor specifici cât şi a testelor moleculare pentru
confirmarea diagnosticului şi monitorizarea terapiei. Prezenţa anticorpilor anti-HCV este doar un
indicator de expunere la HCV şi nu poate fi considerată un marker pentru infecţia curentă2.
Dintre markerii biochimici ai afectării hepatice, nivelul alaninaminotransferazei (ALT) a fost considerat
un element important în decizia de a efectua biopsie hepatică şi/sau de a iniţia terapia antivirală. Cu
toate acestea, gradul creşterii ALT-ului nu poate fi direct corelat cu nivelul infecţiei HCV deoarece:
la pacienţii cu hepatită cronică C nivelul seric al ALT poate fluctua spontan, fiind posibile perioade
îndelungate de remisiune biochimică; nivelul ALT poate fi influenţat de alţi factori cum ar fi consumul
de alcool, medicaţia asociată, prezenţa altor infecţii virale, steatoza hepatică non-alcoolică; există o
categorie de pacienţi (estimată recent la 20-40% din cazurile de infecţie cronică HCV) care prezintă un
348
18
nivel persistent normal sau discret crescut al ALT, în condiţiile unei replicări virale continue1.
Pe de altă parte, detecţia prin amplificarea acizilor nucleici cu ajutorul reacţiei de polimerizare în lanţ
(PCR) oferă o măsură a replicării virale, fiind utilă atât pentru diagnosticul infecţiei active cât şi pentru
monitorizarea tratamentului. Noile teste care cuantifică încărcătura virală prin tehnologia ”real-time
PCR” au o sensibilitate analitică mai mare şi un domeniu de linearitate (măsurabil) mult extins, în
comparaţie cu tehnologia PCR conventională2;6.
În ceea ce priveşte diagnosticul, folosind metoda PCR, este posibilă detecţia viremiei HCV înainte de
sero-conversia imunologică6.
Protocolul de tratament al hepatitei cronice HCV include asocierea unui preparat de interferon pegylat
cu ribavirină, cuantificarea ARN-HCV fiind utilă pentru stabilirea viremiei bazale şi monitorizarea
încărcăturii virale în timpul tratamentului, având rol în evaluarea eficienţei terapiei şi identificarea
pacienţilor care nu vor beneficia probabil de continuarea tratamentului2;6.
Prelucrare necesara după recoltare - se separă plasma în maxim 1 zi de la recoltare prin centrifugare
la 800-1600 x g timp de 20 de minute la temperatura camerei, apoi se transferă intr-o eprubetă de
polipropilen (sunt necesari min. 2mL de plasmă)4
Stabilitate probă - plasma separată poate fi păstrată timp de 72 de ore la temperatura camerei, 7
zile la 2-8°C sau cel puţin 6 săptămâni congelată la -80°C. Probele pot fi congelate/decongelate de
maximum cinci ori fără pierderea ARN-ului HCV6.
PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise.
Menţiune: procesarea probelor se face automat6.
Valori de referinţă - ARN-HCV nedetectabil; limita de detecţie a metodei în domeniul de linearitate
este de 45 UI/mL; sensibilitatea analitică: 15 UI/mL. Un rezultat «nedetectabil» semnifică faptul că
este vorba fie de o viremie foarte scăzută (sub limita de cuantificare), fie de o viremie absentă6.
Obţinerea unui rezultat pozitiv indică prezenţa unei infecţii active.
Interferonul pegylat este indicat pentru tratamentul hepatitei cronice tip C la pacienţii adulţi cu
ARN-VHC pozitiv, precum şi la pacienţii cu ciroză hepatică compensată postinfecţie virală C. La
pacienţii cu hepatită cronică tip C, modul optim de folosire a interferonului pegylat este în asociere cu
ribavirina2;3.
Ţinta tratamentului antiviral este răspunsul virusologic susţinut („sustained virusological
response”, SVR) definit ca ARN-HCV nedetectabil la 6 luni după încheierea tratamentului.
Răspunsul la tratamentul antiviral este influenţat de numeroşi factori, fie virologici (genotipul HCV,
nivelul viremiei bazale), fie care ţin de gazdă (rasă, severitatea afecţiunii hepatice, rezistenţa la
insulină). Alături de aceştia există şi factori corectabili, care au apărut în cursul terapiei iniţiale dar
asupra cărora se poate interveni la a doua încercare de tratment (reducerile mari de doze sau chiar
întreruperea tratamentului ca urmare a unor reacţii adverse hematologice sau a depresiei; complianţă
349
redusă)4.
În funcţie de momentul la care s-a produs clearance-ul viral, răspunsul virusologic poate fi încadrat în
una din următoarele categorii:
- răspuns virusologic rapid („rapid virusological response”, RVR): obţinerea unui ARN-HCV nedetectabil
la 4 săptămâni de la iniţierea terapiei; pacienţii sunt consideraţi “rapid-responders”;
- răspuns virusologic precoce („early virusological response”, EVR) complet: definit printr-o
viremie nedetectabilă la 12 săptămâni de la iniţierea terapiei; pacienţii sunt consideraţi “standard-
responders”;
- răspuns virusologic lent („slow virusological response”) sau răspuns virusologic precoce parţial:
definit printr-o scădere a viremiei cu ≥2 log10 faţă de nivelul de bază la 12 săptămâni de la începutul
tratamentului şi obţinerea unui ARN HCV nedetectabil în săptămâna 24; pacienţii sunt consideraţi
“slow-responders”3;4.
Pe de altă parte, există următoarele categorii asociate cu eşecul terapiei antivirale:
- lipsă de răspuns virusologic (“non-response”): definit printr-o scădere a viremiei cu <2 log10 faţă de
nivelul de bază la 12 săptămâni de la începutul tratamentului; în cadrul acestei categorii mai există un
grup de pacienţi, consideraţi ca fiind cei mai refractari la tratamentul antiviral, la care se constată în
orice moment o scădere a viremiei <0.5 log10 faţă de nivelul de bază (“null-response”); pacienţii sunt
consideraţi “non-responders” şi se întrerupe tratmentul antiviral în săptămâna 12;
- răspuns virusologic parţial: definit printr-o scădere a viremiei cu ≥2 log10 faţă de nivelul de bază la 12
săptămâni de la începutul tratamentului, însă cu un ARN HCV detectabil în săptămâna 24; la aceşti
pacienţi se întrerupe de tratamentul antiviral în săptămâna 24;
- reapariţia viremiei („breakthrough”): ARN HCV detectabil în cursul tratamentului, după un răspuns
virusologic iniţial;
- recădere („relapse”): ARN-HCV detectabil după sfârşitul terapiei la pacienţi care au niveluri
nedetectabile susţinute ale viremiei în cursul tratamentului4.
Durata tratamentului combinat este în funcţie de genotipul viral. Conform programelor standard de
terapie antivirală, pacienţii infectaţi cu HCV genotip 1 sau genotip 4, indiferent de nivelul viremiei de
bază, trebuie să primească tratament timp de 48 săptămâni. Studiile clinice multinaţionale au arătat
că la pacienţii infectaţi cu genotipurile 2 sau 3 durata tratamentului combinat poate fi redusă la 24
săptămâni, fără compromiterea eficienţei (rata răspunsului virusologic susţinut este de 84%)5.
Date recente însă (studiul INDIV-2) indică posibilitatea instituirii unei terapii individualizate, ghidată de
răspunsul virusologic, la pacienţii cu genotip 1/4, astfel:
- durata tratamentului va fi de 24 săptămâni la pacienţii “rapid-responders”, cu viremie bazală
scăzută (<600 000 - 800 000 UI);
- în cazul pacienţilor “standard-responders” durata tratamentului va fi de 48 săptămâni;
- pacienţii “slow-responders” pot beneficia de prelungirea tratamentului la 72 săptămâni.
Comparativ cu lotul martor care a primit tratamentul standard de 48 săptămâni, rata SVR în cazul
terapiei individualizate a fost de 55%, versus 48%3.
În ceea ce priveşte pacienţii la care primul program de terapie a eşuat, retratarea va fi luată în
considerare în funcţie de categoriile mai sus menţionate4.
Heparina inhibă PCR-ul, de aceea aceasta nu trebuie folosită ca anticoagulant6.
350
18
Bibliografie
1. Alfredo Alberti. Towards more individualized management of hepatitis C virus patients with
initially or persistently normal alanineamniotransferase levels. In Journal of Hepatology 42
(2005): 266-274.
2. ARUP’s Guide to Clinical Laboratory Testing. Hepatitis C Virus RNA Quantitative, Real-Time
PCR. www.aruplab.com/guides. Ref Type: Internet Communication.
3. Christoph Sarrazin, T. Berg et al. Prophylaxis, diagnosis and therapy of hepatitis C virus (HCV)
infection: the German guidelines on the management of HCV infection. In Z. Gastroenterol.,
2010, Feb. 48(2), 289-351.
4. Graham R. Foster, K. Rajender Reddy. Viral Liver Disease, Blackwell Publishing, 2010, 34-42.
5. Hadziyannis SJ, et al. Peginterferon-α2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C.
A randomized study of treatment duration and ribavirin dose. In Ann Intern Med 2004; 140:346-
355.
18.3.11 Virusul hepatitei C (HCV) - genotipare

Asemenea altor virusuri ARN, HCV prezintă la nivel nucleotidic o diversitate genetică considerabilă
generată de rata înaltă a mutaţiilor virusului. Pentru a structura într-un anume mod această diversitate
genetică a fost formulată o clasificare HCV în 6 genotipuri (denumite 1, 2, 3, 4, 5, 6) pe baza analizei
filogenetice a secvenţei genomice. Fiecare genotip, la rândul său, este subdivizat filogenetic în unul
sau mai multe subtipuri (denumite a, b, c, etc). Aceste denumiri au devenit sistemul standard pentru
noua nomenclatură a genotipurilor HCV10;11. În plus, la persoanele infectate HCV circulă şi se comportă
ca un amestec de populaţii virale distincte denumite cvasispecii.
Cele 6 tipuri genetice majore diferă unul de celălalt la nivelul secvenţelor nucleotidice în proporţie
de 30-35%; între subtipuri se înregistrează o diferenţă de 20-25%, iar în cadrul aceluiaşi subtip, o
diferenţă de până la 10%.
Genomul HCV este alcătuit din domenii care diferă mult în ceea ce priveşte rata mutaţiilor şi
variabilitatea secvenţelor nucleotidice. Astfel, regiunea netranslatată de la capătul 5’ al genomului
(5’UTR) reprezintă domeniul cel mai bine conservat, cu rata evolutivă cea mai lentă. Urmează apoi
gena C (core) care codifică miezul nucleocapsidic proteic şi care evoluează de trei ori mai rapid în
comparaţie cu regiunea 5’UTR. Genele care codifică proteinele de înveliş E1 şi E2 constituie regiunea
hipervariabilă, care diferă de la un izolat la altul. Aceasta permite virusului să evite mecanismele
imunologice ale gazdelor îndreptate împotriva proteinelor accesibile din învelişul viral.
351
Genotipurile şi subtipurile HCV prezintă modele complexe de distribuţie geografică, prevalenţă relativă
şi moduri de transmitere a infecţiei ce pot fi mai bine înţelese dacă sunt clasificate în trei grupuri:
1. grupul epidemic cuprinde subtipurile 1a, 1b, 2a, 2b şi 3a, care au o distribuţie globală şi sunt
responsabile pentru majoritatea infecţiilor din întreaga lume. Răspândirea globală rapidă a acestor
subtipuri rezultă din transmiterea lor eficientă prin produse de sânge infectate şi administrarea de
droguri intravenoase. Subtipurile 1b şi 2a sunt asociate predominat cu transmiterea prin produse
de sânge iar prevalenţa lor relativă a scăzut în ultimii ani ca urmare a îmbunătăţirii screening-ului
donatorilor. Subtipurile 1a şi 3a se întâlnesc în principal la dependenţii de droguri iar prevalenţa
acestora este în creştere.
2. grupul endemic are o distribuţie mai redusă decât grupul epidemic fiind limitat la anumite regiuni.
De exemplu, subtipurile genotipului 6 se găsesc numai în sud-estul Asiei. Diversitatea genetică foarte
mare a tulpinilor endemice sugerează o persistenţă îndelungată a infecţiei în aceste regiuni datorită
menţinerii unor modalităţi de transmitere relativ ineficiente, printre care se numără şi cea sexuală.
3. grupul local epidemic prezintă o prevalenţă mare în anumite regiuni şi populaţii ale globului. Astfel,
subtipul 4a este responsabil de infectarea a mai mult de 10% din populaţia Egiptului şi este rar întâlnit
în afara Orientului Mijlociu. Studiile epidemiologice sugerează că acest fenomen a avut loc în cursul
secolului XX, cu ocazia administrării în masă pe cale intravenoasă a unor medicamente împotriva
schistosomiazei11.
În ţara noastră predomină genotipul 1b şi un amestec de genotipuri 1a şi 1b4. Un studiu efectuat recent
la Institutul Matei Balş în Bucureşti pe 670 pacienţi a indicat o prevalenţă de 99.7% a genotipului 1
HCV6.
Cunoaşterea genotipului viral oferă informaţii cu valoare prognostică în ceea ce priveşte eficacitatea
terapiei la pacienţii cu hepatită virală cronică HCV. Spre exemplu, genotipul 1b (dobândit cel mai
adesea post-transfuzional) se asociază cu un răspuns slab la tratament şi cu un risc crescut de ciroză
şi carcinom hepato-celular. Pe de altă parte, genotipurile 2 şi 3 (dobândite predominat prin consumuri
de droguri i.v.) se asociază cu un răspuns favorabil la terapia antivirală7;8;9.
US National Institute of Health (NIH) arăta în 2002 că determinarea genotipurilor HCV este importantă
în alegerea dozelor optime de interferon şi ribavirină precum şi a duratei tratamentului. Astfel, la
pacienţii cu genotip sălbatic 1 se recomandă o durată a tratamentului de 48 de săptămâni, iar pentru
pacienţii cu genotip 2 şi 3 o durată de 24 de săptămâni cu doze mai mici de ribavirină. Este util ca
genotiparea HCV să fie efectuată în toate infecţiile cu virus C înaintea începerii oricărui tratament1.
Testul efectuat în laboratorul nostru foloseşte o tehnică PCR de amplificare a unor regiuni ale
genomului HCV urmată de revers-hibridizare pentru identificarea genotipurilor HCV de la 1 la 6 şi a
subtipurilor a şi b ale genotipului 15.
Regiunea 5’UTR prezintă multiple secvenţe specifice fiecărui genotip distribuite de-a lungul a 7 mici
regiuni variabile care pot da informaţii precise despre genotipurile 1-5 şi subtipurile a şi b ale genotipului
6. Datorită marii similitudini secvenţiale, subtipurile c-l ale genotipului 6 (clasificate anterior ca 7, 8,
9 şi 11) nu pot fi deosebite de genotipul 1 doar prin analiza regiunii 5’UTR. Acurateţea identificării
subtipurilor 1a şi 1b prin analiza regiunii 5’UTR este cuprinsă între 80% şi 95% şi depinde de izolatele
specifice testate3. Testul nostru utilizează secvenţe ale regiunii core în asociere cu regiunea 5’UTR
pentru identificarea genotipului 6, subtipurile c-l. Pentru a perfecţiona acurateţea identificării subtipurilor
352
18
1a şi 1b sunt incluse secvenţe adiţionale ale genei core5.

Pregătire pacient - nu este necesară o pregatire specială5.
hemolizate5.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ urmată de revers-hibridizare; produsul de amplificare biotinilat
suferă un proces de hibridizare folosindu-se sonde oligonucleotidice specifice pentru regiunile 5’UTR
şi core ale diverselor genotipuri HCV fixate pe un strip de nitroceluloză; după etapa de hibridizare se
adaugă conjugatul (streptavidină marcată cu fosfatază alcalină) care se va ataşa de hibridul biotinilat;
substratul cromogen adăugat în final va reacţiona cu complexul strepatvidină-fosfatază alcalină şi va
genera un precipitat violet maroniu care va fi vizualizat sub forma unor benzi pe strip; interpretarea
rezultatelor se face cu ajutorului unui card5.
Efectuarea genotipării HCV nu este recomandată pentru screening-ul sau confirmarea infecţiei HCV.
Testul este posibil numai în cazul existenţei unei viremii C > 600 UI/mL.
În anumite cazuri se pot obţine rezultate neinterpretabile datorită heterogenităţii secvenţelor genomului
HCV, infecţiior mixte sau existenţei (rare) de tulpini HCV recombinate5.
Bibliografie
1. AASLD Practice guidelines http:/www.aasld.org/pdffiles/Prac._Guide_Hep_C

2. Consensus Conference Treatment of hepatitis C. Maison de la Chimie, Paris, France, 27 – 28
february 2002. Agence Nationale d”Accreditation et d”Evaluation en Sante (ANAES).
3. Chen Z, Weck KE. Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5’ untranslated region
cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. In J Clin Microbiol. 2002; 40: 3127 – 3134.
4. Ileana Constantinescu, Institutul Clinic Fundeni. Genotiparea virusurilor hepatitice în România.
Simpozion iunie 2008, Tg. Mureş: Rolul tehnicilor de biologie moleculară în elucidarea
mecanismelor infecţiei cu virusul hepatitic de tip C, precum şi în descoperirea de noi markeri
pentru fibroză şi carcinomul hepatocelular asociate cu această infecţie.
6. Neaga Emil. Prevalenţa genotipului 1 HCV în România. Simpozion iunie 2008, Tg. Mureş: Rolul
tehnicilor de biologie moleculară în elucidarea mecanismelor infecţiei cu virusul hepatitic de tip
C, precum şi în descoperirea de noi markeri pentru fibroză şi carcinomul hepatocelular asociate
cu acastă infecţie.
7. Nguyen MH, Keeffe EB. Prevalence and treatment of hepatitis C virus genotypes 4,5 and 6. In
Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 10: S97 – S101.
8. Pawlotsky JM. Hepatitis C virus genetic variability: pathogenic and clinical implications. In Clin
353
Liver Dis. 2003; 7; 45 – 66.

9. Seeff LB, Hoofnagle JH Appendix: The National Institute of Health Consensus Development
Conference : Management of Hepatitis C 2002. In Clin Liver Dis. 2003; 7: 261 – 287.
10. Simmonds P, Bukh J, Combet C et al. Consensus proposals for a unified system of
nomenclature of hepatitis C virus genotypes. In Hepatol. 2005; 42; 962 – 973.
11. Stumpf M.P.H., Pybus O.G. Genetic diversity and models of viral evolution for the hepatitis C
virus. In FEMS Microbiology Letters 214 (2002) 143-152.
18.3.12 HIV-1 ARN
Virusul imunodeficienţei umane (HIV), agentul etiologic al sindromului imunodeficienţei umane
dobândite (SIDA), face parte din familia Retroviridae, subfamilia Lentivirinae.
Există două tipuri de HIV, fiecare cu mai multe subtipuri, diferenţiate pe zone geografice:
HIV-1
• mai virulent;
• responsabil de epidemia globală actuală;
• severitatea infecţiei variază de la o persoană la alta;
• include grupul M cu 10 subtipuri, de la A la J, grupul O (secundar, “outlier”) şi grupul N (non-M,
non-O).
HIV-2
• descoperit iniţial în vestul Africii, este prezent la ora actuală şi în unele ţări din Europa şi sud-estul
Asiei;
• tip viral mai atenuat;
• genomul său este mai înrudit cu genomul SIV (virusul imunodeficienţei simiene) decât în cazul
HIV-1;
• este divizat in 5 grupuri, de la A la E.
HIV este un virus ARN monocatenar cu polaritate pozitivă, cu o anvelopă pe care sunt prezente
numeroase copii ale glicoproteinei de suprafaţă gp120 care se leagă de receptorul CD4 situat pe
limfocitele T helper, macrofage, celule foliculare dendritice. Genomul conţine două filamente de ARN
viral monocatenar pe care sunt dispuse următoarele 3 categorii de gene:
- gene structurale
● gag (genome-associated gene) care codifică proteinele ce formează miezul
sau
nucleul virusului: - p17 (proteina matricei);
- p24 (proteina capsidală);
- p7 (proteina nucleocapsidei);
354
18
● pol (polymerase) care codifică: - p11 (proteaza);

- p66 (reverstranscriptaza);
- p32 (integraza);
● env (envelope) care codifică proteinele ce formează anvelopa virionului:
Gp 160 – glicoproteina precursor care prin scindare dă naştere la:
- gp 120 (de suprafaţă);
- gp 41 (transmembranară);
- gene reglatoare: rev, nef, tat.;
- gene de maturare care sunt esenţiale pentru patogenicitate in vivo: vif, vpu,
vpr/vpx1;5.
Pătrunderea HIV în organism se face la nivelul:
- mucoaselor urogenitale, rectale sau orale, prin contact hetero- sau
homosexual;
- perinatal, de la mamă la făt;
- parenteral, prin soluţii de continuitate ale tegumentelor şi mucoaselor, injecţii,
tatuaje, transfuzii şi transplant de organe de la donatori infectaţi1;5.
Modelul comun este infecţia prin mucoase, ţintele iniţiale fiind celulele Langerhans din lamina propria
subiacentă acestora. Sunt infectate mai ales macrofagele în curs de diferenţiere cu susceptibilitate
crescută la replicare şi limfocitele T activate. Infecţia limfocitelor T CD4+ favorizează progresia spre
ganglionii teritoriali şi ţesuturile mai profunde.
O etapă caracteristică pentru ciclul replicativ al retrovirusurilor este conversia ARN-ului viral în ADN
proviral bicatenar prin reverstranscriere catalizată de reverstranscriptază; ADN-ul proviral este
translocat în nucleul celulei gazdă, transformat în ADN circular şi inserat în genomul acesteia cu ajutorul
integrazei. După ce are loc integrarea, replicarea şi sinteza de noi particule virale sunt dependente
de prezenţa unor factori celulari şi virali necesari activării promotorilor virali. Factorii externi cum ar
fi coinfecţia cu alţi agenţi patogeni, producţia de citokine inflamatorii şi activarea celulară potenţează
replicarea virală. Mecanismele moleculare care reglează producţia virală includ căi celulare în care
sunt implicaţi factori, cum ar fi familia factorului nuclear - κB (NF- κB) (factori de transcripţie), care
generează o cascadă de evenimente ce conduc în final la expresia genomului viral.
Diseminarea virusului de la situsul de intrare se face pe cale sanguină, fie sub formă de virioni liberi,
fie asociat cu limfocitele CD4+ sau monocitele5.
Aproximativ jumătate dintre pacienţii infectaţi acut cu HIV prezintă un sindrom pasager asemănător
mononucleozei infecţioase; în faza acută nivelurile de HIV-ARN sunt crescute în timp ce anticorpii
specifici pot fi încă nedetectabili. Din acest motiv, detectarea prin reacţia de polimerizare în lanţ (PCR)
a acizilor nucleici HIV-1 s-a dovedit a fi mai sensibilă decât testele ELISA de generaţia a 3-a în
perioada de „fereastră imunologică” (în primele 3-4 săptămâni de la contactul infectant). Folosirea
testelor de generaţia a 4-a care combină detecţia anticorpilor HIV cu cea a antigenului p24 conduce
la o sensibilitate clinică mai mare în faza precoce de seroconversie; totuşi detectarea HIV1-ARN este
posibilă cu 6 zile mai devreme în comparaţie cu cea a antigenului p24. În ţările dezvoltate băncile de
sânge utilizează de rutină tehnici moleculare pentru depistarea donatorilor cu infecţie HIV în stadiu
iniţial7;8.
355
Faza acută este urmată de o perioadă de infecţie asimptomatică; în medie, intervalul de timp necesar
pentru reducerea marcată a numărului de limfocite CD4+ şi dezvoltarea sindromului imunodeficienţei
dobândite (SIDA) este de 10-11 ani; 5-10% dintre pacienţi trec în această fază mult mai rapid, în
decurs de 3 ani, în timp ce 5-10% menţin un număr constant de celule CD4+ şi rămân asimptomatici
o perioadă de timp indefinită. Etapa SIDA este marcată de evoluţia unor infecţii cu risc vital, de
neoplasme oportuniste sau de manifestări directe ale citopatogenicităţii HIV8.
Diagnosticul serologic al infecţiei HIV în perioada prenatală este complicat de persistenţa prelungită
a anticorpilor materni (aproximativ 18 luni de la naştere). Din acest motiv, metoda de elecţie pentru
depistarea infecţiei neonatale sunt testele moleculare. Acestea se recomandă a fi efectuate după 2-3
săptămâni de la naştere, la vârsta de 1-2 luni şi la 4-6 luni, pentru toţi copiii născuţi din mame HIV
pozitive3;7.
Sunt descrise două tipuri de teste care detectează încărcătura virală:
- un test care detectează încărcătura virală celulară, respectiv ADN proviral în
celulele mononucleare din sângele periferic prin tehnica PCR;
- un test care detectează încărcătura de ARN plasmatic prin tehnica RT-PCR care
foloseşte reverstranscriptaza.
Ambele tehnici optimizate evaluează cantitativ numărul de copii genomice7.
Testul de detecţie a ADN-ului proviral este utilizat pentru diagnosticul infecţiei la copiii născuţi din mame
HIV pozitive, depistarea precoce a infecţiei în perioada în care testele serologice, antigenul p24 şi HIV-
ARN sunt negative, precum şi în cazul obţinerii unui rezultat echivoc la testul Western blot6. Testul
de detecţie a ARN-ului plasmatic poate fi utilizat de asemenea în diagnosticul infecţiei perinatale (are
aceeaşi sensibilitate ca testul ADN proviral)3, însă principala sa utilitate este monitorizarea evoluţiei
bolii şi a terapiei antiretrovirale6.
Monitorizarea viremiei este necesară pentru a evalua răspunsul la tratament şi durabilitatea supresiei
virusologice. Ţinta terapiei antiretrovirale, atât la pacienţi „naivi” cât şi la cei cu tratamente anterioare,
este supresia HIV-ARN până la nivele nedetectabile. Viremia trebuie determinată înaintea iniţierii
terapiei, după 2-8 săptămâni şi apoi la intervale de 4-8 săptămâni până în momentul în care HIV-
ARN devine nedetectabil. La 4 săptămâni de la începerea tratamentului trebuie să se obţină o
scădere a viremiei cu cel puţin 1 log10, iar după 16-24 săptămâni este necesar să se ajungă la valori
nedetectabile. Viremiile tranzitorii, acele creşteri de ordinul a 50-1000 copii/mL, produse la pacienţi cu
valori anterioare suprimate, sunt ocazional întâlnite dar nu par să fie asociate cu un eşec al răspunsului
virusologic şi nu necesită modificarea tratamentului. Un eşec real al răspunsului virusologic este definit
prin persistenţa unei viremii detectabile la un pacient care a prezentat anterior o suprimare a viremiei
sau prin incapacitatea de a obţine o viremie nedetectabilă după 24-48 săptămâni de tratament. Deşi
pot exista cauze multiple pentru acest eşec virusologic trebuie suspectată în primul rând o rezistenţă
la tratamentul antiretroviral.
În clinicile unde monitorizarea viremiei nu este disponibilă, folosirea numai a criteriilor clinice şi eventual
a numărării celulelor CD4 pozitive poate avea drept consecinţă lipsa identificării unei rezistenţe la
antivirale şi continuarea unui tratament numai parţial eficient2.
Recomandări pentru determinarea HIV-1 ARN
● diagnosticul infecţiei la nou-născuţi din mame seropozitive (câteva studii au demonstrat o
356
18
sensibilitate de 25-40% a testului în primele săptămâni de viaţă, care creşte la 90-100% până la
vârsta de 2-3 luni)3;
● monitorizarea evoluţiei bolii (în prezenţa sau în absenţa terapiei antiretrovirale);
● evaluarea eficacităţii diferitelor tratamente antivirale: înaintea iniţierii terapiei (valori bazale),
monitorizare indirectă pentru detectarea unei posibile rezistenţe antiretrovirale, lipsa complianţei la
tratament6.
Avantajele testului
- sensibilitate şi specificitate comparabile cu izolarea virusului;
- utilizarea unor cantităţi mici de probe de testat;
- testul este rapid şi se observă un paralelism cert între încărcătura virală
plasmatică sau celulară, depleţia de celule T CD4 şi progresia bolii, elemente
ce trebuie luate în considerare la aplicarea tratamentului7.
Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant4;
Cantitate recoltată - cât permite vacuumul4;
Prelucrare necesară după recoltare - proba nu va fi centrifugată4.
Cauze de respingere a probei - probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant4.
Stabilitate probă - probele de sânge sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor
nucleici4.
Metodă – Real-time PCR (TaqMan): reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului
PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (test cantitativ).4
Valori de referinţă - HIV-1ARN: nedetectabil4.
Un rezultat nedetectabil indică faptul că testul nu a detectat HIV-1 ARN în proba analizată. Un rezultat
având comentariul „HIV-1 ARN detectabil, dar <20 copii/mL” indică faptul că a fost detectat HIV-1
ARN în probă, dar nivelul său se află sub limita inferioară de detecţie a metodei; acest rezultat se
poate datora unei viremii foarte mici, unei infecţii HIV1 în stadiu precoce (<3 săptămâni de la contactul
infectant) sau a unei false pozitivităţi (datorate unei imprecizii a testului în absenţa infecţiei)6.
În cazul copiilor născuţi din mame HIV pozitive rezultatele vor fi interpretate astfel:
- obţinerea a două valori negative pentru HIV1-ARN la vârsta de minimum 1 lună
şi respectiv la 4 luni (sau mai mult) infirmă infecţia;
- obţinerea a două valori pozitive pentru HIV1-ARN la vârsta de minimum 1 lună
şi respectiv la 4 luni (sau mai mult) confirmă infecţia3.
Nu se recomandă stabilirea unor decizii terapeutice pe baza unei singure valori a viremiei. Rezultatele
viremiei trebuie interpretate întotdeauna în contextul clinic şi corelate cu numărul celulelor CD4
pozitive6.
Variaţiile diurne ale HIV ARN sunt mai mari la copii comparativ cu adulţii; din acest motiv numai
357
creşteri de peste 5 ori (0.7 log10) pot fi semnificative la copiii <2 ani, faţă de creşterile de peste 3 ori
(0.5 log10) considerate ca fiind relevante la copiii mari şi adulţi3.
Introducerea tratamentului antiretroviral imediat după naştere poate suprima nivelele ARN-ului şi
interfera cu diagnosticul infecţiei7.
Testul este optimizat doar pentru cuantificarea viremiei în infecţia HIV-1 determinată de grupul M,
subtipurile A-H şi nu prezintă acurateţe în detectarea infecţiei cauzată de HIV-1 grupurile N şi O,
precum şi a infecţiei HIV-2.
Un rezultat negativ nu indică în mod necesar absenţa replicării virale4;6.
Bibliografie
1. ARUP Laboratories. Test Directory: Human Immunodeficiency Virus 1 RNA Quantitative Real-
Time PCR. www.aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
2. Athe M.N. Tsibris. Martin S. Hirsch. Antiretroviral Therapy for Human Immunodeficiency Virus
Infection. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases,
7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 1847-1848.
3. Geoffrey A. Weinberg, George K. Siberry. Pediatric Human Immunodeficiency Virus. In Mandell,
5. Marvin S. Reitz, JR. Robert C.Gallo. Human Immunodeficiency Viruses. In Mandell, Douglas,and
Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone,
Elsevier, 2010, 2323-2333.
6. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: HIV Type 1 Proviral DNA Qualitative
Detection by PCR, Blood. HIV Type 1 RNA Quantification, Plasma.
7. Robin Dewar, Deborah Goldstein, Frank Maldarelli. Diagnosis of Human Immnuodeficiency Virus
Infection. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th
edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 1663-1681.
8. Timothy R. Sterling, Richard E. Chaisson. General Clinical Manifestations of Human
Immunodeficiency Virus infection. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and Practice of
Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 1705-1721.
358
18
18.3.13 ADN HPV - detecţie tipuri oncogene

Papilomavirusurile umane (HPV) fac parte din familia Papovaviridae şi constituie un grup heterogen
de virusuri de dimensiuni mici, al căror genom conţine un ADN circular dublu catenar.
Sunt cunoscute peste 100 tipuri diferite de HPV. În funcţie de epiteliul infectat, se descriu două
categorii de HPV:
- HPV cutanate, cu tropism pentru epiteliul keratinizat;
- HPV mucoase, cu tropism pentru epiteliul nekeratinizat.
În categoria virusurilor cu tropism pentru mucoase sunt incluse şi tipurile genitale; astfel, au fost
identificate peste 40 de virusuri transmisibile sexual. La rândul lor, virusurile genitale sunt împărţite în
două grupuri, în funcţie de asocierea lor cu tumori maligne ale tractului genital:
- HPV cu risc scăzut: cele mai comune sunt tipurile 6 şi 11, mai rar 40, 42, 43, 44, implicate
în producerea condiloamelor (verucilor) genitale, ce nu prezintă risc de malignizare;
- HPV cu risc crescut (oncogene): cele mai importante sunt tipurile 16 şi 18, implicate în
producerea leziunilor scuamoase epiteliale (actuala denumire a neoplaziilor intraepiteliale
cervicale CIN) şi a leziunilor maligne genitale (mai ales cancerul invaziv de col uterin, dar şi
de vulvă sau vagin).
Este important de menţionat faptul că tropismul tisular al HPV nu este complet specific unei anumite
zone anatomice, astfel că tipurile 6 şi 11 pot afecta şi alte mucoase, în afară de cea genitală, spre
exemplu: cavitatea bucală, mucoasa conjunctivală şi tractul respirator6.
Infecţia genitală cu HPV reprezintă cea mai frecventă boală virală cu transmitere sexuală, anual fiind
înregistrate în toate lumea peste 500.000 cazuri noi. Studiile epidemiologice indică faptul că peste 70%
din femeile active sexual sunt infectate cu un tip de HPV, marea majoritate a infecţiilor vindecându-se
spontan, în decurs de 6-18 luni.
Asocierea tipurilor HPV oncogene cu neoplaziile de col uterin este în momentul de faţă bine stabilită,
prezenţa acestora fiind demonstrată în peste 95% din cancerele scuamoase ale colului6;7;8.
Tipurile HPV cu risc crescut produc oncoproteinele E6 şi E7, care leagă proteinele supresoare
tumorale normale p53 şi pRB şi induc în timp “mutaţii” responsabile de proliferarea celulară anormală.
Trebuie menţionat faptul că infecţia cu HPV oncogene reprezintă condiţia necesară dar nu suficientă
pentru apariţia procesului neoplazic, astfel că numai un număr redus de paciente ce prezintă infecţie
persistentă vor dezvolta leziuni maligne. Acest lucru demonstrează că este necesar să existe şi alţi
cofactori carcinogeni, printre care se numără: fumatul, consumul îndelungat (> 6 ani) de contraceptive
orale, imunosupresia persistentă, alte boli cu transmitere sexuală (ex.: infecţia cu Chlamydia
trachomatis, HSV-2 etc.), comportamentul sexual (primul raport sexual la vârstă precoce, număr mare
de sarcini şi/sau avorturi, parteneri multipli)2;6;8.
Unele infecţii cu HPV (cele care produc condiloame genitale) sunt identificate prin examen clinic, totuşi
diagnosticul acestora presupune în marea majoritate a cazurilor efectuarea examenului microscopic
(test Papanicolau), pentru depistarea unei citologii anormale, şi recurgerea la tehnici moleculare
pentru demonstrarea prezenţei ADN-HPV în celulele infectate5.
359
Examenul citologic Papanicolau deţine de mult timp un rol esenţial în screening-ul cancerului cervical.
Laboratoarele în care se efectuează acest test trebuie să comunice rezultatele folosind sistemul
Bethesda de clasificare. Astfel, pentru comunicarea rezultatelor anormale sunt utilizaţi termenii “leziuni
scuamoase intrapiteliale cu risc scăzut” şi “leziuni scuamoase intraepiteliale cu risc crescut”. În prima
categorie sunt incluse modificările citologice asociate cu displazie uşoară; cea de-a doua categorie
cuprinde modificările citologice asociate cu displazie moderată, displazie severă şi carcinom in situ.
Pacientele la care se depistează aceste tipuri de leziuni cervicale premaligne trebuie evaluate prin
examen colposcopic şi eventual bioptic. În cazurile în care la examenul citologic se obţine un rezultat
echivoc/ASC-US (“celule scuamoase anormale de semnificaţie nedeterminată”), există 3 modalităţi
de evaluare: 1) colposcopie; 2) repetarea examenului citologic la intervale de 6 luni până se obţin 3
rezultate negative; 3) efectuarea testului ADN-HPV1.
Deşi screening-ul prin examen citologic a reuşit să reducă mortalitatea prin cancer cervical, s-au
descris numeroase limitări ale citologiei:
- rezultatele sunt semnificativ influenţate de calitatea probei recoltate;
- interpretarea furnizată de examenul microscopic este subiectivă;
- caracterul repetitiv al examinărilor poate conduce la un număr mare de erori de
interpretare.
Sensibilitatea redusă a citologiei are implicaţii medicale, economice şi medico-legale majore7.
În martie 2003 organizaţia FDA a aprobat utilizarea în SUA a testului ADN-HPV în programul de
screening al cancerului cervical la pacientele ≥ 30 ani, împreună cu examenul citologic. Decizia s-a
bazat pe faptul că testarea HPV s-a dovedit a fi mai sensibilă decât examenul citologic la toate grupele
de vârstă şi în toate studiile efectuate4.
Deoarece determinarea ADN-HPV este mai sensibilă decât examenul citologic în detectarea leziunilor
scuamoase intraepiteliale cu risc crescut, obţinerea unui rezultat negativ la ambele teste conferă
garanţia că riscul unui cancer cervical neidentificat este foarte redus (aproximativ 1/1000). La această
categorie de paciente, în absenţa altor factori de risc, programul de screening recomandă retestarea
după un interval de 3 ani4;7.
În Europa majoritatea programelor recomandă ca screening-ul cancerului cervical să înceapă la
vârsta de 25 sau 30 ani (debutul screening-ului la vârste sub 25 ani nu este recomandat datorită
riscului scăzut la această grupă de vârstă). Există numeroase studii europene în desfăşurare, care au
drept scop evaluarea utilizării ADN-HPV ca test unic în screening-ul cancerului cervical7.
Un studiu publicat recent care a utilizat datele unui trial populaţional randomizat (ce a inclus femei cu
vârste cuprinse între 32 şi 38 ani) a evaluat eficienţa a 11 strategii posibile de screening al cancerului
cervical bazate pe testare ADN-HPV şi examen citologic. În urma comparaţiei efectuate s-a constatat
că cea mai fezabilă strategie este screening-ul iniţial cu un test ADN-HPV, triajul rezultatelor HPV
pozitive cu examenul citologic şi repetarea peste 1 an a testului HPV la femeile având rezultat pozitiv
şi citologie negativă. Aplicarea acestei strategii a determinat o creştere cu 30% a sensibilităţii pentru
detectarea cazurilor CIN3+ în comparaţie cu citologia izolată şi numai o creştere cu 12% a numărului
total de teste screening efectuate5.
Concluzii:
- protocoalele de screening care includ numai examenul citologic vor continua să genereze
360
18
imprecizii în evaluarea rezultatelor cu semnificaţie incertă; în majoritatea acestor situaţii

evoluţia pacientelor va fi benignă, dar va exista un procent de 6-11% cazuri cu leziuni
intraepiteliale cu risc crescut şi aproximativ 1/1000 cu leziuni de cancer cervical;
- testarea ADN-HPV este mai eficientă şi mai sensibilă decât examenele citologice repetate,
mai ales la pacientele cu citologie echivocă;
- în ceea ce priveşte screening-ul primar, testarea pacientelor ≥ 30 ani în scopul depistării
tipurilor HPV cu risc crescut este mai sensibilă decât examenul citologic; având în vedere
valoarea predictivă negativă crescută (99-100%) a testului HPV, intervalul de timp la care
se efectuează retestarea poate fi extins la 3-5 ani la pacientele cu rezultat negativ;
- testarea HPV la 6 luni după intervenţia terapeutică pentru leziuni scuamoase intrepiteliale
cu risc crescut este cea mai sensibilă metodă de depistare a leziunilor persistente sau
recurente7.
Testul efectuat în laboratorul Synevo utilizează tehnica de hibridizare a acizilor nucleici “hybrid
capture” pentru depistarea calitativă a 13 tipuri oncogene de HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59 şi 68) în celule cervicale colectate în mediu lichid. Investigaţia are 2 indicaţii majore:
- triajul pacientelor cu examen citologic echivoc;
- screening-ul primar al cancerului cervical2.
Pregătire paciente - se va evita recoltarea probei în perioada menstruală.
De asemenea, 48 ore înainte de prelevarea probei, pacientele vor evita:
- raporturile sexuale;
- efectuarea duşurilor vaginale;
- folosirea tampoanelor intravaginale, contraceptivelor locale, a diverselor geluri, creme şi
tratamente vaginale4.
Specimen recoltat - celule cervicale colectate în mediu lichid; recoltarea va fi efectuată cu ajutorul
periuţei cervicale Cervex-Brush (vezi fig.18.3.13.1) Forma periuţei permite colectarea simultană de
celule exo- şi endocervicale, fiind inclusă zona de transformare (o arie de epiteliu metaplaziat între
exocervixul matur şi epiteliul columnar al canalului endocervical, unde apar leziunile intraepiteliale).
Instrucţiuni:
- inseraţi partea centrală (cu fire mai lungi) a periuţei în canalul endocervical;
- împingeţi uşor, până când marginile scurte ale periuţei vor veni complet în contact cu
exocervixul;
- pastrând fixată partea centrală în canalul endocervical, rotiţi de cinci ori periuţa în sensul
acelor de ceasornic;
- introduceţi periuţa în flaconul cu mediu lichid PreservCyt (vezi fig.18.3.13.2) până la baza
recipientului;
- permiteţi descărcarea conţinutului periuţei, prin 10 mişcări de apăsare a firelor periuţei pe
suprafaţa de la baza recipientului, forţând separarea acestora;
- la sfârşit rotiţi ferm periuţa pentru a descărca materialul restant;
- îndepărtaţi periuţa de recoltare (nu se va lăsa vârful periuţei în flacon);
- ataşaţi capacul flaconului şi notaţi datele de identificare ale pacientei2.
361
Fig. 13.3.13.1 Periuţa Cervex-Brush Fig.17.3.13.2 Flacon cu mediu lichid PreservCyt.
Stabilitate probă - celulele cervicale colectate în mediul PreservCyt sunt stabile 21 zile la temperatura
camerei şi 8 săptămâni la 2-8ºC2.
Metodă - hibridizare în fază lichidă (soluţie) cu detecţie prin chemiluminiscenţă (sistem “hybrid
capture”); sunt detectate separat două grupuri de HPV: cu risc crescut (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59 şi 68) şi cu risc scăzut (6,11,42,43,44)2.
Valori de referinţă – ADN-HPV cu risc crescut nedetectabil; ADN-HPV cu risc scăzut nedetectabil;
limita de detecţie a metodei de lucru variază între 0.62 şi 1.39 pg/mL în funcţie de tipul HPV2.
Acest test a fost validat numai pentru utilizarea celulelor cervicale colectate în mediu lichid; folosirea
altor tipuri de probe poate conduce la rezultate neconcludente.
Detectarea ADN-HPV cu risc crescut este dependentă de cantitatea de genom viral prezentă în
probă, care poate fi influenţată de modul de recoltare, vârsta pacientei şi stadiul infecţiei2. Obţinerea
unui rezultat pozitiv atestă prezenţa infecţiei cu un tip HPV oncogen, dar nu poate stabili existenţa
unor leziuni precanceroase sau maligne la nivelul colului; pacientele trebuie evaluate şi prin examen
citologic şi colposcopic3.
Testul permite numai diferenţierea între cele 2 grupuri de HPV: cu risc crescut şi cu risc scăzut; pentru
identificarea tipului HPV implicat în infecţie se recomandă efectuarea genotipării HPV3.
Prezenţa de sânge sau mucus în probă nu interferă cu testul2.
Bibliografie
1. CDC. Sexually Transmitted Diseases. Treatment Guidelines 2006.

3. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Human
Papillomavirus (HPV), High-Risk DNA Detection. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet
Communication.
4. Linda Bren. Cervical Cancer Screening. www.fda.gov 2004.
5. Naucler P, Ryd W, Törnberg S, et al.: Efficacy of HPV DNA testing with cytology triage and/or
repeat HPV DNA testing in primary cervical cancer screening. In J Natl Cancer Inst 101 (2): 88-
99, 2009.
6. Qinghua Feng, Nancy B. Kiviat. Human Papilloma Virus. In Manual of Clinical Microbiology, 8th
362
18
Edition, 2003, 1512-1534.

7. Tom Cox, Jack Cuzick. HPV DNA Testing în Cervical Cancer Screening. From Evidence to
Policies. In Gynecologic Oncology 103 (2006), 8-11.
8. www.materno-fetala.ro. Papiloma Virusul Uman.
18.3.14 HPV (Papiloma Virus Uman) ADN - genotipare

Infecţia HPV este implicată în marea majoritate a cazurilor de cancer cervical3. Pe baza potenţialului
oncogen tipurile genitale de HPV sunt împărţite în tipuri cu risc scăzut şi tipuri cu risc crescut.
Tipurile HPV cu risc scăzut sunt asociate în mod caracteristic cu verucile (condiloamele) genitale, în
timp ce tipurile cu risc crescut sunt responsabile de apariţia cancerului invaziv.
În cadrul tipurilor oncogene de HPV tipul 16 determină peste 50% din cazurile de cancer cervical, iar
tipul 18 este implicat în 10-20% din cazuri6.
Într-un studiu la care au participat peste 20 000 de femei incidenţa cumulată (pe o perioadă de 10
ani) a leziunilor intraepiteliale de tip CIN3 şi a cancerului cervical a fost de 17% şi, respectiv, 14% la
persoanele infectate cu tipurile HPV 16 şi 18 la înrolarea în studiu. Comparativ, s-a obţinut o incidenţă
de 3% pentru celelalte tipuri HPV oncogene. Luând în considerare doar persoanele ≥ 30 ani având
citologie cervicală negativă incidenţele cumulate pentru tipurile HPV 18, HPV 16 şi alte tipuri HPV
oncogene au fost de de 21%, 18% şi, respectiv, 2%3.
Pe baza acestor date şi a altor rezultate similare ghidul ASCCP (American Society for Colposcopy
and Cervical Pathology) din 2006 recomandă utilizarea unui test de genotipare HPV pentru tipurile
16 şi 18 la pacientele ≥ 30 ani cu citologie negativă şi ADN-HPV detecţie tipuri cu risc crescut pozitiv.
Scopul acestui test este de a tria pacientele pozitive pentru HPV 16 sau 18 care trebuie trimise imediat
la colposcopie de cele negative, la care se recomandă repetarea citologiei şi ADN-HPV detecţie tipuri
oncogene peste 12 luni. Testul a primit aprobarea FDA în martie 2009. Deşi ASCCP nu recomandă
genotiparea HPV la pacientele cu citologie ASC-US (“celule scuamoase anormale de semnificaţie
nedeterminată”), FDA a aprobat ca testul HPV 16/18 să fie folosit ca adjuvant în managementul
acestor paciente2.
În iunie 2006 FDA (Food and Drug Administration) a aprobat în SUA utilizarea vaccinului Gardasil
produs de compania Merck & Co. Inc. pentru profilaxia infecţiilor induse de anumite tipuri de HPV.
Gardasil este un vaccin recombinat tetravalent ce acţionează împotriva tipurilor HPV 6, 11, 16 şi 18 şi
este indicat pacientelor tinere (9-26 ani).Tipurile 16 şi 18 sunt responsabile de producerea a 70% din
cazurile de cancer cervical asociate cu HPV, în timp ce tipurile 6 şi 11 sunt implicate în etiologia a 90%
din cazurile de leziuni anogenitale benigne (condiloame). Având în vedere compoziţia sa, vaccinul
nu poate preveni cazurile de cancer cervical induse de alte tipuri de HPV, astfel că va fi necesară
continuarea programelor de screening1.
Pe măsură ce vaccinul va începe să fie utilizat pe o scară largă, testarea ADN HPV va dobândi o
363
importanţă şi mai mare în monitorizarea infecţiilor, mai ales dacă va fi asociată cu genotiparea HPV4.
Testul efectuat în laboratorul Synevo utilizează amplificarea ADN-ului ţintă prin tehnica PCR şi
hibridizarea acizilor nucleici, pentru detectarea calitativă individuală (genotipare) a 37 tipuri anogenitale
de HPV: 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67,
68, 69, 70, 71, 72, 73(MM9), 81, 82(MM4), 83(MM7), 84(MM8), IS39 si CP6108, în celule cervicale
colectate în mediu lichid4.
Indicaţiile efectuării testului de genotipare sunt următoarele:
- monitorizarea evoluţiei infecţiei determinate de un anumit tip HPV;
- monitorizarea persistenţei genotipurilor asociate cu risc crescut de cancer cervical, în
special la pacientele cu citologie negativă5;
- femei ≥ 30 ani cu citologie negativă şi ADN-HPV detecţie tipuri cu risc crescut pozitiv;
- femei cu citologie ASC-US şi ADN-HPV detecţie tipuri cu risc crescut pozitiv2;
- monitorizarea eficienţei tratamentului în cazul leziunilor cervicale asociate cu HPV (conizaţie,
radioterapie sau chimioterapie);
- genotiparea pre- şi postvaccinală în programe selecţionate de screening;
- facilitarea investigaţiilor epidemiologice referitoare la evoluţia naturală a infecţiilor HPV4.
Pregătire paciente - vezi recomandările de la testul ADN HPV - detecţie tipuri oncogene.
periuţei cervicale Cervex-Brush4.
Stabilitate probă - celulele cervicale colectate în mediul PreservCyt sunt stabile 21 zile la temperatura
camerei şi 8 săptămâni la 2-8ºC2
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) cu detecţie colorimetrică; genotiparea este efectuată
cu ajutorul unui strip ce conţine sondele specifice într-o dispoziţie lineară4.
Valori de referinţă - ADN HPV nedetectabil; limita de detecţie a metodei de lucru este de 120, 815,
1920 şi 251 copii/mL pentru genotipurile 16, 18, 31 şi 45.
Un rezultat pozitiv include comunicarea genotipurilor HPV prezente în probă4.
Acest test a fost validat numai pentru utilizarea celulelor cervicale colectate în mediu lichid; folosirea
altor tipuri de probe poate conduce la rezultate neconcludente.
Detectarea ADN HPV este dependentă de cantitatea de genom viral prezent în probă, care poate fi
influenţată de modul de recoltare, vârsta pacientei şi stadiul infecţiei.
Probele care conţin sânge intr-un procent mai mare de 3.5% pot inhiba reacţia PCR şi conduce la
rezultate fals negative. Prezenţa mucusului cervical nu interferă cu testul4.
Bibliografie
1. Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, Biological
License Application Approvals.
2. HPV Genotyping Clinical Update. www. Asccp.org/consensus.shtmal, July 2009. Reference
3. Khan MJ, castle PE, Lorincz AT, et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and
cancer in women with human papilloma virus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-
364
18
specific HPV testing in clinical practice. In J Natl Cancer Inst. 2005;97:1072-1079.

5. Tom Cox, Jack Cuzick. HPV DNA Testing in Cervical Cancer Screening. From Evidence to
Policies. In Gynecologic Oncology 103 (2006), 8-11.
6. Wheeler CM. Natural history of human papilloma virus infections, cytologic, and histologic
abnormalities, and cancer. In Obstet Gynecol Clin N Am. 2008; 35:519-536.
18.3.15 HPV (Papiloma Virus Uman) E6/E7 ARNm

Cancerul de col uterin se dezvoltă ca urmare a unei infecţii persistente, necontrolate de către sistemul
imun al gazdei, cu un tip HPV (papiloma virus uman) oncogen, în special tipurile 16 şi 18 care sunt
responsabile de > 70% din cazuri.
Proteinele E6 şi E7 produse de tipurile HPV cu risc crescut deţin un rol esenţial în carcinogeneză fiind
exprimate atât în leziunile cervicale pre-maligne cât şi în cele avansate. Genele E6 şi E7 se află sub
controlul proteinei codificată de gena E2. Un eveniment crucial pentru transformarea malignă este
integrarea ADN circular HPV în genomul gazdei. Integrarea se produce adesea la nivelul genei E2
care este astfel inactivată; ca urmare a acestui proces rezultă o expresie necontrolată a genelor E6
şi E7.
Oncoproteinele E6 şi E7 perturbă ciclul celular prin legarea şi inactivarea a două proteine ale gazdei
cu rol important în reglarea diviziunii celulare normale: proteina supresoare tumorală p53 şi proteina
retinoblastomului pRb. Astfel, legarea proteinei E6 de p53 induce degradarea rapidă a acestei proteine
supresoare tumorale printr-un proces dependent de ubiquitină4. De asemenea interacţionează cu
proteina pro-apoptotică Bax şi determină rezistenţă la apoptoză alături de o instabilitate cromozomială
crescută. În plus, oncoproteina E6 activează telomeraza şi are drept rezultat imortalizarea celulelor
infectate. E7 are drept ţintă un alt supresor tumoral –pRb – pe care îl inactivează prin alterarea stării
de fosforilare. În mod normal, pRb se leagă de factorul de transcripţie E2F, care are rol în progresia
ciclului celular din faza G1 în faza S în urma interacţiunii cu cicline şi cu kinaze dependente de cicline.
În prezenţa E7 rezultă un complex E7-pRb inactiv care perturbă ataşarea E2F la pRb şi permite ca
E2F să se lege de ADN şi să inducă creşterea şi proliferarea celulară.
Proteinele E6 şi E7 ale diferitelor tipuri HPV exercită un efect variabil în cursul procesului de
transformare malignă: cele provenite de la HPV 16 şi HPV 18 au un potenţial oncogen ridicat, pe când
cele produse de HPV 6 şi HPV 11 sunt incapabile să lege şi să inactiveze p53 şi pRb.
Integrarea materialului genetic viral în genomul gazdei este însoţită de alterarea morfologiei epiteliului
scuamos cervical, de la leziuni intraepiteliale cu risc scăzut la cele cu risc crescut, caracterizate prin
atipii citologice şi indice mitotic anormal. Integrarea genomului viral se produce în cromozomi diferiţi,
365
însă, de regulă, în regiunile care conţin gene importante pentru viabilitatea celulară. Nu este necesară
integrarea întregului genom viral, dar cea a genelor E6 şi E7 este critică pentru carcinogeneză.
Celulele care conţin genom viral integrat prezintă un avantaj de creştere faţă de celulele normale,
ceea ce conduce la proliferare celulară şi pierderea proprietăţii de diferenţiere. De asemenea,
integrarea întrerupe ciclul de viaţă al virusului astfel că nu se mai produc virioni compleţi (infecţie
neproductivă). Deşi integrarea reprezintă sfârşitul biologic al virusului, aceasta facilitează expresia
perpetuă a oncogenelor virale.
De obicei, în cazul leziunilor intraepiteliale cu risc scăzut (LSIL) nu se constată integrarea ADN-
ului HPV, spre deosebire de HSIL în care materialul genetic viral este frecvent integrat în genomul
gazdei. Integrarea conferă infecţiei HPV un caracter ireversibil. În absenţa tratamentului, un număr
semnificativ de HSIL evoluează către cancer cervical, deşi acest proces poate să dureze ani de zile
sau chiar decade.
Într-un procent de până la 25% din cazurile de cancer cervical induse de HPV 16 se constată prezenţa
unui ADN viral extracromozomial (epizomal) neintegrat, în timp ce carcinoamele asociate cu HPV
18, 31 şi 35 conţin aproape întotdeauna ADN-HPV integrat. În cancerele cu HPV epizomal s-a
demonstrat existenţa unor mutaţii YY1; elementele YY1 constituie situsurile de reglare pentru factorul
de transcripţie YY1 care controlează activitatea unui număr mare de gene. Mutaţiile YY1 împiedică
legarea factorului de transcripţie şi facilitează expresia oncogenelor E6/E7 cu accelerarea ciclului
celular şi proliferare celulară anormală5.
Deoarece HPV nu poate fi cultivat s-au dezvoltat teste care se bazează pe detecţia acizilor nucleici
virali în ţesuturile infectate. Majoritatea testelor depistează ADN-ul viral prin diverse tehnici de
amplificare confirmând astfel prezenţa infecţiei la nivelul celulelor cervicale. Cu toate acestea, testele
bazate pe ADN (cum ar fi testul de detecţie a tipurilor cu risc crescut sau cel de genotipare HPV)
prezintă o limitare importantă prin faptul că majoritatea infecţiilor HPV au un caracter tranzitoriu iar
valoarea predictivă pozitivă a unui rezultat ADN-HPV pentru dezvoltarea leziunilor cervicale cu risc
crescut este destul de scăzută. Pentru a pune în evidenţă activitatea oncogenă HPV au apărut teste
care se bazează pe detectarea ARN-ului mesager pentru proteinele E6/E7 din 5 tipuri HPV cu risc
crescut (16, 18, 31, 33, 45). ARNm E6/E7 traduce activitatea virală directă şi corespunde iniţierii şi
menţinerii leziunilor pre-canceroase; astfel testele bazate pe ARN au valoare predictivă superioară
testelor ADN în ceea ce priveşte riscul pentru dezvoltarea cancerului cervical.
S-a constatat că nivelurile ARNm E6/E7 înregistrează creşteri proporţionale cu severitatea leziunilor,
astfel că detecţia produsului de transcripţie ar avea o valoare prognostică mai mare şi ar putea
îmbunătăţi specificitatea şi valoarea predictivă pozitivă a ADN-HPV în screening.
Într-un studiu norvegian 3% din femeile peste 30 ani testate au fost pozitive pentru ARNm E6/
E7 iar pentru persoanele cu citologie normală sau modificările de tip LSIL s-au obţinut mult mai
puţine rezultate pozitive la testul pentru ARNm decât la detecţia HPV-ADN tipuri oncogene. Valoarea
prognostică a acestui test a fost evaluată de asemenea într-un studiu de urmărire, pe o perioadă de 2
ani, a 77 paciente cu citologie ASC-US (“celule scuamoase anormale de semnificaţie nedeterminată”)
sau LSIL; femeile care au obţinut rezultate pozitive la testul ARNm au avut o probabilitate de 70 ori
mai mare de a fi diagnosticate cu neoplazie cervicală intraepitelială CIN 2+confirmată histologic decât
femeile cu rezultate negative. Mai mult, testul ARNm a prezentat o sensibilitate clinică pentru CIN 2+
366
18
similară cu cea a testelor PCR de detecţie ADN-HPV dar o specificitate clinică mai mare, ceea ce
sugerează că testele bazate pe ARNm ar putea îmbunătăţi triajul pacientelor cu citologie echivocă
sau cu risc scăzut.
Într-un studiu care a inclus femei sub 30 ani, rata de pozitivitate pentru ARNm E6/E7 a fost de 14.5%
în comparaţie cu cea de 32.5% şi 20.8% pentru ADN-detecţie tipuri oncogene şi respectiv genotipare
HPV. Obţinerea unui număr mai mic de rezultate pozitive la testul ARNm se traduce practic într-un
număr mai redus de paciente care trebuie urmărite; totuşi nu au putut fi formulate concluzii în legătură
cu specificitatea clinică a testului la această grupă de vârstă datorită lipsei datelor histologice. Totuşi,
testul ARNm ar putea prezenta valoare în cazul femeilor sub 30 ani, mai ales că la aceste persoane
nu se recomandă testarea ADN-HPV datorită prevalenţei foarte mari a infecţiilor tranzitorii.
Tot într-un studiu norvegian ARNm E6/E7 a fost pozitiv în 89% din carcinoamele scuamoase ale
colului şi în 77% din leziunile cu risc crescut (CIN 2/3). CIN 2+ a fost detectat la 83% din femeile cu
citologie normală şi ARNm pozitiv. Nu a fost calculată valoarea predictivă a testului în acest studiu,
însă se pare că specificitatea clinică a ARNm este mai bună faţă de cea a ADN-HPV. S-a raportat
că un singur rezultat ARNm pozitiv are valoare predictivă mai bună pentru infecţia persistentă decât
testul ADN1.
Ca o concluzie, detecţia calitativă a produsului de transcripţie E6-E7 pentru 5 tipuri HPV cu risc
crescut poate să evalueze specific riscul de progresie şi de transformare malignă în special la femeile
cu citologie ASC-US sau LSIL, precum şi la cele cu citologie normală şi ADN-HPV pozitiv. 60-80% din
numeroasele infecţii HPV sunt tranzitorii, fiind eliminate spontan, în medie, în decurs de 1 an, ceea
ce face ca testul ARNm să fie mai specific decât detecţia ADN-ului viral. Scopul este deci depistarea
infecţiilor active şi potenţial persistente2.
Pregătire paciente - se va evita recoltarea probei în perioada menstruală.
De asemenea, 48 ore înainte de prelevarea probei, pacientele vor evita:
- raporturile sexuale;
- efectuarea duşurilor vaginale;
- folosirea tampoanelor intravaginale, contraceptivelor locale, a diverselor geluri, creme şi
tratamente vaginale3.
periuţei cervicale Cervex-Brush3.
Stabilitate probă – probele de celule cervicale colectate în mediul PreservCyt sunt stabile cel puţin
1 săptămână la 2-8ºC3.
Metodă – NASBA (amplificare bazată pe secvenţe de acizi nucleici). Testul identifică producţia
oncoproteinelor E6 şi E7 (factor primar în carcinogeneză) şi nu virionii HPV; de asemenea specifică
genotipul HPV asociat produsului de transcripţie identificat3.
Valori de referinţă – HPV E6/E7 ARNm nedetectabil3.
Limita de detecţie pentru cele 5 tipuri HPV variază între 2.3×102 şi 3.0×104 copii/mL3.
Un rezultat pozitiv pentru HPV E6/E7 ARNm are un alt impact clinic decât cel pentru HPV-ADN în
sensul că indică un potenţial crescut de transformare malignă a epiteliului scuamos cervical3.
367
Bibliografie
1. Agnes Kathrine Lie, MD, PhD. Human papillomavirus E6/E7 mRNA testing as a predictive
marker for cervical carcinoma. In Expert Rev Mol Diagn. 2008; 8(4):405-415.
2. Joseph Monsonego. Traité des infections et pathologies génitales à papillomavirus. Springer-
Verlach France, Paris, 2007, 57-58.
3. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
4. Mike F. Janicek, MD and Hervy E. Averette, MD. Cervical Cancer: Prevention, Diagnosis, and
Therapeutics. In CA Cancer J Clin 2001; 51:92.
5. Richard Mac DeMay. Human Papilloma Virus. In The Pap Test, ASCP Press, 2005, 83-85.
18.3.16 Identificarea germenilor asociaţi parodontitei

(teste micro-IDent A, micro-IDent B)

Parodontita sau boala parodontală reprezintă inflamaţia ţesuturilor de susţinere a dinţilor
(parodonţiului) şi este o leziune ireversibilă, care în timp duce la pierderea dinţilor de pe arcadele
dentare. Parodontita constituie faza evolutivă şi/sau complicaţia gingivitei.
Clasificarea parodontitei a cunoscut multe modificări în ultimii ani. În momentul de faţă, specialiştii
în domeniu recunosc ca entităţi distincte: parodontita cronică generalizată vs. localizată, parodontita
agresivă generalizată vs. localizată, parodontita asociată cu boli sistemice, parodontita asociată cu
leziuni endodontice şi parodontita ulcero-necrotică. Dintre acestea, parodontita cronică este cea mai
frecvent întâlnită în populaţia adultă1;4.
Alături de predispoziţia genetică individuală a pacientului, care are o influenţă majoră asupra severităţii
tabloului clinic, există germeni asociaţi parodontitei care generează procesul inflamator. Creşterea
acestor agenţi patogeni anaerobi sau facultativ aerobi este favorizată de anaerobioza din spaţiul
parodontal6.
În placa subgingivală au fost identificate peste 500 specii bacteriene care constituie o nişă ecologică
complexă. Sub influenţa unor factori locali sau sistemici unele bacterii din biofilmul dentar subgingival
devin agenţii etiologici primari ai bolii parodontale. Aceste infecţii polimicrobiene implică în majoritatea
cazurilor patogeni parodontali Gram-negativi anaerobi care acţionează sinergic. Cele mai frecvent
implicate bacterii sunt: Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Bacteroides forsythus (Tannerella forsythensis), Treponema denticola, Peptostreptococcus
micros, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Campylobacter rectus, Eubacterium
nodatum, Capnocytophaga spp. Eşecul eliminării acestor bacterii este asociat cu progresia bolii şi un
368
18
răspuns slab la tratament1;6. Astfel, agenţii patogeni parodontali produc numeroşi factori de virulenţă
care facilitează colonizarea zonelor subgingivale şi rezistenţa la mecanismele de apărare ale gazdei
conducând în final la distrugerea ţesuturilor de susţinere a dinţilor. Deşi A. actinomycetemcomitans
se asociază cu parodontită agresivă localizată, P. gingivalis este considerat agentul etiologic major
al parodontitei cronice. Studii recente au demonstrat prezenţa unor asocieri specifice între bacteriile
patogene parodontale implicate în debutul şi progresia bolii. Spre exemplu, a fost raportată o asociere
între Bacteroides forsythus şi C. rectus în cazurile de parodontită agresivă. De asemenea, Sokranski şi
colaboratorii au arătat că asocierea dintre P. gingivalis, T. denticola şi B. forsythus (aşa-zisul „complex
roşu”) este implicată puternic în fazele active destructive ale parodontitei cronice4.
În majoritatea cazurilor, bacteriile menţionate se transmit prin intermediul salivei la membrii unei familii.
Răspândirea intrafamilială a A. actinomycetemcomitans şi P. gingivalis ar putea să justifice aplicarea
tratamentului întregii familii, în scopul prevenirii reinfectării cu patogenii parodontali2.
Deşi prezenţa agenţilor patogeni este esenţială pentru debutul parodontitei, aceste organisme nu sunt
suficiente pentru a determina progresia bolii. Răspunsul imun al gazdei este implicat în modularea
evoluţiei către destrucţie tisulară sau vindecare. Producţia excesivă a unor mediatori ca interleukina-
1-β, factorul de necroză tumorală şi prostaglandinele generează un proces inflamator persistent care
stă la originea destrucţiei tisulare4.
Îndepărtarea mecanică a biofilmului dentar şi eliminarea factorilor iritanţi locali constituie baza
terapiilor parodontale iniţiale. Totuşi, acest protocol terapeutic are limitele sale. Nu toţi pacienţii sau
toate regiunile dentare răspund favorabil şi uniform la terapia mecanică convenţională. Eficacitatea
redusă a terapiei poate fi explicată de o serie de factori (locali sau generali) care ţin de gazdă, forma
de boală şi compoziţia biofilmului. De asemenea, agenţii patogeni nu sunt localizaţi numai în placa
dentară ci şi pe faţa dorsală a limbii sau alte zone ale mucoasei bucale. Pentru a preveni reinfecţia
regiunilor tratate terapia trebuie să afecteze toţi patogenii din cavitatea buco-faringiană2.
Având în vedere natura infecţioasă a parodontitei şi a limitelor terapiei mecanice folosirea antibioticelor
este justificată în anumite forme de boală1;2;4.
Antibioticele pot fi administrate local sau sistemic. Deşi prin tratamentul local se elimină riscul reacţiilor
adverse sistemice există dezavantajul că rezervoarele de patogeni nu sunt complet eliminate şi se poate
produce recolonizarea zonelor tratate. Antibioticele administrate sistemic penetrează la nivelul pungii
parodontale şi atacă bacteriile care nu sunt afectate de tratamentul mecanic şi de antibioticoterapia
locală. În plus, acestea pot suprima şi organismele patogene localizate la nivelul limbii şi în alte zone
ale cavităţii bucale, asigurând eradicarea infecţiilor şi prevenirea recurenţelor.
Decizia de a opta pentru un tratament antibiotic local sau sistemic va fi luată de către medicul
stomatolog după evaluarea corectă a beneficiilor (tratarea pacienţilor cu parodontită refractară la
tratamentul convenţional) vs. reacţii adverse (riscul de dezvoltare a unor specii bacteriene rezistente
sau de infecţii fungice)4.
Conform Academiei Americane de Parodontologie tratamentul cu antibiotice pe cale sistemică prezintă
următoarele indicaţii:
- parodontite refractare, rezistente la tratamentul mecanic convenţional;
- parodontite acute cu evoluţie accelerată (către forme necrotice şi abcese parodontale)
- parodontite agresive.
369
De asemenea, pacienţii fumători pot beneficia de antibioticoterapie sistemică în asociere cu tratamentul

mecanic. Mai mult, parodontita cauzată de Actinobacillus actinomycetemcomitans necesită adesea
tratament antibiotic deoarece bacteria este răspândită pe toate suprafeţele membranei mucoase a
cavităţii bucale şi poate invada ţesuturile moi4;6.
O altă indicaţie de tratament antibiotic sunt infecţiile periimplant6.
Pentru aplicarea unei antibioticoterapii ţintite şi evitarea prescrierii unor medicamente ineficiente
anumite categorii de pacienţi pot beneficia de teste pentru identificarea bacteriilor patogene2.
Testele micro-IDent efectuate în laboratorul nostru au la bază tehnica polimerizării în lanţ (PCR) şi
prezintă o specificitate înaltă pentru identificarea bacteriilor parodontopatogene şi stabilirea cantităţii
lor relative. Testele sunt de asemenea mai sensibile decât cultura bacteriană deoarece identifică
germenii după ADN, indiferent de viabilitatea acestora (bacteriile anaerobe rezistă adesea foarte
puţin în cursul transportului către laborator şi culturile pot da rezultate fals negative pentru patogenii
parodontali).
Testul micro-IDent A face posibilă determinarea celor cinci markeri importanţi parodotogeni:
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides
forsythus şi Treponema denticola). În unele cazuri de parodontită spectrul de diagnostic poate
fi lărgit prin determinarea altor 6 germeni: Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum/
periodonticum, Eikenella corrodens, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum şi Capnocytophaga
spp (testul micro-IDent B).
Ca o concluzie, testele micro-IDent sunt utile pentru:
- identificarea zonelor cu risc şi recunoaşterea precoce a recidivelor;
- alegerea antibioticului adecvat şi documentarea succesului terapeutic;
- evaluarea riscului de implant nereuşit înaintea tratamentului.
Mai mult, cunoaşterea situaţiei microbiologice permite o terapie precoce care împiedică apariţia sau
progresia bolii6.
Specimen recoltat - prelevarea probei se face de către medicul stomatolog cu ajutorul beţişoarelor
de hârtie conţinute în trusa de recoltare, obligatoriu înaintea tratamentului mecanic sau cu antibiotice.
Cu ajutorul unei pense sterile se introduce un beţişor în punga parodontală până la baza acesteia
(adâncimea pungii parodontale trebuie să fie de cel puţin 4 mm). Beţişorul va rămâne pe loc timp de
10 secunde, după care va fi retras şi introdus într-un tub de transfer. Se pot recolta maxim 4 probe
din pungi parodontale diferite. Toate beţişoarele provenite de la acelaşi pacient vor fi introduse într-un
singur tub de transfer. Tubul va fi plasat în trusa albastră de recoltare împreună cu o fişă care conţine
datele pacientului.
Transportul către laborator nu ridică probleme, fiind vorba de determinarea ADN3;5;6.
Stabilitate probă – 1 săptămână la 2-8°C3.
Metodă - reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) de tip multiplex cu detecţie colorimetrică3.
Valori de referinţă3;6
Micro-IDent A
370
18
Denumire patogen parodontal Detecţie ADN

Actinobacillus actinomycetemcomitans Negativ
Porphyromonas gingivalis Negativ
Prevotella intermedia Negativ
Bacteroides forsythus Negativ
Treponema denticola Negativ
Micro-IDent B
Denumire patogen parodontal Detecţie ADN

Peptostreptococcus micros Negativ
Fusobacterium nucleatum/periodonticum Negativ
Eikenella corrodens Negativ
Campylobacter rectus Negativ
Eubacterium nodatum Negativ
Capnocytophaga spp (gingivalis, ochracea, Negativ
sputigena)
În cazul detecţiilor ADN pozitive, pentru fiecare bacterie patogenă rezultatul va fi raportat astfel:
“slab pozitiv”, “pozitiv”, “intens pozitiv”. Aceste moduri de comunicare se corelează cu cantitatea de
germeni identificaţi în probă.
Pentru orientarea medicului stomatolog prezentăm mai jos câteva posibile scheme de tratament
antibiotic în funcţie de patogenii identificaţi, recomandate de Societatea Germană de Medicină
Dentară în cazurile de parodontită marginală:
Schemă recomandată de DGZMK (Deutsche Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde)
Nach Flemming & Karch, iunie 1998.
Antibiotic Mod de administrare şi indicaţii Doze administrate
Metronidazol Sistemic Parodontită generalizată cu detecţie 3 x 400 mg/zi 8 zile

pozitivă pentru Pg, Bf, Td, Pi, (Pm***),
Fn şi la care nu s-au depistat Aa,
Ec****, Cs****.
Numai în cazul modificărilor localizate

Local şi a detecţiei pozitive de bacterii
patogene.
371
Clindamicină* Sistemic Parodontită generalizată cu detecţie 4 x 300 mg/zi 7 zile

pozitivă pentru Pg, Bf, Td, Pi, Pm, Fn sau
şi la care nu s-au depistat Aa, Ec****, 2 x 600 mg/zi
Cs****.
Amoxicilină Sistemic Parodontită generalizată cu detecţie 3 x 500 mg/zi 8 zile

pozitivă pentru Aa, Ec****, Cs****.
Amoxicilină + Sistemic Parodontită generalizată cu detecţie 3 x 500 mg/zi 8 zile
Metronidazol** pozitivă pentru Pg, Bf, Td, Pi, Pm, Fn, (Amoxicilină)
Cr, En şi la care nu s-au depistat Aa, 3 x 400 mg/zi
Ec****, Cs****. (Metronidazol)
Ampicilină/ Sistemic Parodontită generalizată cu detecţie 3 x 375 mg/zi 10
Sulbactam pozitivă pentru Pg, Bf, Td, Pi, Pm, Fn, zile
Ec, Cs şi la care nu s-a depistat Aa;
doar în caz de alergii la Metronidazol/
Clindamicină.
Claritromicină Sistemic Numai în cazurile de detecţie pozitivă 2 x 250 mg/zi 7 zile
pentru Cr**** şi/sau En****.
Doxiciclină* Sistemic În cazul detecţiei pozitive de patogeni 1 x 200 mg/zi 20
facultativ anaerobi (mai ales Aa); efectul (in prima zi) zile
este incert în cazul bacteriilor strict 1 x 100 mg/zi
anaerobe (Pg, Bf, Td, Pi, Pm, Fn, En);
se indică doar în cazurile de alergie
la Metronidazol, Clindamicină,
Amoxicilină.
Numai în cazul modificărilor localizate
Local şi a detecţiei pozitive de bacterii
patogene
Completare a schemei (după Jervoe-Storm et al. – ZMK 3/2000).
Antibiotic Indicaţii Doze administrate

Ciprofloxacin* Înlocuieşte amoxicilina în cazurile 2 x 500 mg/zi 10 zile
de alergie la peniciline
Metronidazol + Infecţii mixte cu Aa şi bacterii strict 2 x 500 mg/zi 8 zile
Ciprofloxacin* anaerobe (Pi, Pg, Bf, Td, etc) la 2 x 500 mg/zi
pacienţii alergici la peniciline.
Aa Actinobacillus actinomycetemcomitans Pm Peptostreptococcus micros
372
18
Pg Porphyromonas gingivalis Fn Fusobacterium nucleatum

Bf Bacteroides forsythus Cr Campylobacter rectus
Td Treponema denticola En Eubacterium nodatum
Pi Prevotella intermedia Ec Eikenella corrodens
Cs Capnocytophaga spp.
* Doar în cazurile de alergie la antibiotice alternative

** Asocierea clasică de antibiotice “Cocktail Winkelhoff” (van Winkelhoff et al. 1989, J Clin
Periodontol, Vol.16: 128-131) recomandă 3 x 375 mg/zi Amoxicilină şi 3 x 250 mg/zi
Metronidazol timp de 8 zile. DGZMK recomandă folosirea unor doze mai mari însă pot fi
folosite şi dozele mai mici.
*** În cazul unei detecţii “intens pozitive“ pentru Pm se preferă administrarea de Clindamicină
datorită rezistenţei bacteriene potenţiale.
**** În cazul unor detecţii “intens pozitive“ şi a unor elemente clinice relevante6.
Bibliografie
1. Kenneth S. Kornman, D. D.S., Ph.D. Diagnostic and Prognostic Tests for Oral Diseases:
Practical Applications. In Journal of Dental Education, May 2005, vol.69, no.5, 498-/508.
2. Jorgen Slots, Michael G. Jorgensen. Efficient Antimicrobial Treatment in Periodontal
Maintenance Care. In J Am Dent Assoc, 2000, vol 131, No.9, 1293-1304.
4. Philippe Bidault, Fatiha Chandad, Daniel Grenier. Szstemic Antibiotic Therapy in the Treatment
of Periodontitis. In Journal of the Canadian Dental Association (JCDA), July/August 2007, vol.73,
No.6, 515-519.
5. www.hain-diagnostics.com. Products - microIDent.
6. www.zahnarzt/diagnostic.de. Nachweiss von parodontitis-assoziierten Keimen.
18.3.17 Mycobacterium tuberculosis complex - ADN
Genul Mycobacterium face parte din familia Mycobacteriaceae. Bacteriile din acest gen sunt bacili
necapsulaţi, nesporulaţi, obligatoriu aerobi, imobili, acid-alcoolo-rezistenţi (se pun în evidenţă prin
coloraţia Ziehl-Neelsen), cu creştere lentă (mediul Lowenstein-Jensen).
Organizaţia Mondială a Sănătăţii estimează că în fiecare an Mycobacterium tuberculosis este
responsabil de aproape 2 milioane decese şi 9 milioane cazuri nou diagnosticate de tuberculoză la
373
nivel mondial.
Omul este singurul rezervor pentru M. tuberculosis, sursa de infecţie fiind reprezentată de bolnavii
care elimină bacilii pe cale respiratorie (excretori pulmonari), renală (excretori renali) sau prin
abcedare ganglionară (excretori ganglionari). Există şi excretori cutanaţi, cum este cazul bolnavilor
de tuberculoză osoasă.
Forma clinică cea mai frecventă este tuberculoza pulmonară, însă această afecţiune poate avea
multe alte localizări extrapulmonare (în ~10% din cazuri): osteoarticulară, ganglionară, genitourinară,
intestinală, meningiană6;9.
Tuberculoza pulmonară
Testele de laborator convenţionale utilizate în depistarea infecţiei sunt examenul microscopic pentru
evidenţierea bacililor acid-alcoolo-rezistenţi (coloraţia Ziehl-Neelsen, coloraţii fluorescente) şi cultura
mycobacteriilor (metoda standad de diagnostic). Deşi rapid şi puţin costisitor examenul microscopic
are o valoare limitată datorită sensibilităţii sale reduse (50-70%) şi valorii predictive pozitive scăzute în
regiunile în care izolarea mycobacteriilor non-tuberculoase este frecventă (50-80%). Cultura stabileşte
definitiv diagnosticul de tuberculoză, însă datorită ratei lente de creştere a mycobacteriilor rezultatele
sunt disponibile în medie după 4-6 săptămâni. Ca urmare a dezvoltării tehnicilor de amplificare a acizilor
nucleici (PCR) şi introducerii acestora în practica medicală curentă s-a îmbunătăţit management-
ul pacienţilor suspectaţi de tuberculoză: iniţierea precoce a tratamentului, ameliorarea stării clinice,
crearea unor posibilităţi mai mari de stopare a transmiterii infecţiei şi a unor intervenţii de sănătate
publică mai eficiente. În SUA, CDC (Center for Disease Control and Prevention) a elaborat recent un
ghid de utilizare a testelor de amplificare a acizilor nucleici în diagnosticul tuberculozei pulmonare.
Astfel CDC recomandă ca testul PCR să fie efectuat cel puţin într-o probă de secreţie respiratorie la
toţi pacienţi cu semne şi simptome de tuberculoză pulmonară (tuse care persistă de >3 săptămâni fără
o cauză evidentă, leziuni radiologice compatibile cu TBC), la cei suspectaţi de TBC dar fără diagnostic
confirmat sau în situaţiile în care rezultatul testului ar putea modifica management-ul cazului sau
activităţile de supraveghere a contacţilor3.
Testul PCR se bazează pe amplificarea unei secvenţe unice a genei katG prezente la membri
complexului Mycobacterium tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti. Este posibilă astfel detectarea rapidă a ADN-ului
complexului Mycobacterium tuberculosis în decurs de 24-48 ore de la sosirea probelor în laboratorul
la care se face testarea5;6. În comparaţie cu examenul microscopic valoarea adăugată a testului PCR
constă în următoarele:
- valoare predictivă pozitivă mare (>95%) la pacienţii cu examen microscopic pozitiv care
provin din regiuni în care izolarea mycobacteriilor non-tuberculoase este frecventă;
- confirmă rapid prezenţa Mycobacterium tuberculosis la 50-80% dintre pacienţii cu examen
microscopic negativ şi culturi pozitive.
În comparaţie cu izolarea în cultură testele PCR pot detecta prezenţa Mycobacterium tuberculosis
cu câteva săptămâni mai devreme la 70-90% dintre pacienţii suspectaţi de tuberculoză, al căror
diagnostic este confirmat ulterior prin cultură.
Astfel beneficiile testelor PCR sunt evidente: evitarea unui tratament tuberculostatic nenecesar la
pacienţii cu examen microscopic pozitiv şi test PCR negativ, evitarea investigării şi izolării inutile
374
18
a contacţilor aceleiaşi categorii de pacienţi, reducerea folosirii inadecvate a fluorochinolonelor

ca tratament empiric al pneumoniilor (practică ce a fost incriminată în dezvoltarea rezistenţei la
fluorochinolone a M. tuberculosis) şi a întârzierii iniţierii tratamentului tuberculostatic la pacienţii cu
test PCR pozitiv3.
Tuberculoza genito-urinară se manifestă ca o infecţie repetată a tractului urinar, care nu răspunde
la antibioticele obişnuite. Simptomele sunt în general intermitente şi nespecifice, cele mai frecvente
manifestări fiind: poliuria (iniţial în timpul zilei, ulterior noaptea), disuria, durerea suprapubiană,
hematuria, piuria şi febra.
Criteriul de diagnostic pentru tuberculoza genito-urinară este izolarea Mycobacterium tuberculosis
din urină. Acest lucru nu este uşor de realizat, deoarece descărcarea bacililor în urină este sporadică
şi, mai important, numărul bacteriilor urinare este mic. Cultura este cea mai sensibilă metodă, dar
durează 6-8 săptămâni, din cauza ratei lente de creştere a mycobacteriilor. De aceea tehnica cea mai
folosită în situaţiile paucibacilare este PCR-ul, prezenţa unui număr extrem de mic de bacterii putând
fi astfel detectată în termen de 24-48 ore. Sensibilitatea ridicată a PCR face din această metodă una
precisă pentru detectarea ADN-ului bacteriilor din complexul Mycobacterium tuberculosis în probele
de urină8.
Meningita tuberculoasă este dificil de diagnosticat; simptomatologia neurologică se instalează
insidios, pe fondul impregnaţiei bacilare. Debutul este prelungit, cu febră sau subfebrilităţi, vărsături,
fotofobie, cefalee şi ameţeli. În perioada de stare la sindromul de iritaţie meningeană, care poate fi
incomplet sau slab exprimat, se adaugă semne de afectare a nervilor oculomotori (ptoză palpebrală,
strabism etc.).
La persoanele imunocompetente Mycobacterium tuberculosis determină o formă acută sau subacută
de boală caracterizată prin febră, cefalee, somnolenţă, meningism şi confuzie ce durează aproximativ
2-3 săptămâni.
Diagnosticul de meningită tuberculoasă se stabileşte în urma evidenţierii bacilului la nivelul lichidului
cefalorahidian. Un diagnostic rapid şi fiabil în cazul acestei afecţiuni poate fi dat de utilizarea PCR-ului,
deşi rezultate fals negative ar putea să apară în probele care conţin foarte puţine microorganisme6;9.
Pleurezia TBC apare la aproximativ 30% dintre pacienţii cu tuberculoză. Afectarea pleurală poate fi
primară, secundară tuberculozei pulmonare sau produsă prin reactivarea infecţiei în contextul unei
imunosupresii. Bacilii TB sunt rareori vizualizaţi pe preparatele colorate Ziehl-Neelsen sau izolaţi
în cultură, deoarece revărsatul pleural în tuberculoză se dezvoltă ca urmare a unor mecanisme
imunologice (reacţie de hipersensibilitate de tip întârziat faţă de proteinele de Mycobacterium).
Determinarea adenozin deaminazei (ADA) în lichidul pleural prezintă de asemenea o sensibilitate şi o
specificitate redusă. Într-un studiu publicat în 2001 s-a constatat că testul PCR din lichidul pleural are
o sensibilitate şi specificitate de 70% şi, respective, 100%1;9.
Tuberculoza peritoneală este o manifestare neobişnuită a infecţiei extrapulmonare cu Mycobacterium
tuberculosis. Prezintă un risc crescut pacienţii cu ciroză, infecţie HIV, diabet zaharat, neoplazii,
tratament cu agenţi biologici (anti-TNF alfa), precum şi cei cu dializă peritoneală ambulatorie continuă
(CAPD). Infecţia se produce cel mai frecvent ca urmare a reactivării unor focare tuberculoase latente
din peritoneu rezultate ca urmare a diseminării hematogene de la un focar pulmonar primar. Mai
rar, mycobacteriile pătrund în cavitatea peritoneală transmural în cazul infecţiei intestinului subţire
375
sau contiguu în cazul salpingitei TBC. Peste 90% dintre pacienţii cu peritonită TBC prezintă ascită
în momentul stabilirii diagnosticului (mecanismul de producere a ascitei este similar celui implicat
în carcinomatoza pleurală); un număr redus asociază o formă fibroadezivă “uscată”. Deoarece
mortalitatea este mare în cazul peritonitei TBC testele moleculare pot stabili rapid diagnosticul4;9.
Pericardita TBC reprezintă cea mai frecventă cauză de pericardită în Africa şi în alte ţări în care
tuberculoza este o problemă majoră de sănătate şi în care de asemenea prevalenţa infecţiei HIV
este mare. În ţările dezvoltate incidenţa pericarditei tuberculoase este mult mai mică (doar 4% din
totalul pericarditelor). Afectarea pericardică se produce de obicei prin diseminarea limfatică retrogradă
de la ganglionii limfatici peritraheali, peribronşici sau mediastinali sau prin diseminare hematogenă
de la un focar primar. Rareori este implicată o diseminare contiguă de la o leziune pulmonară.
Răspunsul imun faţă de bacilii acid-alcoolo-rezistenţi viabili care pătrund la nivelul pericardului
este responsabil de morbiditatea asociată cu pericardita TBC. Antigenele proteice bacilare induc
o reacţie de hipersensibilitate de tip întârziat caracterizată prin eliberarea de limfokine de către
limfocitele stimulate, care activează macrofagele şi influenţează formarea de granuloame. Se descriu
4 stadii în evoluţia pericarditei tuberculoase: exsudativ-fibrinos cu formarea granulomului precoce;
de efuziune serosanguină; de resorbţie a efuziunii cu organizarea cazeificării granulomatoase şi
îngroşarea pericardului cauzată de fibrină, colagenoză şi în final de fibroză; de cicatrizare care are
drept consecinţă finală dezvoltarea pericarditei constrictive. Din punct de vedere clinic pericardita
TBC se poate prezenta sub 3 forme: revărsat pericardic ce se poate complica în 10% din cazuri cu
tamponadă pericardică, pericardită constrictivă şi o combinaţie de revărsat lichidian cu constricţie.
Determinarea ADN-ului pentru complexul Mycobacterium tuberculosis în lichidul pericardic constituie
o metodă rapidă de stabilire a diagnosticului şi de iniţiere precoce a terapiei tuberculostatice2.
Tuberculoza osteoarticulară este responsabilă de aproximativ 10% din cazurile de tuberculoză
extrapulmonară. Cele mai frecvente localizări ale infecţiei sunt: vertebrele (50%), articulaţia şoldului
(15%) şi cea a genunchiului (15%). Distrucţiile şi deformările osoase constituie un semn tardiv de
tuberculoză. Analiza prin tehnica PCR a lichidului sinovial constituie o metodă rapidă de diagnostic al
artritei genunchiului7.
Recomandări pentru determinarea Mycobacterium tuberculosis - ADN
1. Detectarea rapidă a complexului Mycobacterium tuberculosis ADN în diverse produse
patologice.
2. Diagnosticul tuberculozei în asociere cu izolarea M. tuberculosis în cultură6.
Specimen recoltat – a) probe recoltate din tractul respirator: spută, lichid obţinut prin spălătură
bronşică sau lavaj bronho-alveolar; b) o probă de urină spontană; c) lichid cefalorahidian recoltat prin
puncţie lombară; d) lichid de puncţie (pleural, pericardic, ascită, sinovial)5.
Recipient de recoltare - eprubetă pentru urină; recipient steril pentru restul probelor5.
Cantitate recoltată – a) 3 mL; b) 5 mL; c) şi d) minimum 2 mL5.
Metodă - Real-time PCR TaqMan: reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului
PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (test calitativ)5.
376
18
Valori de referinţă - Mycobacterium tuberculosis complex - ADN nedetectabil5.

Un rezultat pozitiv indică prezenţa ADN-ului Mycobacterium tuberculosis în proba testată5;6.
Rezultatele obţinute în cazul probelor recoltate din tractul respirator vor fi interpretate împreună cu
cele furnizate de examenul microscopic, astfel:
● Examen microscopic pozitiv şi test PCR pozitiv: se va considera că pacientul are tuberculoză şi
se va începe tratamentul specific; vor fi aşteptate oricum rezultatele la cultură pentru confirmarea
definitivă a diagnosticului.
● Examen microscopic negativ şi test PCR pozitiv: în funcţie de contextul clinic şi celelalte investigaţii
medicul clinician va decide iniţierea terapiei tuberculostatice; dacă este nevoie, va fi repetat testul
PCR pe o nouă probă; vor fi aşteptate oricum rezultatele la cultură pentru stabilirea definitivă a
diagnosticului.
● Examen microscopic pozitiv şi test PCR negativ: dacă testul PCR s-a validat corect (control intern
în limitele acceptate) şi s-au obţinut 2 rezultate negative pe 2 probe diferite, se poate presupune că
pacientul are o infecţie cu mycobacterii non-tuberculoase; medicul clinician va decide iniţierea terapiei
specifice în cazurile speciale în care suspiciunea clinică de tuberculoză este mare, chiar dacă testul
PCR a dat rezultate negative; vor fi aşteptate oricum rezultatele la cultură pentru stabilirea definitivă
a diagnosticului.
● Examen microscopic negativ şi test PCR negativ: diagnosticul de tuberculoză nu poate fi exclus în
totalitate; medicul clinician va decide iniţierea terapiei specifice în cazurile speciale în care suspiciunea
clinică de tuberculoză este mare, chiar dacă examenul microscopic şi testul PCR au dat rezultate
negative; vor fi aşteptate oricum rezultatele la cultură pentru stabilirea definitivă a diagnosticului3.
Sunt posibilele şi situaţiile în care nu se obţine validarea testului PCR (controlul intern nu este situat
în limitele admise); acest fapt poate indica prezenţa de inhibitori în produsele testate (3-7% din
cazuri) care împiedică amplificarea ADN-ului. În acest caz testul PCR nu poate fi utilizat în elucidarea
diagnosticului3.
Acest test trebuie realizat împreună cu culturile bacteriene.
Pentru un diagnostic corect, rezultatele testelor PCR trebuie corelate cu simptomele clinice prezente
în momentul investigaţiei.
Un rezultat negativ nu exclude prezenţa Mycobacterium tuberculosis, deoarece bacilul poate fi prezent
la nivele aflate sub limita de detecţie a acestui test2.
Nu a fost evaluată performanţa testului PCR în cazul pacienţilor la care s-a iniţiat deja tratamentul
tuberculostatic3;6.
Bibliografie
1. Babu S. Nagesh, Shobha Sehgal, Surinder K. Jindal and Sunil K. Arora. Evaluation of
Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Pleural Fluid. In
Chest 2001; 119; 1737-1741.
377
2. Bongani M. Mayosi. Tuberculous Pericarditis. In Circulation. 2005;112:3608-3616.

3. CDC. Updated Guidelines for the Use of Nucleic Acid Amplification Tests in the Diagnosis of
Tuberculosis, MMVR, Jan. 2009, 58(01), 7-10.
4. Chow KM; Chow VC; Hung LC; Wong SM; Szeto CC. Tuberculous peritonitis-associated
mortality is high among patients waiting for the results of mycobacterial cultures of ascitic fluid
samples. In Clin Infect Dis 2002 Aug 15;35(4):409-13. Epub 2002 Jul 17.
6. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Mycobacterium tuberculosis
Complex, Molecular Detection, PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet
Communication.
7. Nobukazu Fujimoto et al. Tuberculosis diagnosed by PCR analysis of synovial fluid. In Journal of
Infection and Chemotherapy, vol.16. nr.1, febr.2010, 53-55.
8. Serdar Arisan, N. Cem Sönmez, Ömer Onur Çakir, Erbil Ergenekon Polymerase chain reaction
is a good diagnostic tool for Mycobacterium tuberculosis in urine samples. In Journal of Cell and
Molecular Biology 99-103, 2003.
9. Thomas Herchline, Judith K Amorosa, Tuberculosis, www.emedicine.medscape.com, . Ref Type:
18.3.18 Mycoplasma pneumoniae - ADN
Mycoplasma pneumoniae constituie un agent patogen implicat frecvent în pneumonia comunitară
caracterizată, în majoritatea cazurilor, printr-un debut insidios, atipic4.
M. pneumoniae este un microoorganism procariot, cu un genom foarte mic. Spre deosebire de
celelalte bacterii, nu deţine perete celular, fiind delimitat de o membrană trilamelară ce conţine steroli.
Se divide asexuat prin fisiune binară, timpul de dublare al populaţiei fiind >6 ore; din acest motiv
cultivarea patogenului necesită un timp îndelungat (5-20 zile)5.
M. pneumoniae colonizează mucoasa tractului respirator; ataşarea de celulele mucoasei, sustragerea
de la procesul de fagocitoză şi modularea sistemului imun sunt elemente esenţiale pentru iniţierea
bolii1. Patogenicitatea mycoplasmei a fost asociată cu activarea mediatorilor inflamaţiei, cum ar fi
citokinele4.
Cea mai frecventă manifestare clinică este traheobronşita; pneumonia, care se dezvoltă la aproximativ
o treime din persoanele infectate, debutează lent în 2-3 săptămâni de la expunere, cu febră, cefalee,
faringită, tuse persistentă neproductivă. Pneumonia se remite în majoritatea cazurilor după 2-3
săptămâni, deşi tusea se poate menţine o lună de zile1;4.
Au fost descrise frecvent manifestări extrapulmonare ale infecţiei cu Mycoplasma pneumoniae, ce pot
378
18
afecta orice organ. Totuşi, datorită prevalenţei mari a infecţiei în populaţie, este posibil ca multe din
evenimentele raportate să constituie doar o asociere întâmplătoare cu pneumonia. Printre manifestările
extrapulmonare se numără: erupţii cutanate tranzitorii, sindrom Stevens-Johnson, sindrom Raynaud,
complicaţii cardiace (aritmii, modificări EKG - tulburări de conducere, insuficienţă cardiacă congestivă),
neurologice (encefalită, meningită aseptică, meningo-encefalită, mielită transversă, disfuncţie de
trunchi cerebral, sindrom Guillain-Barré, neuropatii periferice, vasculită SNC), musculo-scheletale
(poliatralgii, artrită), renale, hematologice (cazuri rare de anemie aplastică)5.
Cultivarea microorganismului din secreţii respiratorii sau fluide biologice ar trebui să reprezinte metoda
“gold-standard” pentru diagnostic. Cu toate acestea, cultura necesită o procedură laborioasă şi medii
specializate, nefiind disponibilă în majoritatea laboratoarelor de microbiologie.
Sensibilitatea şi specificitatea înaltă a testelor de biologie moleculară (de exemplu, metoda real-
time PCR) care detectează ADN-ul specific M. pneumoniae în spută, exsudat nazofaringian, aspirat
traheal, lichid de lavaj bronho-alveolar sau spălătură bronşică indică faptul că acestea pot sta la baza
unui diagnostic rapid şi specific. Sensibilitatea cea mai mare se obţine în cazul probelor de spută.
Testele PCR pot fi utilizate în orice etapă a infecţiei, inclusiv în cele precoce când reacţiile serologice
sunt negative4;5.
La unii pacienţi cu afecţiuni neurologice (encefalită, accident vascular ischemic), însoţite sau nu de
manifestări respiratorii, a fost posibil să se izoleze M. pneumoniae ADN în LCR demonstrând că
patogenul este capabil să penetreze bariera hematoencefalică şi să invadeze direct SNC; în alte
cazuri cu serologie sugestivă pentru o infecţie recentă cu M. pneumoniae şi tulburări neurologice nu
a fost detectat ADN-ul specific, dovedind implicarea unor mecanisme imunologice, post-infecţioase în
apariţia complicaţiilor neurologice2.
Izolarea ADN-ului pentru M. pneumoniae din sânge este limitată la cazurile de infecţie cu manifestări
sistemice importante3.
Recomandări pentru determinarea Mycoplasma pneumoniae – ADN - detectarea infecţiilor
pulmonare şi posibil a altor complicaţii extrapulmonare3;4;5.
Specimen recoltat – a) exsudat faringian sau nazofaringian; b) lichid obţinut prin spălătură bronşică
sau lavaj bronho-alveolar, aspirat traheal sau bronşic, spută; c) sânge EDTA; d) lichid cefalo-rahidian
recoltat prin puncţie lombară3.
Recipient de recoltare - a) tampon uscat (fără mediu de transport); b), d) recipient steril; c) vacutainer
ce conţine EDTA ca anticoagulant3.
Cantitate recoltată – b), d) minimum 2 mL; c) cât permite vacuumul3.
Cauze de respingere a probei - cantitate insuficientă pentru analiză; contaminarea specimenului;
specimene prea vechi3.
Valori de referinţă - Mycoplasma pneumoniae - ADN nedetectabil3.
379
Detecţia Mycoplasma - ADN în diverse produse patologice sugerează un diagnostic clinic de infecţie
cu Mycoplasma pneumoniae3.
Cu toate că PCR-ul este o metodă ce oferă un diagnostic rapid şi fiabil, rezultate fals negative pot să
apară în probele care conţin foarte puţine microorganisme. Din acest motiv, pentru diagnosticul unei
infecţii acute testul PCR trebuie efectuat împreună cu serologia5.
Bibliografie
1. Gail L. Woods, David H. Walker. Chlamydial, Ricketsial, and Mycoplasmal infections. In Henry’s
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007,
1010, 1011.
2. John E Greenlee, Richard T Johnson. Neurologic complications of Mycoplasma pneumoniae
infection. www.medlink.com. Reference Type: Internet Communication.
4. Michael J. Bono. Pneumonia, Mycoplasma. emedicine.medscape.com, 2010. Reference Type:
5. Stephen G. Baum. Mycoplasma pneumoniae and Atypical Pneumonia. In Mandell, Douglas,
and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone,
Elsevier, 2010, 2481-2487.
18.3.19 Neisseria gonorrhoeae - ADN
Neisseria gonorrhoeae, un diplococ Gram negativ, este agentul etiologic al gonoreei, una din cele mai
frecvente boli cu transmitere sexuală.
La bărbaţi infecţia este în cele mai multe cazuri simptomatică, fiind asociată cu uretrită anterioară
însoţită de secreţie purulentă. La femei infecţia se manifestă ca cervicită, însă poate fi adesea
asimptomatică. În absenţa tratamentului antibiotic adecvat se pot dezvolta complicaţii acute sau
tardive, cum ar fi: epididimită sau prostatită la bărbaţi; boală inflamatorie pelvină, infertilitate, sarcini
ectopice la femei.
N. gonorrhoeae este un germene labil care nu supravieţuieşte în probele ce sunt recoltate în afara
laboratorului. Din acest motiv, diagnosticul microbiologic bazat pe cultură are valoare scăzută în
aceste cazuri.
Dezvoltarea tehnicilor de amplificare a acizilor nucleici a îmbunătăţit depistarea infecţiilor cu gonoc,
aceste tehnici prezentând în mod evident o serie de avantaje în comparaţie cu metodele clasice de
380
18
cultivare:
• deoarece este detectat ADN-ul bacterian nu este necesar ca microorganismul să fie viabil;
• prezintă o sensibilitate mai mare;
• la bărbaţi testul poate fi efectuat şi din urină, ceea ce creşte complianţa pacienţilor la investigaţie4;5.
Testul disponibil în laboratorul nostru utilizează tehnica de amplificare izotermică SDA (“strand
displacement amplification”) pentru detectarea ADN-ului ţintă al N. gonorrhoeae în probe endocervicale,
uretrale şi de urină (bărbaţi).
Menţionăm că din acelaşi tip de probe se poate testa simultan cu Neisseria gonorrhoeae-ADN şi
Chlamydia trachomatis-ADN3.
Recomandări pentru determinarea Neisseria gonorrhoeae - ADN – diagnosticul infecţiilor acute
urogenitale, screening-ul infecţiei la persoanele cu risc crescut; screening-ul gravidelor în primul
trimestru de sarcină; testul va fi repetat în trimestrul III, în cazul persoanelor cu risc crescut1;2.
Specimen recoltat - se vor recolta probe provenite din tractul urogenital: tampon endocervical, tampon
uretral şi urină primul jet (numai pentru bărbaţi); se vor utiliza tampoanele incluse în sistemele de recoltare
furnizate de laborator (vezi figura 18.3.19.1), separat pentru bărbaţi şi femei.
Recoltarea probei endocervicale
Înainte de recoltarea propriu-zisă se va îndepărta mucusul în exces de la nivelul orificiul colului cu
ajutorul tamponului de curăţare prevăzut cu burete; se va introduce tamponul de recoltare în canalul
cervical, se va roti 15-30 secunde după care se va retrage uşor, se va evita contactul cu mucoasa
vaginală şi se va introduce în tubul de transport; se va rupe tamponul în dreptul semnului astfel că
numai capătul tamponului va rămâne în tubul de transport ce va închis etanş cu capacul.
Recoltarea probei uretrale
Se inserează blând tamponul pe uretră cca 2-4 cm, se roteşte 3-5 secunde, se retrage uşor şi se
introduce în tubul de transport; se va rupe tamponul în dreptul semnului astfel că numai capătul
tamponului va rămâne în tubul de transport ce va fi închis etanş cu capacul.
Recoltarea probei de urină
Pacientul nu trebuie să urineze timp de 2 ore, apoi se recoltează cel puţin 5 mL din primul jet3.
Fig. 18.3.19.1 Sistem de recoltare a probelor cervicale
Stabilitate probă – 1 săptămână la 2-20ºC pentru probele genitale; 1 săptămână la 2-8ºC pentru
urină3.
381
Metodă - tehnică de amplificare izotermică SDA (“strand displacement amplification”) şi detecţie în

timp real a produşilor de amplificare prin fluorescenţă; sunt folosite următoarele tipuri de controale:
control de extracţie, control negativ şi control pozitiv (ce conţine aproximativ 2400 copii/mL de plasmidă
linearizată pCGint3B4)3.
Valori de referinţă – Neisseria gonorrhoeae ADN nedetectabil3.
Limita de detecţie a metodei de lucru: 50 celule bacteriene/mL urină sau 100 celule/mL specimen
genital3.
Un rezultat negativ nu exclude prezenţa unei infecţii deoarece recoltarea inadecvată a probei,
tratamentul antibiotic asociat, prezenţa de inhibitori sau existenţa unui număr redus de microorganisme
în proba testată pot influenţa rezultatul obţinut.
Interpretarea rezultatelor pozitive în cazul bărbaţilor asimptomatici se va face cu prudenţă având în
vedere prevalenţa scăzută a infecţiei la această categorie de pacienţi şi a duratei scurte a infecţiei
asimptomatice.
Valoarea predictivă a testului este influenţată de prevalenţa infecţiei într-o anumită populaţie sau grup.
Astfel, în grupurile cu prevalenţă crescută a bolilor cu transmitere sexuală valoarea predictivă pozitivă
este crescută. În schimb în grupurile cu prevalenţă scăzută a acestor categorii de infecţii rezultatele
pozitive trebuie să fie atent interpretate în contextul clinic general al pacientului, luând în considerare
şi posibilitatea existenţei unor rezultate fals pozitive.
Prezenţa spermicidelor, a lubrifianţilor ginecologici, precum şi a sângelui în proba analizată nu
afectează performanţa testului. Doar în cazul în care proba conţine sânge >60% se pot obţine rezultate
invalide ca urmare a lipsei de recuperare a controlului de extracţie.
Testul nu se recomandă pentru aprecierea eficienţei tratamentului antibiotic datorită posibilităţii
persistenţei acizilor nucleici3;5.
Sunt posibile reacţii încrucişate cu două bacterii din flora normală a tractului respirator superior:
Neisseria cinerea şi Neisseria subflava, din acest motiv se va evita în cursul procesului analitic
contaminarea probelor sau reactivilor cu aerosoli orofaringieni.
Testul nu va fi folosit în practica medico-legală (în cazurile de abuz sexual), cultura celulară fiind
singura metodă acceptată în aceste situaţii3;4.
Bibliografie
1. Centers for Disease Control and Prevention, “Sexually Transmitted Diseases Treatment
Guidelines 2002,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR6):1-78.
2. Johnson RE, Newhall WJ, Papp JR, et al, “Screening Tests to Detect Chlamydia trachomatis
and Neisseria gonorrhoeae,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR15):1-38.
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Chlamydia/
Gonococcus, Nucleic Acid Amplification (NAA) www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet
Communication.
5. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Neisseria gonorrhoeae by Nucleic Acid
Amplification. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
382
18
18.3.20 Parvovirus B19 (B19V) – ADN
B19V, clasificat iniţial ca parvovirus, este încadrat actual în genul Erythrovirus datorită replicării
preferenţiale a virusului în celulele progenitoare eritroide3.
Genomul B19V este liniar fiind alcătuit dintr-o singură catenă ADN cu lungimea de 5.1 Kb.
ADN-ul viral a fost depistat în secreţiile respiratorii ale pacienţilor în momentul viremiei, sugerând
faptul că infecţia se transmite în general pe cale respiratorie. Este posibilă însă şi transmiterea prin
produse de sânge1.
Infecţia cu B19V poate fi asimptomatică sau poate genera un spectru variat de afecţiuni, de la eritemul
infecţios la copil (boala “obrajilor pălmuiţi“) până la artropatie, anemie severă şi manifestări sistemice
care afectează sistemul nervos, cordul, ficatul, în funcţie de competenţa imună a gazdei3.
La pacienţii cu eritem infecţios nu se detectează viremii înalte deoarece manifestările clinice sunt
mediate de complexele imune formate. La persoanele cu anemii hemolitice, eritropoieză accelerată
sau ambele, infecţia poate induce o suprimare temporară a producţiei de eritrocite - criză aplastică
tranzitorie. Spre deosebire de pacienţii cu eritem infecţios, cei cu criză aplastică tranzitorie prezintă în
mod obişnuit viremii de până la 1014 copii genomice/mL, astfel încât diagnosticul poate fi stabilit prin
detectarea ADN-ului viral în sânge1.
La gravide infecţia contractată în cursul sarcinii poate cauza hidrops fetal, anemie congenitală sau
moartea fătului in utero. Infecţiile fetale pot fi puse în evidenţă prin detectarea ADN-ului viral în lichidul
amniotic sau în sângele de cordon ombilical.
La persoanele imunodeprimate infecţia persistentă cu B19V determină anemie cronică.
Diagnosticul infecţiilor acute este stabilit de obicei pe baza testelor serologice. Cu toate acestea
valoarea acestora în diagnosticul infecţiilor cu B19V la pacienţii imunodeprimaţi este limitată, adesea
fiind necesar să se recurgă la diagnosticul molecular1;3.
Recomandări pentru determinarea B19V- ADN - diagnosticul infecţiilor B19V; astfel:
1. B19V – ADN în sânge: diagnosticul precoce al crizei aplastice tranzitorii; diagnosticul
anemiei cronice la pacienţii imunodeprimaţi (anemie persistentă cu niveluri scăzute sau
absente de anticorpi specifici, însă cu viremie B19V persistentă sau recurentă);
2. B19V – ADN în LCR: diagnosticul infecţiilor SNC determinate de B19V (encefalită, meningită
aseptică);
3. B19V – ADN în lichid amniotic: diagnosticul infecţiei fetale cu B19V1;2;3.
Specimen recoltat - a) sânge venos; b) lichid cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară; c) lichid
amniotic2.
Recipient de recoltare - a) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant; b) şi c) recipient steril2.
Cantitate recoltată - a) cât permite vacuumul; b) şi c) minimum 2 mL2.
Prelucrare necesară după recoltare - a), b), c) probele nu vor fi centrifugate2.
Cauze de respingere a probei – a) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant2.
Stabilitate probă - probele de sânge, LCR sau lichid amniotic sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte de
383
extracţia acizilor nucleici2.

produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise2.
Valori de referinţă – Parvovirus B19 - ADN nedetectabil2.
Limita de detecţie – 5000 copii/mL2.
Obţinerea unui rezultat pozitiv indică prezenţa infecţiei B19V3.
Un rezultat negativ nu elimină posibilitatea unei infecţii B19V cu replicare scăzută3.
Bibliografie
1. Kevin Brown. Human Parvoviruses, Including Parvovirus B19 and Human Bocavirus. In Mandell,
3. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Parvovirus B19, Molecular Detection,
PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
4. Michael Costello, Margaret Yungbluth. Viral Infections. In Henry’s Clinical Diagnosis and
Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 989.
18.3.21 Polyomavirus BK - ADN
Polyomavirusurile umane - virusul JC (JCV) şi virusul BK (BKV) - sunt ubicuitare şi nu produc boli la
persoanele imunocompetente. Se descrie o prevalenţă de 86 şi 90% a anticorpilor specifici faţă de
JCV şi, respectiv, BKV în populaţia de vârstă adultă2.
Se descriu 4 subtipuri de BKV; fiecare subtip prezintă aproximativ 5000 perechi de baze azotate care
alcătuiesc ADN-ul dublu catenar şi o omologie a secvenţelor de ~ 70% cu JCV4.
Infecţia primară cu BKV se produce în copilărie şi este asimptomatică; după rezoluţia infecţiei virusul
rămâne într-o stare latentă fiind cantonat la nivelul rinichiului şi tractului urinar. Reactivarea BKV are
loc în condiţii de imunosupresie, în special la pacienţii cu transplant renal, la care induce o nefropatie
asociată cu polyomavirus (PVAN).
Prevalenţa acestei complicaţii la pacienţii transplantaţi variază între 1 şi 10% şi are drept consecinţă
eliminarea grefei în până la 60% din cazuri. Diagnosticul este stabilit în medie la 44 săptămâni de
la transplant, cu un vârf al incidenţei în săptămâna 24. O dată cu introducerea noilor medicamente
384
18
imunosupresoare (tacrolimus, mycophenolate mofetil) se descrie o tendinţă de creştere a prevalenţei

PVAN2;4.
Incidenţa viremiei şi viruriei BK scade semnificativ după 1 an de la transplant, cu reducerea riscului
de reactivare.
Alături de PVAN, BKV mai poate induce la pacienţii cu transplant renal stenoză uretrală (rata incidenţei
este de 3%).
Nu în ultimul rând, cea mai prevalentă complicaţie asociată cu BKV este cistita hemoragică care se
dezvoltă la 10-25% dintre pacienţii cu transplant medular.
În majoritatea cazurilor viruria BK nu se asociază cu nefropatie sau cistită hemoragică. Acest
lucru indică faptul că patogeneza BKV este rezultatul mai multor factori care includ: predispoziţia
gazdei, afectarea organului-ţintă şi imunosupresia. În perioada iniţială post-transplant, regimurile
imunosupresoare severe constituie un trigger pentru reactivarea BKV în celulele renale; reactivarea
conduce la infecţie productivă şi liza celulelor epiteliale renale.
Manifestările clinice ale nefropatiei BKV sunt similare cu cele ale respingerii grefei, respectiv creşterea
progresivă a nivelurilor de creatinină serică. Unii pacienţi pot prezenta febră şi hematurie2.
Clasic diagnosticul de nefropatie BKV necesită demonstrarea efectelor citopatice ale virusului în
epiteliul tubular din ţesutul renal. Totuşi biopsia renală este asociată cu o rată de rezultate fals-negative
de până la 30%, datorită naturii focale a bolii.
Prezenţa celulelor cu nucleu mare şi cu un singur corp de incluzie bazofilic (celule “momeală”) în
probele de sediment urinar poate indica infecţia BKV. Cu toate acestea valoarea predictivă pozitivă
a citologiei urinare este scăzută, modificările celulare nefiind caracteristice numai pentru BKV, ci şi
pentru JCV şi adenovirusuri.
Din aceste motive recomandările actuale prevăd ca în perioada posttransplant renal pacienţii să fie
monitorizaţi prin tehnici PCR de detectare a BKV-ADN în urină şi sânge. Secvenţa ţintă este specifică
pentru BKV; nu sunt posibile reacţii încrucişate cu JCV2;4. Viruria clinic silenţioasă precede de obicei
PVAN, ceea ce permite identificarea pacienţilor cu risc şi instituirea de măsuri preventive (ajustarea
dozelor de medicamente imunosupresoare)1.
Recomandări pentru determinarea BKV - ADN - diagnosticul rapid al bolilor renale asociate cu
BKV; monitorizarea pacienţilor cu transplant renal pentru depistarea precoce a nefropatiei în vederea
reducerii dozelor de imunosupresoare1;4.
Specimen recoltat - a) o probă de urină spontană; b) sânge venos.
Recipient de recoltare - a) eprubetă pentru urină; b) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant
Cantitate recoltată - a) minimum 2 mL; b) cât permite vacuumul3.
Stabilitate probă - probele de urină şi sânge sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor
nucleici3.
Valori de referinţă - BKV - ADN nedetectabil3.
385
Detecţia BKV-ADN în urină asociată cu tabloul de insuficienţă renală, în contextul clinic adecvat,
stabileşte diagnosticul de nefropatie indusă de BKV.
Deşi detecţia BKV-ADN în urină reprezintă un test sensibil la pacienţii cu cistită hemoragică,
specificitatea sa este redusă deoarece viruria BK asimptomatică este frecventă.
Testul de detectare a BKV-ADN în sânge este util mai mult pentru excluderea nefropatiei BKV decât
pentru stabilirea diagnosticului, deoarece are o valoare predictivă negativă de 100% şi o valoare
predictivă pozitivă de numai 50%. Trebuie menţionat însă faptul că BKV nu este detectat de obicei în
sânge la pacienţii cu cistită hemoragică sau stenoză uretrală2.
Bibliografie
1. Blanckaert K, De Vriese AS: Current recommendations for diagnosis and management of

polyoma BK virus nephropathy in renal transplant recipients. Nephrol Dial Transplant 2006 Dec
21; 12);3364-3367.
2. C. Sabrina Tan, Igor J. Koralnik. JC, BK and Other Polyomaviruses: Progresive Multifocal
Leukoencephalopathy. In Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious
Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2051-2054.
4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: BK Virus, Molecular Detection, PCR,
18.3.22 Polyomavirus JC - ADN
Polyomavirusurile umane - virusul JC (JCV) şi virusul BK (BKV) - sunt ubicuitare şi nu produc boli la
persoanele imunocompetente. Se descrie o prevalenţă de 86 şi 90% a anticorpilor specifici faţă de
JCV şi respectiv BKV în populaţia de vârstă adultă.
JCV este un virus ADN de dimensiuni mici, lipsit de anvelopă, care constituie agentul etiologic al
leucoencefalitei multifocale progresive (PML), o boală demielinizantă a sistemului nervos central care
apare la pacienţii cu imunodepresie severă.
Infecţia primară se produce în prima copilărie şi este asimptomatică, după care JCV persistă în
organism într-o stare latentă. JCV-ADN este detectat prin tehnica PCR în ţesutul amigdalian la
39% din indivizii sănătoşi, ceea ce sugerează o posibila transmitere a infecţiei pe cale orală sau
respiratorie. Depistarea virusului în urină la persoanele sănătoase indică faptul că rinichiul este
un sediu de cantonare a virusului latent. De asemenea detectarea JCV-ADN în măduva osoasă şi
386
18
creierul persoanelor fără PML sugerează alte două situsuri ale latenţei virale1. După mai mulţi ani
virusul poate fi reactivat la persoanele imunodeprimate, în special la cei cu SIDA; PML se produce ca
urmare a reactivării JCV şi se caracterizează prin modificări histologice şi neuroradiologice tipice1;2;4.
La pacienţii cu PML JCV infectează oligodendrocitele şi astrocitele din creier şi, mai rar, din măduva
spinării şi induce liza acestora, având drept rezultat distrugerea tecii de mielină1.
PML a fost descrisă iniţial ca o complicaţie la pacien¡ii imunosupresaţi cu limfoame primitive ale SNC,
cu leucemie, la pacienţi cu tratament imunosupresor pentru artrită reumatoidă, sarcoidoză sau după
transplante de organ. În prezent imunodepresia determinată de infecţia HIV este cea mai frecventă
cauză de PML cu o incidenţă de 50 de ori mai mare comparativ cu alte afecţiuni care determină
imunosupresie2. Astfel, 80% din pacienţii cu PML au SIDA, 13% prezintă boli hematologice maligne,
5% au suferit un transplant de măduvă sau de organe solide, iar 2% au boli inflamatorii cronice. Recent
a fost raportat un nou grup de pacienţi cu PML; aceştia au primit tratamente imunomodulatoare pentru
diverse afecţiuni maligne sau autoimune, cum ar fi: natalizumab pentru scleroza multiplă sau boala
Crohn, rituximab pentru limfoame sau LES şi efalizumab pentru psoriazis1.
Prevalenţa PML este de 0.7-8% din bolile indicatoare SIDA şi a rămas neschimbată după introducerea
pe scară largă a terapiei antiretrovirale înalt active (HAART), comparativ cu celelalte infecţii oportuniste
şi cu encefalopatia HIV ale căror incidenţe s-au redus la jumătate după introducerea HAART.
Leziunile din PML sunt de demielinizare, de obicei în focare multiple, localizate în substanţa albă. Tabloul
clinic corespunde topografiei zonelor lezate, predominând deficitele motorii de tipul hemiparezelor.
Diagnosticul de prezumţie se stabileşte pe baza examinării prin rezonanţă magnetică nucleară şi
poate fi confirmat prin detecţia virusului JC în lichidul cefalorahidian prin utilizarea tehnicilor PCR.
Diagnosticul de certitudine este histologic: aspect de demielinizare multifocală, oligodendrocite cu
nuclei măriţi şi astrocite mari, bizare, cu nuclei lobulaţi, hipercromatici2. Cu toate acestea biopsia
cerebrală poate să nu fie disponibilă în cazul anumitor localizări ale leziunilor şi datorită stării precare a
pacienţilor. În plus, acest procedeu invaziv este asociat cu un risc crescut de morbiditate şi mortalitate.
Detecţia JCV-ADN în LCR constituie o alternativă non-invazivă rapidă la biopsia cerebrală. Secvenţa
ţintă este specifică pentru JCV; nu sunt posibile reacţii încrucişate cu BKV.
Înainte de aplicarea pe scară largă a HAART testul avea o sensibilitate de 72-92% şi o specificitate
de 92-100%. După introducerea HAART sensibilitatea analitică a scăzut semnificativ la 58% fără a
se modifica însă specificitatea1.
Recomandări pentru determinarea JCV - ADN - suspiciune de PML3;4.
Specimen recoltat - lichid cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară3.
Recipient de recoltare - recipient steril3.
Cantitate recoltată - minimum 2 mL3.
Stabilitate probă - probele de LCR sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor nucleici3.
Valori de referinţă - JCV - ADN nedetectabil3.
387
Detecţia JCV-ADN în LCR susţine diagnosticul clinic de PML cauzat de acest virus4.
Un rezultat negativ nu exclude diagnosticul de PML4.
Bibliografie
1. C. Sabrina Tan, Igor J. Koralnik. JC, BK and Other Polyomaviruses: Progresive Multifocal
Leukoencephalopathy. In Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious
Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2051-2054.
2. Dan Duiculescu, Luminiţa Ene. Leucoencefalita multifocală progresivă (PML). În Revista română
de boli infecţioase, vol IX, nr.1-2, 2006.
4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: JC Virus, Molecular Detection, PCR,
18.3.23 Toxoplasma gondii - ADN

Toxoplasma gondii este un protozoar aparţinând ordinului Coccidia, clasa Sporozoare, foarte apropiat
de genul Isospora. Ciclul de viaţă al Toxoplasma presupune 3 forme:
- trofozoit: forma invazivă responsabilă de manifestările acute ale infecţiei;
- chist: responsabil de infecţia persistentă şi latentă;
- oochist: nu se întâlneşte la om, ci numai la pisică (gazdă obligatorie), având rol
în ciclul evolutiv al Toxoplasmei şi în transmiterea infecţiei7.
Parazitul este ubicuitar în natură, fiind întâlnit în mod obişnuit în solurile din regiuni calde şi umede ce
sunt contaminate cu materii fecale de la animale. Parazitul poate infecta orice mamifer, însă principalul
rezervor al bolii este reprezentat de familia Felidae (din care face parte şi pisica), unde parazitul se
reproduce şi este eliminat prin materiile fecale sub formă de oochişti în cursul infecţiei acute.
Infecţia se transmite la om prin ingestia de carne crudă sau insuficient preparată termic ce conţine
chisturi tisulare, consumul de apă sau alimente contaminate cu oochişti sau vertical (transplacentar) de
la o mamă ce a dobândit infecţia în cursul sarcinii. Mult mai rară este transmiterea printr-un transplant
de organ infectat sau o transfuzie cu celule sangvine contaminate.
Receptivitatea faţă de infecţie este generală. Toxoplasma gondii se multiplică intracelular la locul de
invazie (tractul gastrointestinal), iar bradizoiţii eliberaţi din chisturile tisulare sau sporozoiţii eliberaţi din
oochisturi penetrează şi se multiplică în celulele epiteliale intestinale. Formele parazitare se propagă
mai întâi în ganglionii limfatici mezenterici după care ajung şi la organe situate la distanţă, pe cale
388
18
limfatică sau sangvină. Toxoplasma infectează virtual toate tipurile celulare, însă există o predilecţie
pentru neuroni, microglii, celulele coroidei şi retinei, precum şi pentru celulele aparţinând sistemului
reticuloendotelial. O dată cu dezvoltarea răspunsului imun umoral sau celular supravieţuiesc doar acei
paraziţi care sunt protejaţi de un habitat intracelular sau se găsesc în interiorul chisturilor tisulare. Un
răspuns imun eficient reduce semnificativ numărul tahizoiţilor din toate ţesuturile. Formarea chisturilor
tisulare se produce în numeroase ţesuturi şi organe în cursul primei săptămâni de infecţie; acestea
sunt responsabile de infecţia reziduală (cronică sau latentă) şi persistă în principal la nivelul creierului,
muşchilor scheletici, miocardului şi ochiului5.
Frecvenţa infecţiei variază după grupe de vârstă şi populaţie între 20 şi 80%, procentul crescând cu
vârsta, aşa cum rezultă din prezenţa testelor serologice pozitive, al căror procent creşte cu vârsta11.
Sunt descrise 5 forme de toxoplasmoză:
- dobândită la un pacient imunocompetent;
- dobândită sau reactivată la un pacient imunodeprimat;
- oculară;
- toxoplasmoza la gravide;
- congenitală5.
La pacienţii imunocompetenţi infecţia evoluează în majoritatea cazurilor asimptomatic. Atunci
când infecţia devine clinic manifestă, pacientul prezintă un sindrom mononucleozic autolimitant cu
astenie fizică şi adenopatii. Pentru diagnosticul diferenţial al limfadenopatiilor pot fi utilizate testele
serologice11.
Dacă la persoanele normale evoluţia toxoplasmozei este benignă, la pacienţii imunodeprimaţi
(neoplazii hematologice: boala Hodgkin şi limfoamele non-hodgkiniene, transplant de organe, SIDA,
corticoterapie de lungă durată, chimioterapie, terapia anti-TNF alfa) consecinţele infecţiei pot fi foarte
grave, de aceea diagnosticul trebuie stabilit cât mai repede. Febra de cauză neprecizată poate fi
singura manifestare a toxoplasmozei în stadiu precoce la această categorie de pacienţi. Encefalita,
pneumonita şi miocardita reflectă infecţia activă a organelor cel mai frecvent afectate.
Encefalita indusă de T. gondii este cea mai frecventă formă de manifestare a toxoplasmozei şi cauza
cea mai comună de leziuni SNC focale la pacienţii cu SIDA. Pneumonita este frecventă şi adesea
omisă ca diagnostic. Infecţia diseminată nu este neobişnuită, iar manifestările clinice pot să nu
reflecte întotdeauna severitatea bolii. Mortalitatea se apropie de 100% în absenţa tratamentului iniţiat
precoce. Toxoplasmoza la imunodeprimaţi poate fi consecinţa reactivării unei infecţii latente sau poate
fi rezultatul unei infecţii primare dobândite cel mai adesea prin transplantul unui organ infectat5.
La pacienţii imunodeprimaţi rezultatele serologiei trebuie interpretate cu prudenţă, deoarece aceştia
prezintă de obicei titruri scăzute de anticorpi IgG, iar anticorpii IgM pot fi nedetectabili. Reacţia de
polimerizare în lanţ (PCR) care detectează T. gondii ADN (în special gena B1) în sânge şi diverse
lichide biologice s-a dovedit a fi o metodă sensibilă şi specifică pentru diagnosticul infecţiei la aceşti
pacienţi. Astfel, pentru diagnosticul encefalitei toxoplasmozice cel mai util produs patologic este
lichidul cefalo-rahidian (LCR), testul PCR având o sensibilitate şi o specificitate de 83.3%, respectiv
95.7%8;9;12. Determinarea ADN-ului în sânge este importantă pentru diagnosticul toxoplasmozei
generalizate şi mai puţin pentru encefalita toxoplasmozică (în cazul infecţiei SNC parazitemia este
mai rar prezentă). Se pare că tratamentul influenţează sensibilitatea metodei PCR; sensibilitatea este
389
mai mare dacă probele de sânge sau de LCR se recoltează fie înainte, fie în prima săptămână de
tratament4;5;9;12.
Infecţia oculară la pacienţii imunocompetenţi produce corioretinită acută caracterizată prin inflamaţie
severă şi necroză. La pacienţii cu SIDA corioretinita se manifestă prin panoftalmită segmentară şi zone
de necroză de coagulare asociate cu chisturi tisulare şi tahizoiţi. În jurul vaselor retiniene trombozate
pot fi vizualizate numeroase microorganisme; se pot produce leziuni multiple şi bilaterale. Pacienţii
având corioretinită activă indusă de Toxoplasma gondii nu prezintă de obicei anticorpi IgM detectabili,
iar titrurile de anticorpi IgG sunt scăzute. În majoritatea cazurilor corioretinita toxoplasmozică este
diagnosticată prin examen oftalmologic. Cu toate acestea există pacienţi cu modificări atipice ale
retinei; la aceştia detectarea ADN-ului parazitului în umoarea apoasă sau în cea vitroasă confirmă
diagnosticul5.
Infecţia acută cu Toxoplasma este asimptomatică la majoritatea gravidelor. Cu toate acestea
este importantă datorită posibilităţii transmiterii infecţiei la făt. În cea mai mare parte a cazurilor
transmiterea la făt este limitată la acele paciente care dobândesc infecţia în cursul sarcinii. Excepţii
rare au fost observate la unele femei imunocompetente care au fost infectate cu T. gondii cu puţin
timp înaintea concepţiei. Rareori transmiterea la făt se produce prin reactivarea unei infecţii latente
la gravide imunodeprimate infectate înaintea concepţiei (coinfecţie HIV - T.gondii, paciente cu LES
sub corticoterapie). Pentru a evita complicaţiile din cursul sarcinii se recomandă evaluarea statusului
imun înainte de concepţie. Se consideră astfel că femeile seropozitive înainte de a rămâne însărcinate
sunt protejate în ceea ce priveşte transmiterea infecţiei viitorului făt. Pe de altă parte, femeile
seronegative prezintă riscul de a contracta infecţia în cursul sarcinii, iar la acestea trebuie aplicate
măsuri profilactice2;5.
Infecţia fetală în cursul primului trimestru de sarcină se produce mai rar, dar se asociază cu un risc mai
mare de avort spontan şi apariţie a anomaliilor fetale. Infecţia contractată într-o perioadă avansată a
sarcinii este mai frecvent transmisă la făt, dar prezintă un risc mai mic de a induce anomalii fetale.
Cel mai mare risc de boală congenitală severă apare când infecţia este dobândită în săptămânile
10-24 de sarcină, iar cel mai mare risc de transmitere verticală se produce în cursul săptămânilor
26-40. Infecţia primară a mamei imediat înaintea concepţiei sau în primele 10 săptămâni de sarcină
are o rată de transmitere verticală de 2%, dar peste 80% dintre fetuşii infectaţi vor dezvolta o boală
severă cu microftalmie, corioretinită, hidrocefalie şi calcificări intracraniene. Între săptămânile 24 şi
30 prevalenţa infecţiei severe scade de la 80 la 20%, iar după săptămâna 30 se reduce la 6%, deşi
peste 80% dintre gravidele care prezintă infecţie primară în această perioadă vor transmite infecţia
fătului. Efectuarea testului PCR din lichid amniotic reprezintă cea mai bună metodă de diagnostic a
infecţiei fetale1. Astfel, la gravidele care prezintă seroconversie în cursul sarcinii studiile au indicat o
sensibilitate de 83-97.5% şi o specificitate de 100% în detectarea infecţiei fetale. Amniocenteza va
fi evitată la mamele HIV pozitive datorită riscului de transmitere a virusului la făt. La nou-născutul cu
suspiciune de toxoplasmoză congenitală se pot recolta probe de lichid cefalorahidian, urină sau sânge
periferic în vederea diagnosticului molecular1;3;10.
Recomandări pentru determinarea Toxoplasma - ADN
1. Toxoplasma – ADN în sânge: diagnosticul toxoplasmozei diseminate şi al infecţiei
neonatale5;10.
390
18
2. Toxoplasma – ADN în urină: detectarea infecţiei congenitale3.

3. Toxoplasma – ADN în LCR: diagnosticul encefalitei toxoplasmozice la pacienţi imunodeprimaţi
sau la nou-născut5;8;1.
4. Toxoplasma – ADN în lichid amniotic: diagnosticul infecţiei fetale cu T. gondii1;10.
5. Toxoplasma – ADN în lichid ocular (umoare apoasă sau vitroasă): detectarea corioretinitei
toxoplasmozice5.
Specimen recoltat - a) sânge venos; b) o probă de urină spontană; c) lichid cefalorahidian recoltat
prin puncţie lombară; d) lichid amniotic; e) umoare apoasă sau vitroasă6.
Recipient de recoltare - a) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant; b) eprubetă pentru urină;
c), d), e) recipient steril6.
Cantitate recoltată - a) cât permite vacuumul; b), c) şi d) minimum 2 mL; e) minimum 0.1 mL (optim
0.3 mL)6.
Cauze de respingere a probei - a) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant6.
Stabilitate probă - probele de sânge, urină, LCR, lichid amniotic sau ocular sunt stabile 48 ore la
2-4°C înainte de extracţia acizilor nucleici6.
Metodă – PCR cu detecţie colorimetrică (test calitativ)6.
Valori de referinţă - Toxoplasma gondii - ADN nedetectabil6.
Detecţia Toxoplasma - ADN în diverse produse patologice susţine diagnosticul clinic de infecţie
datorată acestui parazit8.
Un rezultat negativ nu elimină posibilitatea unei infecţii cu Toxoplasma gondii, în special la nivel
SNC8.
Bibliografie
1. Ann M. Gronowski. Prenatal Screening and Diagnosis of Congenital Infections. In Handbook of

Clinical Laboratory Testing During Pregnancy, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2004, 273-
276.
2. Berrebi, W.E. Kobuch. Toxoplasmosis în pregnancy. In Lancet, 1994, 344, 950.
3. Isabel Fuentes, Mercedes Rodriguez. Urine Sample Used for Congenital Toxoplasmosis
Diagnosis by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 1996, 34 (10): 2368–2371.
4. J. Lamoril, J-M Molina. Detection by PCR of Toxoplasma gondii in blood in the diagnosis of
cerebral toxoplasmosis in patients with AIDS. J Clin Pathol 1996; 49:89-92.
5. Jose G. Montoya, John C. Boothroyd, Joseph A. Kovacs. Toxoplasma gondii. In Mandell,
391
7. Marin Voiculescu. Toxoplasmoza. În Boli infeţtioase-clinică şi epidemiologie, Editura
Medicala,1988, 1130-1139.
8. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Toxoplasma gondii, Molecular Detection,
PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
9. Michel Dupon, Jean Cazenave. Detection of Toxoplasma gondii by PCR and Tissue Culture
in Cerebrospinal Fluid and Blood of Human Immunodeficiency Virus-Seropositive Patients. In
Journal of Clinical Microbiology. 1995, 33 (9):2421–2426.
10. Nazan Dalgıc. Congenital Toxoplasma gondii infection. In Marmara Medical Journal 2008;
21(1);089-101.
11. P. Ambroise-Thomas, et al. Le toxoplasme et sa pathologie. Médecine et maladies infectieuses,
1993, 23 spécial, 121-128.
12. Yenisey Alfonso, Jorge Fraga. Molecular diagnosis of Toxoplasma gondii infection in
cerebrospinal fluid from AIDS patients. In Cerebrospinal Fluid Research, 2009, 6:2.
18.3.24 Treponema pallidum - ADN
Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului

Testele PCR identifică Treponema pallidum prin amplificarea unor secvenţe ADN specifice
microorganismului.
Deşi sunt dezvoltate mai recent au început să fie utilizate în anumite laboratoare şi centre specializate
datorită specificităţii lor înalte.
Astfel, reacţia de polimerizare în lanţ poate fi un test util în diagnosticul sifilisului primar dacă este
efectuată din probele recoltate de la nivelul leziunii, mai ales în situaţiile în care microscopia pe fond
întunecat nu este disponibilă, iar testele serologice sunt negative. Pe de altă parte, utilitatea testului
PCR din leziunile cutanate din sifilisul secundar rămâne incertă1.
De asemenea testul PCR efectuat din lichidul cefalo-rahidian prezintă importanţă în diagnosticul
neurosifilisului, în special la pacienţii cu sindromul imunodeficienţei dobândite (SIDA)2;4.
În ceea ce priveşte diagnosticul sifilisului congenital detectarea ADN-ului poate fi efectuată din:
- lichidul amniotic: pentru diagnosticul infecţiei fetale testul are o sensibilitate similară
inoculării intratesticulare a prelevatelor patologice la iepure (RIT = rabbit infectivity test);
- sânge şi lichid cefalorahiadian la nou-născut1;2.
Specimen recoltat – a) produs prelevat din leziune (ulceraţie) pe tampon uscat; b) sânge venos; c)
lichid cefalorahidian (LCR) recoltat prin puncţie lombară; d) lichid amniotic2.
Recipient de recoltare – a) tampon fără mediu de transport; b) vacutainer ce conţine EDTA ca
anticoagulant;
392
18
c), d) recipient steril2.

Cantitate recoltată - b) cât permite vacuumul; b), c) minimum 2 mL2.
Cauze de respingere a probei - b) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant2.
Stabilitate probă - probele de sânge, produs din leziune, LCR sau lichid amniotic sunt stabile 48 ore
la 2-4°C înainte de extracţia acizilor nucleici2.
Metodă – Real-time PCR: reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului PCR
acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise; ţinta ADN este reprezentată de gena polA2.
Valori de referinţă – Treponema pallidum - ADN nedetectabil2.
Limita de detecţie – 1.75 copii/reacţie2.
Detecţia Treponema pallidum-ADN în diverse produse patologice sugerează un diagnostic de infecţie
datorată acestei bacterii3.
Detecţia treponemei pallidum prin PCR este o metodă specifică, dar nu poate distinge între
microorganismele vii şi cele moarte.
Un rezultat negativ pentru Treponema pallidum-ADN în LCR sau lichidul amniotic nu exclude
sifilisul1.
Bibliografie

1. APHL (Association of Public Health Laboratories). Laboratory Diagnostic Testing for Treponema
pallidum. Expert Consultation Meeting Summary Report, January 13-15, 2009, Atlanta (report
produced in cooperation with the Centers for Disease Control and Prevention.
2. Edmund C. Tramont. Treponema pallidum (Syphilis). In Mandell, Douglas, and Bennett’s
Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier,
2010, 3044-3049.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog
4. P. Rocco LaSala, Michael B. Smith. Siprochete Infections. In Henry’s Clinical Diagnosis and
Management by Laboratory Methods, 21., 1059-1063.
393
18.3.25 Virus Epstein-Barr – ADN calitativ în sânge şi LCR

Virusul Epstein-Barr (EBV) este asociat cu un spectru larg de afecţiuni benigne şi maligne ce
include: mononucleoza infecţioasă, limfomul, sindromul limfoproliferativ posttransplant şi carcinomul
nazofaringian.
Determinarea genomului viral EBV-ADN este din ce în ce mai mult utilizată în laboratoarele clinice în
diagnosticul şi monitorizarea afecţiunilor induse de această infecţie5.
Infecţiile EBV sunt larg răspândite astfel că până la vîrsta de 35-40 ani 95% dintre persoanele adulte
au venit în contact cu acest virus. Mulţi copii dobândesc infecţia în primii de viaţă, însă în majoritatea
cazurilor aceasta este asimptomatică sau evoluează ca o infecţie uşoară de tract respirator
superior7. La adolescent şi adultul tânăr infecţia EBV primară poate determina, în 35-50% din cazuri,
mononucleoza infecţioasă – o afecţiune limfoproliferativă benignă caracterizată prin febră, astenie
fizică, faringită şi poliadenopatii.
Infecţiile primare se caracterizează prin viremii crescute care înregistrează scăderi până la valori
nedetectabile pe măsură ce sistemul imun recunoaşte şi controlează infecţia. Ca şi alte virusuri
herpetice, EBV poate să rămână în organism într-o stare dormantă ani de zile (infecţie latentă).
Reactivările periodice sunt însoţite de viremii tranzitorii. Unii pacienţi dezvoltă ulterior neoplazii
asociate infecţiei EBV iar aceştia prezintă ca trăsătură definitorie valori foarte ridicate ale viremiei.
Astfel, determinarea cantitativă EBV-ADN nu detectează numai infecţia activă ci constituie şi un fi
“marker tumoral” pentru anumite tipuri de procese maligne2;3;8.
Testul de detecţie a genomului EBV (EBV-ADN) în sânge poate fi util în diagnosticul mononucleozei
infecţioase în stadiu precoce precum şi în situaţiile în care markerii serologici nu oferă rezultate
concludente.
Genomul EBV a fost depistat în sângele pacienţilor atât în infecţiile primare cât şi în reactivări. Conform
unui studiu, utilizarea metodei moleculare a crescut cu peste 16% numărul cazurilor diagnosticate6.
Complicaţiile neurologice în mononucleoza infecţioasă au fost documentate pentru prima dată în
urmă cu peste 70 ani. Incidenţa exactă a acestora nu este cunoscută, dar este estimată la 1-5% din
cazuri. EBV produce afecţiuni atât ale sistemului nervos central cât şi periferic. Prezenţa EBV-ADN
în LCR a fost demonstrată astfel la pacienţi cu meningită aseptică, encefalită, mielită şi neuropatie
(oftalmoplegie, plexopatie lombosacrată, neuropatie senzorială sau autonomă)1.
Alături de diagnosticul complicaţiilor neurologice ale infecţiei primare, EBV-ADN în LCR constituie
un marker non-invaziv pentru cazurile de limfom al sistemului nervos central asociate cu sindromul
imunodeficienţei dobândite SIDA (sensibilitate de 83-100% şi specificitate >90% ca „marker
tumoral”)4.
Pregătire pacient – nu este necesară5.
Specimen recoltat – a) sânge venos; b) lichid cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară5.
Recipient de recoltare - a) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant; b) recipient steril pentru
LCR5.
Cantitate recoltată - a) cât permite vacuumul; b) minimum 2 mL5.
Prelucrare necesară după recoltare - a) proba nu va fi centrifugată5.
394
18

anticoagulant5.
Stabilitate probă - probele de sânge sau de LCR sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia
acizilor nucleici5.
Valori de referinţă – EBV-ADN nedetectabil5.
Limita de detecţie – 150 copii/mL5.
Obţinerea unui rezultat pozitiv în LCR susţine diagnosticul clinic de afecţiune SNC cauzată de EBV7.
Un rezultat negativ în LCR nu elimină posibilitatea unei infecţii SNC cauzată de EBV7.
La pacienţii cu SIDA pot exista ocazional rezultate fals pozitive sau fals negative pentru EBV-ADN în
LCR; în situaţiile neconcludente se va recurge la biopsie cerebrală pentru a confirma sau infirma un
limfom primar SNC4.
Bibliografie
1. Arshad Majid et al. Epstein–Barr virus myeloradiculitis and encephalomyeloradiculitis. In Brain,

Vol. 125, No. 1, 159-165, January 1, 2002.
2. De David H. Persing, Thomas F. Smith, Fred C. Tenover. PCR Detection and Typing of Epstein-
Barr Virus. In Diagnostic molecular microbiology. 1993. 344-355
3. Gulley ML, Tang W. Laboratory Assays for Epstein-Barr Virus-Related Disease. In J Molec
Diagn, 2008; 10:279-292.
4. Guy Boivin. Diagnosis of herpesvirus Infection of the Central Nervous System. In Herpes 11.
Supplement 2004; 2, 49-54.
6. Luderer Rianne et al. Real Time Epstein-Barr Virus PCR for diagnosis of primary EBV infections
and EB reactivation. In Molecular Diagnosis, 2005; 9 ( 4): 195-200.
7. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Epstein-Barr Virus (EBV) by
Rapid PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
8. Ryan JL, Fan H, Swinnen LJ, Schichman SA, Raab-Traub N, Covington M, Elmore S, Gulley
ML. Epstein-Barr Virus (EBV) DNA in plasma is not encapsidated in patients with EBV-related
malignancies. In Diagn Mol Pathol. 2004;13:61–68.
395
18.3.26 Epstein-Barr-Virus (EBV) ADN în sânge (cantitativ)
Virusul Epstein-Barr (EBV) este asociat cu un spectru larg de afecţiuni benigne şi maligne ce
include: mononucleoza infecţioasă, limfomul, sindromul limfoproliferativ posttransplant şi carcinomul
nazofaringian.
Determinarea genomului viral EBV-ADN este din ce în ce mai mult utilizată în laboratoarele clinice în
diagnosticul şi monitorizarea afecţiunilor induse de această infecţie6.
Infecţiile EBV sunt larg răspândite astfel că până la vîrsta de 35-40 ani 95% dintre persoanele adulte
au venit în contact cu acest virus. Mulţi copii dobândesc infecţia în primii de viaţă, însă în majoritatea
cazurilor aceasta este asimptomatică sau evoluează ca o infecţie uşoară de tract respirator
superior7. La adolescent şi adultul tânăr infecţia EBV primară poate determina, în 35-50% din cazuri,
mononucleoza infecţioasă – o afecţiune limfoproliferativă benignă caracterizată prin febră, astenie
fizică, faringită şi poliadenopatii.
Infecţiile primare se caracterizează prin viremii crescute care înregistrează scăderi până la valori
nedetectabile pe măsură ce sistemul imun recunoaşte şi controlează infecţia. Ca şi alte virusuri
herpetice, EBV poate să rămână în organism într-o stare dormantă ani de zile (infecţie latentă).
Reactivările periodice sunt însoţite de viremii tranzitorii. Unii pacienţi dezvoltă ulterior neoplazii
asociate infecţiei EBV, iar aceştia prezintă ca trăsătură definitorie valori foarte ridicate ale viremiei.
Astfel, determinarea cantitativă EBV-ADN nu detectează numai infecţia activă ci constituie şi un
“marker tumoral” pentru anumite tipuri de procese maligne2;3;4;9.
Tumorile asociate cu EBV sunt sindroamele limfoproliferative postransplant, carcinomul nazofaringian,
limfoamele asociate sindromului imunodeficienţei dobândite (SIDA) şi limfomul Burkitt3.
Celula ţintă pentru infecţia EBV este limfocitul B. Pacienţii imunodeprimaţi, care nu prezintă anticorpi
anti-EBV (adesea copii), prezintă riscul de a dezvolta infecţie EBV acută care poate cauza sindroame
limfoproliferative; acestea includ sindroamele limfoproliferative posttransplant şi limfoamele
asociate sindromului imunodeficienţei dobândite (SIDA)5. Incidenţa sindroamelor limfoproliferative
posttransplant variază de la 1% la pacienţii cu transplant renal până la 9% la pacienţii cu transplant de
cord/plămân şi 12% la cei cu transplant de pancreas7.
Recomandări pentru determinarea cantitativă EBV-ADN
Diagnosticul serologic este rareori util în evaluarea infecţiei la pacienţii imunodeprimaţi şi în
monitorizarea tumorilor induse de EBV, în special post-transplant. Deoarece cultivarea virusului nu
este accesibilă laboratorului clinic, se consideră că ADN-EBV poate servi ca “marker tumoral” în
evaluarea bolilor limfoproliferative şi a carcinomului nasofaringian2. Nivelul ADN în sânge (cuantificat
prin PCR cantitativ) începe să crească cu câteva luni înainte de debutul bolii limfoproliferative şi
scade după iniţierea terapiei. Din acest motiv determinarea EBV-ADN în sânge poate constitui un
marker predictiv la pacienţii susceptibili, fiind posibilă estimarea riscului de dezvoltare în următoarele
3-4 luni a sindroamelor limfoproliferative postransplant în funcţie de valorile viremiei. De asemenea
determinările seriate de EBV-ADN sunt utile în evaluarea răspunsului la tratament al pacienţilor cu
boli limfoproliferative6.
În carcinomul nasofaringian viremia este mare la debut, scade în cursul radioterapiei, devine
396
18
nedetectabilă după obţinerii remisiunii, dar persistă în cazul recidivelor1;4.

Cauze de respingere a probei – probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant6.
Stabilitate probă – proba de sânge este stabilă 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor
nucleici6.
Metodă - Real-time PCR: reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului PCR
acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise6.
Limita de detecţie - 1000 copii EBV/mL.6.
Valori ale viremiei care cresc progresiv la determinări seriate sunt sugestive pentru sindroamele
limfoproliferative posttransplant.
Pacienţii imunodeprimaţi care prezintă reactivări ale infecţiei, fără a dezvolta însă sindroame
limfoproliferative, au de regulă valori scăzute ale viremiei.
În anumite situaţii analizorul poate indica valori sub limita de detecţie a metodei. Acestea vor fi
comunicate cu menţiunea: “Rezultatul poate să nu fie reproductibil datorită numărului redus de copii
ale genomului viral”8.
Determinările seriate EBV-ADN sunt mult mai utile în evaluarea riscului de sindrom limfoproliferativ
posttransplant decât o viremie izolată8.
Bibliografie
1. Chan AT, Lo YM, Zee B, Chan LY, Ma BB, Leung SF, Mo F, Lai M, Ho S, Huang DP,Johnson
PJ. Plasma Epstein-Barr virus DNA and residual disease after radiotherapy for undifferentiated
nasopharyngeal carcinoma. In J Natl Cancer Inst, 2002; 94:1614-1619.
2. De David H. Persing, Thomas F. Smith, Fred C. Tenover. PCR Detection and Typing of Epstein-
Barr Virus. In Diagnostic molecular microbiology. 1993. 344-355
3. Fan H, Gulley ML. Epstein-Barr viral load measurement as a marker of EBV-related disease. In
Mol Diagn. 2001; 6:279–289.
4. Gulley ML, Tang W. Laboratory Assays for Epstein-Barr Virus-Related Disease. In J Molec
Diagn, 2008; 10:279-292.
5. Guy Boivin. Diagnosis of herpesvirus Infection of the Central Nervous System. In Herpes 11.
Supplement 2004; 2, 49-54.
7. Luderer Rianne et al. Real Time Epstein-Barr Virus PCR for diagnosis of primary EBV infections
and EB reactivation. In Molecular Diagnosis, 2005; 9 ( 4): 195-200.
397
8. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Epstein-Barr Virus (EBV)
DNA Detection by PCR, Quantitative, Blood. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type:
9. Ryan JL, Fan H, Swinnen LJ, Schichman SA, Raab-Traub N, Covington M, Elmore S, Gulley
ML. Epstein-Barr Virus (EBV) DNA in plasma is not encapsidated in patients with EBV-related
malignancies. In Diagn Mol Pathol. 2004;13:61–68.
18.3.27 Virus herpetic uman tip 6 (HHV-6) - ADN
Virusul herpetic uman tip 6 - Human herpesvirus 6 (HHV-6) - a fost izolat în 1986 de Salahuddin şi
colaboratorii, în urma supravegherii virusulogice a pacienţilor cu boli limfoproliferative şi HIV, fiind
recunoscut ca un virus cu afinitate crescută pentru limfocitele T CD4 pozitive. Face parte din subfamilia
β-herpesvirusurilor, genul Roseolovirus şi i se descriu două variante: A şi B. HHV-6B este principalul
agent implicat în etiologia unei afecţiuni cutanate - exanthema subitum (roseola infantum sau a 6-a
boală a copilăriei) - în timp ce HHV-6A a fost detectat în principal la gazde imunocompromise2.
HHV-6 este un virus ADN, genomul său fiind înconjurat de un înveliş lipidic. Ca şi în cazul celorlalte
virusuri herpetice HHV-6 determină atât infecţii primare cât şi reactivări ale unor infecţii latente4.
HHV-6 este răspândit ubicuitar, 95% din populaţie prezentând anticorpi anti-HHV-6; transmisia
virusului se face în general prin intermediul salivei persoanelor infectate.
In vivo, HHV-6 infectează şi se replică la nivelul limfocitelor CD4 pozitive, prin intermediul receptorului
celular CD46, care este o glicoproteină transmembranară de 52-57kDa, ce interacţionează cu
glicoproteine virale: gH, gL, gQ1 sau gQ2.
În timpul infecţiei acute replicarea se produce în limfocite (B, T, NK), macrofage, histiocite, celule
endoteliale, hepatocite, glande salivare şi în sistemul nervos central. HHV-6A infectează cu predilecţie
celulele nervoase, în timp ce HHV-6B se găseşte mai frecvent în celulele mononucleare din sângele
periferic. Virusul produce citoliză directă, acest efect fiind responsabil pentru manifestările cutanate şi
cele asemănătoare mononucleozei infecţioase. HHV-6 creşte expresia CD4 pe suprafaţa limfocitelor
T determinând o creştere a susceptibilităţii la infecţia cu HIV.
Infecţia primară apare, după o perioadă de incubaţie de 1-2 săptămâni, de obicei, la sugari (40 – 50%
dintre copii fac boala în primul an de viaţă, procentul celor infectaţi ajungând la 77 – 82% până la
vârsta de 2 ani, cu un vârf între 9 şi 21 luni) şi este responsabilă de o treime din cazurile de convulsii
febrile la copiii cu vârsta între 6-24 luni. Aproximativ 25% din infecţiile cu HHV-6 se manifestă ca
exanthema subitum (roseola infantum), caracterizată prin febră ridicată ce durează 3-4 zile, urmată de
erupţii cutanate maculare sau maculopapuloase, care apar atunci când temperatura se normalizează.
Erupţiile cutanate încep de la trunchi sau gât, se răspândesc spre faţă şi membre şi au o durată ce
variază între câteva ore şi 2 zile. Boala mai poate fi acompaniată de: tuse, limfadenopatie cervicală
398
18
sau occipitală, iritabilitate, conjunctivită, edem palpebral, protruzia fontanelei, rinoree, sau diaree.
Manifestările clinice durează în medie 9 zile şi rareori se complică cu meningită sau encefalită.
HHV-6 constituie o cauză rară de meningită; virusul poate determina de asemenea encefalită la copii
aparent sănătoşi care se prezintă cu stare de conştienţă alterată, convulsii, psihoză sau paralizii de
nervi cranieni. În cele mai multe cazuri este vorba de panencefaliă care se poate asocia cu sechele
neurologice persistente2. HHV-6 ADN a fost detectat în LCR într-un procent de până la 57% la copiii
<1 an având convulsii febrile şi de asemenea la copiii ce prezintă convulsii febrile recurente1.
Infecţia acută cu HHV-6 este rară la adulţii imunocompetenţi şi se poate manifesta ca un sindrom
asemănător mononucleozei infecţioase cu febră, limfadenopatie, rash generalizat, hepatită fulminantă,
purpură trombocitopenică, miocardită sau encefalită.
După infecţia primară virusul rămâne latent în limfocite şi monocite, persistă la un nivel scăzut în
diverse celule sau ţesuturi şi se poate reactiva în momentul în care sistemul imunitar este compromis.
La persoanele imunocompetente această infecţie persistentă nu are nici o consecinţă.
Reactivarea HHV-6 este o manifestare frecventă la persoanele imunosupresate (50% din pacienţii
cu transplant de celule stem hematopoetice şi 33% din cei cu transplant de organe solide), ADN-ul
viral putând fi detectat în sângele periferic. Reactivările au loc în prima lună de la transplant şi sunt
mai frecvente la pacienţii trataţi cu anticorpi anti-CD3 sau corticosteroizi sau la cei care au suferit
un transplant alogenic sau cu celule stem din cordonul ombilical. Pacienţii prezintă frecvent febră
şi rash în perioada precoce posttransplant. HHV-6 infectează celulele progenitoare hematopoietice
inhibând formarea de colonii in vitro şi a fost asociat în unele studii cu supresia măduvei osoase şi
grefarea tardivă. 95% din reactivările virale la pacienţii cu transplant de celule stem hematopoetice
se datorează HHV-6B.
Manifestarea cea mai bine documentată la pacienţii imunosupresaţi este encefalita. Aceştia se
prezintă la un interval de 2-6 săptămâni de la transplant cu cefalee, confuzie, convulsii, psihoză sau
deficite la nivelul nervilor cranieni. În timp ce examenul CT este de obicei normal în faza iniţială, RMN-
ul indică anomalii la nivelul substanţei cenuşii din lobii temporali la 75% dintre pacienţi. Diagnosticul
pozitiv se stabileşte pe baza prezenţei virusului în lichidul cefalorahidian.
Au fost descrise şi cazuri de hepatită cu celule gigante, colită şi gastroduodenită asociate HHV-6 la
pacienţii cu transplant.
HHV-6 este mai rar implicat în apariţia encefalitei şi pneumoniei la pacienţii cu SIDA şi nu se consideră
că influenţează rata de progresie a infecţiei HIV către etapa SIDA.
HHV-6 a fost asociat cu scleroza multiplă pe baza detectării ADN-ului şi antigenelor virale în LCR
şi creier. Astfel, HHV-6 a fost găsit în nucleii oligodendrocitelor din leziunile pacienţilor cu sleroză
multiplă, cercetătorii descoperind o asociere puternică între prezenţa anticorpilor anti-HHV-6 IgM din
lichidul cefalorahidian şi fazele iniţiale ale sclerozei multiple. Unii susţin că infecţia virală joacă un rol
important în patogeneza bolii, prin mimetism molecular, proteinele virale reacţionând încrucişat cu
proteina bazică a mielinei. Cu toate acestea, investigaţii suplimentare sunt necesare pentru a defini
pe deplin rolul HHV-6 în scleroza multiplă2.
Diagnosticul pozitiv al unei infecţii primare poate fi demonstrat prin seroconversia anticorpilor IgG de
la negativ la pozitiv sau prin prezenţa anticorpilor IgM. Creşterea titrului anticorpilor IgG de 4 ori indică
o boală activă. Diagnosticul serologic nu poate diferenţia însă o infecţie primară de o reactivare. O
399
metodă alternativă de diagnostic este detectarea ADN-ului viral în ser sau plasmă înaintea apariţiei
anticorpilor, dar această metodă este mai puţin specifică decât seroconversia.
La persoanele imunocompromise este important să se facă diferenţa între infecţia latentă (fără
manifestări clinice) şi reactivare, lucru ce poate fi realizat prin determinarea ADN-ului viral în
plasmă2.
Recomandări pentru determinarea HHV-6 - ADN - utilitate în diagnosticul rapid al infecţiilor cu
HHV-64.
LCR3.
Prelucrare necesară după recoltare - a), b) probele nu vor fi centrifugate3.
anticoagulant3.
acizilor nucleici3.
produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (testul va fi efectuat din plasmă sau
LCR)3.
Valori de referinţă – HHV-6 ADN nedetectabil3.
Obţinerea unui rezultat pozitiv pentru HHV-6 ADN în plasmă, în prezenţa tabloului clinic, reprezintă
un indicator de infecţie activă.
Detectarea ADN-ului HHV-6 la nivelul lichidului cefalorahidian este sugestivă pentru o infecţie la
nivelul sistemului nervos central, dar nu are valoare diagnostică absolută (poate exista HHV-6 ADN
în LCR şi în cadrul altor afecţiuni SNC neasociate cu acest virus; de asemenea poate fi detectat şi la
pacienţi fără sindroame neurologice)1;2;4.
Un rezultat negativ nu exclude infecţia cu HHV-64.
Utilitatea testului PCR pentru diagnosticul infecţiilor cu HHV-6 este complicată de faptul că HHV-6 este
integrat în ADN-ul cromozomial la 0.7-1.5% din persoane. Celulele stem care conţin copii integrate
de HHV-6 transmit ADN viral primitorilor de transplant. Din acest motiv, dacă proba analizată conţine
leucocite este posibil să se obţină un rezultat pozitiv în absenţa unei infecţii active2.
Bibliografie
Supplement, 2004.
2. Jeffrey I. Cohen Human Herpes Types 6 and 7. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and
400
18
Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010, 2011-2014.
4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Human Herpesvirus-6, Molecular Detection,
PCR, Plasma, Varies. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
Virusul herpetic uman tip 7 - Human herpesvirus 7 (HHV-7) - a fost izolat în 1990 de către Frenkel şi
colaboratorii în limfocitele CD4 ale unui adult sănătos cu exanthema subitum. Face parte din subfamilia
β-herpesvirusurilor, genul Roseolovirus, prezentând omologie cu HHV-6 în proporţie de 20 - 75%.
Având în vedere caracterul ubicuitar al HHV-7, peste 80% din populaţie prezintă anticorpi anti-HHV-7
în ser. Infecţia cu HHV-7 apare mai târziu decât cea cu HHV-6; 18% dintre copii sunt infectaţi în primul
an de viaţă, procentul atingând 53% până la vârsta de 2 ani. Mulţi copii dezvoltă boala între 2 şi 5 ani,
transmisia virusului realizându-se, în general, prin intermediul salivei persoanelor infectate.
HHV-7 are tropism pentru limfocitele T CD4 pozitive, celulele epiteliale de la nivelul glandelor salivare,
precum şi celulele din plămâni şi tegument. De asemenea virusul a fost detectat în laptele matern.
HHV-7 rămâne cantonat în concentraţii crescute în salivă, atât la adulţi, cât şi la copii, pe toată durata
vieţii. Virusul induce degradarea moleculelor din clasa I a complexului major de histocompatibilitate.
Infecţia primară poate fi asimptomatică sau se caracterizează prin apariţia febrei (400C), convulsiilor
febrile, mai rar a vomei, diareei şi a manifestărilor de tract respirator superior.
HHV-7 este implicat de asemenea şi în apariţia exantemului subit (identic cu cel indus de HHV6),
deşi majoritatea cazurilor sunt induse de HHV-6. HHV-7 a fost asociat mai rar cu boală SNC decât
HHV-6.
HHV-7 poate determina encefalită atât la persoanele imunocompetente cât şi la cei imunosupresaţi.
Conform unui studiu, 10% din copiii spitalizaţi în Marea Britanie cu encefalită sau febră şi convulsii au
fost diagnosticaţi ca având infecţie acută cu HHV-7.
Diagnosticul pozitiv al unei infecţii cu HHV-7 se bazează pe seroconversia IgG de la negativ la pozitiv
sau prin prezenţa anticorpilor IgM. În absenţa anticorpilor, o metodă alternativă de diagnostic este
detectarea ADN-ului viral în ser sau plasmă, prezenţa acestuia indicând o infecţie acută2.
Recomandări pentru determinarea HHV-7ADN - utilitate în diagnosticul rapid al infecţiilor cu HHV-
72;3.
LCR3.
401
Prelucrare necesară după recoltare - a), b) probele nu vor fi centrifugate3.

anticoagulant3.
acizilor nucleici3.
produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (testul va fi efectuat din plasmă sau
LCR)3.
Valori de referinţă – HHV-6 ADN nedetectabil3.
Obţinerea unui rezultat pozitiv pentru HHV-7 ADN în plasmă, în prezenţa tabloului clinic, reprezintă un
indicator de infecţie activă2.
Detectarea ADN-ului HHV-7 la nivelul lichidului cefalorahidian este sugestivă pentru o infecţie la
nivelul sistemului nervos central, dar nu are valoare diagnostică absolută (poate exista HHV-7 ADN în
LCR şi la pacienţi fără sindroame neurologice)1.
Un rezultat negativ nu exclude infecţia cu HHV-73.
Bibliografie
Supplement, 2004.
2. Jeffrey I. Cohen Human Herpes Types 6 and 7. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and
Virusul herpetic uman tip 8 - Human herpesvirus 8 (HHV-8) - a fost izolat în 1994 de către Chang,
Moore şi colaboratorii, în urma analizei PCR a leziunilor din sarcomul Kaposi, fiind numit iniţial
herpes virus asociat sarcomului Kaposi (KSHV). HHV-8 este singurul rhadinovirus uman (gamma-2
herpesvirus) cunoscut şi este implicat în etiologia sarcomului Kaposi, bolii Castleman multicentrice şi
PEL (primary effusion lymphoma = limfom primar cavitar)2.
KSHV este un virus ADN dublu catenar, învelit de o nucleocapsidă, înconjurată de un tegument
amorf şi închise de o anvelopă ce prezintă proiecţii scurte. ADN-ul viral, iniţial liniar, devine circular
402
18
spontan, imediat după decapsidare în nucleii celulelor infectate. Genomul HHV-8 de ~ 165 kb conţine
aproximativ 100 de cadre deschise de citire (ORFs) aranjate într-o regiune lungă unică flancată
de mai multe unităţi repetitive (de 0.8 kb) cu conţinut ridicat în citozină şi guanină. Regiunea lungă
conţine secvenţe de gene conservate găsite în cele mai multe herpesvirusuri, intercalate cu secvenţe
specifice pentru HHV-8. De asemenea un număr de gene KSHV prezintă omologie cu unele gene
umane. Aceasta se datorează probabil faptului că virusul, de-a lungul evoluţiei sale, a „piratat”
numeroase gene din celulele gazdă: gene care codifică proteina de legare a complementului (ORF
4), citokine IL6-like (ORF K2), chemokine (ORF K4, ORF K4.1 şi ORF K6), factorul antiapoptotic
Bcl-2 (ORF 16), factorul de reglare a interferonului (ORF K9), ciclina D (ORF 72), proteina inhibitoare
FLICE (ORF K13), molecule de adeziune celulară (ORF K14), receptorul cuplat cu proteine G (ORF
74), dihidrofolat reductaza, timidin kinaza, timidilat sintetaza, ADN-polimeraza. Studii funcţionale
sugerează că aceste gene piratate ar putea ajuta virusul să se sustragă răspunsului imun, să prevină
oprirea ciclului celular şi să întrerupă activarea căilor apoptotice. Această strategie a fost denumită
“piraterie moleculară”1;2;5.
După infecţie, virusul pătrunde la nivelul limfocitelor şi rămâne într-o stare latentă. În această
perioadă genomul viral devine circular prin fuziune cap-coadă şi persistă sub forma unui episom
extracromozomial (plasmidă) aflat în copii multiple (10 - 50 copii) în interiorul nucleului. Doar ~ 5
gene sunt activate în cursul infecţiei latente, având rolul de a promova supravieţuirea celulară şi
tumorigeneza. Gena care codifică antigenul nuclear asociat cu latenţa (LANA sau ORF 73) asigură
replicarea ADN-ului viral şi legarea episomilor la cromozomi în timpul mitozei. Ciclina D virală (ORF
72) stimulează trecerea din stadiul G1 în S, este rezistentă la numeroşi factori inhibitori şi determină
diviziunea necontrolată a celulelor. FLICE activează factorul nuclear kappa B şi inhibă apoptoza2.
În cazul în care virusul se reactivează şi intră în starea litică, începe replicarea virală a episomului,
sub formă de molecule ADN liniare (fiecare unitate genomică este tăiată la nivelul regiunii terminale
repetitive), care sunt asamblate în particule virale, ce sunt ulterior eliminate din celulă, cu rolul de a
infecta celule noi sau de a fi transmise la o nouă gazdă. În timpul replicării litice, o singură celulă poate
produce mii de particule virale, care de obicei determină şi moartea acesteia1;2.
Spre deosebire de celelalte herpesvirusuri, HHV-8 nu induce infecţii cu caracter ubicuitar, acestea
fiind limitate în populaţia generală. Persoanele din Africa sub-sahariană prezintă rata cea mai mare
a infecţiei (~50% din populaţie). Seroprevalenţa în regiunea mediteraneană este de ~10%, deşi în
anumite zone din Italia poate atinge 30%. În SUA prevalenţa anticorpilor specifici este de 5%, în timp
ce în Japonia de numai 0.2%. Există mai multe modalităţi de transmitere a infecţiei: contact sexual (în
special la homosexuali), prin saliva persoanelor infectate, transfuzii de sânge, transplant de organe
solide de la donatori seropozitivi2;4.
Infecţia primară cu HHV-8
Identificarea infecţiei primare cu HHV-8 este dificilă din cauza incidenţei scăzute a infecţiei în cele
mai multe populaţii studiate şi din cauza lipsei de trăsături specifice care să definească boala. Cele
mai multe infecţii sunt asimptomatice sau prezintă manifestări nespecifice, cum ar fi: febră, diaree,
astenie, rinoree, erupţii cutanate localizate, limfadenopatie sau artralgii. Într-un studiu clinic efectuat
recent, 2 dintre pacienţii care au suferit transplant renal au dezvoltat la 4 luni de la intervenţie o infecţie
primară cu HHV-8 de la acelaşi donator pozitiv (un pacient a prezentat sindrom Kaposi diseminat, iar
403
celălalt sindrom febril, splenomegalie, citopenie şi aplazie medulară cu plasmocitoză). Deşi există
puţine studii în acest sens, se pare că infecţiile primare pot fi letale în contextul imunosupresiei, în timp
ce la persoanele sănătoase infecţia este autolimitantă2.
Sarcomul Kaposi (SK) a fost descris pentru prima dată în 1872 de către dermatologul ungur Moritz
Kaposi, ca fiind o tumoră agresivă ce afectează pacienţii tineri.
La indivizii sănătoşi nu s-a decelat HHV-8, însă virusul a fost izolat la 52% din bolnavii SIDA cu SK şi
la 8 % din cei fără SK. S-a arătat că peste 55% din bolnavii infectaţi HIV la care s-a izolat HHV-8 au
sau vor face SK în următoarele luni1.
SK este endemic în Africa ecuatorială sub-sahariană, reprezentând 10-17% din totalul tumorilor
maligne ale adulţilor. În altă regiuni ale globului SK este rar, fiind decelat la persoane adulte din bazinul
mediteranean şi Europa de Est. În Statele Unite SK afectează în primul rând pacienţii cu SIDA.
Sarcomul Kaposi este o tumoră vasculară, ce apare la nivelul tegumentului, mucoaselor şi viscerelor,
cu evoluţie ce merge de la forme indolente, cu afectare minimă a tegumentului sau ganglionilor
limfatici, până la forme fulminante, cu manifestări viscerale şi cutanate extensive. Un diagnostic de
sarcom Kaposi se bazează pe biopsia din leziunea suspectă. Histologic se observă proliferarea
celulelor fusiforme endoteliale şi extravazarea eritrocitelor. În cazurile depistate precoce pot fi
observate macrofage încărcate cu hemosiderină şi celule inflamatorii2;5.
Clinic, sarcomul Kaposi se prezintă sub 4 forme: clasic, asociat cu SIDA, asociat cu afecţiuni ce
determină imunosupresie şi endemic.
Sarcomul Kaposi clasic apare mai ales la pacienţii vârstnici din regiunea mediteraneană şi Europa de
Est; leziunile se găsesc la nivelul extremităţilor şi au o evoluţie lentă.
Forma endemică a sarcomului Kaposi se întâlneşte mai frecvent în Africa, predominant la bărbaţi
(bărbaţi:femei = 20:1) şi copii HIV negativi. Din punct de vedere clinic, se aseamănă cu forma clasică,
dar apariţia bolii la copiii sub vârsta de 10 ani are o evoluţie agresivă, adeseori fatală.
Sarcomul Kaposi asociat cu SIDA apare la pacienţii cu infecţie HIV şi reprezintă forma cea mai agresivă
clinic a sarcomului. Poate apărea în orice stadiu al infectiei HIV, chiar cu valori normale ale limfocitelor
T CD4+. Morbiditatea şi mortalitatea apar prin afectare cutanată (leziunile sunt mai frecvente la nivelul
feţei), gastrointestinală sau pulmonară extinsă. La pacienţii cu terapie HAART boala are o evoluţie mai
lentă sau poate regresa spontan1;2;5.
Sarcomul Kaposi iatrogen apare la persoanele imunocompromise după transplant de organe sau la
cei care primesc terapie imunosupresivă, incidenţa sa fiind mai crescută la persoanele cu transplant
renal decât alte tipuri de imunosupresie (incidenţă de până la 5%). Transmiterea infecţiei HHV-8
prin intermediul organelor transplantate de la donatori seropozitivi constituie un factor de risc pentru
dezvoltarea SK asociat cu transplantul. Reducerea terapiei imunosupresoare determină remisia
sarcomului Kaposi1;2;4.
Limfomul asociat cu HHV-8 (PEL) a fost descris pentru prima dată în 1989 la pacienţi infectaţi cu
HIV, ca o categorie specială de limfoame ce se dezvoltă la nivelul cavităţilor seroase (pleură, pericard,
peritoneu). Este o afecţiune rară ce este responsabilă de 3% din limfoamele asociate cu HIV şi 0.4%
din limfoamele non-Hodgkin cu celule mari ale persoanelor HIV negative.
Are o morfologie distinctă comparabilă cu limfomul imunoblastic şi cu limfomul anaplazic cu celule
mari şi apare frecvent la bărbaţi. Se prezintă ca un revărsat limfomatos ce rămâne localizat la nivelul
404
18
cavităţii de origine. Celulele maligne exprimă imunoglobuline clonale şi CD45 pe suprafaţă indicând
originea în limfocitele B, deşi antigenele specifice celulei lipsesc. Celulele tumorale infectate cu HHV-8
sunt frecvent coinfectate cu virusul Epstein-Barr.
Prognosticul este rezervat, decesul producându-se în câteva luni de la diagnostic1;2.
Boala Castleman este o afecţiune limfoproliferativă rară, descrisă în 1956, ce se prezintă sub 2 forme:
localizată şi multicentrică. Forma localizată nu este asociată cu HHV-8. Virusul este asociat aproape
întotdeauna (80%) cu boala Castleman la pacienţii HIV pozitivi şi în circa 50% cazuri la persoanele
HIV negative. Celulele infectate cu HHV-8 sunt localizate în zona de manta a foliculului limfatic de
la nivelul ganglionilor. IL-6, interleukina care determină diferenţierea limfocitelor B în plasmocite, se
găseşte în concentraţii crescute în centrul germinativ al foliculului limfatic, explicând numărul mare de
plasmocite în ser.
Forma multicentrică se asociază cu febră, hepatosplenomegalie şi limfadenopatie generalizată, are o
evoluţie agresivă, frecvent fatală.
Diagnosticul pozitiv al unei infecţii cu HHV-8 poate fi demonstrat prin detectarea ADN-ului viral în
plasmă sau în celulele mononucleare din sângele periferic.
Recomandări pentru determinarea HHV-8 ADN - utilitate în diagnosticul infecţiilor cu HHV-83.
Cauze de respingere a probei – probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant3.
Stabilitate probă - probele de sânge sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor
nucleici3.
Valori de referinţă - HHV-8 ADN nedetectabil3.
Detectarea HHV-8 ADN în celulele mononucleare din sângele periferic la pacienţii HIV pozitivi fără
sarcom Kaposi este predictivă pentru dezvoltarea leziunilor ulterioare.
Viremia HHV-8 este mai mare la persoanele cu forme avansate de sarcom comparativ cu stadii
incipiente şi, de asemenea, valori ridicate se înregistrează la formele asociate cu HIV faţă de cele
clasice. Încărcătura virală din celulele mononucleare din sângele periferic este mai mică la bolnavii
cu sarcom în remisie faţă de cei cu boală activă. Deşi există corelaţie între viremie şi activitatea
bolii, folosirea acesteia pentru monitorizarea evoluţiei şi tratamentului sarcomului Kaposi este limitată
deoarece concentraţiile plasmatice sunt prea mici.
Pacienţii cu limfom au un nivel al viremiei mai ridicat decât cei cu sarcom Kaposi, dar mai scăzut decât
cei cu boală Castleman.
Încărcarea virală atât în plasmă, cât şi în celulele mononucleare din sângele periferic este la un nivel
405
suficient de ridicat pentru ca viremia să fie folosită în monitorizarea evoluţiei şi tratamentului bolii
Castleman. Faza activă a bolii se asociază cu valori crescute ale viremiei, spre deosebire de stadiul
de remisiune caracterizat de nivele scăzute de ADN HHV-81;2.
Bibliografie
1. Daniel C Edelman. Human herpesvirus 8 – A novel human pathogen. In Virology Journal, 2005,
2:78.
2. Kenneth M. Kaye. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Tzpe 8. In Mandell, Douglas,and
Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone,
Elsevier, 2010, 2017-2021.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories Test Catalogs and Guides. Human Herpesvirus-8
Antibody, IgG, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. Victoria Arama,. Madelena I. Dragan. Infecţii cu virusuri herpetice. În Boli infecţioase pentru
studenţii facultăţilor de Stomatologie, UMF Bucureşti, 1998.
18.3.30 Virus herpes simplex 1/2 (HSV) - ADN
Tipurile 1 şi 2 de virus herpes simplex (HSV-1, HSV-2) sunt responsabile de o varietate largă de
afecţiuni, de la infecţii cutaneo-mucoase până la infecţii SNC şi infecţii ocazionale ale organelor
viscerale, unele dintre acestea cu potenţial letal. HSV-1 este asociat în principal cu infecţii oculare şi
orale, în timp ce HSV-2 determină leziuni genitale.
Deşi HSV-1 şi HSV-2 sunt cele mai apropiate herpesvirusuri, acestea constituie entităţi serologice şi
genetice distincte.
Genomul HSV are o structură ADN bicatenară, liniară; molecula ADN este alcătuită din două domenii
unice, L (lung) şi S (scurt), legate covalent. Între cele 2 tipuri de virus herpetic există o omologie
a secvenţelor de 50%. Regiunile cu specificitate de tip sunt importante pentru răspunsul imun al
gazdei3.
HSV este răspândit ubicuitar; majoritatea populaţiei (>80%) prezintă anticorpi anti-HSV ceea ce indică
o expunere foarte frecventă la acest virus. Transmiterea se face prin contactul apropiat cu persoanele
infectate (cel mai adesea prin salivă şi secreţii genitale). De asemenea mamele cu leziuni active în
cursul travaliului pot transmite infecţia non-născutului3;6.
Expunerea la HSV a suprafeţelor mucoase şi a soluţiilor de continuitate de la nivelul tegumentului
facilitează pătrunderea virusului şi replicarea în celulele epiteliale la locul de intrare. Iniţial infecţia
HSV este adesea subclinică, fără leziuni aparente. O dată cu replicarea locală şi depăşirea barierei
mucoase virusul pătrunde în terminaţiile nervilor senzitivi sau autonomi şi este transportat pe cale
406
18
axonală la corpii neuronali din ganglionii regionali corespunzători regiunii anatomice a infecţiei iniţiale.
În cazul infecţiei HSV-1 este afectat în mod obişnuit ganglionul nervului trigemen, în timp ce pentru
HSV-2 se descrie cel mai frecvent afectarea ganglionului rădăcinii nervului sacral (S2-S5). Replicarea
virusului se produce în ganglioni şi în ţesutul neuronal contiguu doar în cursul infecţiei primare. După
inocularea iniţială în ganglioni virusul se răspândeşte către alte suprafeţe cutanate sau mucoase, prin
migrarea centrifugă a virionilor infecţioşi de-a lungul nervilor senzitivi periferici. Acest fenomen de
migrare explică dezvoltarea caracteristică de leziuni noi, la distanţă de grupul iniţial de vezicule apărut
la pacienţii cu infecţie HSV primară, orolabială sau genitală. Răspândirea contiguă a virusului se poate
produce şi prin auto-inoculare. Viremia este prezentă la 25% dintre infecţiile primare HSV-2 şi poate
afecta evoluţia naturală a infecţiei, din punct de vedere al localizării, severităţii şi frecvenţei reactivării.
După rezoluţia infecţiei primare HSV infecţios nu mai poate fi izolat în cultură; cu toate acestea ADN-
ul viral este prezent în 2-11% dintre celulele ganglionare corespunzătoare sediului iniţial al infecţiei.
Astfel, mai mulţi neuroni pot contribui la reactivare. Mecanismul reactivării nu este cunoscut; aceasta
poate fi indusă de stimuli diverşi, cum ar fi: traume, stress, expuneri la radiaţii, factori hormonali. Ciclul
replicativ este productiv, citolitic, manifestându-se clinic prin erupţia veziculoasă caracteristică.
Tabloul clinic şi evoluţia infecţiilor HSV depind de regiunea anatomică afectată, de vârsta şi statusul
imun al gazdei, precum şi de tipul antigenic al virusului3.
Infecţia primară (primoinfecţia) poate fi adesea asimptomatică; în acelaşi timp ambele tipuri virale pot
cauza infecţii genitale şi orofaciale. Cazurile severe de infecţie primară sunt însoţite de simptome şi
semne sistemice, asociază atât afectări ale mucoaselor cât şi a regiunilor extramucoase, prezintă o
rată mai mare de complicaţii şi o durată mai lungă a manifestărilor clinice.
Infecţia recurentă constă în reapariţia episodică a simptomatologiei în teritoriul afectat anterior de
primoinfecţie. Expresia clinică a recurenţei este mai puţin severă decât cea a infecţiei primare.
Frecvenţa reactivării este influenţată de regiunea anatomică şi tipul virusului.
Gingivostomatita şi faringita sunt cele mai frecvente manifestări clinice ale infecţiei primare HSV-1.
Keratoconjunctivita se caracterizează secreţii oculare nepurulente, erupţie veziculară a pleoapelor,
ulceraţie corneană care poate conduce în cazuri grave la cecitate.
Eczema herpeticum este o formă gravă de suprainfecţie cu HSV la persoanele cu eczemă sau alte
afecţiuni dermatologice.
În cazul herpesului genital vârsta medie de apariţie pentru ambele sexe este de 20-24 ani. Leziunile
veziculo-ulcerative sunt localizate pe vulvă, vagin, cervix la femei, penis la bărbaţi, precum şi în
regiunile perianală sau anală. Printre complicaţiile herpesului genital se numără meningismul (28%
din cazuri) şi meningita aseptică (5% din cazuri)3;4;6.
Nou-născuţii dobândesc infecţia HSV prin contactul cu secreţiile infectate, cel mai adesea în cursul
travaliului. 90% din herpesul neonatal este contractat perinatal, 5-8% este congenital şi câteva cazuri
sunt dobândite postnatal prin contactul cu membri ai familiei sau personalul sanitar care prezintă
infecţie HSV-1 orolabială simptomatică sau asimptomatică. 70% din cazurile de herpes neonatal sunt
cauzate de HSV-2 şi dobândite majoritar în cursul travaliului. Herpesul congenital este cauzat aproape
invariabil de infecţii materne primare atât cu HSV-1 cât şi cu HSV-2; nou-născuţii afectaţi prezintă
microcefalie, hidrocefalie şi corioretinită3;5;6.
În ceea ce priveşte sindroamele SNC, infecţia primară sau recurentă cu HSV-1 este asociată
407
predominat cu encefalita herpetică; sindroamele SNC asociate în principal cu infecţia HSV-2 includ
meningita, meningita aseptică recurentă (Mollaret’s) şi meningoencefalita neonatală. Introducerea
testelor PCR care detectează HSV-ADN în lichidul cefalorahidian a permis identificarea unor forme
uşoare sau atipice de encefalită herpetică care iniţial au fost atribuite altor virusuri. De asemenea
depistarea ADN-HSV în LCR a stabilit diagnosticul şi rolul etiologic al HSV-1 în encefalita trunchiului
cerebral, mielită, encefalita multifocală sau difuză fără afectarea lobului temporal survenită la copii,
encefalita neonatală2.
Infecţia HSV diseminată se manifestă prin vezicule multiple, pe suprafeţe extinse ale trunchiului şi ale
extremităţilor; reprezintă o complicaţie rară a herpesului cutaneo-mucos primar. Diseminarea cutanată
se produce de obicei în stadii precoce ale bolii şi este adesea asociată cu meningită aseptică, hepatită
sau pneumonie. Alte complicaţii ale infecţiei primare cu HSV-2 includ: monoartrita, trombocitopenia,
necroza suprarenaliană şi mioglobinuria. Sarcina poate predispune de asemenea la infecţii viscerale
diseminate3.
Pacienţii imunodeprimaţi prezintă un risc crescut de a dezvolta infecţii HSV severe. Datorită infecţiilor
cutanate extinse HSV poate disemina în organe viscerale cum ar fi: ficatul, plămânul, glandele
suprarenale, măduva osoasă şi tractul gastrointestinal. Diseminarea viscerală este rezultatul
viremiei1;3.
Criteriile clinice sunt esenţiale pentru stabilirea diagnosticului de infecţie HSV. Cu toate acestea,
având în vedere impactul diagnosticului unei boli cu transmitere sexuală ce poate evolua toată viaţa,
un management corect al pacientului ar trebui să includă şi confirmarea laboratorului. Cea mai bună
metodă de confirmare a infecţiei HSV este detectarea rapidă a HSV-ADN în produsele prelevate
din leziuni, prin tehnici de hibridizare in situ sau PCR. Detectarea ADN-ului viral este de 3-4 ori mai
sensibilă decât izolarea virusului în cultură3.
Recomandări pentru determinarea HSV - ADN - diagnosticul infecţiilor HSV; astfel:
1. HSV – ADN în sânge: detectarea precoce a infecţiilor HSV cu potenţial crescut de diseminare,
în special la persoanele imunodeprimate (viremia HSV este un fenomen tranzitor la un
număr redus de pacienţi cu infecţie genitală, dar poate fi important în dezvoltarea bolii
diseminate); diagnosticul precoce al infecţiei neonatale diseminate1;4.
2. HSV – ADN în leziune: diagnosticul diferenţial al leziunilor cutanate mai ales în cazul
aspectelor atipice; în herpesul genital metoda PCR detectează ADN-HSV chiar în perioadele
tardive de evoluţie a leziunilor3;4;5;6.
3. HSV – ADN în LCR: diagnosticul sindroamelor SNC asociate cu HSV (sensibilitate
şi specificitate >95% pentru meningită, meningită aseptică recurentă Mollaret’s,
meningoencefalită neonatală, boala diseminată); constituie metoda “gold standard” pentru
diagnosticul infecţiilor SNC2;5.
Specimen recoltat - a) sânge venos; b) produs prelevat din leziune pe tampon uscat; c) lichid
cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară4.
Recipient de recoltare - a) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant; b) tampon fără mediu de
transport; c) recipient steril4.
Cantitate recoltată - a) cât permite vacuumul; c) minimum 2 mL4.
408
18
Prelucrare necesară după recoltare - a), c) probele nu vor fi centrifugate4.

anticoagulant4.
Stabilitate probă - probele de sânge, produs din leziune sau LCR sunt stabile 48 ore la 2-4°C înainte
de extracţia acizilor nucleici4.
produsului PCR acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise (test calitativ); testul face diferenţa
între HSV-1 şi HSV-24.
HSV-1-ADN: nedetectabil;
HSV-2-ADN: nedetectabil4.
Detecţia HSV-ADN în diverse produse patologice susţine diagnosticul clinic de infecţie datorată
acestui virus5.
Detecţia viremiei se corelează cu diseminarea virală atât la persoanele imunocompetente cât şi la
cele imunodeprimate şi este asociată cu o rată crescută de mortalitate1.
În encefalita herpetică HSV-ADN poate fi depistat de obicei în LCR imediat după debutul simptomelor
neurologice şi rămâne pozitiv în prima săptămână de tratament antiviral2. HSV-ADN nu este detectat
în lichidul cefalorahiadian al pacienţilor care nu prezintă infecţie SNC cauzată de virus5.
Un rezultat negativ nu elimină posibilitatea unei infecţii HSV, în special la nivel SNC5.
Bibliografie
1. Berrington William R et al. Clinical Correlates of Herpes Simplex Virus Viremia among
Hospitalized Adults. In Clinical Infectiuos Diseases, 2009, vol.49, no.9, 1295-1301. In HERPES
11 Supplement 2, 2004.
2. Guy Boivin. Diagnosis of Herpesvirus Infections of the Central Nervous System. . In HERPES
11, Supplement, 2004.
3. Joshua T. Schiffer. Herpes Simplex Virus. In Mandell, Douglas,and Bennett’s Principles and
5. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog Herpes Simplex Virus (VZV), Molecular
Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 980-989.
409
18.3.31 Virus varicelo-zosterian (VZV) - ADN
Virusul varicelo-zosterian (VZV) face parte din familia Herpesviridae; conţine un ADN dublu catenar
localizat central şi înconjurat de o anvelopă6.
VZV produce leziuni veziculare dermice ce se exprimă clinic ca varicelă (infecţie primară) sau herpes
zoster (reactivare). Infecţia primară se manifestă în special la copiii sub 10 ani printr-o erupţie veziculo-
pustuloasă generalizată care este în majoritatea cazurilor autolimitată. La copiii imunodeprimaţi
elementele cutanate sunt mai numeroase, au adesea o bază hemoragică, se vindecă mai greu, iar
uneori se suprainfectează cu bacterii Gram pozitive3;5;6.
Complicaţiile varicelei sunt rare şi afectează predominat SNC şi plămânul. Anomaliile neurologice
includ ataxia cerebeloasă acută, encefalita, meningita, mielita transversă. Ataxia cerebeloasă
(prevalenţă 1 la 4000 cazuri) se dezvoltă cel mai adesea în decurs de 1 săptămână de la debutul
exantemului, dar poate să apară chiar şi după 21 zile. La copii constituie de obicei o complicaţie
benignă care se remite într-un interval de 2-4 săptămâni; prin tehnici PCR poate fi detectat VZV-ADN
în lichidul cefalorahidian. O complicaţie mai gravă este encefalita, care este însoţită de o mortalitate
de 5-20% şi de sechele neurologice la 15% dintre supravieţuitori. De asemenea, o complicaţie severă
care survine adesea la adulţi şi la pacienţii imunodeprimaţi este pneumonia variceloasă (dispnee cu
tahipnee, tuse, febră, modificări radiologice de tip interstiţial) care poate fi letală pentru gravidele aflate
în trimestrul II sau III de sarcină6.
Dacă infecţia primară survine în primele 28 săptămâni de sarcină există un risc de 1-2% de afectare
fetală (sindromul varicelei fetale sau varicela congenitală). VZV-ADN poate fi detectat prin tehnica PCR
în lichidul amniotic; testul are o sensibilitate foarte mare, dar o specificitate redusă pentru sindromul
varicelei fetale. Cu toate acestea nu a fost descris nici un caz de afectare fetală în asociere cu un
VZV-ADN nedetectabil în lichidul amniotic. Riscul de varicelă congenitală este mare dacă prezenţa
VZV-ADN în lichidul amniotic este însoţită de modificări ecografice sugestive1.
Dacă infecţia mamei se produce la termen, există un risc semnificativ de varicelă a nou-născutului, cu
mortalitate de până la 30%1;6.
După infecţia primară cu VZV virusul persistă într-o stare latentă în ganglionii senzitivi de pe traiectul
rădăcinii dorsale a nervilor spinali şi a nervilor cranieni. Reactivările se produc la 10-20% dintre
adulţi, mai frecvent după vârsta de 50 ani şi se manifestă printr-o erupţie veziculară unilaterală cu
distribuţie dermatomală5. În cadrul herpes zosterului pot exista afectări SNC exprimate clinic ca
meningoencefalită sau encefalită. O complicaţie rară care apare după herpes zoster ophthalmicus
este angeita granulomatoasă cerebrală. La persoanele imunodeprimate evoluţia herpes zosterului
este mai severă şi mai îndelungată. Pacienţii cu limfoproliferări maligne au risc crescut de diseminare
cutanată şi afectare viscerală (pneumonie, hepatită şi meningoencefalită)6.
Leziunile caracteristice sugerează de obicei diagnosticul de herpes zoster. Totuşi, atât virusul herpes
simplex (HSV) cât şi virusurile Coxsackie pot produce leziuni veziculare dermatomale. Pentru
diagnosticul diferenţial se poate recurge la detectarea ADN-ului viral din leziuni, care este rapidă şi
mai sensibilă decât izolarea virusului în culturi de celule4.
Recomandări pentru determinarea VZV - ADN - diagnosticul infecţiilor VZV; astfel:
410
18
1. VZV – ADN în sânge: detectarea precoce a infecţiilor VZV complicate la pacienţii cu

imunodepresie severă (ex. post-transplant medular) în vederea instituirii tratamentului
antiviral3;6.
2. VZV – ADN în leziune: diagnosticul diferenţial al leziunilor cutanate4;6.
3. VZV – ADN în LCR: diagnosticul sindroamelor SNC asociate cu VZV (sensibilitate şi
specificitate >95% pentru zoster sine herpete, meningită aseptică, encefalită, mielită
transversă, vasculită SNC, cerebelită); cel mai mult beneficiază de testare pacienţii cu
sindroame neurologice fără erupţie concomitentă; testul PCR este mai util în diagnosticul
complicaţiilor neurologice ale varicelei; pentru sindroamele SNC asociate cu herpes zoster
este nevoie de mai multe date care să susţină utilitatea testării, deoarece VZV-ADN a fost
detectat în lichidul cefalorahidian al unor pacienţi cu infecţii cutanate necomplicate2.
4. VZV – ADN în lichid amniotic: diagnosticul infecţiei fetale cu VZV1;6.
Specimen recoltat - a) sânge venos; b) produs prelevat din leziune pe tampon uscat; c) lichid
cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară; d) lichid amniotic3.
Recipient de recoltare - a) vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant; b) tampon fără mediu de
transport; c) şi d) recipient steril3.
Cantitate recoltată - a) cât permite vacuumul; c) şi d) minimum 2 mL3.
Prelucrare necesară după recoltare - a), c), d) probele nu vor fi centrifugate3.
anticoagulant3.
Stabilitate probă - probele de sânge, produs din leziune, LCR sau lichid amniotic sunt stabile 48 ore
la 2-4°C înainte de extracţia acizilor nucleici3.
Valori de referinţă - VZV - ADN nedetectabil3.
Detecţia VZV-ADN în diverse produse patologice susţine diagnosticul clinic de infecţie datorată
acestui virus5.
Un rezultat negativ nu elimină posibilitatea unei infecţii VZV, în special la nivel SNC5.
Bibliografie
1. Ashraf Fouda. Chickenpox in Pregnancy. www.obgyn.net/educational-tutorial. Ref Type: Internet

Communication.
Supplement, 2004.
4. Mark J. Espy et al. Diagnosis of Varicella-Zoster Virus Infections in the Clinical Laboratory by
411
LightCycler PCR. In J Clin Microbiol. 2000 September; 38(9): 3187–3189.

5. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Varicella-Zoster Virus (VZV), Molecular
6. Richard J. Whitley. Varicella-Zoster Virus. In Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and
18.3.32 Virusul rubeolei - ARN
Rubeola, una din bolile exantematoase ale copilăriei, este produsă de un togavirus cu ARN
monocatenar. În mod obişnuit copiii prezintă febră şi o erupţie maculo-papulară tranzitorie, în timp
ce la adulţi manifestările cutanate, adesea discrete, sunt precedate de o fază prodromală de 1-5 zile
asociată cu limfadenopatie (cel mai frecvent în regiunea cervicală) şi semne constituţionale. Totuşi
multe cazuri rămân subclinice2.
Infecţia cu virusul rubeolei are o evoluţie autolimitantă şi, spre deosebire de rujeolă, complicaţiile sunt
rare. Aproximativ o treime din femeile cu rubeolă pot prezenta artrită sau artralgii; aceste complicaţii
sunt neobişnuite la copii şi bărbaţi. Cel mai adesea sunt afectate articulaţiile pumnului şi genunchiului;
manifestările se remit lent (pot dura până la o lună) şi rareori se poate dezvolta o artrită cronică.
Complicaţiile hemoragice au o incidenţă redusă (~1 la 3000 cazuri), afectează în special copiii şi
sunt consecinţa atât a trombocitopeniei, cât şi a leziunilor vasculare, care sunt probabil mediate
imunologic. Encefalita este o complicaţie extrem de rară a rubeolei, se manifestă în principal la adulţi
şi este însoţită de o mortalitate ridicată (20-50%); pacienţii care supravieţuiesc encefalitei nu prezintă
de obicei sechele neurologice1.
ARN-ul viral poate fi detectat prin RT-PCR în secreţii nazofaringiene, sânge integral, ser şi urină în
cursul primelor 7 zile de la debutul erupţiei5.
Rubeola poate avea consecinţe dezastruoase dacă înfecţia primară a mamei se produce în primul
trimestru de sarcină; virusul infectează placenta, este transmis fătului şi poate conduce la moartea
acestuia, naştere prematură sau la un spectru larg de anomalii congenitale. Incidenţa rubeolei
congenitale într-o populaţie dată este extrem de variabilă, fiind influenţată de numărul persoanelor
susceptibile, circulaţia virusului în comunitate şi de modul de implementare a vaccinării faţă de virusul
rubeolei.
Efectele virusului rubeolei asupra fătului depind în mare măsură de momentul în care s-a produs
infecţia; în general, cu cât vîrsta gestaţională la care s-a contractat infecţia este mai mică, cu atât
afectarea fetală este mai severă. Astfel, în primele 2 luni de sarcină riscul de afectare fetală este
de 65-85%, având drept rezultat defecte congenitale multiple, avort spontan sau ambele. Rubeola
dobândită în cursul celei de a treia luni de viaţă intrauterină a fost asociată cu un risc de 30-35%
de dezvolta un defect unic, cum ar fi surditatea sau cardiopatia congenitală. În cea de-a patra lună
412
18
există un risc de 10% ca fătul să dezvolte un defect congenital unic1. Detecţia prin RT-PCR a ARN-
ului viral în lichidul amniotic are o sensibiliate şi o specificitate de aproape 100% pentru diagnosticul
infecţiei congenitale4. Defectele sunt rareori întâlnite în cazul în care infecţia mamei s-a produs după
săptămăna 20 de sarcină1.
Sindromul rubeolei congenitale asociază manifestări oftalmice (cataractă, microftalmie, glaucom,
retinopatie pigmentară, corioretinopatie), auditive (surditate), cardiace (persistenţa canalului arterial,
defecte septale ventriculare, stenoza arterei pulmonare periferice) şi craniofaciale (microcefalie)5.
Expunerea secundară la virus sau reinfecţia se asociază extrem de rar cu transmiterea intrauterină a
virusului, indicând faptul că imunitatea mamei (dobândită natural sau indusă prin vaccinare) conferă
protecţie împotriva infecţiei in utero2.
Nou-născutul cu infecţie congenitală excretă virusul în urină o perioadă de timp îndelungată (luni
sau chiar ani) fiind astfel contagios pentru persoanele din jur4;5. Printre manifestările neonatale ale
sindromului rubeolei congenitale se numără meningoencefalita, hepatita, hepatosplenomegalia,
pneumonita interstiţială, trombocitopenia (care poate fi fatală), modificările radiologice caracteristice
ale oaselor lungi (radiotransparenţă)5. RT-PCR efectuat în diverse produse patologice recoltate la
nou-născut (sânge, urină, lichid cefalo-rahidian) reprezintă un instrument util pentru confirmarea
diagnosticului de infecţie congenitală cu virusul rubeolei1;2;4;5.
Recomandări pentru determinarea virusului rubeolei - ARN - diagnosticul pre- şi postnatal al
infecţiilor congenitale cu virusul rubeolei; utilitate în diagnosticul rubeolei postnatale (împreună cu
testele serologice)5.
Specimen recoltat - a) exsudat faringian şi nazal; b) sânge venos; c) o probă spontană de urină; d)
lichid cefalorahidian recoltat prin puncţie lombară; e) lichid amniotic3.
Recipient de recoltare - a) două tampoane fără mediu de transport; b) vacutainer ce conţine EDTA
ca anticoagulant; c) eprubetă pentru urină; d) şi e) recipient steril3.
Cantitate recoltată - b) cât permite vacuumul; c) şi d) şi e) minimum 2 mL3.
Prelucrare necesară după recoltare - b), c), d), e) probele nu vor fi centrifugate3.
Cauze de respingere a probei – b) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca
anticoagulant3.
Stabilitate probă - probele de sânge, secreţii nazofaringiene, urină, LCR sau lichid amniotic sunt
stabile 48 ore la 2-4°C înainte de extracţia acizilor nucleici3.
Metodă – RT- PCR: într-o primă etapă are loc transcrierea inversă a ARN-ului ţintă pentru a genera
ADN-ul complementar (ADNc); urmează etapa de amplificare a ADN-ului folosindu-se primeri
corespunzători unei regiuni variabile a genei E1; detecţia ampliconului se efectuează în timp real3.
Valori de referinţă – Virusul rubeolei - ARN nedetectabil3.
Detecţia ARN-ului pentru virusul rubeolei în diverse produse patologice susţine diagnosticul clinic de
infecţie datorată acestui virus3;5.
Un rezultat negativ nu elimină posibilitatea unei infecţii cu virusul rubeolei3;5.
413
Bibliografie
1. Anne A. Gershan. Rubella Virus (German Measles). In Mandell, Douglas, and Bennett’s
Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier, 2010,
2127-2130.
2. Ann M.Gronowski. Prenatal Screening and Diagnosis of Congenital Infections. În Handbook of
Clinical Laboratory Testing During Pregnancy. Totowa, NJ: Humana Press ed. 2004; 264-266.
Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 987-988.
5. Surveillance Guidelines for Measles, Rubella and Congenital Rubella Syndrome in the WHO
European Region, WHO, 2009.
414
TESTE DE CITOGENETICĂ
19
19 ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ
19. ALALIZĂ CROMOZOMIALĂ
19.1 Analiză cromozomială în sânge (cariotip constituţional sau postnatal)
Testarea citogenetică constituie parte integrantă a medicinii clinice deoarece identificarea unei aberaţii
cromozomiale specifice poate explica o anomalie fenotipică şi poate fi direct asociată cu diagnosticul
unei boli.
Din acest motiv este esenţial să se determine dacă o persoană afectată prezintă o variantă cromozomială
ce diferă de pattern-ul standard al celor 23 perechi de cromozomi cu morfologie cunoscută.
Există două categorii mari de anomalii citogenetice detectabile: de tip numeric şi de tip structural.
Anomalii cromozomiale numerice
Cariotipul unei specii, termen introdus de Levitsky în 1924, reprezintă numărul de cromozomi prezenţi
în nucleul celulelor somatice. Cariotipul uman este alcătuit 46 cromozomi, organizaţi în 23 perechi;
prin analiza citogenetică, cromozomii pot fi identificaţi ca entităţi structurale discrete, fiecare celulă
umană conţinând 22 perechi de autozomi, precum şi o pereche de cromozomi sexuali. Într-o pereche
de cromozomi unul este de provenienţă maternă, iar celelălalt de origine paternă1.
Un set de 23 constituie numărul haploid (N) de cromozomi şi corespunde numărului de cromozomi
dintr-un gamet. În procesul de fertilizare două seturi haploide se alătură pentru a forma zigotul cu 46
cromozomi – setul diploid (2N) de cromozomi. Erorile survenite în diviziunea celulară pot genera seturi
de cromozomi care au mai mult sau mai puţin de 46 cromozomi. Prezenţa într-o celulă somatică a
unui multiplu exact al unui set haploid de cromozomi este denumită euploidie, în timp ce pierderea sau
prezenţa în plus a unuia sau mai multor cromozomi este cunoscută ca aneuploidie.
Diploidia – starea normală a celulelor umane – reprezintă o formă de euploidie. Euploidiile anormale
includ triploidia (3N = 69 cromozomi) şi tetraploidia (4N = 92 cromozomi), aberaţii ce nu sunt compatibile
cu viaţa şi care sunt depistate în principal în produşii de concepţie avortaţi spontan. Triploidia se poate
datora unui eşec în gametogeneză apărut la una din diviziunile meiotice, ce dă naştere unui gamet 2N,
care atunci când este fertilizat de către un gamet haploid provenit de la celălalt părinte, va produce un
zigot triploid. Pe de altă parte un set 3N mai poate fi derivat din dispermie - fertilizarea unui ou haploid
de către 2 spermatozoizi – ce dă naştere de obicei la o molă hidatiformă parţială. Tetraploidia este
în majoritatea cazurilor un eveniment postmeiotic care se prezintă ca o duplicare a unui set diploid
(XXXX sau XXYY), ca urmare a unui eşec apărut într-un clivaj mitotic precoce al zigotului1;3.
Aneuploidia are ca mecanism de producere nondisjuncţia (lipsa de separare a comozomilor), care
poate survini fie în meioză, fie în mitoză. De obicei este afectată o singură pereche de cromozomi.
Nondisjuncţia mitotică precoce într-un zigot poate da naştere la o aberaţie cromozomială prezentă în
toate celulele din organism, în timp ce erorile de diviziune survenite mai târziu conduc la mozaicism –
prezenţa în acelaşi organism a două linii celulare ce diferă între ele printr-un cromozom.
În meioza normală o replicare ADN este urmată de două diviziuni celulare ce au ca rezultat final
4 gameţi haploizi (1 copie a fiecărui cromozom). Prima diviziune meiotică se caracterizează prin
416
ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ
19
reducerea la jumătate a numărului total de cromozomi pe celulă. A doua diviziune meiotică este o
simplă diviziune de tip mitotic în care are loc separarea centromerilor şi distribuţia cromozomilor în
celulele-fiică. Erorile survenite în meioză pot da naştere la gameţi cu un cromozom în deficit sau
în exces. Nondisjuncţia din cursul primei meioze va genera 2 gameţi care sunt disomici pentru un
cromozom şi la 2 gameţi cărora le lipseşte cromozomul respectiv (nulisomici). Atunci când are loc
fertilizarea, primii gameţi vor da naştere la un produs de concepţie cu trisomie, în timp ce în al doilea
caz va rezulta un zigot cu monosomie. Atunci când eroarea survine în cea de a doua diviziune meiotică
rezultă doi gameţi haploizi normal, un gamet disomic şi unul nulisomic (vezi fig.19.1.1).
Fig. 19.1.1 Meioza
A. Meioza normală; B. Nondisjuncţie în prima diviziune meiotică; C. Nondisjuncţie în a doua

diviziune meiotică
(Adaptare după medical-dictionary.thefreedictionary.com)
Trisomia şi monosomia pot afecta orice cromozom, însă majoritatea acestor aberaţii sunt incompatibile
cu viaţa şi vor da naştere la un avort spontan. De exemplu, trisomia 16 este anomalia cea mai frecvent
raportată la analiza citogenetică a produşilor de concepţie avortaţi însă ea nu fost descrisă la nou-
născuţii vii. Trisomiile autozomale care se pot însoţi de un făt viabil sunt cele care includ cromozomii
13, 18 şi 21. Mai rar sunt identificate persoane cu mozaic cromozomial care conţine trisomiile 8, 9 sau
22. Trisomiile cromozomilor sexuali sunt viabile; singura monosomie viabilă este cea a cromozomului
X (45, X)1;2.
Deoarece trisomiile şi monosomiile sunt în general incompatibile cu viaţa s-a presupus că acestea
vor conduce inevitabil la avort spontan. Cu toate acestea, analizele moleculare au arătat că un mic
417
procent al produşilor de concepţie aneuploizi poate fi “salvat” şi da naştere la un făt viabil. În cazul
monosomiei “salvarea“ este realizată prin duplicarea singurului cromozom existent, rezultând o
pereche de cromozomi cu izodisomie uniparentală (două copii ale aceluiaşi cromozom moştenit de la
un părinte). Acest mecanism este exemplificat de o serie de comunicări din literatură în care un copil
afectat de fibroză chistică era homozigot pentru mutaţia ΔF508, deşi analiza moleculară a ambilor
părinţi a arătat că doar unul dintre aceştia era purtător al mutaţiei. Explicaţia a fost că produsul de
concepţie a prezentat o monosomie 7 ce fost “salvată” prin duplicarea cromozomului existent care,
întâmplător, era purtător al mutaţiei pentru fibroza chistică. O situaţie similară este posibilă în cazul
trisomiei. Cele mai multe trisomii nu sunt viabile, dar dacă unul din cei trei cromozomi este eliminat,
rezultă o disomie pentru acea pereche de cromozomi, cu următoarele posibilităţi:
- pierderea unui cromozom va da naştere, în două treimi din cazuri, la o pereche de cromozomi, în
care unul are provenienţă maternă şi celălalt paternă (heterodisomie biparentală);
- în o treime din cazuri va rezulta o pereche de cromozomi care provin de la acelaşi părinte
(heterodisomie uniparentală).
În această situaţie este important momentul în care survine eroarea de diviziune. Astfel, o nondisjuncţie
apărută în prima diviziune meiotică va genera o heterodisomie uniparentală (2 cromozomi omologi
heterozigoţi proveniţi de la acelaşi părinte), în timp ce o nondisjuncţie în cea de a doua diviziune va
rezulta într-o izodisomie uniparentală (două copii ale unui singur cromozom) – vezi figura 19.1.2.
Pereche de cromozomi paterni Pereche de cromozomi materni
Disomie uniparentală paternă Disomie uniparentală maternă

Heterodisomie Isodisomie Heterodisomie Isodisomie
sau
sau
Cele patru combinaţii

normale posibile
Fig. 19.1.2 Tipuri de disomie uniparentală produse de erori de diviziune

(Adaptare după Uniparental Disomy; Gene Reviews www.be-md.ncbi.nlm.nih.gov)
Deşi se credea ca a avea o pereche de cromozomi este suficient, datele actuale arată că, în unele
cazuri, este necesar ca perechile să conţină un cromozom de provenienţă maternă şi unul paternă.
Problemele de disomie uniparentală vs biparentală ca şi de isodisomie vs heterodisomie au o
importanţă majoră pentru fenomenul de amprentare (exprimarea diferenţiată a genelor în funcţie de
originea lor parentală)1.
Aneuploidii autozomale
Cea mai obişnuită cauză de retard mental, având o incidenţă de 1 la 700 naşteri, este trisomia 21 sau
sindromul Down. Nou-născutul cu trisomie 21 are lungime şi greutate mai mică decât parametrii vârstei
418
19
gestaţionale, prezintă hipotonie musculară, hiperextensibilitate şi reflexe comportamentale (de exemplu

refexul Moro) reduse. Capul este brahicefalic, cu occiput turtit şi fontanele largi. Faţa este rotundă, plată
şi prezintă o dismorfie sugestivă: epicantus (un repliu în unghiul intern al ochiului), fantele palpebrale
oblice în sus şi în afară; nasul mic cu rădăcina turtită şi narine mici şi anteversate; gura deschisă şi
protruzie linguală (datorită cavităţii orale mici); urechile mai jos situate, mici şi displazice. Gâtul este
scurt, cu exces de piele pe ceafă; mâinile sunt scurte şi late, cu brahidactilie, clinodactilie (încurbare) a
degetului V şi, frecvent, un singur pliu de flexie palmară (pliu simian); inconstant sunt prezente unele
malformaţii viscerale (defecte cardiace, atrezie duodenală, imperforaţie anală).
Aproximativ 92.5% din persoanele cu sindrom Down prezintă 47 cromozomi (sunt incluse 3 copii ale
cromozomului 21) ca urmare a unei nondisjuncţii apărute în meioză. Sub 3% dintre pacienţi exprimă
un fenotip mai puţin sever datorită unui mozaicism caracterizat prin 2 linii celulare (47,XX,+21/46, XX
sau 47,XY,+21/46,XY) şi aproximativ 5% au doar 46 cromozomi, deoarece cromozomul 21 în exces
face parte dintr-o translocaţie robertsoniană sau un alt tip de translocaţie. Faptul că un copil prezintă
o translocaţie reprezintă un indiciu că unul dintre părinţi ar putea fi purtător al unei astfel de anomalii
structurale şi de aceea este important să se stabilească cariotipul fiecărui părinte pentru a vedea dacă
respectivul cuplu prezintă riscul de a mai avea un copil cu sindrom Down la sarcinile ulterioare. Deşi în
majoritatea cazurilor un pacient cu sindrom Down deţine 3 copii complete ale cromozomului 21, studiile
moleculare ale persoanelor cu rearanjări ale cromozomului 21 au arătat în mod clar că sunt necesare
doar 3 copii ale regiunii cromozomului 21 ce conţine benzile 21q22.12-21q22.3, denumită regiunea
critică pentru sindromul Down.
Celelalte două trisomii viabile sunt trisomia 13 şi trisomia 18. Trisomia 13 – sindromul Patau – este
întâlnită cu o incidenţă de 1:4000-1:10 000 naşteri. Se caracterizează prin microcefalie, defecte ale
scalpului, fisură labio-palatină, ciclopie, cataractă, displazie retiniană, polidactilie, pliu simian, călcâi
proeminent, defect septal ventricular, polichistoză renală, uter bifid, criptorhidrie, hipospadias, retard
mintal sever. Trisomia 18 sau sindromul Edwards, are o incidenţă de 1:8000 nou-născuţi; trăsăturile
clinice includ: greutate mică la naştere, microcefalie, occiput proeminent, micrognaţie, urechi jos
inserate cu pavilionul modificat, fisură de palat sau palat ogival, anomalii ale dermatoglifelor, haluce în
dosiflexie, defect septal ventricular, rinichi în potcoavă, retard mintal sever.
Dacă pacienţii cu sindrom Down pot supravieţui până în cea de-a doua sau a treia decadă de viaţă,
cei cu trisomie 13 sau 18 decedează de obicei în prima lună. Din aceste motive, consilierea genetică
include opţiunea de întrerupere a sarcinii.
Aneuploidiile cromozomilor sexuali
Sunt relativ frecvente în populaţie (prevalenţă globală de 1:500 naşteri) şi exprimă un fenotip mai puţin
sever în comparaţie cu aneuploidiile autozomale datorită efectului de inactivare a cromozomului X
precum şi a numărului limitat de gene situate pe cromozomul Y.
În majoritatea cazurilor, aneuploidiile cromozomilor sexuali sunt reprezentat de patru afecţiuni: trei
trisomii şi o monosomie.
Cariotipurile aberante ale persoanelor care prezintă 3 cromozomi X (femei 47,XXX) sau 1 cromozom
X şi doi cromozomi Y (bărbaţi 47,XYY) trec adesea neobservate în cursul vieţii. Incidenţa acestora
la naştere este de 1:1000, însă, cu excepţia unei staturi mai înalte, nu există alte trăsături care să
419
sugereze o anomalie cromozomială. Unele persoane prezintă tulburări de învăţare şi pot fi astfel
identificate prin programele şcolare de screening. Femeile XXX şi bărbaţii XXY sunt depistaţi de
asemenea în clinicile de infertilitate, deşi anomalia citogenetică nu induce tulburări ale fertilităţii.
Indivizii XYY au incidenţă crescută de tulburări comportamentale, iar date mai vechi, care ulterior au
fost infirmate, au asociat anomalia de cariotip cu o rată mai mare a criminalităţii.
Bărbaţii cu sindromul Klinefelter (47,XXY) au tendinţa de a fi mai înalţi şi mai slabi în comparaţie
cu persoanele de aceeaşi vârstă din jurul lor. Principalele trăsături clinice sunt: hipogonadismul
postpubertal, dezvoltarea sânilor, infertilitate datorată testiculelor mici cu tubi hialinizaţi şi azoospermie.
Există o formă mai atenuată de sindrom Klinefelter asociată cu un oarecare potenţial fertil ca urmare
a unui mozaic cromozomial: 47,XXY/46XY; proporţia relativă de celule XY vs celule XXY la zigot în
cursul determinării sexului este esenţială pentru fertilitate.
Cea mai frecvent identificată aneuploidie a cromozomilor sexuali asociată cu fenotip feminin este
sindromul Turner - 45,X. La determinarea sexului, dezvoltarea feminină normală este dependentă
de existenţa a doi cromozomi X activi. Regiunea critică pentru diferenţierea sexului feminin a fost
delimitată la o zonă de pe braţul scurt al cromozomului X situată în apropierea centromerului. Dacă
această regiune lipseşte sau este inactivă se va dezvolta sindromul Turner. Aproximativ jumătate din
persoanele cu acest sindrom prezintă monosomia clasică 45,X. Singurul cromozom X este de obicei
de origine maternă sugerând faptul că nondisjuncţia meiotică paternă constituie cea mai frecventă
sursă de eroare. În plus faţă de 45,X pot exista şi cariotipuri mai complexe (de exemplu, deleţii
de cromozom X, prezenţa unui cromozom X inelar sau izocromozom X, mozaicuri cromozomiale:
45,X/46,XX; 45,X/46,XY).Cea mai severă este situaţia în care există cel puţin o linie celulară cu un
cromozom Y parţial sau complet, datorită riscului crescut de gonadoblastom.
Fenotipul asociat sindromului Turner este foarte variabil. Persoanele afectate au de obicei o statură
mică (<150 cm) cu disgenezie gonadală şi tulburări de învăţare. Alte trăsături comune includ: o plică
de piele ce se întinde de la creasta omoplatului până la zona nucală (gât palmat), torace în formă de
scut, inserţie posterioară joasă a părului, cubitus valgus, malformaţii cardiace sau renale.
Hygroma chistica este aspectul ecografic prenatal caracteristic, corespunzător unei mase chistice
septate în regiunea nucală fetală; aceasta apare, cel mai probabil, din cauza dezvoltării anormale
a limfaticelor mari fetale. Alte semne ecografice majore în sindromul Turner sunt: defecte ale inimii
stângi, malformații renale și scheletale, anasarcă sau hidrops fetal. Translucența nucală este, de
obicei, crescută în trimestrul I de sarcină.
Persoanele cu sindrom Turner prezintă de obicei un nivel normal de inteligenţă deşi acesta poate fi
variabil, existând chiar cazuri de handicapuri mentale semnificative. Deşi infertilitatea este o trăsătură
definitorie a acestui sindrom, dezvoltarea tehnicilor de reproducere asistată a permis ca unele femei
afectate (în special cele cu cariotipuri mozaicate) să obţină şi să ducă la termen o sarcină normală1;3.
Anomalii cromozomiale structurale
Cromozomii nu sunt structuri statice, astfel că atât în cursul meiozei cât şi al mitozei au loc fenomene
de recombinare. Recombinarea este un proces natural care asigură variabilitatea speciilor. Cu toate
că există un sistem de reglare foarte dezvoltat pentru a preveni erorile de recombinare, acestea se
produc totuşi, conducând uneori la rearanjări care schimbă structura unuia sau mai multor cromozomi.
420
19
Rearanjările pot fi:

- echilibrate, dacă materialul cromozomial este prezent şi funcţional în totalitate însă aranjat
într-o conformaţie diferită;
- neechilibrate, dacă există pierderi şi/sau duplicări ale unui material cromozomial.
Rearanjările echilibrate sunt sunt de obicei benigne din punct de vedere clinic şi tind să se transmită
stabil; pot creşte însă riscul de erori survenite în meioză ce pot genera anomalii cromozomiale la făt
şi nou-născut. Rearanjările neechilibrate sunt în general asociate cu un fenotip anormal ce include
adesea întârziere în dezvoltare şi retard mintal.
Anomaliile cromozomiale structurale sunt reprezentate de:
1. Deleţie – pierderea unei porţiuni dintr-un cromozom ce conduce la monosomie parţială;
deleţiile variază în dimensiuni (de la foarte mici la deleţii largi) şi pot fi terminale (pierderea
cromozomială include şi telomerul) sau interstiţiale (pierderea unei porţiuni interne a
cromozomului); deleţiile pot apărea ca urmare a unuei rupturi cromozomiale, a unui
crossing-over inegal sau a nondisjuncţiilor (vezi figura 19.1.3).
Deleţie
Puncte de
ruptură
Material
genetic
deletat
Fig. 19.1.3 Deleţie

(Adaptare după Genetic Homes Reference – Chromosomal Deletion)
2. Duplicaţie - prezenţa unei copii suplimentare a unui segment cromozomial ce conduce

la o trisomie parţială; acestă anomalie poate fi de asemenea terminală sau interstiţială; se
produce printr-un mecanism similar deleţiilor şi cu cât segmentul duplicat este mai mare cu
atât anomaliile clinice vor fi mai severe (vezi figura 19.1.4).
421
Duplicaţie
Cromozom
Material
genetic
duplicat
Fig. 19.1.4 Duplicaţie

(Adaptare după Genetic Homes Reference – Chromosomal Duplication)
3. Inversie – amplasarea unor segmente cromozomiale în poziţii inversate faţă de configuraţia

normală a genelor; necesită cel puţin două puncte de ruptură la nivelul cromozomului;
inversiile pot fi paracentrice (cele două puncte de ruptură se găsesc de aceeaşi parte a
centromerului, pe acelaşi braţ) sau pericentrice (punctele de ruptură se găsesc de o parte
şi de alta a centromerului şi implică ambele braţe ale cromozomului); majoritatea inversiilor
sunt echilibrate, dar dacă ruptura se produce în interiorul unei gene este perturbată sinteza
produsului genei respective şi pot fi generate anomalii clinice; există un risc crescut de erori
survenite în cursul meiozei, iar purtătorii de inversii prezintă adesea infertilitate sau pierderi
precoce de sarcină ca urmare a unor produşi de concepţie cu dezechilibru cromozomial;
astfel, în cazul inversiilor paracentrice pot apărea, ca urmare a recombinării meiotice,
cromozomi acentrici sau dicentrici non-viabili, iar în cazul inversiilor pericentrice este posibil
să fie generaţi gameţi cu duplicaţii şi/sau deleţii (vezi figurile 19.1.5 şi 19.1.6).
1
A 2
1
B 2
1
2
C
3
4
Fig.19.1.5 Inversie paracentrică
422
19
XYZ ABC
1
XYZ ABC
A 2
XYZ ABC
1
B 2
XYZ ABC
1
XYZ ABC
2
C XYZ XYZ
3
ABC ABC
4
Fig.19.1.6 Inversie pericentrică
4. Translocaţie clasică (reciprocă) – rearanjare care implică unul sau mai mulţi cromozomi
neomologi; fiecare cromozom prezintă un singur punct de ruptură iar segmentele rezultate
îşi schimbă locul între ele generând doi sau mai muţi cromozomi derivaţi; la fel ca şi
inversiile, majoritatea translocaţiilor sunt echilibrate şi numai în cazul în care este afectată
o genă structurală importantă apar implicaţii clinice; principala problemă o reprezintă riscul
crescut de anomalii cromozomiale la produşii de concepţie ai purtătorilor de translocaţii;
astfel, în cursul meiozei pot rezulta gameţi cu deleţii/duplicaţii dacă în anafază cromozomii
derivaţi nu segregă împreună (până la o treime din cazuri); cromozomii pot urma şi un
model de segregare 3:1 în care 3 cromozomi sunt separaţi într-o celulă şi unul în cea de a
doua celulă (vezi figura 19.1.7).
Înainte de translocaţie După translocaţie
Cromozom 20 derivat
Cromozom 20
Cromozom 4 derivat
Cromozom 4
Fig.19.1.7 Translocaţie clasică

(Adaptare după Genetics Primer – http://members.cox.net)
423
5. Translocaţie robertsoniană – constituie o variantă a translocaţiei clasice; se produce

între doi cromozomi acrocentrici prin fuziunea braţelor lungi ale cromozomilor la nivelul
centromerului cu pierderea ambelor braţe scurte; de obicei nu sunt consecinţe clinice
deoarece pe toţi cromozomii acrocentrici sunt localizate copii multiple ale genelor ARNr;
purtătorii acestui tip de translocaţie au un număr de 45 cromozomi, deoarece doi cromozomi
au devenit unul singur din punct de vedere funcţional şi prezintă acelaşi centromer; există
un risc crescut de nondisjuncţii meiotice rezultând produşi de concepţie cu trisomie faţă
de unul din cromozomii rearanjaţi; cel mai obişnuit exemplu este translocaţia ce implică
cromozomii 13 şi 14 ai cărei purtători pot da naştere unor copii cu trisomie 13 (cariotip
cu 46 cromozomi, 2 copii de cromozom 13 şi translocaţie robertsoniană 13;14); de obicei
translocaţia implică doi cromozomi neomologi, însă pot exista situaţii în care sunt afectaţi
cromozomi omologi: de exemplu, translocaţia robertsoniană de novo 21;21 ai cărei purtători
pot da naştere unor copii cu sindrom Down (vezi figura 19.1.8).
Braţele scurte
(pierdute)
Doi cromozomi O translocaţie

acrocentrici rebertsoniană
Fig. 19.1.8 Translocaţie robertsoniană

(Adaptare după Cytogenetics – www.ucl.ac.uk)
6. Izocromozom – reprezintă un cromozom ce apare ca urmare a unei erori de diviziune a

centromerului: sunt generate două copii ale unui braţ cromozomial cu lipsa celuilalt braţ;
rezultă astfel doi cromozomi derivaţi, unul cu o duplicaţie inversată a braţului lung, celălalt cu
o duplicaţie inversată a braţului scurt; dacă ambii izocromozomi sunt menţinuţi într-o celulă
va rezulta o trisomie pentru cromozomul de bază, condiţie ce este de obicei incompatibilă
cu viaţa; dacă însă este menţinut doar un singur izocromozom în celulă va rezulta o trisomie
pentru unul din braţele cromozomiale duplicate şi o monosomie pentru celălalt braţ; cel mai
cunoscut exemplu este izocromozomul braţului lung al cromozomului X care poate să apară
la unele paciente cu sindrom Turner (monosomia pentru braţul scurt al izocromozomului X
induce o dezvoltare anormală) (vezi figura 19.1.9).
424
19
Izocromozomi
Două
braţe p
Braţ p
Două
braţe
q
Braţ q
Fig. 19.1.9 Izocromozomi

(Adaptare după Genetic Homes Reference – Isochromosomes)
7. Cromozom inelar – reprezintă un cromozom ce rezultă prin pierderea ambelor telomere

şi fuziunea circulară a porţiunii restante în vederea refacerii stabilităţii cromozomiale; în
majoritatea cazurilor acest tip de structură este instabil, însă există unele situaţii în care
cromozomii inelari pot fi transmişi la celulele-fiice (vezi figura 19.1.10).
Cromozom inelar
Material genetic
deletat
Puncte de
Fuziune
ruptură
Material genetic
deletat
Fig. 19.1.10 Cromozom inelar

(Adaptare după Genetic Homes Reference – Ring Chromosome)
8. Cromozom marker – constituie un cromozom cu un centromer ce este transmis stabil

la celulele-fiice dar care nu poate fi clar identificat, fie datorită dimensiunii sale prea mici,
fie datorită aspectului la bandare prea ambiguu. Tehnica FISH-multicolor constituie un
instrument util pentru determinarea originii marker-ilor1;2.
A fost descris un număr semnificativ de sindroame asociate direct cu o anomalie cromozomială
structurală.
425
Sindroamele cu deleţii autozomale

Deleţiile sau duplicaţiile ce pot fi identificate citogenetic pot cauza tulburări de dezvoltare şi malformaţii
congenitale, fiind asociate de cele mai multe ori cu un fenotip caracteristic.
Cele mai importante deleţii terminale sunt reprezentate de: 4p-, 5p-, 11p-, 11q-, 13q-, 18p- şi 18q-.
O altă categorie de deleţii subtelomerice sunt detectabile doar prin tehnica FISH sau prin alte metode
moleculare.
Majoritatea deleţiilor şi duplicaţiilor survin de novo.
Deleţia 4p- (sindromul Wolf-Hirschhorn)
Se caracterizează clinic prin retard de creştere, retard mintal sever, facies în “coif de războinic grec”
cu frunte şi glabelă proeminente, sprâncene arcuite şi nas lung, ochi îndepărtaţi (hipertelorism)
şi îndreptaţi in jos (fante antimongoliene), pliu cutanat suplimentar în unghiul intern al ochiului
(epicantus), strabism, coloboma şi alte anomalii oculare, nas turtit, gură cu buza superioară scurtă,
despicătură labială sau palatină (“buză de iepure” sau “gură de lup”), bărbie mică (microretrognaţie),
urechi jos implantate, mari, cu formă anormală; surditate, malformaţii cardiace, pulmonare sau renale,
hipospadias.
Deleţiile braţului scurt al cromozomului 4 pot avea dimensiuni variabile; uneori sunt atât de mici încât
nu pot fi detectate decât prin tehnica FISH.
Deleţia 5p- (sindromul cri-du-chat)
Descris în 1963 de către Lejeune şi colaboratorii săi acest sindrom include un fenotip caractersitic:
laringe anormal dezvoltat ce reprezintă cauza ţipătului ascuţit (ca cel al unei pisici), microcefalie,
micrognaţie, hipertelorism, fante antimongoliene, pliu palmar unic, hipotonie, retard mintal.
Deleţiile pot avea dimensiuni variabile, însă regiunea critică este 5p15.2.
Sindroamele cu microdeleţii
Prin definiţie, microdeleţia reprezintă o deleţie foarte mică, care afectează doar o porţiune dintr-o
bandă cromozomială. Deşi dimensiunile microdeleţiilor sunt mici, acestea sunt semnificativ mai mari
(>500 kb) decât deleţiile moleculare tipice, astfel încât unele pot fi detectate chiar prin efectuarea
cariotipului clasic; majoritatea microdeleţiilor sunt însă identificate prin tehnica FISH.
Deşi s-a crezut iniţial că este vorba de deleţii în cadrul unor gene singulare s-a descoperit că
multe sindroame se datorează de fapt unor deleţii care cuprind porţiuni din gene adiacente diferite.
Mărimea deleţiei şi numărul genelor implicate sunt variabile, astfel că fenotipul exprimat poate să
difere semnificativ între persoanele afectate. Aceste sindroame mai sunt denumite sindroame de
contiguitate genică:
Sindromul Miller-Dieker
A fost asociat cu o microdeleţie a porţiunii distale a braţului scurt al cromozomului 17 (17p13.3).
Elementele clinice caracteristice sunt aspectul particular al feţei şi anomaliile cerebrale: lisencefalia
(suprafaţă netedă a emisferelor cerebrale), agenezia de corp calos şi calcificările de pe linia mediană
ce explică retardul mintal sever şi convulsiile. Lisencefalia izolată a fost recunoscută ca entitate
separată asociată cu o deleţie mică a genei LIS1. Sindromul Miller-Dieker este mai complex fiind
afectate cel puţin două gene.
Sindromul Prader-Willi şi sindromul Angelman sunt cele mai cunoscute sindroame de microdeleţie.
426
19
Ambele prezintă aceeaşi deleţie interstiţială a porţiunii proximale a braţului lung al cromozomului 15 -
del(15)(q11.2q11.2) - însă tabloul clinic este semnificativ diferit. Acest fapt este explicat prin fenomenul
de amprentare: dacă deleţia afectează cromozomul de origine paternă rezultă sindromul Prader-Willi,
iar dacă este implicat cromozomul de origine maternă se dezvoltă sindromul Angelman.
Pacienţii cu sindrom Prader-Willi prezintă hipotonie severă şi greutate mică la naştere însă în cursul
primului an de viaţă încep să câştige rapid în greutate. Dacă nu se instituie o dietă corespunzătoare se
instalează obezitate prin hiperfagie. Alte trăsături clinice includ mâini şi picioare mici, hipogonadism,
retard mintal moderat şi un comportament particular cu reacţii violente. Pe de altă parte, pacienţii cu
sindrom Angelman prezintă un retard mintal sever, tulburări de vorbire, discursul fiind întrerupt adesea
de accese de râs inadecvate situaţiei, hiperactivitate, statură mică, microcefalie, convulsii şi ataxie.
Prin tehnica citogenetică convenţională poate fi detectată deleţia 15q la aproximativ 60% din persoanele
cu sindrom Prader-Willi şi doar la 10-20% dintre cele cu sindrom Angelman. Prin tehnica FISH pot fi
detectate deleţii în 80-85% din cazuri, pentru ambele sindroame. Faptul că nu pot fi detectate deleţii în
toate cazurile a ridicat suspiciunea existenţei unui alt tip de anomalie. La ora actuală se consideră că
sindromul Prader-Willi şi sindromul Angelman sunt asociate cu defecte de amprentare, iar procesele
mutaţionale cauzatoare de boală sunt mult mai complexe decât o simplă deleţie a ADN-ului.
Sindromul Williams
A fost asociat cu o deleţie a genei elastinei (ELN) localizată în porţiunea proximală a braţului lung a
cromozomului 7 (7q11.23). Se caracterizează clinic prin anomalii cardiace, hipertensiune arterială, voce
răguşită, îmbătrânire prematură a pielii, tulburări comportamentale la care se adaugă hipercalcemie
şi/sau hipercalciurie. Dacă absenţa elastinei explică multe dintre anomaliile fizice asociate cu acest
sindrom, totuşi aceasta nu poate fi asociată cu tulburările comportamentale. În concepţia curentă,
sindromul Williams este un sindrom de contiguitate genică, iar variabilitatea fenotipică este dependentă
de numărul genelor adiacente afectate de deleţie alături de ELN.
Diagnosticul se stabileşte prin efectuarea cariotipului pentru identificarea rearanjamentelor
cromozomiale care pot include regiunea 7q11.23, urmat de testul FISH, cu sonde ADN pentru regiunea
critică deletată care include genele ELN şi LIMK1.
Sindromul WAGR
Este un sindrom de contiguitate genică bine definit, ce include tumoră Wilms, aniridie, defecte genito-
urinare şi retard mintal. Cu excepţia defectelor genito-urinare care par să fie cauzate de o variantă a
mutaţiei de la nivelul locusului tumorii Wilms, fiecare din cele 3 anomalii este asociată cu o anumită
genă; aceste trei gene sunt dispuse în tandem pe braţul scurt al cromozomului 11. Fenotipul variază
în funcţie de mărimea deleţiei. Statistic, 1:3 din copiii cu aniridie vor dezvolta tumoră Wilms, în timp ce
doar 1:50 din copiii cu tumoră Wilms asociază aniridie.
Sindromul velo-cardio-facial
Reprezintă probabil cel mai frecvent sindrom cu microdeleţii, dar adesea este dificil de identificat
datorită spectrului larg de manifestări clinice. Acest spectru include hipoplazia sau aplazia timusului
(deficite imune) şi a glandelor paratiroide (hipocalcemie), anomalii cardiace, dismorfie facială sugestivă,
despicătură palatină sau insuficienţă velo-palatină, anomalii reno-urinare, anomalii scheletice, întârziere
în dezvoltarea psihomotorie şi tulburări psihice, dificultăţi de învăţare şi altele. Până la 15% din copii au
427
un părinte afectat de aceeaşi deleţie dar cu un fenotip mult mai puţin sever. Se pare că deleţia de 3 Mb
din porţiunea proximală a braţului lung al cromozomului 22 (22q11.2q11.2) se datorează recombinării
ce are loc între secvenţele repetitive ce flanchează regiunea ce este în mod obişnuit deletată. Aceste
recombinări intracromozomiale vor genera o structură în formă de buclă ce va fi detectată ca un defect
de către enzimele de reparare. Enzimele vor exciza ADN-ul din buclă şi vor reface porţiunea lineară a
cromozomului; va rezulta astfel o deleţie cu pierderea tuturor genelor asociate. Deleţia 22q11 este de
obicei prea mică pentru a fi identificată prin examenul citogenetic de rutină însă poate fi demonstrată prin
tehnica FISH1;3.
Recomandări pentru determinarea cariotipului constituţional
- în scop diagnostic la nou-născuţi sau copii mici ce prezintă semne sau simptome clinice
sugestive pentru o anomalie cromozomială (malformaţii congenitale multiple însoţite de
tulburări de creştere şi retard psihomotor);
- persoane cu ambiguitate genitală (pentru stabilirea sexului genetic şi identificarea unei
anomalii a cromozomilor sexuali);
- pacienţi cu retard mintal de cauză neprecizată, mai ales dacă se asociază cu dismorfism
facial şi cu o anamneză familială pozitivă;
- cupluri cu infertilitate, nou-născuţi morţi, nou-născuţi vii plurimalformaţi sau avorturi spontane
recurente (în vederea depistării unor anomalii cromozomiale echilibrate)1;3.
Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine heparină ca anticoagulant4.
Cauze de respingere a probei – folosirea unui alt tip de anticoagulant; probe vechi, coagulate,
hemolizate sau contaminate bacterian4.
Stabilitate probă – maxim 72 ore din momentul recoltării probei până la intrarea acesteia în lucru4.
Metodă – tehnica clasică de bandare G; se va suplimenta cu testarea FISH în funcţie de
suspiciunea clinică; sunt analizate 15 metafaze dintre care 5 sunt cariotipizate4.
În vederea raportării rezultatelor se va folosi următoarea nomenclatură pentru cariotip (în
conformitate cu ISCN = International System of Cytogenetic Nomenclature):
- precizarea numărului total de cromozomi;
- precizarea cromozomilor sexuali;
- menţionarea oricărei anomalii cromozomiale.
Cele 3 tipuri de date sunt separate prin virgule.
Exemple:
• femeie cu cariotip normal: 46,XX;
• bărbat cu cariotip normal: 46,XY;
• dacă sunt prezente două sau mai multe linii celulare acestea vor fi indicate secvenţial şi separate prin
semnul / iar clona diploidă normală (dacă există) va fi menţionată ultima: 45,X/46,XX;
alte clone vor fi prezentate în ordinea dimensiunii acestora, clona cea mai mare fiind prima
menţionată - numărul de celule din fiecare clonă va fi indicat de un număr trecut în paranteză:
428
19
45,X(15)/47,XXX(3)/46,XX(12);
• în cazul anomaliilor numerice autozomale, numărul total de cromozomi va fi crescut sau redus pentru
a indica modificarea globală, iar cromozomul specific dobândit sau pierdut va fi precizat la sfârşit:
47,XX,+13 (trisomie 13 la o persoană de sex feminin); 45,XY,-8 (monosomie 8 la o persoană de sex
masculin);
• în cazul anomaliilor numerice constituţionale ale cromozomilor sexuali, nu vor mai folosite semnele
+ sau -: 45,X; 47,XXX; 47,XXY, 47,XYY; pe de altă parte dacă anomaliile numerice ale cromozomilor
sexuali sunt dobândite în unele linii celulare maligne vor fi folosite semnele + sau - : 45,X,-Y (o
persoană de sex masculin care a pierdut cromozomul Y ca rezultat al unei afecţiuni maligne);
• dacă sunt prezente, anomaliile cromozomiale structurale vor fi indicate la sfârşitul nomenclaturii
pentru a clarifica statusul cromozomului rearanjat; vor fi folosite abrevieri ale anomaliei urmate de
cromozomul implicat şi de punctele de ruptură corespunzătoare:
- 46,XX,del(4)(p15): deleţia terminală a braţului scurt al cromozomului 4, la banda 15;
- 46,XX,dup(11)(q13q23): duplicaţia interstiţială a braţului lung al cromozomului 11;
- 46,XY,t(4;9)(q21.2;p22): translocaţie între braţul lung al cromozomului 4 şi braţul scurt al
cromozomului 9;
- 46,XY,inv(9)(p11q21.1): inversie pericentrică la nivelul cromozomului 9 între benzile p11 şi
q21.1.
La buletinul final va fi ataşată şi cariograma pacientului respectiv1;4.
Bibliografie
1. Constance K. Stein. Applications of Cytogenetics in Modern Pathology. In Henry’s Clinical

2. Chromosome Abnormality. www.web-books.com. Reference Type: Internet Communication.
3. Eberhard Passarge. Karyotype-Phenotype Relationship. In Color Atlas of Genetics, Georg
Thieme Verlag KG, 3rd Edition, 2007, 412-416.
19.2 Analiză cromozomială (cariotip) în lichid amniotic
Informaţii generale şi recomandări pentru determinarea cariotipului în lichid amniotic

Anomaliile cromozomiale reprezintă o componentă importantă a afecţiunilor genetice atât în perioada
prenatală cât şi la naştere. Se estimează că acestea apar cu o frecvenţă de 6-20 la 1000 naşteri vii.
Dintre acestea, anomaliile echilibrate (anomaliile structurale care nu induc pierdere sau câştig de
material genetic şi care în general nu se însoţesc de modificări fenotipice) au o rată de producere
429
ce variază între 2 şi 15 la 1000 naşteri vii. Anomaliile cromozomiale neechilibrate, ce au o frecvenţă

de 7-12 la 1000 naşteri vii, cauzează trăsături dismorfice, tulburări de reproducere şi dezvoltare
anormală. Dintre acestea, 80% se datorează unei anomalii cromozomiale numerice; marea majoritate
a aberaţiilor cromozomiale numerice depistate la naştere implică cromozomii 13, 18, 21, X şi Y.
În perioada prenatală rata anomaliilor cromozomiale este semnificativ mai mare decât cea raportată la
naştere1. Astfel, studiile au arătat că 1 din 13 produşi de concepţie prezintă o anomalie cromozomială,
dar din aceştia numai 6 la 1000 sunt viabili, ceea ce indică faptul că majoritatea erorilor sunt
recunoscute şi eliminate biologic. De exemplu, din toate concepţiile cu monosomie 45,X un procent
de 95% va fi eliminat spontan. Frecvenţe similare de avort spontan sunt raportate în trisomiile viabile:
90% pentru trisomia 13, 80% pentru trisomia 18 şi 65% pentru trisomia 21. În medie, 15% din toate
sarcinile depistate sunt pierdute spontan, dintre care 80% în primul trimestru. Se estimează că 60%
din avorturile spontane se datorează unei anomalii cromozomiale. Rata anomaliilor cromozomiale este
cu atât mai mare cu cât vârsta gestaţională este mai mică. Monosomia X ce dă naştere sindromului
Turner şi triploidiile (69 cromozomi) constituie cele mai frecvente anomalii cromozomiale asociate
cu avort spontan (aproximativ 79:1000). Trisomiile autozomale afectează în principal cromozomii 16
(59:1000), 22 (35:1000), 21 (22:1000) şi 15 (22:1000). Anomaliile cromozomiale de tip structural sunt
mai puţin frecvente în avorturile spontane (27:1000)2.
Este larg acceptat faptul că riscul de nondisjuncţie ce generează anomalii cromozomiale creşte o dată
cu vârsta maternă; acesta este probabil legat de procesul de maturare a ovocitului prelungit ca urmare
a expunerii la diverşi agenţi din mediu sau de reducerea naturală a activităţilor fiziologice o dată cu
înaintarea în vârstă.
Riscul crescut asociat cu vârsta peste 35 ani a mamei este bine documentat în sindromul Down.
Pe baza unor studii populaţionale mari se estimează că riscul de sindrom Down la vârsta de 24 ani
variază de la 1:1294 la 1:1877, în timp ce la vârsta de 35 ani variază de la 1:250 la 1:404 naşteri.
Riscul creşte la 1:44-1:24 la vârsta de 45 ani şi devine foarte mare la femeile peste 45 ani. Din
acest motiv este oportun să se ofere amniocenteză şi examen citogenetic femeilor peste vârsta de
35 ani, chiar în absenţa unui istoric familial pozitiv pentru afecţiuni genetice. Deoarece în societăţile
dezvoltate sarcinile sunt planificate la vârste mai mari, diagnosticul prenatal a devenit un aspect
important al medicinii preventive.
La bărbaţi, o dată cu înaintarea în vârstă există o rată mai mare de nondisjuncţii, dar aceasta este
nesemnificativă deoarece procesul de meioză are o durată de 64 zile şi se produce un număr mare
de spermatozoizi.
Anomaliile numerice pot afecta orice cromozom, însă majoritatea acestora conduc la avort spontan.
În general, cu cât un cromozom este mai mic (cromozomul 21 este cel mai mic) cu atât este mai mare
riscul să apară într-o trisomie viabilă1.
Multe din aceste anomalii pot fi diagnosticate prenatal prin analiza amniocitelor. Prelevarea de lichid
amniotic prin amniocenteză se efectuează după săptămâna 12 de sarcină, deşi pentru creşterea
optimă a celulelor se preferă săptămânile 15-18. Această metodă permite astfel detectarea aberaţiilor
cromozomiale în trimestrul doi de sarcină sau mai târziu. Se consideră că analiza citogenetică
efectuată pe lichid amniotic are o acurateţe ce se apropie de 100% pentru depistarea anomaliilor
430
19
cromozomiale fetale mari. Se estimează că astfel de anomalii sunt detectate în aproximativ 3% din
probele de lichid amniotic testate4.
Alături de tehnica citogenetică clasică de cultivare a amniocitelor sub formă de monostrat in situ, a
devenit disponibilă în ultimii ani şi o tehnică FISH rapidă (rezultat în 24-36 ore de la sosirea probelor în
laborator) pentru depistarea aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X şi Y în combinaţie cu modificările
ecografice. Cu toate acestea, testul nu poate detecta anomaliile numerice ale altor cromozomi şi
nici anomaliile cromozomiale de tip structural. Mai mult, mozaicismul cromozomial, în special cel
în proporţie redusă (≤ 10%), trebuie confirmat prin analiza citogenetică standard. Mozaicismul este
prezent la 3% din cazurile de sindrom Down şi până la 75% din cazurile de sindrom Turner1.
Pe lângă vârsta maternă înaintată, alte indicaţii de amniocenteză şi efectuare de cariotip din lichid
amniotic includ: evidenţierea unui risc crescut la screening-ul efectuat prin dublu sau triplu test,
naşterea anterioară a unui copil cu anomalii cromozomiale, ecografie fetală anormală, istoric familial
pozitiv pentru anomalii cromozomiale1;2;4.
Specimen recoltat - 20-30 mL lichid amniotic recoltat prin amniocenteză într-un recipient steril
de plastic (în momentul recoltării primii 2 mL de lichid aspirat vor fi aruncaţi pentru a se evita
contaminarea cu celulele materne; se va folosi o seringă de unică folosinţă după care lichidul va fi
transferat în recipientul steril)3.
Cauze de respingere a probei – probe vechi sau contaminate bacterian4.
Stabilitate probă – maxim 72 ore din momentul recoltării probei până la intrarea acesteia în lucru4.
Metodă – tehnica clasică de bandare G; se efectuează trei culturi independente de lichid amniotic
dintre care se analizează două, iar cea de a treia rămâne în incubator (ca rezervă); de regulă, se
examinează cel puţin 6 colonii celulare (maxim 12) şi 15 metafaze, dintre care 5 sunt cariotipizate4.
Pentru modul de raportare a rezultatelor vezi 19.1.1 Analiza cromozomială în sânge (cariotip
constituţional sau postnatal).
Cele mai frecvente anomalii detectate la examenul citogenetic din lichid amniotic sunt trisomiile viabile
şi aneuploidiile cromozomilor sexuali. Deoarece sunt rezultatul unei nondisjuncţii meiotice au un risc
foarte mic de recurenţă.
Ocazional se poate depista o anomalie cromozomială structurală echilibrată sau neechilibrată. În
aceste cazuri se recomandă a se efectua cariotipul ambilor părinţi pentru a diferenţia o rearanjare
moştenită de o anomalie de novo. De exemplu, un copil cu translocaţie echilibrată moştenită are un
risc <1% ca această rearanjare să genereze un fenotip anormal. În schimb, dacă translocaţia aparent
echilibrată nu este depistată la nici unul dintre părinţi, este o modificare de novo asociată cu un risc
de 5-10% de modificări fenotipice.
Depistarea unei translocaţii neechilibrate la făt, indiferent dacă părinţii sunt purtători sau nu ai acestei
anomalii, indică întotdeauna prezenţa unui defect genetic. Cariotipul părinţilor este de asemenea
recomandat pentru a evalua riscul de recurenţă a acestei anomalii la sarcinile ulterioare2.
Un cariotip normal nu exclude posibilitatea unor defecte fetale care se datorează unor anomalii
citogenetice submicroscopice, mutaţii moleculare sau modificări induse de agenţi teratogeni4.
431
Bibliografie
1. Ann M.Gronowski. Chromosome Analysis in Prenatal Diagnosis. In Handbook of Clinical

Laboratory Testing During Pregnancy. Humana Press, USA, Ed. 2004, 139-157.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Chromosome Analysis, Amniotic Fluid.
www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
19.3 Citogenetica tumorală
Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea examenului citogenetic în neoplazii

Un alt domeniu medical în care examenul citogenetic îşi găseşte aplicaţii este oncologia. Dacă pentru
tumorile solide variabilitatea foarte mare a modificărilor cariotipice face dificile deciziile terapeutice,
pentru leucemii şi limfoame există numeroase date clinice care atestă asocierea directă a unor
rearanjări cromozomiale specifice cu tumorigeneza şi permit instituirea unor tratamente ţintite.
Astfel, examenul citogenetic standard împreună cu tehnica FISH la pacienţii cu diverse neoplazii
hematologice au devenit din ce în ce mai importante în managementul acestor boli. În primul rând,
cunoaşterea anomaliilor genetice este importantă pentru încadrarea corectă a leucemiilor conform
clasificării OMS, iar în al doilea rând unele aberaţii au valoare prognostică. În al treilea rând au fost
dezvoltate din ce în ce mai multe tratamente specifice care ţintesc direct sau indirect subtipurile de
leucemie definite genetic. Dacă tratamentul este eficient, majoritatea anomaliilor cromozomiale dispar
= remisiune citogenetică. În cazul recăderilor reapar aberaţiile citogenetice depistate iniţial, la care se
pot adăuga anomalii noi ca urmare a dezvoltării unor linii celulare mai complexe = evoluţia cariotipului.
În general, numărul şi tipul anomaliilor cromozomiale detectate se corelează direct cu severitatea
bolii şi prognosticul nefavorabil. Din acest motive se recomandă ca în neoplaziile hematologice să se
efectueze examen citogenetic4.
Deşi tehnicile moleculare s-au dezvoltat mult în ultimii ani şi au devenit obligatorii pentru evaluarea
anumitor subtipuri de leucemii, acestea nu pot încă să înlocuiască citogenetica convenţională.
Câteva grupuri de studiu au încercat să efectueze o standardizare a analizei citogenetice în neoplaziile
hematologice. Astfel, un subgrup aparţinând asociaţiei European Leukemia Network (ELN, WP11) a
colectat protocoale din 12 ţări europene şi le-a concentrat într-un ghid dedicat citogeneticienilor şi
hematologilor.
Deoarece neoplazii hematologice diferite sunt caracterizate prin anomalii citogenetice distincte
necesitând condiţii de cultură şi sonde FISH specifice, au fost dezvoltate protocoale separate pentru
leucemia acută limfoblastică (ALL), leucemia acută mieloblastică (AML), leucemia limfocitară cronică
432
19
(CLL), leucemia mieloidă cronică (CML), neoplasmele mieloproliferative cronice şi sindroamele

mielodisplazice.
Măduva osoasă este proba preferată de analizat, cu excepţia CLL în care sângele periferic reprezintă
alternativa recomandată. Pe fiecare mL de mediu de cultură sunt aplicate aproximativ
1-3 x 106 celule care sunt cultivate timp de 24 şi 48 ore, după care celulele sunt expuse la Colcemid
înainte de a fi recoltate. Pentru acurateţea examenului citogenetic este necesar să fie examinate 10-
20 metafaze anormale sau 20-25 metafaze normale. În funcţie de contextul clinic pot fi recomandate
investigaţii suplimentare: FISH, RT-PCR, Southern blot3.
Leucemia acută limfoblastică
Trebuie să se efectueze cel puţin 2 culturi, una timp de 24 ore şi cealaltă de 48 ore. Dacă există
suficientă probă, va fi efectuată şi o cultură de 72 ore. Înainte de recoltarea celulelor se recomandă
o expunere de 0.5-2 ore la Colcemid. Deoarece s-a demonstrat că tehnicile de sincronizare a ciclului
celular, concentraţiile crescute şi expunerea prelungită la Colcemid exercită un impact negativ asupra
analizei bandării cromozomiale (datorită „otrăvirii” celulelor), se recomandă să se utilizeze suplimentar
şi tehnica FISH.
Indicaţii de utilizare a sondelor FISH în ALL:
- pentru gena MLL în pro-B ALL (pre-pre B ALL, CD10 -) şi la toţi copiii <1 an;
- pentru gena de fuziune BCR-ABL1 în leucemia cu precursor de celulă B (BCP ALL);
- pentru gena de fuziune ETV6-RUNX1 în leucemia cu precursor de celulă B (BCP ALL) a
copilului;
- pentru cromozomii 4, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 21 şi X în leucemia cu precursor de celulă B
(BCP ALL) a copilului;
- pentru gena MYC în leucemia cu celulă B matură (B-ALL);
- pentru genele CDKN2A, SIL-TAL1 şi NUP214-ABL1 în leucemia cu celulă T (T-ALL).
Dacă numărul de metafaze ce au putut fi examinate a fost <10 sau nu a fost detectată nici o anomalie
specifică, iar subtipul ALL este necunoscut, se recomandă toate aceste teste FISH3.
Atât numărul cât şi alterările structurale ale cromozomilor reprezintă un element de prognostic
independent în ALL.
Astfel, copiii ai căror limfoblaşti prezintă hiperdiploidie (>50 cromozomi) au perioade mai lungi de
remisiune şi o rată mai bună de supravieţuire în comparaţie cu alte grupuri citogenetice. Mai mult,
hiperdiploidia înaltă (>53 cromozomi) este asociată cu o rată de recădere mult mai mică. Prognosticul
favorabil al hiperdiploidiei s-ar datora prezenţei simultane a trisomiilor 4 şi 10 sau a trisomiilor 4, 10
şi 17. Pe de altă parte, hipodiploidia severă (prezenţa unei clone cu <44 cromozomi) conferă un
prognostic nefavorabil, în ciuda tratamentului intensiv.
Translocaţiile cromozomiale clonale reprezintă un marker important de prognostic în ALL6.
Un subset de ALL cu un prognostic nefavorabil, caracterizat prin recădere precoce după chimioterapie,
prezintă o translocaţie ce implică gena MLL (Mixed Lineage Leukemia, cunoscută şi ca HRX sau
ALL1) de pe segmentul cromozomial 11q23. În mod normal MLL controlează expresia genelor Hox
ce deţine un rol important în dezvoltarea hematopoetică. Deoarece translocaţiile MLL se găsesc în
mod specific în leucemiile copilului mic precum şi în leucemia indusă de chimioterapie, nu este clar
433
dacă factori ce ţin de gazdă sau diferenţe biologice intrinseci legate de tumoră sunt responsabile
de prognosticul nefavorabil. Blaştii MLL pot exprima atât markeri mieloizi cât şi limfoizi. Punctul de
ruptură este situat între exonii 5 şi 11 ai genei MLL. Produsul translocaţiei este o proteină himerică
în care porţiunea N-terminală a MLL fuzionează cu capătul C-terminal al partenerului de fuziune. Se
cunosc aproximativ 49 gene de fuziune; aproximativ 36 translocaţii au fost caracterizate citogenetic.
Produsul de fuziune devine un activator transcripţional; nivelul ridicat al HOXA9, HOXA5, HOXA4,
HOXA10 şi chiar MEIS1 caracterizează profilul genetic al leucemiilor cu rearanjări MLL10;12.
Cele mai frecvente translocatii sunt t(4;11)(q21;q23) asociată adesea cu ALL la sugari, t(6;11)
(q27;q23), t(9;11)(p22;q23) şi t(11;19)(q23;p13). Principalii parteneri de fuziune ai genei MLL sunt AF4
pe cromozomul 4, AF6 pe cromozomul 6, AF9 pe cromozomul 9 şi, respectiv, ENL pe cromozomul
19. Pentru t(4;11)(q21; q23) s-au descoperit 10 produşi ARNm de fuziune, în funcţie de punctul de
ruptură10.
Translocaţia t(12;21)(p13;q22) ce are drept rezultat apariţia genei de fuziune ETV6-RUNX1 (TEL-
AML1) este detectată la 25% dintre copiii cu leucemie cu precursor de celulă B (tipic, >2 ani), fiind
asociată cu un prognostic favorabil. Precursorii de celulă B, deşi nu prezintă imunoglobuline de
suprafaţă sau citoplasmatice (cIg), exprimă antigene de suprafaţă care se regăsesc pe limfocitele
B mai mature (CD19, CD22, CD79a). Deşi majoritatea limfoblaştilor pre-B sunt CD10+ (CD10 mai
este denumit şi CALLA = common ALL antigen), se pare că expresia acestui marker nu prezintă
semnificaţie prognostică independentă2;6;12.
Translocaţia t(1;19)(q23;p13) este întâlnită la aproximativ 25% dintre pacienţii cu imunofenotip pre-B
cIg+. Această translocaţie este rezultatul fuziunii genei E2A de pe cromozomul 1 cu gena PBX1 de pe
cromozomul 19. Expresia genei de fuziune E2A-PBX1 este asociată cu cazurile de ALL la copii cIg+,
însoţite de un număr mare de leucocite. Prognosticul nefavorabil conferit de această translocaţie este
contracarat în prezent de protocoalele de tratament intensiv.
Translocaţiile ce afectează locusul c-MYC de pe 8q24 împreună cu unul din locusurile Ig de pe 14q32,
2p12 sau 22q11 sunt caracteristice leucemiei cu celulă B matură (Burkitt) şi nu pot fi deosebite de
t(8;14) şi alte translocaţii asociate care apar în limfomul Burkitt. Şi în această formă chimioterapia
intensivă a anulat prognosticul infaust determinat de aceste translocaţii.
Cromozomul Philadelphia rezultat ca urmare a translocaţiei t(9;22)(q32;q11) este prezent la ~20-
30% dintre adulţii şi 1-5% dintre copiii cu ALL; se asociază cu număr mare de leucocite, vârstă mai
înaintată, sexul masculin şi morfologie FAB-L2. Deşi prognosticul advers al cromozomului Ph este
independent de alţi factori, un studiu internaţional a arătat că unii copii cu ALL-Ph+ dar cu elemente
de prognostic favorabil pot fi vindecaţi numai prin chimioterapie agresivă. Inhibitorii de tirozin-kinază
au îmbunătaţit tratamentul şi prognosticul acestei forme de leucemie, însă transplantul alogenic de
măduvă osoasă continuă să fie recomandat în prima remisiune6.
Alterări în expresia genei TAL1/SCL (T-cell acute lymphoblastic leukemia 1/stem cell leukemia) sunt
cele mai frecvente anomalii în T-ALL; gena TAL1/SCL a fost clonată iniţial din translocaţia t(1;14)
(p34;q11) prezentă în 3% din cazurile de T-LAL. TAL1 codifică factorul de transcripţie helix-loop-helix
(bHLH) cu rol în hematopoieză. În cursul dezvoltării, gena este exprimată în elementele hematopoietice
primitive; postnatal este exprimată în liniile eritroide, megacariocitare, mastocitare, dar nu în celulele
434
19
T. Experimental, a fost demonstrat că gena TAL1/SCL nu este necesară pentru menţinerea celulelor
stem hematopoietice, însă este utilă în diferenţierea eritrocitară şi megacariocitară10.
Alterarea unităţii de transcripţie TAL-1 are la bază 2 mecanisme diferite: 25% dintre pacienţii T-ALL
au o deleţie de 90 până la 100 baze la capătul 5’ al situsului TAL, în timp ce 3% dintre pacienţii T-ALL
prezintă translocaţia t(1;14)(q34;q11), care transpune TAL1 de pe cromozomul 1 pe cromozomul 14,
în locusul receptorului TCR (complexul alfa-delta). În urma rearanjării cromozomiale, promotorul SIL
influenţează expresia genei SCL - mecanism de generare a leucemiei T limfoblastice14.
Deleţiile sau translocaţiile care afectează cromozomul 9p sunt întâlnite în ~10% din cazurile de ALL la
copii şi sunt asociate cu un număr mare de leucocite la debut, masă mediastinală, imunofenotip T şi
un risc crescut de recădere. Gena inhibitorului 4 de kinază dependent de ciclină (CDKN2 sau p16ink4)
localizată pe 9p21 suferă deleţie în >20% din cazurile de ALL sau alte neoplazii limfoide10.
Leucemia acută mieloblastică
În AML este necesar să se efectueze cel puţin două culturi celulare: una de 24 ore şi cealaltă de 48
ore. Dacă există suficientă probă va fi efectuată şi o cultură de 72 ore, alături de o cultură de 24 ore
suplimentară. În subtipurile FAB M3 şi M3v de AML este obligatoriu să se efectueze cultura de 48 ore,
deoarece clona aberantă nu poate fi detectată în cultura de 24 ore. Înainte de recoltarea celulelor se
recomandă o expunere de 0.5-2 ore (opţional 24 ore) la Colcemid.
Datorită impactului mare asupra prognosticului exercitat de anumite anomalii genetice în AML precum
şi a naturii criptice a acestora, în unele cazuri se recomandă analize FISH suplimentare.
Indicaţii de utilizare a sondelor FISH în AML:
- pentru genele PML şi RARA în AML M3 şi M3v;
- pentru gena MLL în AML M4 şi M5;
- pentru CBFB în în AML M4 cu eozinofile anormale.
Dacă numărul de metafaze ce au putut fi examinate a fost <10 sau nu a fost detectată nici o anomalie
specifică, iar subtipul morfologic AML este necunoscut, se recomandă toate aceste teste FISH. În
plus se recomandă sonde pentru RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO), 5q31, 7q31 şi TP53 în caz de eşec
al analizei de bandare cromozomială3.
Frecvent în AML apar alterări genetice specifice. Aceste modificări pot fi translocaţii cromozomiale:
t(15;17), t(8;21), inv(16) sau mutaţii la nivelul genelor care codifică moleculele semnalului de
transducţie cum ar fi: RAS sau receptorul tirozinkinazei FLT3. Detectarea fiecărei dintre aceste aberaţii
are importanţă în diagnostic.
Astfel, asocierea translocaţiei t(15;17)(q22;q21) cu morfologia caracteristică leucemiei acute
promielocitare APL (blaşti hipergranulari cu numeroşi corpi Auer sau varianta microgranulară cu
nuclei indentaţi) este de mult cunoscută. Comunicarea iniţială a faptului că acidul trans-retinoic (ATRA)
poate induce remisiune completă la pacienţii cu ALP a precedat descoperirea că translocaţia t(15;17)
afectează gena acidului retinoic α (RARα) situată pe cromozomul 17.
Dintre cele 4 translocaţii cunoscute ca fiind asociate cu APL cea mai frecventă este t(15;17)(q22;q21),
în care porţiunea 5’ a proteinei de fuziune este codificată de gena PML (gena leucemiei promielocitare)
de pe 15q22, iar porţiunea 3’ de către gena RARα situată pe 17q21. Această translocaţie este prezentă
în > 95% din cazurile de ALP. Gena RARα codifică un receptor steroidic dependent de ligand care
435
mediază efectele ligandului - acidul retinoic - asupra celulei. Punctul de rupere este situat invariabil
în intronul 2, obţinându-se porţiunea C-terminală a produsului de fuziune, care include domeniile de
legare a ADN-ului şi a ligandului, precum şi domeniile de dimerizare şi represie ale genei RARα.
La nivelul genei PML există 3 puncte de majore de ruptură, cel mai cunoscut produs de fuziune
fiind PML(L)-RARα care include primii 6 exoni ai genei PML ce codifică 554 aminoacizi. Mecanismul
răspunsului APL la ATRA a fost precizat prin studierea unei alte translocaţii t(11;17)(q23;q21), rar
întâlnită la pacienţii cu APL.
Translocaţia t(8;21)(q22;q22) apare la aproximativ 15% dintre pacientii cu AML. Rezultatul translocaţiei
la nivel molecular este fuziunea porţiunii 5’ a genei ETO cu gena RUNX1 (AML1). Rolul esenţial al
RUNX1 în hematopoieză se datorează funcţiei sale de activator al transcripiţiei. Produsul de fuziune
este asociat cu pierderea alelei ETO nontranslocate, ceea ce duce la absenţa genei funcţionale în
celulele leucemice. Proteina de fuziune se leagă de acelaşi situs de legare a ADN-ului ca şi RUNX1
şi poate să heterodimerizeze cu CBFβ (core binding factor). Astfel, proteina RUNX1-ETO acţionează
ca un inhibitor dominant negativ al tipului sălbatic RUNX19;10.
Inversiunea 16 sau t(16,16), prezentă în aproximativ 8% din cazurile AML, implică gena CBFβ şi este
asociată cu un subtip morfologic distinct de AML, M4Eo (o formă de leucemie mielomonocitară cu
eozinofile anormale care au atât granulaţii violet-închis cât şi portocalii). Această anomalie citogenetică
în care gena CBFβ este alăturată genei MYH11 (gena lanţului greu al miozinei muşchiului neted)
determină fuziunea primilor 165 aminoacizi ai CBFβ cu regiunea C-terminală coiled-coil a SMMHC
(smooth muscle myosin heavy chain protein). O regiune C-terminală a regiunii SMMHC este necesară
pentru activitatea CBFβ/SMMHC de represor al transcripţiei. Astfel, CBFβ/SMMHC care nu poate lega
singur ADN-ul va interacţiona cu RUNX1 pentru a forma un complex represor al transcripţiei7;10.
APL cu t(15;17) şi AML cu anomalii CBFβ - t(8;21) şi inv(16) - reprezintă grupuri citogenetice cu
evoluţie favorabilă. AML cu anomalii CBFβ prezintă o rată crescută de remisiune completă şi de
supravieţuire, mai ales când se utilizează protocoale terapeutice cu doze mari de citarabină. Cu toate
acestea prognosticul acestor pacienţi se poate modifica dacă la citogenetica favorabilă se adaugă un
anumit marker de suprafaţă sau o anomalie moleculară. De exemplu, dacă t(18,21) survine la pacienţi
vârstnici sau atunci când celulele cu translocaţie exprimă molecula CD56 sau prezintă mutaţii c-KIT
prognosticul este infaust. Tratamentul standard al pacienţilor AML cu citogenetică favorabilă constă
în chimioterapie postremisiune.
Grupurile nefavorabile citogenetic includ formele AML cu del(5q)/-5q, -7/del(7q) şi/sau cariotip-uri
complexe (definite prin prezenţa a mai mult de 3 sau mai mult de 5 anomalii diferite) sau cu inv(3)/
t(3;3), t(6;9) sau t(9;22). Există o variabilitate în comunicarea altor cariotipuri asociate cu evoluţie
nefavorabilă între grupurile de studiu. Printre acestea se numără: anomaliile 9q, 11q, 12p, 17p, 20q, +8
şi +21. Anomaliile 11q23 prezintă un impact negativ asupra ratei de supravieţuire, cu excepţia t(9;11).
Tratamentul standard al pacienţilor AML cu citogenetică nefavorabilă este transplantul alogenic de
măduvă osoasă, atunci când acesta este disponibil, sau terapiile experimentale.
Grupul citogenetic cu risc intermediar este definit ca grupul AML cu cariotip normal sau cu anomalii
citogenetice neîncadrate ca fiind favorabile sau nefavorabile. Pacienţii cu cariotip normal reprezintă un
grup heterogen care poate fi în continuare divizat în categorii pe baza testelor moleculare9.
436
19
Leucemia mieloidă cronică

În CML este necesar să se efectueze cel puţin două culturi celulare: una de 24 ore şi celalaltă de
48 ore. Dacă există suficientă probă va fi efectuată şi o cultură de 72 ore, alături de o cultură de 24
ore suplimentară. În momentul diagnosticului examenul citogenetic se poate efectua atât din măduva
osoasă cât şi din sângele periferic; după obţinerea remisiunii hematologice analiza măduvei este
obligatorie pentru evaluarea răspunsului citogenetic. Înainte de recoltarea celulelor se recomandă o
expunere de 0.5-2 ore (opţional 24 ore) la Colcemid.
Tehnica FISH cu sonde pentru BCR şi ABL1 este obligatorie în cazurile în care numărul de metafaze
este insuficient sau în situaţia în care la citogenetica convenţională nu se depistează t(9;22)(q34;q11)
– în ~ 5% din cazuri fuziunea BCR-ABL1 este criptică3.
CML se caracterizează prin prezenţa translocaţiei cromozomiale t(9;22)(q34;q11) care a fost
considerată iniţial ca o anomalie 22 q- (un cromozom 22 cu braţul lung scurtat) şi denumită cromozomul
Philadelphia (Ph) (Nowell, 1960; Rowley, 1973). Această translocaţie are drept rezultat juxtapunerea
genei tirozin kinazei ABL1 (Abelson) de pe cromozomul 9 lângă gena BCR (Breakpoint Cluster
Region) de pe cromozomul 22 cu formarea genei de fuziune BCR-ABL1 (fuziune cap-coadă capăt 5’
BCR – capăt 3’ ABL). Gena anormală se transcrie într-un ARNm hibrid ce va determina în final sinteza
unei proteine himerice Bcr-Abl cu activitate tirozin-kinazică autonomă.
În mod obişnuit punctele de ruptură de pe gena BCR se situează în regiunea majoră (M-bcr) care
se întinde pe aproximativ 6 kb, între exonii 12 şi 16; în urma fuzionării cu secvenţe 3’ ale genei ABL
va rezulta o genă hibrid ce va genera în final o proteină de 210 kD. Punctele de ruptură mai pot
fi localizate şi într-o regiune minoră (m-bcr); în acest caz va rezulta în final o proteină de fuziune
trunchiată de 190 kDa, care conţine doar secvenţele codificate de primii 2 exoni ai genei BCR (vezi
fig.19.3.1). Proteina p210 este întâlnită în principal în CML, în timp ce p190 în ALL Ph+10.
437
Gena BCR- cromozom 22 Gena ABL1 cromozom 9

Punctul de ruptură în ALL
Punctul de ruptură în CML Punctul de ruptură în CML úi ALL
5’ 3’ 5’ 3’
Proteina bcr 160 kDa Proteina abl 145 kDa
TranslocaĠie
5’ 3’ Gena de fuziune BCR/ABL
TranscripĠie
3’ ARNm de fuziune
5’ AAA
TranslaĠie
3’ Proteina bcr/abl
5’
Fig. 19.3.1 Schemă simplificată de generare a unei proteine de fuziune bcr/abl

(Adaptare după Alberts B, Molecular biology of the cell)
Neoplasmele mieloproliferative cronice

Este necesar să se efectueze cel puţin două culturi celulare: una de 24 ore şi celalaltă de 48 ore.
Dacă există suficientă probă va fi efectuată şi o cultură de 72 ore, alături de o cultură de 24 ore
suplimentară. Sunt preferate probele de măduvă osoasă pentru tehnica de bandare cromozomială.
Cu toate acestea, dacă există leucocitoză marcată cu celule imature sau puncţia medulară este albă
(în cazul mielofibrozei), pot fi utilizate şi probe de sânge periferic.
În cazul sindromului hipereozinofilic/leucemiei eozinofilice cronice se recomandă teste FISH pentru
detectarea fuziunii FIP1L1-PDGFRA şi a rearanjărilor PDGFRB10.
Leucemia limfocitară cronică
În CLL analiza prin bandare cromozomială este limitată de rata scăzută de proliferare in vitro a
celulelor leucemice. Se preferă utilizarea probelor de sânge periferic. Este necesar să se efectueze
cel puţin două culturi: una de 24 ore şi celalaltă de 72 ore. Dacă există suficientă probă va fi efectuată
şi o cultură de 48 ore, alături de o cultură de 96 ore. Se recomandă adăugarea în cultură a unor factori
de stimulare a creşterii.
438
19
Deoarece citogenetica convenţională poate să fie neconcludentă, testele FISH sunt recomandate de
rutină pentru clasificarea citogenetică a CLL. Se utilizează sonde FISH pentru următoarele locusuri:
- ATM de pe 11q22;
- D13S319, D13S25 şi D13S272 de pe 13q1 4;
- TP53 de pe 17p13;
- Cen12.
În plus tehnica FISH mai poate fi folosită pentru detectarea deleţiei 6q21-23. În cazurile în care
nu se poate face o diferenţiere între CLL şi alte limfoame non-hodgkiniene de malignitate joasă se
recomandă sonde pentru IGH@, BCL2 şi CCND1.
Chiar dacă tehnica de bandare cromozomială identifică un cariotip aberant, se recomandă test FISH
pentru deleţia 13q14, deoarece 5-10% dintre deleţiile 13q sunt submicroscopice3.
Cea mai frecventă anomalie clonală în CLL (19-36%) este trisomia 12, izolată sau în combinaţie cu alte
aberaţii citogenetice. Alte modificări frecvent observate includ anomalii structurale ale cromozomilor
13 (10-20%) şi 14 (8-16%). Anomaliile 13q sunt reprezentate în principal de deleţia 13q14 sau de
translocaţiile cu punct de ruptură în regiunea 13q14. Anomaliile 14q includ translocaţii ce afectează
în principal cromozomul 11. Mai puţin de 5% dintre pacienţi prezintă o deleţie 11q22-23. Anomaliile
cromozomilor 12 şi 13 se produc cu frecvenţă similară la pacienţii cu o singură anomalie clonală şi la
cei cu aberaţii multiple; în schimb anomaliile cromozomului 14 apar la pacienţii cu mai multe anomalii
clonale.
În general, pacienţii cu cariotip anormal au un prognostic mai rezervat decât cei fără anomalii
citogenetice; impactul este şi mai mare în cazul anomaliilor clonale multiple. În plus, cu cât procentul
celulelor aflate în metafază ce sunt afectate de aberaţii clonale este mai mare cu atât prognosticul
este mai rezervat. Dintre pacienţii cu o singură anomalie clonală, cei cu trisomie 12 au prognosticul cel
mai nefavorabil, în schimb cei cu 13q+ au rată de supravieţuire similară pacienţilor cu cariotip normal.
Trisomia 12 este întâlnită în cele ~ 15% din cazuri cu variante CLL – leucemie prolimfocitară sau CLL
atipică – ceea ce ar explica prognosticul nefavorabil al pacienţilor cu aceste variante de boală.
Atunci când se iau în considerare toţi pacienţii, indiferent de numărul clonelor anormale, cei cu
anomalii ale cromozomului 14 au prognosticul cel mai sever. Majoritatea pacienţilor cu anomalii ale
cromozomului 14 prezintă translocaţia t(11;14)(q13;q32), astfel că prezintă mai degrabă un limfom cu
celule ale mantalei decât CLL.
Deleţiile 11q22-q23 sau 17p13 se asociază cu progresia bolii şi o rată mai mică de supravieţuire.
S-a recomandat recent ca toţi pacienţii cu CLL să fie examinaţi de rutină pentru o translocaţie IgH
(immunoglobulin heavy chain locus). Aceste tipuri de translocaţii sunt întâlnite mai frecvent în unele
limfoame non-hodgkiniene cu celule B de care trebuie diferenţiată CLL:
- translocaţia între cromozomii 14 şi 18 ce implică gena BCL2 şi locusul IgH apare mai frecvent în
limfomul folicular;
- translocaţia între cromozomii 11 şi 14 ce implică gena ciclinei D1 (CCND1) şi locusul IgH apare mai
frecvent în limfomul cu celule ale mantalei.
Există dovezi privind evoluţia clonală în CLL. Prin efectuarea testelor FISH se constată că aproximativ
25% din pacienţi vor dezvolta anomalii cromozomiale noi după 5 ani de evoluţie. Riscul este mai mare
439
la cei care primesc tratament cu fludarabină. Astfel, achiziţionarea de deleţii 11q22-23 sau 17p13 se
asociază cu o evoluţie nefavorabilă a bolii5.
Sindroamele mielodisplazice (MDS)
În MDS este necesar să se efectueze cel puţin două culturi celulare: una de 24 ore şi celalaltă de
48 ore. Dacă există suficientă probă va fi efectuată şi o cultură de 72 ore, alături de o cultură de 24 ore
suplimentară. Trebuie să se utilizeze probe de măduvă osoasă deoarece celulele aparţinând clonelor
din MDS nu se divid de obicei în sângele periferic. Înainte de recoltarea celulelor se recomandă o
expunere de 0.5-2 ore (opţional 24 ore) la Colcemid. Expunerea prelungită creşte rata de succes
în special în MDS hipocelulare. Dacă nu au putut fi analizate cel puţin 10 metafaze, se recomandă
utilizarea de sonde FISH pentru 5q31, cen7, 7q31, cen8, TP53, 20q şi cenY care depistează aberaţiile
cele mai frecvente3.
Anomalii cromozomiale clonale se înregistrează în 30-50% dintre cazurile de MDS de novo şi în~ 80%
din MDS secundare sau iatrogene. Modificările cromozomiale caracteristice MDS includ un număr
mare de rearanjări (translocaţii, deleţii, inversii şi inserţii) şi un număr mai redus de aberaţii numerice
(monosomii şi trisomii). Acestea sunt rezumate în tabelul de mai jos:
Incidenţa anomaliilor cromozomiale în MDS primar şi în MDS indus iatrogen prezentate în

ordinea frecvenţei
MDS primar (de novo)
Anomalii ale cromozomilor 5 şi 7
+8
Anomalii ale cromozomului 5 (în principal deleţii 5q)
-7
del(20q)
Anomalii ale 17 p (în principal deleţii)
-Y
MDS indus iatrogen (therapy-related MDS)
Anomalii ale cromozomului 7
Anomalii ale cromozomului 5 (în principal deleţii 5q)
Anomalii ale cromozomilor 5 şi 7
t(11q23)
t(21q22)
inv(16)
t(15;17)
Deşi deleţiile 5q pot fi detectate în întreg spectrul de MDS, primare sau iatrogene, sindromul 5q-
constituie o entitate bine definită. Acest sindom se dezvoltă în special la femeile vârstnice şi se
caracterizează prin anemie macrocitară rezistentă la tratment, un număr normal sau crescut de
trombocite şi printr-un număr crescut de megacariocite cu anomalii morfologice caracteristice (nuclei
hipolobulaţi). Evoluţia bolii este blândă, iar transformarea în AML este rară, mai ales dacă 5q-
440
19
reprezintă singura anomalie citogenetică.

Deleţia 5q este întâlnită în cel puţin 50% din cazurile de anemie refractară (RA). În RA mai pot să
apară monosomia 7 (7-) şi trisomia 8 (+8).
Aproximativ 20% din anemiile refractare cu sideroblaşti inelari (RARS) prezintă anomalii citogenetice
clonale. Trisomia 8 este cea mai frecventă anomalie, urmată de del(5q), monosomia 7, del(11q23) şi
del(20q).
Anemia refractară cu exces de blaşti (RAEB) şi anemia refractară cu exces de blaşti în transformare
(RAEB-t) se asociază cu anomalii cromozomiale în 45-60% din cazuri. Incidenţa şi gradul de extindere
al aberaţiilor citogenetice se corelează cu numărul de mieloblaşti din măduvă. Deleţia 5q este cea mai
frecventă anomalie structurală (în 25% din cazuri). Monosomia 5 este relativ comună (10%) dar apare
rar ca o modificare izolată. Monosomia 7 este mai frecventă în RAEB-t (25%) decât în alte subtipuri de
MDS. Del(11q) este mai frecventă în MDS secundar decât în cel de novo. Del(7q) apare mai frecvent
în asociere cu alte modificări de cariotip. Trisomia 8 este o altă anomalie comună în RAEB-t fiind
detectată în 15-20% din cazuri.
Deşi leucemia mielomonocitară cronică (CMML) nu este inclusă în rândul MDS prin clasificarea OMS
acesta este menţionată în majoritatea studiilor citogenetice efectuate la pacienţi cu MDS. Anomaliile
citogenetice se înregistrează în o treime din cazuri, monosomia 7 şi trisomia 8 fiind cele mai frecvente.
Pierderea cromozomului Y este observată mai frecvent în LMMC decât în alte variante MDS şi este
posibil să fie legată de vârsta pacientului şi să nu fie de fapt implicată în procesul neoplazic. În LMMC
a fost raportată şi o translocaţie specifică t(5;12)(q13;p13) care conduce la apariţia genei de fuziune
TEL-PDGFB. Incidenţa scăzută a del(5q) în LMMC reprezintă un indiciu că această formă de afecţiune
nu aparţine MDS1.
Specimen recoltat – a) măduvă osoasă recoltată prin puncţie aspirativă medulară într-o seringă
heparinizată ce va fi descărcată rapid în vacutainer; b) sânge venos8.
Recipient de recoltare – a), b) vacutainer ce conţine heparină ca anticoagulant8.
Cantitate recoltată – a) minim 2-3 mL de măduvă osoasă; b) 5 mL sânge8.
Cauze de respingere a probei – folosirea unui alt tip de anticoagulant; probe vechi, coagulate,
hemolizate sau contaminate bacterian8.
Stabilitate probă – a), b) maxim 72 ore din momentul recoltării probei până la intrarea acesteia în
lucru8.
Metodă – tehnica clasică de bandare G; se va suplimenta cu testări FISH în funcţie de tipul neoplaziei
hematologice8.
Pentru modul de raportare a rezultatelor vezi 19.1.1 Analiza cromozomială în sânge (cariotip
constituţional sau postnatal)8.
Datorită unor erori de recoltare a probelor de măduvă osoasă este posibil să se obţină rezultate fals-
negative.
Uneori celulele tumorale nu se divid (deşi sunt viabile) astfel încât nu se poate efectua analiza
citogenetică11.
441
Bibliografie
1. Alan F. List, Avery A. Sandberg, Donald C. Doll. Myelodysplastic Syndromes. In Wintrobe`s

Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 12th ed,
Lippincott Williams & Wilkins, 2009, 1965-1968.
2. Anthony V Moorman, Hannah M Ensor, Sue M Richards, , Lucy Chilton, Claire Schwab, Prof
Sally E Kinsey, Prof Ajay Vora, Chris D Mitchell, Prof Christine J Harrison. Prognostic effect of
chromosomal abnormalities in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia: results
from the UK Medical Research Council ALL97/99 randomised trial. In Lancet Oncology, Volume
11, Issue 5, Pages 429-438, May 2010.
3. Claudia Haferlach, Harald Rieder, Debra M Lillington, Nicole Dastugue, Anne Hagemeijer,
Jochen Harbott, Stephan Stilgenbauer, Sakari Knuutila, Bertil Johansson, Christa Fonatsch on
behalf of the European Leukemia-Net-Workpackage Cytogenetics. Proposals for Standardized
Protocols for Cytogenetic Analyses of Acute Leukemias, Chronic Lymphocytic Leukemia,
Chronic Myeloid Leukemia, Chronic Myeloproliferative Disorders, and Myelodysplastic
Syndromes. In Genes, Chromosomes, and Cancer 46:494-499 (2007).
5. James B Jonhson, Matthew Seftel, Spencer B. Gibson. Chronic Lymphocytic Leukemia. In
Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F,
Glader B, 12th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2009, 1894-1895.
6. James K Whitlock, Paul S. Gordon. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. In Wintrobe`s
Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 12th ed,
7. Kristie L. Durst, Bart Lutterbach, Tanawan Kummalue, Alan D. Friedman, and Scott W. Hiebert.
The inv(16) Fusion Protein Associates with Corepressors via a Smooth Muscle Myosin Heavy-
Chain Domain. In Mol Cell Biol. 2003 Jan; 23(2):607-19.
9. Maria R. Baer, John P. Greer. Acute Myeloid Leukemia in Adults. In Wintrobe`s Clinical
Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 12th ed,
10. Mary Ann Thompson. Molecular Genetics of Acute Leukemia. In Wintrobe`s Clinical Hematology,
Wilkins, 2009, 1791-1804.
11. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Chromosome Analysis, Hematologic
Disorders, Bone Marrow. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet
Communication.
12. Scott A. Armstrong , Jane E. Staunton , Lewis B. Silverman , Rob Pieters , Monique L. den Boer
, Mark D. Minden, Stephen E. Sallan , Eric S. Lander , Todd R. Golub & Stanley J. Korsmeyer.
442
19
MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique
leukemia. In Nature Genetics, 2002, Jan, 30(1): 41-47.
13. S D Raynaud, N Dastugue, D Zoccola, S A Shurtleff, S Mathew and S C Raimondi.. Cytogenetic
abnormalities associated with the t(12;21): a collaborative study of 169 children with t(12;21)-
positive acute lymphoblastic leukemia. In Leukemia, September 1999, 13(9):1325-1330.
14. Xia Y, Brown L, Tsan JT, Yang CY, Siciliano MJ, Crist WM, Carroll AJ, Baer R. The translocation
(1;14)(p34;q11) in human T-cell leukemia: chromosome breakage 25 kilobase pairs downstream
of the TAL1 Protooncogene. In Genes, Chromosomes and Cancer, 1992; 4(3):211-6.
443
20 TESTE DE TOXICOLOGIE
TESTE DE TOXICOLOGIE
20
20. TESTE DE TOXICOLOGIE

20.1 ALCOOL ŞI DROGURI
20.1.1 Alcoolemie
Informaţii generale şi recomandări pentru determinarea alcoolemiei

Determinările alcoolemiei (etanol în sânge) se numără printre analizele cele mai frecvent solicitate
laboratoarelor de toxicologie clinică, în scopuri medico-legale.
Etanolul se absoarbe cu uşurinţă din tractul gastrointestinal; concentraţiile maxime se înregistrează de
obicei în 40-70 minute de la ingestia pe nemâncate. Prezenţa alimentelor în stomac scade absorbţia
alcoolului. Etanolul este metabolizat hepatic rapid în acetaldehidă. Odată ce s-au atins concentraţiile
sangvine maxime, dispariţia sa este lineară; un bărbat de 70 kg metabolizează 7-10 g alcool/oră.
Simptomele intoxicaţiei cu etanol instalate în prezenta unor concentraţii serice scăzute pot indica o
problema medicală gravă şi necesita intervenţie terapeutică de urgenţă.
Determinarea alcoolemiei poate fi efectuată în scop medical sau medico-legal pentru diagnosticul
intoxicaţiei cu alcool şi stabilirea terapiei adecvate. Nivelurile de etanol trebuie testate în toate
cazurile de comă de etiologie neclară, deoarece intoxicaţia cu alcool poate mima coma diabetică,
traumatismele cerebrale sau supradozarea de droguri. Acest test este de asemenea folosit pentru
screening-ul alcoolismului, cât şi pentru monitorizarea terapiei cu etanol în intoxicaţia cu metanol1;4.
Specimen recoltat - sânge venos; nu se vor folosi la puncţia venoasă tampoane sau comprese
îmbibate cu soluţie de alcool3.
Prelucrare necesară după recoltare - se separă serul prin centrifugare; tubul trebuie să rămână
închis ermetic până în momentul testării pentru a împiedica evaporarea etanolului3.
Volum probă - minim 2 mL ser3.
Stabilitate probă - serul separat este stabil 4 ore la temperatura camerei; 1 săptămână la 2-4ºC în
tuburi închise ermetic; 6 luni la -20 ºC3.
Metodă - enzimatică (cu alcool dehidrogenază)3.
Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor
<10 mg/dL (<2 mmol/L): negativ (limita de detecţie a metodei).
Implicaţii clinice:
- nivelurile de 50-100 mg/dL (10.8 - 21.7 mmol/L) pot determina: flushing, încetinirea
reflexelor, tulburări ale acuităţii vizuale;
- nivelurile >100 mg/dL (> 21.7 mol/L) pot induce depresia SNC;
- nivelurile >300 mg/dL (>64.8 mmol/L) sunt asociate cu instalarea comei;
- nivelurile >400 mg/dL (>86.4 mmol/L) pot cauza decesul1.
Factor de conversie: mmol/L x 4.61 = mg/dL3.
Creşterea cetonemiei în cetoacidoza diabetică poate cauza false creşteri ale alcoolemiei. Ingestia
445
altor tipuri de alcooli (izopropanol, metanol) poate influenţa rezultatele1.

• Medicamente
Creşteri: aspirină, cloralhidrat, cimetidină, metoclopramid, ranitidină.
Scăderi: acid ascorbic, atropină, fenobarbital, propantelină2.
Bibliografie
1. Frances Fischbach. Drug Monitoring. în A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott
Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009 446-447.
2. Frances Fischbach. Effects of the Most Commonly Used Drugs on Frequently Ordered
Laboratory Tests. în A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins,
USA, 8 Ed., 2009, 1237.
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Ethanol, Blood.
www.labcorp.com . 2010. Ref Type: Internet Communication.

20.1.2 Depistare droguri în urină (screening)
Testarea pentru abuzul de droguri (screening) se realizează pentru depistarea prezenţei în organism
a drogurilor ilegale. Este o metodă utilizată în multe scopuri: clinice sau de îngrijire medicală, la locul
de muncă (medicina muncii), postmortem (cauză de deces) sau testarea sportivilor.
Urina este proba biologică cel mai des folosită pentru testare, dar se pot utiliza şi alte probe precum:
sângele, părul, saliva, produsul glandelor sudoripare.
Testul utilizat în laboratorul Synevo permite o depistare rapidă a următoarelor droguri în urină:
amfetamine, barbiturice, benzodiazepine, cocaină, metadonă, opiacee, fenciclidină.
Amfetaminele sunt substanţe stimulante ale sistemului nervos central înrudite chimic şi farmacologic
cu epinefrina şi norepinefrina – catecolaminele din organism1.
Aceste substanţe sunt larg răspândite, mai ales ca inhibitori ai apetitului alimentar în cure de slăbire,
respectiv indicate pentru creşterea performanţelor înainte de examen sau în viaţa profesională (de
exemplu, la şoferii de camion)8.
După ingestie, amfetaminele sunt absorbite cu uşurinţă din stomac şi pătrund rapid în circulaţia
sangvină. Sunt metabolizate de către ficat prin procese de hidroxilare, demetilare (metamfetamina
este demetilată în amfetamină), deaminare şi conjugare. Eliminarea se face pe cale renală, atât sub
formă de metaboliţi cât şi ca amfetamine nemodificate; procentul de amfetamine excretat depinde de
pH-ul urinar.
Amfetaminele stimulează vigilenţa şi suprimă apetitul prin efectele de excitare ale SNC; în acelaşi timp
446
20
induc o stare de energizare, încredere în sine şi euforie3.

Creşterea performanţelor şi a capacităţii de efort se face pe seama rezervelor energetice; dacă
acestea nu se refac în cantitate suficientă, cu timpul se ajunge la epuizarea generală a organismului.
Acest risc este cu atât mai mare, cu cât prin efectul lor central, amfetaminele şi derivaţii lor suprimă
senzaţia de foame, determinând reducerea aportului alimentar.
Amfetaminele pot induce atât dependenţă fizică cât şi psihică8.
Supradozarea determină anorexie, insomnie, agitaţie psihomotorie, anxietate marcată; efectele
cardiovasculare includ creşterea tensiunii arteriale şi aritmii1;3.
Barbituricele, o clasă de medicamente derivate din acidul barbituric (maloniluree), sunt sedative
hipnotice care deprimă activităţile SNC. În funcţie de durata lor de acţiune sunt clasificate în barbiturice
cu acţiune foarte scurtă, scurtă, intermediară şi îndelungată.
Aceste medicamente sunt prescrise medical pentru a reduce tensiunea emoţională şi induce
somnul; sunt folosite de asemenea în unele forme de epilepsie pentru a reduce frecvenţa crizelor
convulsive3.
Cea mai obişnuită formă de administrare este cea orală, deşi pot fi administrate şi în injecţii
intravenoase sau intramusculare. După ingestie barbituricele sunt absorbite cu uşurinţă din stomac
şi pătrund rapid în circulaţia sangvină; distribuţia şi concentrarea lor în anumite ţesuturi depinde în
mare măsură de gradul lor de solubilitate în lipide şi de proprietăţile de legare a proteinelor. Cele mai
multe din barbiturice sunt metabolizate în ficat prin oxidarea catenei laterale, azot-dealchilare şi/sau
desulfurarea tiobarbituricelor. Gradul de metabolizare în ficat depinde de tipul drogului: secobarbitalul
este oxidat intensiv într-o serie de metaboliţi farmacologic inactivi, pe când fenobarbitalul şi barbitalul
sunt excretaţi în urină nemodificaţi3.
Administrarea excesivă de barbiturice determină tulburări de coordonare a mişcărilor, alterări de
percepţie şi gândire, euforie de dezinhibiţie. Supradozarea poate induce stupoare, comă şi, în cazuri
extreme, deces. Asocierea alcoolului, opiaceelor şi a altor deprimante ale SNC poate cauza tulburări
respiratorii letale3.
Benzodiazepinele constituie o clasă de medicamente cu acţiune deprimantă SNC larg utilizate în
practica medicală datorită efectului anxiolitic, sedativ, miorelaxant şi anticonvulsivant. Folosirea lor
extinsă se bazează pe potenţialul scăzut de inducere a dependenţei fizice şi pe frecvenţa redusă a
reacţiilor adverse grave. Atunci când sunt administrate izolat, chiar în doze mari, nu induc un efect
inhibitor prelungit asupra SNC. Supradozarea se produce atunci când sunt administrate în asociere
cu alte clase de medicamente cu acţiune centrală sau alcool1.
După ingestie benzodiazepinele sunt absorbite, metabolizate şi excretate în urină în proporţii variabile,
datorita diversităţii mari a metaboliţilor3.
Cocaina, un produs natural obţinut din frunzele tufei de coca, este atât un stimulant eficient al SNC
cât şi un anestezic local. Efectele sale farmacologice sunt identice cu cele ale amfetaminelor, deşi
cocaina are o durată de acţiune mai scurtă1.
Cocaina se găseşte în general sub formă de pudră fină albă, cristalină, cunoscută şi sub numele de
Coke, Zăpada, Alba, Base, Crack, Regina Albă, Rocas, Praf de stele; poate fi înghiţită, inhalată pe
nas (prizată), injectată sau fumată6. Se absoarbe cu uşurinţă în circulaţie prin membranele mucoase;
447
efectele sale sunt intense, dar de scurtă durată. Cocaina este inactivată rapid prin hidroliza legăturilor
ester în benzoilecgonină, iar colinesteraza din sânge o hidrolizează în ecgonin-metil-ester; ambii
metaboliţi pot fi hidrolizaţi ulterior în ecgonină1.
Cocaina nemetabolizată are afinitate pentru ţesuturile grase şi pătrunde rapid în creier. Metaboliţii
cocainei fiind solubili în apă sunt excretaţi în urină împreună cu o fracţiune nemodificată. Benzoilecgonina
este principalul marker urinar pentru depistarea consumului acestui drog3.
Efectele cocainei pot fi remarcate imediat după consum şi dispar în 20-30 de minute de la folosire.
Dozele mici de cocaină (sub 100 mg) provoacă euforie şi o stare de energizare. Consumatorul devine
vorbăreţ, este foarte ager mintal şi este temporar hipersensibil la sunete şi stimuli vizuali. Cocaina inhibă
apetitul şi reduce nevoia de somn. Efectele psihologice pot fi însoţite de tahicardie, midriază, febră,
tremor şi transpiraţii; aceste simptome se datorează inhibării resorbţiei neuromediatorilor adrenergici
în structurile de depozitare de la nivelul terminaţiilor nervoase simpatice. Astfel, sub acţiunea cocainei
creşte concentraţia mediatorilor adrenergici de tipul noradrenalinei. Aceştia vor determina o excitare
adrenergică crescută, deci vor creşte tonusul simpatic general. Supradozarea poate duce la apariţia
unor crize convulsive, mişcări primitive, dar şi a unor halucinaţii. În final, tabloul clinic prezentat
degenerează în pierderea cunoştinţei care, împreună cu depresia respiratorie şi prăbuşirea circulaţiei
sangvine, va duce la deces dacă nu se aplică măsuri medicale de terapie intensivă.
În timpul perioadei de consum apare o creştere rapidă şi puternică a dozelor de la 0,1 pâna
la 15 g, în cazuri izolate chiar până la 30 g zilnic. Creşte rapid nu numai frecvenţa administrării,
dar şi cantitatea administrată de fiecare dată. Cocainismul reprezintă dependenţa psihică intensă
şi tendinţa de a creşte doza, în lipsa dependenţei fizice sau a toleranţei faţă de substanţă.
Cocainomania este exemplul cel mai elocvent al dependenţei exclusiv psihice care, în privinţa
efectului ei distructiv, este comparabilă cu dependenţa psihică şi fizică dată de consumul de opiacee.
Fenomenele de sevraj psihic ce apar în caz de abstinenţă sunt adesea atât de puternice, încât pot duce
la tentative de suicid, având în vedere faptul că este păstrată capacitatea de intervenţie a individului în
timpul abstinenţei - spre deosebire de cea din sindromul de abstinenţă a opioidomanului8.
Marijuana este un amestec verde, maro sau gri din frunzele, tulpinile, seminţele şi florile uscate
ale cânepei (Canabis Sativa) şi are aspect de tutun verzui tăiat foarte fin4. Principalul component
psihoactiv din această plantă este tetra-hidro-cannabinolul (THC), deşi există şi alte substanţe
canabinoide care pot contribui la efectele marijuanei1. Cu cât concentraţia de THC este mai mare cu
atât efectele drogului sunt mai puternice.
Cea mai obişnuită modalitate de consum a marijuanei este fumatul în formă pură sau amestecată cu
tutun. Uneori este fumată într-o pipă specială, dar de cele mai multe ori într-o ţigară răsucită numită
“joint”7. Este posibilă şi ingestia drogului, fie prin încorporarea în mâncare, fie sub forma unui extract
lichid (ceai)3.
Marijuana este absorbită rapid din plămâni în circulaţie, cu instalarea imediată a efectelor; în cazul
ingestiei efectele apar mai lent, dar sunt mai îndelungate.
Substanţele canabinoide naturale şi produşii lor de metabolism sunt liposolubile, fiind stocate în
ţesuturile grase ale organismului, inclusiv la nivel cerebral, o perioadă de timp îndelungată de la
consum.
448
20
Metaboliţii canabisului sunt prezenţi în sânge, bilă, fecale şi urină; în urină pot fi detectaţi într-un
interval de câteva ore de la expunere. Datorită liposolubilităţii persistă mult timp în ţesuturile grase,
de unde sunt eliberaţi lent şi excretaţi în urină în decurs de câteva zile, săptămâni sau chiar luni de
la ultima expunere, în funcţie de intensitatea şi frecvenţa utilizării. Metabolitul 11-nor-Δ9 THC-9-acid
carboxilic este principalul marker urinar al consumului de marijuana3.
Efectele acute ale consumului includ: alterarea memoriei, confuzie temporală, afectarea performanţelor
motorii şi depersonalizare4.
Efectele substanţelor active din canabis depind în mod decisiv de personalitatea şi mediul social al
consumatorului. Unii oameni nu simt nimic dacă fumează marijuana iar alţii se pot relaxa şi pot avea un
sentiment înălţător. Se descriu diferite faze ale stării tipice de euforie (engl. “cannabis high”, “social high”).
Printre efectele iniţiale se numără adesea o stare de agitaţie, însoţită ocazional de stare de tensiune şi
anxietate, stări ce vor fi urmate în curând de o senzaţie plăcută de siguranţă şi ocrotire. Urmează stări
introspective şi echilibrate, de un calm deosebit. Alteori pot apărea oscilaţii ale stării de spirit, râsul nemotivat
alternând cu tăcerea contemplativă. Este caracteristică intensificarea percepţiei mediului extern şi intern.
În cazul consumului în grup, aceste modificări pot determina o trăire mai intensă a relaţiilor de grup.
Ameţeala după canabis nu are aceeaşi evoluţie în toate cazurile, există şi stări euforice atipice. Uneori
consumul de canabis poate simula, agrava sau declanşa psihoze schizofreniforme8.
Consumul cronic poate induce în plus efecte la nivel cardiovascular şi pulmonar4.
Dependenţa fizică de substanţele active din canabis poate apărea în urma consumului
îndelungat şi depinde de doza utilizată, de regularitatea consumului, de organismul
consumatorului etc. Aparent nu există simptome de sevraj fizic pur după oprirea consumului.
Există riscul de a dobândi dependenţă psihică în timp şi prin consum regulat8.
Morfina, un produs natural obţinut din macul alb, este un analgezic narcotic folosit pentru a ameliora
durerea severă. Extrasă din opiumul rezultat prin uscarea laptelui de mac, morfina poate fi rafinată
chimic ulterior în heroină, un derivat diacetilat cu potenţă mai mare.
Aceste opiacee cu structură chimică similară reduc sensibilitatea faţă de stimulii fizici şi psihologici,
diminuă durerea, teama şi anxietatea1.
Opiaceele sunt administrate de obicei intravenos sau subcutanat, dar pot fi şi fumate sau prizate. După
pătrunderea în circulaţie, tind să se concentreze în plămâni, splină, rinichi şi ficat; concentraţii mai mici
se găsesc în musculatură şi sistemul nervos central. Există mai multe căi de detoxifiere a organismului
de opiacee printre care se numără dealchilarea, adăugarea de grupări hidroxil, degardarea hidrolitică
şi conjugarea cu acidul glucuronic. Morfina este excretată în urină sub formă glucuronidată, liberă
nemodificată şi alţi metaboliţi minori. Deşi unii metaboliţi ai opiaceelor apar în bilă şi fecale, excreţia
urinară reprezintă principala cale de eliminare3.
Heroina are practic acelaşi spectru de acţiune ca şi morfina, în schimb are un efect analgezic de 5
până la 10 ori mai puternic. În acelaşi timp, heroina este şi puternic euforizantă. La fel ca morfina,
estompează activitatea intelectuală a omului şi influenţează starea sa psihică în sensul eliminării fricii
şi proastei dispoziţii. Sub influenţa heroinei oamenii par a fi foarte fericiţi, iar nevoile lor sunt complet
satisfăcute. Adesea consumatorii relatează un episod de “flash” (engl. trăsnet), un flux dinamic, de
plăcere ce cuprinde întreg corpul imediat după injectarea în circulatia sanguină. Totalitatea efectelor
449
resimţite de către cei care consumă aceste droguri se mai numeşte “kick” (energie, avânt, putere
mobilizatoare). Termenii sugerează funcţia puternică de amplificare a senzaţiilor prin care aceste
opiacee pot domina comportamentul persoanei dependente, mai ales dacă sunt administrate injectabil.
Supradozarea poate duce în cazuri extreme la deces ca urmare a insuficienţei respiratorii8.
Opiaceele induc o stare de dependenţă fizică intensă; simptomele de sevraj se pot instala în câteva
ore de la ultima doză şi pot continua o perioadă de 5-10 zile. Consumatorul încearcă să-şi administreze
din nou drogul, atât pentru a elimina efectele neplăcute ale sevrajului cât şi pentru a obţine euforia
dorită. Intervalul de timp de la administrarea drogului până la instalarea efectelor pozitive depinde de
frecvenţa consumului, cantitatea, rata metabolică, timpul de injumătăţire şi rata de excreţie a drogului,
precum şi de vârsta, greutatea, activitatea şi dieta consumatorului1;8.
Metadona este un opioid produs pe cale sintetică, folosit ca analgezic, antitusiv sau ca medicament
de substituţie, ce se prescrie în cazul dependenţei majore de opiacee.
Este un agonist al receptorilor opioizi cu proprietăţi farmacologice similare morfinei. Efectul
metadonei apare la 30 - 60 minute după administrarea orală şi la 10 - 20 minute după administrarea
parenterală şi durează între 12 şi 48 ore, în funcţie de doza administrată şi variabilitatea individuală
a procesului de metabolizare. Timpul de înjumătăţire este de 15 - 55 ore, făcând posibilă o singură
administrare pe zi. Excreţia metadonei şi metaboliţiilor săi are loc în principal pe cale renală6;7.
Datorită instalării insidioase a efectului, în cazul administrării orale, nu se produce aşa-numitul “kick”,
ceea ce determină o lipsă a sentimentului euforic. Dacă însă se administrează intravenos, efectul este
similar unei doze de heroină injectată.
Administrată în doze mici, metadona ocupă receptorul opioid pentru perioade lungi de timp blocând
efectele morfinei şi eliminând efectul euforic, pe care dependenţii de heroină îl caută. Metadona
permite astfel, încetarea consumului de heroină sau alte opiacee, fără ca sindromul de sevraj să
apară, în condiţiile unei atente supravegheri medicale, psihologice şi sociale.
În general, este bine tolerată, însă unii pacienţi pot prezenta anumite tulburări, dintre care cele mai
importante sunt: transpiraţia excesivă, constipaţia, greţurile, tulburările de somn şi de sensibilitate
gustativă.
Efectele adverse ce apar după administrare repetată includ sedarea marcată, deprimarea respiratorie
şi a SNC-ului, greaţă şi vărsături, bradicardie, hipotensiune arterială, creşterea presiunii intracraniene,
mioză, eliberarea de hormon antidiuretic, precum şi dependenţa fizică şi psihologică. Metadona
determină dependenţă, însă sindromul de abstinenţă este mai puţin intens decât în cazul morfinei6.
Fenciclidina, cunoscută sub denumirea de “praful îngerilor” sau PCP, este un halucinogen, ce a fost
folosit în anii 50 ca anestezic. Aceasta a fost scoasă din uz, deoarece cauza pacienţilor anesteziaţi
halucinaţii şi delir. PCP este disponibilă într-o serie de forme: praf alb, capsule sau comprimate, ce
pot fi înghiţite, fumate (singure sau în combinaţie cu marijuana), prizate sau injectate.
Efectele depind de doza de medicament administrată, modul de utilizare, precum şi variaţiile
individuale. Dozele mici acţionează ca un stimulent, accelerând funcţiile organismului. Efectele
fenciclidinei, variază de la depresie (uneori stări catatonice) la euforie, furie violentă şi halucinaţii,
oferind un comportament bizar. Pentru mulţi utilizatori, PCP modifică modul în care aceştia percep
lucrurile din jurul lor şi pe ei înşişi. De asemenea, fenciclidina determină creşterea frecvenţei cardiace
450
20
şi a tensiunii arteriale, eritem facial, transpiraţii, ameţeli şi parestezii. Atunci când sunt luate în doze
mari, pot provoca somnolenţă, convulsii, comă şi moarte prin insuficienţă pulmonară sau cardiacă şi
hemoragii cerebrale.
PCP poate fi detectat în urină la 4-6 ore de la administrare şi persistă 7-14 zile în funcţie de rata de
metabolizare, vârsta, greutatea, activitatea şi dieta consumatorului6.
Specimen recoltat - o probă de urină spontană5.
Recipient de recoltare - eprubetă pentru urină5.
Cantitatea recoltată - 10 mL5.
Prelucrare necesară după recoltare - nu este necesară adăugarea de aditivi sau substanţe
conservante; pH-ul probelor de urină trebuie să se menţină în intervalul fiziologic 5-85.
Stabilitate probă - probele de urină sunt stabile 3 zile la 2-8°C; dacă nu este posibilă testarea lor în
acest interval de timp probele vor fi congelate5.
Metodă - imunocromatografică. Este o metodă imunologică calitativă de evidenţiere a substanţelor
toxice sau metaboliţilor acestora în urină. Testul foloseşte conjugate proteice cu substanţele toxice
menţionate mai sus, ce intră în competiţie cu drogurile din urină pentru anumite situsuri de pe
anticorpii specifici. Dacă drogurile sunt prezente în urină în concentraţii mai mici decât cut-off-ul,
situsurile anticorpilor specifici nu sunt saturate şi anticorpii vor reacţiona cu conjugatele proteice.
Complexele astfel formate sunt vizualizate în zona care conţine banda testului sub forma unei linii
colorate. Prezenţa drogurilor peste limita cut-off-ului va satura situsurile specifice de pe anticorpi şi nu
va determina apariţia unei benzi colorate. În test este inclusă şi o bandă de control.
Test negativ – linia de control (C) + linie colorată (T); indică o concentraţie urinară mai mică decât
cut-off-ul.
Test pozitiv – doar linia de control (C); indică o concentraţie urinară mai mare decât cut-off-ul5.
Valori de referinţă – negativ pentru fiecare din cele 8 droguri testate.
Rezultatele pozitive semnifică prezenţa unei concentraţii de substanţe toxice mai mari decât cut-off-ul5.
Test Cut-off (ng/mL)

Amfetamine 1
Barbiturice 300
Benzodiazepine 300
Cocaină 300
Canabis 50
Metadonă 300
Opiacee 300
Fenciclidină 25
Limite şi interferenţe - Un rezultat pozitiv indică prezenţa substanţelor toxice în probă, dar nu
furnizează informaţii despre gradul intoxicării, modul de administrare sau concentraţia urinară.
Este posibil ca ingestia de alimente care conţin seminţe de mac să determine rezultate pozitive la
451
testarea opiaceelor ca urmare a conţinutului natural în morfină al seminţelor de mac.

Se recomandă ca toate rezultatele pozitive să fie confirmate printr-o metodă mai specifică: gaz-
cromatografie/spectrometrie de masă.
Un rezultat negativ nu indică neapărat lipsa consumului de substanţe nocive, acestea putând fi la
un nivel sub limita de detecţie a metodei5.
Bibliografie
1. Blum K. Handbook of Abusable Drugs. 1st ed. New York, NZ: Gardner Press Inc 1984.
2. Clark WG, Brater DC, Johnson AR, eds. Goth”s Medical Pharmacology 12th ed. St. Louise: CV
Mosby Company 1998.
3. Hawks RL, Chiang CN, eds. Urine testing for drugs of abuse. National Institute on Drug Abuse
(NIDA), Research Monograph 73:1986.
4. Klonoff H. Marijuana and driving în real life situations. în Science 1974; 186:317-324.
6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Bilirubin, Total
and Direct Serum. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
7. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Methadone Confirmation,
Urine. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
8. www.dependenta.ro/droguri. Amfetamine. Reference type: Internet Communication.
452
20
20.2 METALE GRELE
20.2.1 Aluminiu în sânge
Aluminiul este omniprezent în mediu, fiind al treilea element ca răspândire în scoarţa terestră.
În mod normal tractul gastro-intestinal este relativ impermeabil pentru aluminiu, absorbţia fiind de
aproximativ 2%. Aciditatea gastrică şi citratul administrat pe cale orală favorizează absorbţia, în timp
ce blocantele receptorilor H2 o reduc. În condiţii fiziologice doza de aluminiu ingerată zilnic (5-10 mg)
este complet eliminată. Excreţia se realizează prin filtrarea aluminiului la nivelul glomerulilor renali,
pacienţii cu insuficienţă renală pierzându-şi această capacitate. În cazul în care nu se elimină prin
filtrare renală, aluminiu se acumulează în sânge, se leagă de proteinele serice şi este rapid distribuit
în corp, cu precădere la nivelul creierului şi osului. Ca şi în cazul altor oligoelemente, transferina este
principalul carrier al aluminiului în plasmă, celulele putând să-l preia de la această proteină mai uşor.
De asemenea, aluminiul a fost evidenţiat în preparatele purificate de feritină din creier şi ficat, dar
nu se cunoaşte dacă aceasta are un situs specific de legare pentru element. Modalitatea prin care
aluminiul străbate bariera hemato-encefalică nu este pe deplin înţeleasă2,3.
La persoanele cu afecţiuni renale toxicitatea aluminiului poate fi crescută de numeroşi factori, cum ar
fi apa folosită la dializă, albumina încărcată cu aluminiu şi procesul propriu-zis de dializă care nu este
foarte eficient în eliminarea elementului2.
Toxicitatea aluminiului apare în cazul în care expunerea este abundentă sau prelungită, dacă funcţia
renală este afectată sau în cazul în care elementul acumulat anterior în os este eliberat în condiţii de
stres sau boală. Manifestările asociate expunerii excesive la aluminiu includ: encefalopatie (tulburări
de vorbire, de mers, convulsii, comă, EEG anormal), osteomalacie sau boală aplastică osoasă
(asociată cu fracturi spontane dureroase, hipercalcemie, calcinoză), miopatie proximală, risc crescut
de infecţii, hipertrofie ventriculară stângă şi scăderea funcţiei miocardice, anemie microcitară şi chiar
moarte subită3.
În os aluminiul înlocuieşte calciul în procesul de mineralizare, împiedicând formarea normală de
osteoid. Calciul devine indisponibil pentru resorbţie sub controlul fiziologic al hormonului paratiroidian
(PTH), determinând hiperparatiroidism secundar. Pe termen lung hiperparatiroidismul secundar poate
conduce la hiperparatiroidism terţiar (hipersecreţie paratiroidiană autonomă)2.
Toxicitatea acută poate fi tratată cu desferoxamină, un chelator de metale. De obicei se recomandă
o abordare conservatoare pentru tratamentul supraîncărcării de aluminiu, deoarece desferoxamina
mobilizează rapid cantităţi mari de aluminiu, care pot accentua encefalopatia2.
Recomandări pentru determinarea aluminiului seric:
- monitorizarea pacienţilor dializaţi;
- monitorizarea implantului cu proteze metalice;
- monitorizarea persoanelor care sunt sau au fost expuse la aluminiu;
- pacienţii (adulţi sau copii) cu nutriţie parenterală;
453
- pacienţii cu arsuri care primesc albumină intravenos, în special cei cu insuficienţă

renală coexistentă;
- adulţii şi copiii cu insuficienţă renală cronică, care pot acumula aluminiu din
medicamentele administrate şi dializă2;3.
Recipient de recoltare - vacutainer pentru metale ce conţine EDTA ca anticoagulant1.
Prelucrare necesară după recoltare - nu este necesară1.
Volum probă - cât permite vacuumul1.
Cauze de respingere a probei - specimen coagulat1.
Stabilitate probă - probele de sânge se menţin la temperatura camerei sau la frigider până în
momentul lucrului1.
Metodă - spectrometrie cu absorbţie atomică (AAS)1.
Valori de referinţă - <20.5 μg/L (ng/mL).
Pacienţi care fac dializă:
nivel acceptabil: <60 μg/L;
nivel îngrijorător: <100 μg/L;
nivel toxic: > 200 μg/L1.
Pacienţii cu insuficienţă renală au, în mod invariabil, nivele serice de aluminiu peste 60 ng/mL.
La persoanele care fac dializă s-a definit un profil biochimic, caracteristic supraîncărcării cu aluminiu:
- pacienţii fără semne sau simptome de osteomalacie sau encefalopatie au, de obicei, valori
plasmatice <20 ng/mlL şi concentraţia PTH >16 pmol/L, ceea ce este tipic pentru hiperparatiroidismul
secundar;
- persoanele cu semne şi simptome de osteomalacie sau encefalopatie au concentraţia
serică de aluminiu >60 ng/mL, iar nivelul PTH <16 pmol/mL;
- pacienţii cu valori plasmatice cuprinse între 60-100 ng/mL vor dezvolta manifestări clinice
ale supraîncărcării cu aluminiu şi se impun măsuri specifice de reducere a expunerii zilnice. Acest
lucru poate fi realizat prin înlocuirea chelatorilor de fosfaţi bazaţi pe aluminiu cu unii pe bază de
calciu, asigurându-se totodată că apă de dializă are <10 ng/mL aluminiu şi că albumina utilizată
în timpul tratamentului post-dializă este fără aluminiu. Actualmente noile tehnologii de filtrare oferă
posibilitatea evitării concentraţiilor ridicate de aluminiu în sângele pacientilor dializaţi şi micşorează
riscul dezvoltării osteodistrofiei secundare.
Concentraţiile de aluminiu în sânge înregistrează creşteri peste intervalul de referinţă la pacienţii cu
proteze metalice2.
Un nivel seric crescut de gadoliniu sau iod interferă cu testele la metale, de aceea în cazul în care
au fost administrate substanţe de contrast cu gadoliniu sau iod, recoltarea trebuie amânată cel puţin
96 ore2.
454
20
Bibliografie
2. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Aluminum, Serum. www.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Aluminum,
Plasma or Serum www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
20.2.2 Argint în ser
Argintul nu este un element constitutiv esenţial al corpului uman, metabolismul acestuia fiind
studiat insuficient la om iar puţinele date disponibile sunt incerte. Cu toate acestea, proprietăţile
bacteriostatice ale argintului sunt recunoscute de mult timp, nitratul de argint fiind utilizat, în
secolul al 19-lea, pentru a trata oftalmia gonococică a nou-născutului. Compuşi cu argint care se
folosesc în mod curent în practica medicală sunt unguentul cu sulfadiazină pentru arsuri şi unele
decongestionante nazale. Firele chirurgicale argintate şi anumite catetere s-au arătat eficiente
împotriva unui spectru larg de bacterii. Argintul coloidal este conţinut în diverse preparate alimentare.
Expunerea la argint se poate realiza în timpul procesului de fabricaţie a diverşilor compuşi ce conţin
nitraţi de argint, cum ar fi germicidele, antisepticele, causticele şi reactivii analitici. În plus, sursele de
expunere includ utilizarea sau producerea sărurilor de argint ca şi catalizatori în reacţiile de oxido-
reducere şi polimerizare, în sinteza reactivilor de laborator şi a compuşilor medicali, în fotografie,
placări, fabricarea oglinzilor, cernelurilor, coloranţilor, sticlei şi porţelanului.
Corpul uman normal conţine aproximativ 1 mg de argint.
Contactul prelungit cu diferiţi compuşi de argint determină o afecţiune ce poartă denumirea de argirie
sau argiroză. Cantitatea cea mai mică de argint care produce argirie generalizată este de 4-5 g.
Argintul în cantitate de 50-500 mg/kg corp este toxic şi letal. Această afecţiune se caracterizează
printr-o pigmentare difuză de culoare gri-neagră a pielii şi mucoaselor cauzată de depunerea
particulelor de argint, fie prin expunere industrială (lucrătorii din minele de argint, prelucrarea şi
rafinarea argintului, filmele metalice, soluţii şi procesare fotografică), fie ca rezultat al administrării
de medicamente care conţin săruri de argint (ca suplimente în infecţia HIV, diabet, infecţii herpetice).
Argiroza a fost, de asemenea, atribuită procedurilor chirurgicale, dentare şi acupuncturii. Boala este
asociată cu întârzierea creşterii, dilatare cardiacă, degenerescenţă hepatică, precum şi distrugerea
tubulilor renali2.
Recomandari pentru determinarea argintului seric – monitorizarea expunerii la argint2.
455

Volum probă - 2 mL ser1.
Stabilitate probă - probele de ser se păstrează la temperatura camerei la frigider până în momentul
lucrului1.
Valori de referinţă - <0.3 μg/L1.
O valoare serică >1000 μg/L este orientativă pentru expunerea acută la argint.
Când concentraţia plasmatică a argintului depăşeşte valoarea de >2000 μg/L, putem vorbi despre
argirie.
În studiile clinice de specialitate, nu s-a raportat nici o conexiune între concentraţiile serice moderate
şi simptomatologie2.
Un nivel seric crescut de gadoliniu interferă cu testele la metale, de aceea în cazul în care au fost
administrate substanţe de contrast cu gadoliniu, recoltarea trebuie amânată cel puţin 48 de ore.
Analiza argintului urinar nu poate fi o alternativă la acest test, deoarece studiile au demonstrat că
argintul este rapid îndepărtat din urină în condiţiile normale de păstrare2.
Bibliografie
2. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Silver, Serum. www.
mayomedicallaboratories.com.Ref Type: Internet Communication
20.2.3 Arseniu în sânge şi urină
Nici un zăcământ de minereuri metalice nu a fost sau nu este exploatat exclusiv pentru arseniu;
de regulă, arseniul se obţine ca subprodus, crescând valoarea economică a diferitelor tipuri de
mineralizaţi în care se găseşte.
Compuşii arseniului au numeroase aplicaţii industriale: pesticide, produse farmaceutice, sticlă,
ceramică şi metalurgie. Folosit ca element de aliere măreşte duritatea aliajelor. Arseniul este folosit
cu mare succes şi în electronică datorită proprietăţilor semiconductoare şi fotoconductoare, similare
siliciului şi germaniului. În pirotehnie se foloseşte pentru producerea focurilor albe (cel indian).
Trisulfura de arseniu este pigmentul vopselei de ulei numite galben regal. Aceasta se mai foloseşte în
456
20
tăbăcărie, pentru ignifugarea lemnului2;4.

Arsina (hidrogen arsenios) reprezintă un compus gazos generat în rezervoarele metalice având
impurităţi de arsen, care depozitează acizi.
Arseniul este absorbit cu uşurinţă pe cale intestinală şi este excretat în principal prin urină.
Expunerea acută prin ingestia de compuşi arsenicali sau inhalarea de arsină determină simptome
gastrointestinale severe (hemoragice), icter, insuficienţă renală şi colaps, cu mare potenţial letal2;4.
Intoxicaţia cronică cu arseniu este dificil de diagnosticat. Pot să apară dureri abdominale, diaree,
hiperpigmentare, hiperkeratoză, neuropatii periferice, encefalopatie1;2.
Expunerea cronică prin inhalare, în cazul muncitorilor care lucrează în topitorii, a fost asociată cu un
risc crescut de cancer pulmonar2.
Recomandări pentru determinarea arseniului
- arseniul în sânge: monitorizarea expunerii acute sau recente (timp de înjumătăţire redus);
- arseniul în urină: monitorizarea expunerii cronice2;4.
Pregătire pacient - pacientul trebuie să evite consumul oricărui aliment ce conţine fructe de mare 72
ore înaintea recoltării (aceste alimente cresc semnificativ nivelul arseniului urinar).
Specimen recoltat - 1) sânge venos; 2) urina din 24 ore; 3) o probă de urină spontană3;4.
Cauze de respingere a probei - specimen coagulat3;4.
Recipient de recoltare - 1) vacutainer pentru metale ce conţine EDTA ca anticoagulant; 2) vas de 2-3
litri şi pahar de plastic de unică folosinţă, pentru urină, pe care se notează cantitatea totală de urină
din 24 ore; nu se folosesc conservanţi ; 3) eprubetă pentru urină3;4.
Cantitatea recoltată - 1) cât permite vacuumul; 2), 3) aproximativ 10 mL3;4.
Stabilitate probă - probele de sânge şi urină se menţin la temperatura camerei sau la frigider până
în momentul lucrului3;4.
Metode - plasmă cuplată inductiv cu spectrometrie de masă (ICP/MS); spectrometrie cu absorbţie
atomică (AAS)3.
Arseniul în sânge3: Arseniul în urină3:
< 2.3 μg/L. <25 μg/L (expunere ambientală);
Expunere profesională5: LBT = 50 μg/g creatinină;
LBT= limita biologică tolerabilă.
Factor de conversie4: μg/L x 0.0133 = μmol/L;μmol/L x 75.2 = μg/L.
Bibliografie
1. Frances Fischbach. Appendix G: Minerals in Human Nutrition. In A Manual of Laboratory and

Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009 1199-1200.
2. Jill C.Merill, et al. Metals. In Principles and Methods of Toxicology. Taylor & Francis, 4th Edition,
2001,663- 665.
457
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Arsenic, Blood
and Urine. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
5. Norme generale de protecţie a muncii. Ministerul Muncii şi Solidarităţii sociale. Nr. 508/2002.
20.2.4 Cadmiu în sânge şi urină
Cadmiul este un metal alb-argintiu, prezent în cantităţi variabile în minereurile de zinc. Este utilizat în
principal în procesul de electro-galvanizare şi în reactoarele atomo-nucleare1.
În forma sa organică, cadmiul este întâlnit în alimente, apă şi aer. Aportul normal de cadmiu prin dietă
variază între 2 şi 200 μg/zi. Deşi formele organice solubile pot produce toxicitate, expunerea excesivă
la cadmiul organic indică o poluare izolată a mediului4.
Efectele toxice acute ale cadmiului depind de calea de expunere. Inhalarea unor cantităţi mari de
particule de cadmiu produce într-o primă fază febră, cefalee, greaţă, vărsături, iritaţie nazofaringiană,
tuse, dispnee, urmată de instalarea unei pneumonite chimice şi, posibil, a unui edem pulmonar acut
letal2. Expunerea cronică la particule de cadmiu din aerul respirat poate genera emfizem pulmonar4.
Inhalarea sau ingestia cronică a acestui metal determină leziuni renale, caracterizate prin disfuncţie
tubulară şi/sau glomerulară cu proteinurie, alterarea capacităţii de concentrare a urinii şi scăderea
clearance-ului la inulină. Un alt efect al expunerii cronice este perturbarea metabolismului osos cu
osteomalacie, osteoporoză şi risc crescut de fracturi spontane4.
Efectul carcinogenetic al cadmiului este un subiect mult dezbătut. Studiile privind implicarea sa în
cancerul pulmonar şi de prostată au dat rezultate neconcludente1;4.
Recomandări pentru determinarea cadmiului
- cadmiul în sânge: diagnosticul expunerii acute sau cronice la cadmiu;
- cadmiul în urină: monitorizarea intoxicaţiei cronice şi estimarea încărcării organismului cu cadmiu2;4.
Pregătire pacient - momentul recoltării probei de sânge nu este important pentru monitorizarea
expunerii profesionale3.
Specimen recoltat - 1) sânge venos; 2) urina din 24 ore sau 3) o probă de urină spontană3;4.
Recipient de recoltare - 1) vacutainer pentru metale ce conţine EDTA sau heparinat de litiu ca
anticoagulant; 2) vas de 2-3 litri şi pahar de plastic de unică folosinţă pentru urină, pe care se notează
cantitatea totală de urină din 24 ore; nu se folosesc conservanţi; 3) eprubetă pentru urină3;4.
458
20
Cadmiul în sânge3;4: Cadmiul în urină3;4:
Nefumători: 0.3-1.2 μg/L; <2 µg/g creatinină, <3µg/24 h;
Fumători: 0.6-3.9 μg/L;
Expunere profesională5: LBT = 5 μg/L; LBT = 5 μg/g creatinină.
LBT = limita biologică tolerabilă.
Factor de conversie4: μg/L x 8.897= nmol/L; nmol/L x 0.112= μg/L.
Bibliografie

DiagnosticTests.Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009: 1202-1203.
2001, 665-667.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Cadmium,
Blood and Urine. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
5. Norme generale de protecţie a muncii. Ministerul Muncii şi Solidarităţii Sociale. Nr. 508/2002.
20.2.5 Crom în sânge şi urină
Cromul este un metal tranziţional, al cărui nume provine din cuvântul grecesc “culoare”, deoarece
majoritatea compuşilor săi sunt intens coloraţi. Cel mai important minereu de crom este cromitul.
Cromul şi sărurile sale anorganice prezintă numeroase aplicaţii industriale: placarea metalelor,
producerea de aliaje diverse, materiale refractare, pigmenţi şi conservanţi2.
Cromul în stare trivalentă este cea mai abundentă formă de crom din mediu. Fiziologic, cromul deţine
un rol important în metabolismul glucozei2 şi de asemenea în sinteza colesterolului1. Scăderea
cromului în organism este asociată cu rezistenţa la insulină (hiperinsulinism), risc crescut de
insuficienţă cardiacă congestivă, hipercolesterolemie, reducerea fertilităţii1. Deşi cromul trivalent în
sine are o biodisponibilitate orală redusă, absorbţia sa intestinală este crescută în prezenţa “factorului
de toleranţă la glucoză”, care formează un complex cu Cr3+. Cromul trivalent este considerat a fi relativ
netoxic in vivo2.
Fierul inhibă competitiv legarea cromului de transferină, astfel că pacienţii cu hemocromatoză prezintă
o retenţie scăzută de crom în organism. S-a formulat ipoteza că deficienţa cromului la nivel celular ar
avea un rol în dezvoltarea diabetului la pacienţii cu hemocromatoză4.
Pe de altă parte, cromul hexavalent reprezintă forma cea mai importantă de crom din punct de vedere
toxicologic. Spre deosebire de Cr3+, Cr6+ este absorbit cu usurinţă de majoritatea ţesuturilor, astfel că
459
ingestia accidentală sau intenţionată de Cr6+ determină intoxicaţie acută manifestată prin vărsături
şi leziuni gastrointestinale generalizate, cu hemoragii digestive grave ce pot induce stare de şoc
hipovolemic. Pacienţii care supravieţuiesc efectelor toxice iniţiale dezvoltă necroză tubulară acută,
necroză hepatocelulară şi afectarea ţesuturilor hematoformatoare2.
Expunerea cronică prin inhalarea compuşilor de crom insolubili poate produce pneumoconioză cu
alterarea funcţiei pulmonare. Expunerea la săruri anorganice solubile poate precipita apariţia de ulceraţii
cutanate, dermatită, perforarea septului nazal şi manifestări respiratorii de hipersensibilizare4.
Efectul carcinogen al cromului asupra tractului respirator a fost documentat prin numeroase studii2.
Recomandări pentru determinarea cromului
- cromul în sânge: evaluarea posibilului deficit indus de denutriţie (în special la vârstnici), traumatisme
severe şi stres1; monitorizarea pacienţilor care primesc preparate de crom în cursul alimentaţiei
parenterale; evaluarea intoleranţei dobândite la glucoză la pacienţii cu alimentaţie parenterală;
evaluarea rezistenţei la insulină la pacienţii fără complicaţii septice care sunt alimentaţi parenteral4;
- cromul în urină: monitorizarea expunerii profesionale la crom4 .
Pregătire pacient - pentru monitorizarea expunerii profesionale recoltarea probei de urină se va face
fie în cursul lucrului, fie la sfârşitul schimbului la încheierea săptămânii de lucru4.
Specimen recoltat - 1) sânge venos; 2) o probă de urină spontană3;4.
Cauze de respingere a probei – 1) specimen coagulat; 2) specimen ce conţine conservanţi3;4.
Recipient de recoltare - 1) vacutainer special pentru metale ce conţine EDTA sau heparinat de litiu
ca anticoagulant; 2) eprubetă pentru urină3;4.
Cantitatea recoltată - 1) cât permite vacuumul; 2) 10 mL3;4.
Stabilitate probă - probele de sânge şi urină se păstrează la temperatura camerei sau la frigider până
Cromul în sânge3: Cromul în urină3:
<0.5 ng/mL (μg/L). <1.5 ng/mL (μg/L).
Factor de conversie4: ng/mL x 19.2 = nmol/L; nmol/L x 0.052 = μg/L.
Bibliografie
1. Frances Fischbach. Appendix G:Minerals in Human Nutrition. In A Manual of Laboratory and

Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009: 1203.
2001: 655.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Chromium
Plasma and Urine. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
460
20
20.2.6 Cupru în plasmă şi urină
Cuprul este un component esenţial al unor sisteme enzimatice implicate în producerea hemoglobinei,
metabolismul glucidic, biosinteza catecolaminelor şi formarea legăturilor încrucişate (“cross-linking”)
între fibrele de colagen, elastină şi keratină din firul de păr.
Deficitul de cupru determină anemie, neutropenie şi tulburări de creştere, în special la copii.
Aportul de cupru se realizează în principal prin dietă; absorbţia sa se efectuează cu uşurinţă, dar este
limitată de mecanismele homeostatice după atingerea necesarului. Dupa absorbţie cuprul este legat
de albumină şi ceruloplasmină, iar apoi este depozitat în ficat şi mai puţin în rinichi. Principala cale de
eliminare a cuprului este cea biliară, excreţia urinară fiind mică2;4.
Boala Wilson este o afecţiune autozomal-recesivă caracterizată prin perturbarea homeostaziei
normale a cuprului: alterarea excreţiei biliare a cuprului, retenţie excesivă a cuprului în ficat, scăderea
concentraţiei ceruloplasminei şi creşterea excreţiei urinare a cuprului. Clinic se manifestă prin leziuni
hepatice, renale, neurologice, corneene şi anemie hemolitică.
Sindromul Menkes este o afecţiune multisistemică letală asociată cu simptome neurodegenerative
şi anomalii ale ţesutului conjunctiv, care are drept cauză deficitul uneia sau mai multor enzime
dependente de cupru2.
Inhalarea cronică a particulelor de cupru care se formează în cursul diverselor procese de prelucrare
(metalurgie, placarea obiectelor cu cupru, sudură) poate determina greaţă, vărsături, hepatomegalie,
manifestări neurologice. Expunerea acută conduce la iritaţia căilor respiratorii superioare, febră şi
dureri musculare4.
Recomandări pentru determinarea cuprului
- cuprul în plasmă: suspiciune de boala Wilson (se testează împreună cu ceruloplasmina); monitorizarea
alimentaţiei enterale sau parenterale; intoxicaţii acute;
- cuprul urinar: suspiciune de boala Wilson, monitorizarea intoxicaţiei cronice2;4.
expunerii profesionale3;4.
anticoagulant; 2) vas de 2- 3 litri şi pahar de plastic de unică folosinţă, pentru urină, pe care se notează
Prelucrare necesară după recoltare - se separă plasma prin centrifugare şi se transferă într-un tub
de plastic în vederea transportului (pe tub se va preciza tipul produsului: plasmă, volum minim = 2
mL)3.
Stabilitate probă - probele de plasmă şi urină se menţin la temperatura camerei sau la frigider până
461
Cuprul seric (plasmatic)3;4: Cuprul urinar3;4:

< 4 luni: 8.9-46 μg/dL; 2-80 μg/L; 10-60 μg/24h; <50 μg/gcreatinină.
4-6 luni: 25-108 μg/dL;
7-12 luni: 51-133 μg/dL;
1-5 ani: 83-152 μg/dL;
6-9 ani: 83-133 μg/dL;
10-13 ani: 83-121 μg/dL;
14-19 ani - F: 70-159 μg/dL;
- B: 64-114 μg/dL;
Adulţi - F: 76-152 μg/dL;
- B: 70-140 μg/dL.
Factor de conversie: μg/dL x 0.157 = μmol/L; μmol/L x 6.37= μg/dL4.
Interpretarea rezultatelor4
Concentraţia cuprului seric (plasmatic) reflectă atât cuprul legat de ceruloplasmină, cât şi cuprul “liber”
legat mai slab de albumină sau peptide circulante mici. Ceruloplasmina este un reactant de fază acută
şi, deoarece această proteină leagă o cantitate mare de cupru, atât cuprul seric, cât şi ceruloplasmina
cresc în condiţiile asociate cu inflamaţie (ex. poliartrita reumatoidă), sarcină şi tratament cu estrogeni.
Pe de altă parte, nivelul cuprului seric scade în afecţiuni însoţite de hipoproteinemie: nefroză, malnutriţie,
malabsorbţie, fără să reflecte neapărat reducerea depozitelor hepatice de cupru. De asemenea se mai
înregistrează o scădere a cuprului seric în cursul tratamentului cu ACTH, glucocorticoizi şi valproat.
În tabelul de mai jos sunt sintetizate informaţiile privind modificările cuprului seric, urinar, hepatic,
precum şi ale ceruloplasminei în diverse condiţii clinice:
Fumat; stări
Deficit Sindrom Intoxicaţie Intoxicaţie Boala inflamatorii;
nutriţional Menkes acută cronică Wilson sarcină;
estrogeni
Normal
Cupru seric ↓ ↓ ↑, ↑↑ ↑ ↑, ↑↑
sau ↓
Normală De obicei,
Ceruloplasmina ↓ ↓ ↑ ↑, ↑↑
(precoce) ↓
Cupru urinar ↓ ↑ ↑ ↑ ↑, ↑↑ Normal
Normal
Cupru hepatic ↓ ↓ ↑, ↑↑ ↑↑ Normal
(precoce)
Bibliografie

Diagnostic Tests.Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 1204.
462
20
2001, 656.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Copper, Serum
20.2.7 Mangan în ser şi urină
Manganul este un oligoelement ce intră în constituţia unor enzime mitocondriale (piruvat carboxilază
şi superoxid dismutază) şi activează de asemenea numeroase enzime (decarboxilaze, transferaze,
hidrolaze)2. Astfel, manganul deţine un rol esenţial în metabolismul lipidic şi glucidic, formarea ţesutului
osos şi procesele de reproducere1.
Din punct de vedere industrial, manganul este un metal gri-argintiu întâlnit în minereuri sub formă de
oxizi2. Are aplicaţii în industria oţelului şi în cea chimică. Este prezent în agenţii coloranţi pentru sticlă
şi săpun, vopseluri, lacuri şi linoleum4.
Intoxicaţia acută determină febră, frisoane, mialgii, uscăciunea mucoasei bucale şi faringiene4.
Intoxicaţia cronică prin inhalarea prafului de mangan se asociază cu simptome neuropsihice
(manganism): cefalee, iritabilitate, agitaţie, tulburări de vorbire, auz şi mers, tremor, rigiditate a feţei,
halucinaţii, tulburări de personalitate1;2;4.
Recomandări pentru determinarea manganului
- manganul în ser: monitorizarea tratamentului cu mangan în alimentaţia parenterală; suspiciune de
intoxicaţie cu mangan, în special în prezenţa sindroamelor neurologice şi tulburărilor motorii;
- manganul în urină: confirmarea intoxicaţiei; monitorizarea tratamentului cu mangan în alimentaţia
parenterală; monitorizarea terapiei chelatoare în manganism4.
Recipient de recoltare - 1) vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator; 2) vas de 2- 3 litri şi
pahar de plastic de unică folosinţă, pentru urină, pe care se notează cantitatea totală de urină din 24
ore; nu se folosesc conservanţi; 3) eprubetă pentru urină3;4.
Cantitatea recoltată - 1) minim 2 mL ser; 2), 3) aproximativ 10 mL3;4.
Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare3.
Stabilitate probă - probele de ser şi urină se păstrează la temperatura camerei sau la frigider până
Manganul în ser3: Manganul în urină1;4:
463
0.3-0.9 μg/L. < 2.9 µg/L.

Expunere profesională5: LBT = 10 μg/L;
Factor de conversie4: μg/L x 18.2 = nmol/L; nmol/L x 0.055= μg/L.
În evaluarea toxicităţii trebuie ţinut cont de faptul că nivelul manganului în sânge sau urină poate
reveni la normal în timp ce simptomele neurologice persistă.
Deoarece deficitul de mangan la om este insuficient definit, interpretarea valorilor scăzute trebuie
efectuată cu prudenţă. S-au înregistrat valori uşor scăzute ale manganului în epilepsie şi niveluri
crescute în hepatită sau icter4.
Bibliografie

Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009: 1210-1211.
2001, 659,660.
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Manganese,
Blood and Urine. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.
20.2.8 Mercur în sânge şi urină
Mercurul este un metal fluid alb-argintiu întâlnit atât în rocile vulcanice şi sedimentare, cât şi sub
forma minereului cinabar (sulfid de mercur). Este neesenţial pentru procesele biologice şi toxic pentru
toate organismele. Mercurul şi compuşii săi au numeroase aplicaţii industriale: contoare electrice,
termometre, aditivi, conservanţi antimicrobieni în vopsele, cosmetice şi produse farmaceutice2.
În mod obişnuit mercurul în forma organică nu este întâlnit în mediul industrial.
Intoxicaţia acută sau cronică cu mercur afectează rinichii, SNC şi tractul gastrointestinal.
Triada simptomatică în intoxicaţia cu mercur este următoarea: disfuncţii articulare, perturbarea activităţii
musculare şi îngustarea câmpului vizual. Expunerea cronică la formele metalice şi anorganice ale
mercurului determină nervozitate, tremor şi iritaţia mucoaselor. Intoxicaţia cu mercur anorganic este
asociată în principal cu efecte periferice: gastroenterită şi nefrită tubulară, pe când expunerea la
compuşii organici afectează în principal SNC, fiind posibile leziuni severe şi ireversibile.
Intoxicaţia cronică cu mercur anorganic este o boală profesională ce afectează în special minerii şi
464
20
muncitorii din topitorii.

Cea mai obişnuită sursa neindustrială de intoxicaţie cu mercur este consumul de peşte contaminat
cu metil-mercur4.
Recomandări pentru determinarea mercurului
- mercurul în sânge: cel mai bun test pentru diagnosticul intoxicaţiei cu mercur organic (această formă
de mercur este localizată în principal în eritrocite);
- mercurul în urină: monitorizarea expunerii la mercur (în special forma anorganică)4.
Pregătire pacient - pentru evaluarea expunerii profesionale, momentul optim al recoltării probelor de
sânge este la încheierea schimbului, la sfârşitul săptămânii de lucru; probele de urină vor fi recoltate
înainte de intrarea în schimb4.
Cantitatea recoltată - 1) cât permite vacuumul; 2), 3) 10 mL3;4.
Mercurul în sânge3: Mercurul în urină1;4:
< 5 μg/L. < 5 µg/L, < 5 µg/g creatinină;
Expunere profesională5: LBT = 10 μg/L; LBT = 35 μg/g creatinină.
Factor de conversie4: μg/L x 0.005 = μmol/L;μmol/L x 200= μg/L.
Valori critice1
Mercurul în sânge - nivel toxic: >150 μg/L; nivel letal: > 800 μg/L.
Bibliografie

Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 1211-1212.
2001, 669-670.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Mercury, Blood
465
20.2.9 Nichel în sânge şi urină
Rolul nichelului în organismul uman este discutabil. Există unele dovezi că ar fi implicat în absorbţia
fierului, calciului şi zincului.
Nichelul este prezent în minereuri sub trei forme principale: sulfid, silicat şi arsenid2. Are numeroase
aplicaţii industriale: component al multor aliaje, placarea metalelor, producerea dispozitivelor electrice
şi electronice4.
Expunerea la nichel se produce cel mai frecvent în mediul industrial, fie prin inhalarea prafului de
nichel, fie prin contact dermic. Inhalarea acută determină febră şi iritaţia tractului respirator. Contactul
dermic poate genera dermatită alergică de contact. De asemenea printre efectele toxice ale nichelului
se numară şi depresia SNC1;4.
Numeroasele studii epidemiologice au arătat că expunerea cronică la praful de nichel şi la subsulfidul
de nichel poate cauza cancer pulmonar sau nazal2.
Recomandări pentru determinarea nichelului - monitorizarea expunerii la nichel4 .
Recipient de recoltare - 1) vacutainer pentru metale ce conţine EDTA ca anticoagulant; 2) vas de 2- 3
litri şi pahar de plastic de unică folosinţă pentru urină, pe care se notează cantitatea totală de urină din
24 ore; nu se folosesc conservanţi; 3) eprubetă pentru urină3;4.
Metodă - spectrometrie cu absorbţie atomică (AAS); plasmă cuplată inductiv cu spectrometrie de
masă (ICP/MS)3.
Nichelul în sânge4: Nichelul în urină4:
<3.3 μg/L < 1.7 μg/L
Factor de conversie1: μg/L x 17.1 = nmol/L;nmol/L x 0.058 = μg/L.
Bibliografie

Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009: 1212.
2001, 673-674.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Nickel, Plasma
466
20
20.2.10 Plumb în sânge şi urină
Plumbul este cel mai larg utilizat metal neferos. Plumbul şi compuşii săi au numeroase aplicaţii
comerciale şi industriale, fiind prezenţi în lacuri şi vopseluri, baterii, pigmenţi, insecticide, materiale
plastice şi ceramice, echipamente medicale, armament, benzină, industria sudurii.
Principalele căi de expunere la plumbul anorganic sunt inhalarea şi ingestia. La adult expunerea se
realizează în special profesional, iar la copii prin ingestia de vopseluri cu plumb din case vechi (în
sindromul de “pica”). Expunerea se mai poate face şi prin practicarea distilării ilegale a alcoolului în
recipiente ce conţin plumb2;4.
Plumbul este absorbit în organism atât prin tractul respirator, cât şi prin cel gastrointestinal. Absorbţia
este invers proporţională cu dimensiunea particulei, ceea ce face ca inhalarea prafului cu plumb să
aibă impactul cel mai mare. Este transportat şi transplacentar fiind implicat în intoxicaţia congenitală,
cu următoarele consecinţe posibile: avort spontan, prematuritate sau greutate mică la naştere2.
Simptomele precoce ale intoxicaţiei cu plumb (saturnism) sunt reprezentate de: apatie sau
iritabilitate, astenie fizică, anorexie, greaţă, constipaţie, dureri abdominale intermitente, mialgii.
Anemia cu reticulocitoză şi punctaţii bazofile la examinarea frotiului de sânge periferic se numără
printre complicaţiile hematologice ale saturnismului. De asemenea mai pot să apară: lizereu gingival
caracteristic şi depozite de plumb pe radiografii ale oaselor lungi la copii. În cazul intoxicaţiilor severe
apar tulburări gastrointestinale grave şi neurotoxicitate (ataxie, slăbiciune musculară, convulsii, stupor,
comă)2;4.
Creşterea excreţiei urinare a plumbului indică o expunere excesivă, independent de manifestările
clinice.
Alte caracteristici ale saturnismului includ creşterea acidului delta-aminolevulinic urinar, creşterea
protoporfirinei libere eritrocitare şi scăderea dehidrazei acidului aminolevulinic2.
Recomandări pentru determinarea plumbului
- plumbul în sânge: cel mai bun test pentru diagnosticul expunerii la plumb;
- plumbul în urină: monitorizarea intoxicaţiei cronice cu plumb2;4.
expunerii profesionale.
Prelucrare necesară după recoltare - nu se necesară3.
467
Plumbul în sânge: Plumbul în urină3;4:
Copii: < 9 μg/dL; <50 µg/L, <80 µg/24 h;
Adulţi ≤ 60 ani: < 25 μg/dL;
Adulţi > 60 ani: <32 μg/dL 3;4.
Expunere profesională5: LBT = 40 μg/dL; LBT = 150 μg/L;
LBT = limita biologică tolerabilă. Tratament chelator: <600 μg/24h4.
Factor de conversie : μg/dL x 0.048 = μmol/L;μmol/L x 20.7= μg/dL.
4
Valori critice
Plumbul în sânge:
<15 ani: >20 μg/dL; ≥15 ani: >30 μg/dL.
Expunere profesională: > 60 μg/dL (se întrerupe expunerea şi se iniţiază tratamentul chelator).
Valori > 80 μg/dL: urgenţă medicală!1.
Deficitul de fier poate creşte absorbţia şi toxicitatea plumbului şi adesea coexistă cu expunerea
excesivă. Toţi copiii care au o concentraţie a plumbului în sânge >20 μg/dL trebuie investigaţi pentru
deficitul de fier (dozarea feritinei)1.
Bibliografie
1. Frances Fischbach. Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests.

Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009: 379-382.
2. Jill C.Merill, et al. Metals. In Principles and Methods of Toxicology. Taylor & Francis, 4th Edition
2001, 667-669.
3. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Lead, Blood
5. Norme generale de protectie a municii. Ministerul Muncii si Solidaritatii Sociale. Nr. 508/2002.
20.2.11 Titan în ser

Titanul este un metal de culoare gri-argintie ce se găseşte în natură sub mai multe forme cum ar fi
dioxidul de titan sau diverse aliaje.
Dioxidul de titan reprezintă 70% din totalul pigmenţilor din întreaga lume şi este utilizat pe scară largă
pentru a oferi albul şi opacitatea diferitelor produse, cum ar fi vopselele, materialele plastice, hârtia,
cernelurile, produsele alimentare, pasta de dinţi, precum şi produsele cosmetice şi de îngrijire a pielii,
468
20
care ajută la protejarea de lumina ultravioletă. Capacitatea sa de a fi colorat face din acesta un metal
popular în body piercing.
Pentru că este biocompatibil (non-toxic şi nu este respins de organism) dioxidul de titan este utilizat
în medicină în implanturile chirurgicale sau dentare, care se pot menţine astfel până la 20-30 de ani.
Deoarece titanul este non-magnetic, pacienţii cu implanturi pot fi examinaţi în condiţii de siguranţă prin
rezonanţă magnetică.
Titanul este non-toxic, indiferent de calea de părundere (dermică, inhalatorie sau prin ingestie) chiar şi
în doze mari. Se estimează că 0.8 mg de titan este ingerat de oameni în fiecare zi, dar cea mai mare
parte este eliminată fără a fi absorbită.
Dioxidul de titan a fost încadrat recent, de către Agenţia Internaţională pentru Cercetare în Domeniul
Cancerului (IARC) în grupa 2B, ca substanţă posibil cancerigenă la om. Este important să înţelegem
că deciziile luate de IARC sunt bazate pe dovezi specifice, care au arătat că nivelele ridicate de
pulbere ultrafină de dioxid de titan determină cancer de tract respirator superior la şobolanii expuşi
prin inhalare sau instilaţie intratraheală. Seria de evenimente care produce cancerul pulmonar la
şobolan, cum ar fi depunerile de particule, clearance-ul pulmonar afectat, leziunile celulare, fibroza,
mutaţiile şi în cele din urmă apariţia celulelor maligne, a fost, de asemenea, observată la persoanele
care lucrează în medii cu praf de dioxid de titan. Prin urmare, modificările constatate la animale au fost
considerate de către IARC ca fiind relevante pentru persoanele care sunt expuse la locul de muncă.
De exemplu, cei care lucrează cu dioxid de titan pot fi expuşi la concentraţii ridicate de praf în timpul
procesului de ambalare, frezare, curăţare şi întreţinere, în cazul în care nu există suficiente măsuri
de control.
Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că studiile umane efectuate până în prezent nu sugerează o
asociere între expunerea profesională la dioxid de titan şi un risc crescut de fibroză pulmonară, cancer
sau alte afecţiuni2;3.
Recomandari pentru determinarea titanului seric - evaluarea expunerii la titan2.
Volum probă - 2 mL ser1.
Stabilitate probă - probele de ser se păstrează la temperatura camerei la frigider până în momentul
lucrului1.
Valori de referinţă - <7.7 μg/L1.
Bibliografie
2001,665-667.
469
3. International Agency for Research on Cancer (IARC): Titanium dioxide (IARC Group 2B),
Summary of data reported, Feb. 2006.
20.2.12 Zinc în plasmă şi urină
Zincul este un oligoelement esenţial, component al mai multor sisteme enzimatice. Este stocat în
ţesutul osos şi muscular; mobilizarea din aceste depozite se realizează cu dificultate, chiar în condiţiile
unui deficit de zinc. Absorbţia intestinală creşte atunci când se înregistrează o scădere a depozitelor.
Deficitul de zinc determină inapetenţă, tulburări de creştere (anomalii ale scheletului, alterarea
sintezei colagenului), alopecie şi întârzierea procesului de vindecare a rănilor; în cazul unui deficit
sever se instalează hipogonadism şi nanism care sunt ameliorate prin suplimentarea zincului1;2. Pe de
altă parte, trebuie menţionat faptul că administrarea cronică a preparatelor orale de zinc interferă cu
absorbţia cuprului şi poate precipita deficitul acestuia4.
Din punct de vedere industrial, zincul este un metal alb-albăstrui, extras din minereuri şi folosit în
aliaje, în procesul de galvanizare a fierului pentru a preveni coroziunea şi oxidarea, precum şi în
numeroşi compuşi utilizaţi în industria cosmeticelor şi medicamentelor. La temperaturi apropiate de
punctul de fierbere, zincul volatilizează şi generează prin oxidare fumul de oxid de zinc.
Expunerea acută la oxid de zinc determină iritaţia tractului respirator, tuse, dureri toracice, cefalee,
greaţă, febră şi mialgii2.
Clorura de zinc este un alt compus produs în generatoarele de fum chimic4; inhalarea acestui material
coroziv provoacă pneumonită chimică, obstrucţie bronşică şi alveolară, uneori letale2.
Recomandări pentru determinarea zincului
- zincul în plasmă: monitorizarea expunerii la zinc; evaluarea unui posibil deficit în caz de alimentaţie
parenterală prelungită, pacienţi cu arsuri severe sau afecţiuni cronice grave, alcoolici, diabetici,
anorexici, dietă vegetariană, sindroame de malabsorbţie; confirmarea acrodermatitei enteropatice;
monitorizarea administrării orale de zinc în boala Wilson, monitorizarea administrării intravenoase a
zincului1;4;
- zincul urinar: monitorizarea expunerii la zinc; evaluarea nivelurilor scăzute de zinc seric, precum şi a
complianţei la terapie a pacienţilor cu boala Wilson4.
Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate)3;4.
anticoagulant; 2) vas de 2- 3 litri şi pahar de plastic de unică folosinţă, pentru urină, pe care se notează
Prelucrare necesară după recoltare - se separă plasma prin centrifugare şi se transferă într-un tub
de plastic în vederea transportului (pe tub se va preciza tipul produsului: plasmă, volum minim = 2
470
20
mL)3.
Stabilitate probă - probele de plasmă şi urină se menţin la temperatura camerei sau la frigider până
Zincul plasmatic3;4: Zincul urinar3;4:
< 4 luni: 65-137 μg/dL; 150-1200 μg/24h; 100-900 μg/g creatinină.
4-12 luni: 65-130 μg/dL;
1-5 ani: 65-118 μg/dL;
6-9 ani: 78-105 μg/dL;
10-13 ani - F: 78-118 μg/dL;
- B: 78-98 μg/dL;
14-19 ani - F: 59-98 μg/dL;
- B: 65-118 μg/dL;
Adulţi: 46-150 μg/dL.
Factor de conversie: μg/dL x 0.153 = μmol/L; μmol/L x 6.54 = μg/dL4.
Asocierea nivelului redus al zincului seric cu valori scăzute ale excreţiei urinare confirmă deficitul de
zinc4.
Scăderea zincului seric se înregistrează în stări febrile, sepsis, stres, infarct miocardic, terapie cu
estrogeni (se produce o mobilizare a zincului din ser în ficat de către interleukine). Valori scăzute mai
pot fi întâlnite în uremie, fără să existe o reducere a nivelului tisular.
Niveluri crescute ale zincului seric pot fi întâlnite într-o afecţiune familială, fără să existe semne de
toxicitate sau depozite crescute.
Deficitul de zinc este însoţit de obicei de scăderea excreţiei urinare; cu toate acestea deficitul se poate
instala şi în prezenţa unor pierderi urinare excesive care pot să apară în ciroză, anemii hemolitice,
siclemie, alcoolism sau afecţiuni renale cronice4.
Bibliografie

Diagnostic Tests.Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009: 1216-1217.
2001, 663.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Zinc, Serum
471
20.3 MONITORIZARE TERAPEUTICĂ AL MEDICAMENTELOR
Informaţii generale şi recomandări pentru testare

În practica medicală curentă este recunoscută din ce în ce mai mult importanţa determinării periodice
a nivelului în sânge al multora din medicamentele administrate, fie datorită potenţialului crescut de
reacţii adverse, fie complianţei reduse a pacienţilor.
Monitorizarea terapeutică a unui medicament (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) are drept scop
menţinerea concentraţiei acestuia în intervalul terapeutic, definit ca acel interval de valori ale
nivelului în ser, plasmă sau sânge integral în care medicamentul respectiv îşi exercită efectele clinice
cu reacţii adverse minime pentru majoritatea pacienţilor.
Conceptul de TDM se referă astfel la măsurarea concentraţiei medicamentelor pentru a optimiza şi
adapta tratamentul la nivel individual (terapie personalizată). Pentru realizarea acestei ţinte terapeutice
este important să se cunoască pentru medicamentele administrate date legate de:
- farmacocinetică: studiază efectele medicamentului asupra organismului (relaţia doză-
efect);
- farmacodinamică: studiază efectele organismului asupra medicamentelor (absorbţie,
distribuţie etc);
- farmacogenetică: studiază modelul genetic al metabolizării medicamentelor luând în
considerare variaţiile individuale.
Pentru a obţine rezultate pentru concentraţiile medicamentoase cu utilitate clinică este important ca
proba să fie recoltată în aşa numita „steady state” (stare de echilibru) în care rata de medicament
ce pătrunde în organism este egală cu cea eliminată. Atunci când o doză fixă de medicament este
administrată la intervale de timp regulate, acesta se va acumula în organism în cursul fazei de
absorbţie până este atinsă starea de echilibru; perioada de timp necesară pentru a se ajunge la steady
state depinde de timpul de înjumătăţire al medicamentului (T1/2), adică timpul în care concentraţia
medicamentului în sânge se reduce la jumătate. La rândul său T1/2 depinde de rata de metabolizare
şi excreţie. În condiţiile unei distribuţii rapide şi uniforme a medicamentului în organism (cinetică de
ordinul I), precum şi în absenţa unei doze de încărcare, este nevoie de un interval de timp echivalent
cu cel puţin 5 T1/2 pentru a obţine steady state (vezi fig. 20.3.1)3;4;28.
Csânge
T 1/2
Interval
terapeutic
~ > 96%
T 1/2
Fig 20.3.1 Obţinerea „steady state”
472
20
Acest proces poate fi rezumat astfel:
k
D→E D = concentraţia medicamentului E = forma excretată a medicamentului
k = constanta de dispariţie a lui D
T1/2 = 0.693/k
Aşa cum reiese din ecuaţie, T1/2 este o constantă şi nu depinde de concentraţia medicamentului. Dacă
T1/2 este cunoscut se poate calcula modul de împărţire a dozelor şi intervalul de timp la care trebuie
administrate pentru a se atinge nivelul terapeutic.
Totuşi, unele medicamente sunt metabolizate printr-un alt tip de cinetică decât cea de ordinul I,
suferind mai întâi o metabolizare în ficat, urmată de o distribuţie multicompartimentală în organism
(medicamentul are o anumită rată de distribuţie plasmatică şi o rată diferită de distribuţie tisulară). În
aceste cazuri timpul necesar pentru a atinge steady state poate să fie diferit de echivalentul a 5 T1/2 .
Cu excepţia urgenţelor medicale, în cazurile în care se modifică dozele administrate şi se adaugă
sau se scot medicamente asociate, se va aştepta obţinerea unei noi stări de echilibru înainte de
recoltarea probei pentru monitorizarea terapeutică. Într-un mod similar, se va aştepta aceeaşi perioadă
de timp pânâ când un medicament aflat în steady state se va elimina din organism la întreruperea
administrării4.
Odată atinsă starea de echilibru probele de sânge pot fi recoltate în două momente diferite:
- în momentul nivelului maxim (peak samples): la 2-3 ore după administrarea unei doze orale,
la 30-60 minute după o doză administrată intravenos, la 2-4 ore după o doză administrată
intramuscular sau la 1-1 şi ½ ore după o doză administrată intranazal;
- în momentul nivelului minim (trough samples): imediat înaintea administrării următoarei
doze; acest moment este recomandat în majoritatea cazurilor.
Monitorizarea terapeutică a medicamentelor este indicată în special în următoarele situaţii:
• perturbarea relaţiei doză-efect;
• eşec în obţinerea efectului terapeutic sau suspectarea unei intoxicaţii;
• efect imposibil sau foarte greu de confirmat clinic (de exemplu în cazul imunosupresoarelor);
• interval terapeutic îngust (de exemplu în cazul glicozidelor);
• complianţă redusă a pacienţilor (persoane vârstnice sau cu boli psihice);
• prezenţa unor afecţiuni care afectează absorbţia, distribuţia, metabolizarea şi excreţia
medicamentelor;
• administrarea simultană de medicamente care prezintă aceeaşi cale de eliminare;
• copii şi persoane vârstnice la care este afectat volumul de distribuţie: redus în cazul vârstnicilor şi
crescut la copii.
Clasele de medicamente pentru care se recomandă în mod special TDM sunt următoarele:
1. glicozide cardiace: digoxin. digitoxin;
2. antiaritmice: amiodaronă, flecainidă, procainamidă, chinidină;
3. antiastmatice: teofilină;
4. antibiotice: aminoglicozide, vancomicină;
473
5. antivirale: medicamentele pentru infecţia HIV, ganciclovir;

6. anticonvulsivante: fenobarbital, carbamazepin, fenitoin, acid valproic, gabapentin, primidonă,
lamotrigin;
7. medicamente psihotrope: litiu, antidepresive triciclice, neuroleptice;
8. imunosupresoare: ciclosporină, tacrolimus, sirolimus, everolimus, acid micofenolic,
azatioprină;
9. citostatice: methotrexat3;4.
În tabelul de mai jos sunt precizate pentru anumite medicamente T1/2, intervalul de timp necesar
pentru a se ajunge la steady state, tipul de probă pentru TDM şi stabilitatea acesteia, intervalul
terapeutic3;28:
MEDICAMENT T1/2 T până la steady state Tip Stabilitate Metodă de Interval terapeutic
probă probă determinare
Digoxin 36-48 h 7-10 zile Ser 7 zile ECLIA 0.9-2 ng/mL
la 2-8°C
Amiodaronă 26-107 zile Nu se aplică Ser 7 zile HPLC 0.5-2 mg/L
la 2-8°C
Flecainidă 12-27 ore 3-6 zile Ser 7 zile HPLC 0.2-0.8 mg/L
la 2-8°C
Teofilină 7-11 ore (adult); 15-55 ore (adult); Ser 7 zile HPLC < 1 an:
1-8 ore (copil) 5-40 ore (copil) la 2-8°C 5-10 mg/L
≥ 1 an:
8-20 mg/L
Vancomicină 3-8 ore 1-2 zile Ser 7 zile FPIA 5 – 10 µg/mL

la 2-8°C
Carbamazepin 14-47 ore (adult); 7-12 zile (adult); Ser 7 zile HPLC 4-10 mg/L
8-19 ore (copil) 2-4 zile (copil) la 2-8°C
Acid valproic 9-16 ore (adult); 2-4 zile (adult); Ser 7 zile CEDIA 50-100 mg/L
Topiramat 19-23 ore 5 zile Ser 7 zile HPLC 1-10 mg/L
la 2-8°C
Etosuximid 50-60 ore (adult); 8-12 zile (adult); Ser 7 zile HPLC 40-100 mg/L
30 ore (copil) 6-10 zile (copil) la 2-8°C
Fenobarbital 81-117 ore (adult); 17-24 zile (adult); Ser 7 zile HPLC 10-40 mg/L
474
20
Fenitoin 18-22 ore (adult); 4-8 zile (adult); Ser 7 zile HPLC <14 ani:
7-29 ore (copil) 2-5 zile (copil) la 2-8°C 10-20 mg/L
>14 ani:
6-14 mg/L
Gabapentin 5-7 ore (adult); 1-2 zile (adult); Ser 7 zile HPLC 2 – 10 µg/mL
Lamotrigin 15-30 ore (adult); 3-10 zile (adult); Ser 7 zile HPLC <14 ani:
30 ore (copil) 3-10 zile (copil) la 2-8°C 5-15 mg/L
>14 ani:
1-5 mg/L
Primidonă 3-7 ore (adult); 16-60 ore (adult); Ser 7 zile HPLC 5-15 mg/L
4-6 ore (copil) 20-30 ore (copil) la 2-8°C
Amitriptilină 8-51 ore 2-6 zile Ser 7 zile la 2-8°C LC-MS/MS 50-300 µg/L
Litiu 14-30 ore 2-7 zile Ser 8 ore la ISE Mania acută: 0.6-
temperatura 1.2 mmol/L.
camerei; 24 • Protecţie
ore la 2-8°C; 6 împotriva viitoarelor
luni la -18°C. episoade la
pacienţii cu
afecţiune bipolară:
0.8-1.0 mmol/L.
• Depresie: 0.5- 1.5
mmol/L
Clomipramin 12-36 ore 3 săptămâni Ser 7 zile LC-MS/MS 90-250 µg/L
la 2-8°C
Clozapină 4-66 ore Nu se aplică Ser 7 zile LC-MS/MS 350-600 µg/L
la 2-8°C
Olanzapin 21-54 ore (adult 7 zile Ser 7 zile LC-MS/MS 10-80 µg/L
≤65 ani); la 2-8°C
32-81 ore (adult >65 ani)
Doxepin 8-25 ore 2.5-5 zile Ser 7 zile LC-MS/MS 20-150 µg/L
la 2-8°C
Imipramin 6-20 ore 2-5 zile Ser 7 zile LC-MS/MS 45-150 µg/L
la 2-8°C
Maprotilin 36-105 ore 14 zile Ser 7 zile LC-MS/MS 125-200 µg/L
la 2-8°C
Trimipramin 16-39 ore Nu se aplică Ser 7 zile LC-MS/MS 150-350 µg/L
la 2-8°C
Haloperidol 41-41 ore (lactat); 3-9 zile (lactat); nu se Ser 7 zile LC-MS/MS 5-16 µg/L
14-28 zile (decanoat) aplică la 2-8°C
475
Risperidon 3 ore (fast 1 zi (fast Ser 7 zile LC-MS/MS 10-120 µg/L

metabolizerrisperidon); metabolizerrisperidon); la 2-8°C
21 ore (fast 5-6 zile (fast
metabolizer9-hidroxi- metabolizer9-hidroxi-
risperidon); 20 ore (slow risperidon); 5 zile (slow
metabolizerrisperidon); metabolizerrisperidon);
30 ore (slow nu se aplică (slow
metabolizer9-hidroxi- metabolizer9-hidroxi-
risperidon); risperidon).
Ciclosporină A 6-27 ore 2-6 zile S â n g e 5 zile LC-MS/MS Intervalul
EDTA la -20°C terapeutic variază
în funcţie de tipul
transplantului şi
perioada de timp
de la transplant.
Pentru afecţiuni
dermatologice şi
reumatologice:
<100 µg/L
Pentru sindrom
nefrotic: 60-160
µg/L.
Tacrolimus 4-35 ore (adult); 2-6 zile (adult); nu se S â n g e 5 zile LC-MS/MS - în primele 2 luni
4-12 ore (copil) aplică la copil EDTA la -20°C de la transplant:
15-20 µg/L
- după
2 luni de la
transplant:
8-15 µg/L
Sirolimus 46-78 ore 5-7 zile S â n g e 5 zile LC-MS/MS 4-20 µg/L
EDTA la -20°C
Acid micofenolic 8-18 ore (adult); variabil Nu se aplică Ser 7 zile HPLC 1-3.5 µg/mL
la copil la 2-8°C
476
20
Methotrexat Cinetică bifazică - Ser 7 zile FPIA Se asociază cu

la 2-8°C un risc crescut de
protejat de toxicitate:
lumină - valorile > 5-10
µmol/L la 24 h de
la admistrare;
- valorile > 0.5-1
µmol/L la 48 h de
la administrare;
- valorile > 0.2
µmol/L la 72 h de
la administrare.
ECLIA = metodă imunochimică cu detecţie prin chemiluminiscenţă

HPLC = cromatografie de lichide sub înaltă presiune
LC-MS/MS = cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă
FPIA = fluorescent polarization immunoassay (metodă imunochimică cu detecţie prin fluorescenţă
polarizată)
CEDIA = cloned enzyme donor immunoassay (metodă imunoenzimatică care utilizează tehnologia
ADN-ului recombinant)
ISE = ion selective electrode (metodă potenţiometrică)
Digoxin
Compuşii din familia glicozidelor digitalice sunt alcătuiţi dintr-un nucleu steroidic, un inel de lactonă şi
un zahar. Digoxinul este larg utilizat în tratamentul insuficienţei cardiace congestive şi a tulburărilor de
ritm atriale (în special flutter şi fibrilaţie).
Prin proprietăţile tonicardiace digoxinul creşte debitul cardiac, reduce mărimea cordului, scade
presiunea venoasă şi volumul sanguin. Conduce de asemenea la reducerea şi stabilizarea frecvenţei
cardiace. Aceste efecte terapeutice sunt obţinute printr-o reţea de interacţiuni directe sau indirecte cu
miocardul, vasele sangvine şi sistemul nervos autonom.
După administrarea orală digoxinul este absorbit şi larg distribuit în ţesuturi în special cardiac, renal
şi hepatic. Numeroşi factori pot afecta absorbţia normală, distribuţia şi biodisponibilitatea digoxinului:
prezenţa florei bacteriene enterice, a alimentelor în intestin, efortul fizic intens şi folosirea concomitentă
a altor medicamente. În general la copii sunt necesare concentraţii mai mari de digoxin.
În urma administrării orale se înregistrează o creştere precoce a concentraţiei serice; un echilibru între
nivelul din ser şi cel din ţesuturi este atins după aproximativ 6-8 ore. Este excretat în principal prin
urină. Timpul de înjumătăţire mediu este de 36-48 ore, dar poate fi prelungit la pacienţii cu insuficienţă
renală, existând riscul de acumulare şi toxicitate.
Simptomele intoxicaţiei digitalice pot mima tulburarea de ritm pentru care medicamentul a fost
prescris iniţial. Alte simptome tipice includ manifestări gastrointestinale: anorexie, greaţă, vomă, dureri
abdominale, diaree, precum şi manifestări neuropsihice: astenie, stare de rău general, ameţeli, vedere
477
înceţoşată, halucinaţii vizuale şi auditive, ideaţie paranoidă şi depresie. Toxicitatea digoxinei se poate
datora următorilor factori:
- interval terapeutic îngust;
- variabilitate individuală în ceea ce priveşte capacitatea de metabolizare şi răspunsul la
medicament;
- variaţie mare în absorbţia diferitelor forme orale de digoxin;
- creşterea odată cu vârsta a susceptibilităţii faţă de toxicitate.
Aşa cum este menţionat în tabelul de mai sus, intervalul terapeutic este de 0.9-2 ng/mL. Nivelele
toxice depăşesc 2 ng/mL. iar valorile >4 ng/mL pot pune în pericol viaţa pacientului4;11.
Amiodaronă
Este un antiaritmic utilizat în principal în tratamentul aritmiilor ventriculare cu potenţial letal; intră
în categoria antiaritmicelor de clasa a III-a (blocante ale canalelor de potasiu) deşi prezintă şi alte
mecanisme de acţiune: blochează semnificativ canalele inactivate de sodiu şi exercită efecte slabe
adrenergice şi de blocare a canalelor de calciu.
Amiodarona se poate administra oral sau intravenos; se leagă în proporţie de 95% de proteinele
plasmatice şi are un volum de distribuţie de 60L/kg. Eliminarea medicamentului este foarte lentă,
având un timp de înjumătăţire mediu de 53 zile. Enzima CYP3A4 transformă amiodarona într-un
metabolit cu activitate identică: N-desetil-amiodaronă.
Intervalul terapeutic este de 0.5-2 mg/L; valorile >2.5 mg/L sunt asociate cu toxicitate.
Amiodarona poate prezenta numeroase reacţii adverse:
- perturbarea funcţiei tiroidiene (în principal hipotiroidism, dar uneori şi hipertiroidism) datorită
similitudinii structurale cu hormonii tiroidieni;
- fibroză pulmonară letală;
- hepatită;
- manifestări neurologice şi gastrointesinale;
- bradicardie simptomatică.
În timp ce simptomele neurologice şi gastronitestinale sunt dependente de concentraţia amiodaronei,
afectarea funcţiei tiroidiene, fibroza pulmonară şi hepatotoxicitatea sunt mai puţin legate de
aceasta4;5.
Flecainidă
Este un antiaritmic de clasa I cu proprietăţi electrofiziologice similare lidocainei, chinidinei, procainamidei
şi tocainidei. Flecainida produce o scădere dependentă de doză a conducerii impulsurilor intracardiace,
efectul cel mai mare fiind exercitat asupra asupra sistemului His-Purkinje. Este eliminată din sânge
atât prin metabolizare hepatică cât şi prin clearance renal. Toxicitatea cardiacă atribuită flecainidei
este legată de proprietăţile de încetinire a conducerii impulsurilor cardiace: prelungirea excesivă
a intervalelor PR şi QT precum şi a complexului QRS însoţite de creşterea amplitudinii undei T.
Reducerea contractilităţii miocardului precum şi tulburări de conducere sunt de asemenea asociate cu
doze excesive de flecainidă14.
Teofilină
Împreună cu compusul înrudit aminofilina, teofilina este utilizată pentru relaxarea musculaturii netede
a bronhiilor şi a vaselor pulmonare pentru a combate şi a preveni bronhospasmul.
478
20
Este administrată oral în doze de 400 mg/zi sau 6 mg/kg corp sau intravenos (sub forma de aminofilină)
în doze de 0.6 mg/kg/oră. Dozele administrate oral pot fi crescute cu 200 mg până la un maxim de 900
mg/zi sau 13 mg/kg corp dacă concentraţia serică măsurată în steady state se menţine în intervalul
terapeutic de 10-20 mg/L.
Teofilina are un T1/2 mediu de 4 ore la copii şi adulţii fumători şi un T1/2 mediu de 8 ore la adulţii
nefumători, astfel că steady state este atinsă în ~1 zi. Volumul de distribuţie este de 0.5 L/kg iar
medicamentul se leagă în proporţie de 50% de proteinele plasmatice. Clearance-ul se face, ca şi
în cazul fenitoinei, după o cinetică de ordinul 0 - adică creşteri mici ale dozei conduc la creşteri
disproporţionat de mari ale concentraţiei serice.
Administrarea concomitentă de cimetidină sau eritromicină va inhiba semnificativ clearance-
ul medicamentului, fiind necesară scăderea dozelor. Alte medicamente cum ar fi: alopurinol,
ciprofloxacină, contraceptive orale şi propranolol inhibă clearance-ul teofilinei într-o măsură mai
mică. Fumatul induce sinteza citocromului P448 - citocromul dependent de antipirină – care creşte
semnificativ rata de metabolism al teofilinei. Medicamente ca fenobarbital, fenitoin, carbamazepin şi
rifampicină cresc uşor rata clearance-ului.
Toxicitatea teofilinei este destul de severă (aritmii, convulsii, hemoragie digestivă), fiind proporţională
cu nivelul seric; aceasta apare la valori >20 mg/L4;20.
Vancomicină
Este un antibiotic utilizat în tratamentul infecţiilor cauzate de bacterii Gram pozitive care sunt
rezistente la betalactamine, cum ar fi stafilococii meticilino-rezistenţi (MRSA), Streptococcus viridans,
Streptococus pneumoniae rezistent la peniciline/cefalosporine, precum şi speciile de Enterococcus
rezistente la penicilină/ampicilină.
În formula administrată oral vancomicina nu se absoarbe fiind utilă în tratamentul colitei
pseudomembranoase cauzate de Clostridium difficile.
Vancomicina a fost asociată cu nefrotoxicitate şi ototoxicitate deşi se pare că aceste efecte adverse
s-au datorat unor impurităţi prezente în preparatele iniţiale. Monitorizarea riscului de nefrotoxicitate
este recomandată doar la pacienţii cu funcţie renală afectată, la cei care primesc medicaţie nefrotoxică
asociată vancomicinei sau la cei cu doze agresive sau prelungite de vancomicină.
Pentru monitorizarea terapeutică se recomandă ca probele să fie recoltate în momentul nivelului seric
minim (trough samples); pentru a se evita dezvoltarea rezistenţei bacteriene nivelurile serice minime
trebuie să fie >10 mg/L. În cazul unor infecţii complicate este nevoie de doze mai mari: 15-20 mg/L25.
Anticonvulsivante
Sunt medicamente utile în tratamentul epilepsiei, în special pentru crizele grand mal, petit mal,
psihomotorii, precum şi în unele afecţiuni cum ar fi tic douloureux (nevralgia de trigemen). Deşi
mecanismul de acţiune al acestor medicamente nu a fost elucidat, se pare că toate, posibil cu excepţia
fenobarbitalului, blochează influxul de sodiu în neuronii a căror membrană este afectată. În plus, unele
medicamente şi în special fenitoinul blochează de asemenea influxul secundar de calciu în aceste
celule. Fenobarbitalul şi, posibil, fenitoinul stabilizează membrana neuronilor afectaţi.
Multe din anticonvulsivante exercită efect asupra convulsiilor grand mal, însă sunt ineficace asupra
celor de tip petit mal. Doar etosuximidul şi acidul valproic au un efect terpeutic în aceste condiţii.
În concluzie, deşi mecanismul de acţiune al anticonvulsivantelor pare să fie similar, acestea diferă în
479
ceea ce priveşte specificitatea4.

Fenobarbital
Este un medicament cu acţiune deprimantă asupra sistemului nervos central care s-a dovedit a fi
eficace în controlul convulsiilor generalizate şi parţiale. Se administrează frecvent în asociere cu
fenitoinul sau cu acidul valproic.
Dozele zilnice de fenobarbital variază între 60 mg şi 300 mg la adult şi între 3 şi 6 mg/kg corp la copil.
Absorbţia sa este lentă dar completă cu o biodisponibilitate ce se apropie de 100%. Se leagă într-un
procent de ~50% de proteinele plasmatice şi are un volum de distribuţie de 0.5 L/kg; timpul mediu
de înjumătăţire este de 96 ore, fără metaboliţi activi cunoscuţi. Sedarea apare frecvent la concentraţii
terapeutice ale fenobarbitalului în primele 2-3 săptămâni de tratament, dar acest efect dispare în
timp.
Toxicitatea indusă de supradozare se caracterizează prin depresie SNC, inclusiv a centrilor respiratori.
La concentraţii serice >40 mg/L apar simptome uşoare precum ataxie, nistagmus, astenie, pierderea
atenţiei; simptomele devin severe la nivele >60 mg/L; toxicitatea poate fi letală la valori >100 mg/L.
Nu este cunoscută nici o interacţiune medicamentoasă care să afecteze semnificativ farmacocinetica
fenobarbitalului; în schimb acesta perturbă farmacocinetica altor medicamente datorită inducerii
sintezei enzimelor asociate citocromului hepatic P45021.
Fenitoin
Constituie medicamentul de elecţie pentru tratamentul şi profilaxia convulsiilor tonico-clonice şi
psihomotorii. Dacă singur nu este eficace se poate asocia cu fenobarbitalul.
Terapia cu fenitoin este iniţiată cu doze de 100-300 mg/zi la adult şi de 4 mg/kg corp/zi la copil.
Deoarece absorbţia sa este variabilă şi medicamentul exprimă o cinetică de ordinul 0 (nelineară),
dozele trebuie ajustate într-un interval de 5 zile utilizând concentraţia serică pentru ghidarea terapiei.
Biodisponibilitatea orală variază între 80% şi 95% fiind dependentă de dietă.
Fenitoinul prezintă de asemenea o farmacocinetică de ordinul 0, adică rata clearance-ului este
dependentă de concentraţia medicamentului. Astfel, fenitoinul nu are un timp de înjumătăţire clasic ca
celelalte medicamente, deorece acesta variază în funcţie de concentraţia sangvină. La o concentraţie
de 15 mg/L aproximativ o jumătate din cantitatea totală de fenitoin din organism va fi eliminată în
decurs de 20 ore. Pe măsură ce nivelul sangvin se reduce rata de excreţie a medicamentului creşte.
Fenitoinul are un volum de distribuţie de 0.65 L/kg fiind în legat într-o proporţie de 90% de proteinele
plasmatice, în special de albumină.
Anumite reacţii adverse ale medicamentului se produc în intervalul terapeutic: hiperplazie gingivală,
hiperglicemie, rash.
Farmacocinetica fenitoinului este semnificativ afectată de o serie de medicamente. Aşa cum s-a
menţionat, fenitoinul se administrează adesea în combinaţie cu fenobarbitalul. Inducţia sistemului
enzimatic al citocromului P450 de către fenobarbital va creşte rata de metabolizare a fenitoinului.
În steady state inducţia enzimatică va creşte rata de clearance astfel încât, pentru a menţine nivelul
terapeutic, este necesar ca doza de fenitoin să fie crescută cu 30%.
Uremia exercită un efect asupra legării fenitoinului de proteinele plasmatice. În faza uremică se
acumulează produşii secundari de metabolism care leagă albumina şi deplaseză fenitoinul, ceea ce
duce la creşterea fracţiunii libere.
480
20
Acidul valproic asociat fenitoinului intră în competiţie cu acesta pentru acelaşi situs de legare de pe
albumină. Astfel, acidul valproic deplasează fenitoinul de pe albumină şi conduce la creşterea fracţiunii
libere. Efectul global al administrăriii simultane de acid valproic este acela că nivelul total de fenitoin
scade datorită creşterii clearance-ului însă fracţiunea liberă creşte; din acest motiv concentraţia
fenitoinei libere, care reprezintă forma activă, rămâne practic aceeaşi, nefiind necesară ajustarea
dozelor pentru menţinerea aceluiaşi efect farmacologic.
În insuficienţa renală fracţiunea liberă a fenitoinei nu poate fi uşor eliminată, ceea ce conduce la
creşterea atât a fracţiunii libere cât şi a nivelului total (fracţiunea liberă creşte însă mai rapid decât
concentraţia totală); dozele trebuie reduse pentru evitarea toxicităţii.
Riscul de toxicitate este mare datorită modului particular de metabolizare a fenitoinului. Creşteri mici
ale dozelor conduc la creşteri foarte mari ale concentraţiei sangvine, astfel că apar semne precoce ale
toxicităţii: nistagmus, ataxie, dizartrie. Toxicitatea severă apare la niveluri >30 mg/L şi se caracterizează
prin tremor, hiperreflexie şi letargie. Totuşi, spre deosebire de fenobarbital, consecinţele toxicităţii nu
sunt grave, deoarece fenitoinul nu exercită acţiuni deprimante asupra SNC23.
Acid valproic
Este utilizat în tratamentul crizelor epieptice de tip absenţă simplă sau complexă şi pentru controlul
crizelor generalizate, care includ crize de absenţă, în asociere cu alte anticonvulsivante.
Dozele iniţiale de acid valproic sunt de 15 mg/kg corp/zi dar pot fi crescute progresiv până la maximum
60 mg/kg corp/zi.
Au fost descrise reacţii adverse grave cum ar fi insuficienţa hepatică sau un sindrom similar sindromului
Reye produse în intervalul terapeutic. Din acest motiv este obligatorie monitorizarea atentă a funcţiei
hepatice în cursul primelor 6 luni de tratament.
Acidul valproic are un volum de distribuţie de 0.2 L/kg şi un timp de înjumătăţire de 9-16 ore la adult şi
mai scurt la copil. Se leagă în proporţie de 90% de proteinele plasmatice.
Acest medicament exercită efecte substanţiale asupra farmacologiei fenitoinului, în timp ce fenitoinul
are un efect limitat asupra valproatului.
Principalele reacţii adverse apar la valori ale nivelului seric maxim (peak samples) >125 mg/L şi
includ: depresie SNC, trombocitopenie, disfuncţie hepatică26.
Carbamazepin
Este un medicament utilizat în controlul crizelor convulsive parţiale, atât cu simptome de lob temporal
cât şi psihomotorii, crizelor tonico-clonice generalizate, precum şi ca analgezic în nevralgiile de
trigemen.
Iniţial, carbamazepina se administrează în doze de 400 mg/zi la adult şi de 200 mg/zi la copil, după
care se creşte progresiv până la obţinerea steady state (maxim 1200 mg/zi la adult şi 1000 mg/zi la
copil).
Carbamazepina are un volum de distribuţie de 1.4 L/kg şi se leagă în proporţie de 75% de proteinele
plasmatice.
10,11-carbamazepin epoxid (CBZ 10-11) este un metabolit activ care reprezintă principala formă a
medicamentului la copil, cu un volum de distribuţie de 1.1 L/kg. Intervalul terapeutic pentru acest
metabolit este de 0.2-2 mg/L.
Anemia aplastică şi agranulocitoza sunt reacţii adeverse rare; toxicitatea asociată cu supradozarea
481
carbamazepinei apare la niveluri serice >12 mg/L şi se caracterizează iniţial prin respiraţie neregulată,
excitabilitate musculară şi hiperreflexie urmate de hiporeflexie, tahicardie, hipotensiune şi alterarea
stării de conştienţă până la comă7.
Etosuximid
Este utilizat în tratamentul crizelor de tip absenţă. Este complet absorbit din tractul intestinal, atingând
un nivel maxim în plasmă în 1-7 ore.
Aproximativ 10-20% din medicament este excretat nemodificat în urină; restul este metabolizat în
microzomii hepatici. Are un volum de distribuţie de 0.7 L/kg; doar o cantitate redusă de etosuximid se
leagă de proteinele plasmatice.
Medicamentul determină o toxicitate similară barbituricelor, caracterizată prin depresie SNC şi
respiratorie, greaţă şi vărsături, la nivele serice >100 mg/L13.
Gabapentin
Este un medicament antiepileptic utilizat în tratamentul convulsiilor, neuropatiilor, precum şi al altor
afecţiuni neurologice şi psihice. Deşi este considerat un analog de acid gama-amino butiric (GABA),
gabapentin nu se leagă de receptorii GABA şi nici nu afectează captarea neuronală sau conţinutul de
GABA; mecanismul său de acţiune nu este cunoscut.
Gabapentin circulă în principal nelegat de proteinele plasmatice. Spre deosebire de majoritatea
medicamentelor antiepileptice nu este metabolizat hepatic, fiind eliminat renal aproape în întregime.
Timpul de înjumătăţire este de 5-7 ore la adulţii cu funcţie renală normală.
Datorită acestor particularităţi, gabapentinul nu prezintă interacţiuni farmacocinetice cu alte
antiepileptice.
Reacţiile adverse sunt rare – somnolenţă, ameţeală, ataxie, astenie - şi se remit de obicei în timp15.
Lamotrigin
Este utilizat:
- ca un medicament adjuvant în tratamentul convulsiilor tonico-clonice generalizate din cadrul
sindromului Lennox-Gastaut, convulsiilor tonico-clonice generalizate primare şi crizelor
parţiale survenite la adulţi sau copii >2 ani;
- în conversia la monoterapie a adulţilor trataţi cu acid valproic sau cu un inductor enzimatic
(fenitoin, carbamazepin, fenobarbital sau primidon);
- în tratamentul de întreţinere al tulburărilor bipolare de tip I.
Lamotriginul este un derivat de triazină care inhibă eliberarea glutamatului (un aminoacid excitator)
precum şi canalele de sodiu sensibile la voltaj, stabilizează membranele neuronale şi are un efect
inhibitor slab asupra receptorului de serotonină.
Biodisponibilitatea orală este de aproximativ 98%; în proporţie de 55% se leagă de proteinele
plasmatice şi are un volum de distribuţie de aproximativ 1L/kg. Lamotriginul este metabolizat prin
conjugare cu acid glucuronic; timpul de înjumătăţire mediu este de 25-30 ore la adult; T1/2 se reduce
la 13-14 ore dacă se administrează concomitent fenitoin sau carbamazepin şi se prelungeşte la 59-
70 ore la asocierea lamotriginului cu acidul valproic. Afecţiunile renale sau hepatice pot alungi de
asemenea T1/2.
Semnele de toxicitate apar de obicei la concentraţii serice maxime (peak samples) >20 mg/L: ameţeală,
ataxie, vedere înceţoşată sau diplopie, greaţă, vărsături16.
482
20
Primidonă
Este utilizată pentru controlul crizelor grand mal refractare la alte antiepileptice precum şi al convulsiilor
de origine psihomotorie sau focală.
Primidona se administrează oral în doze care variază între 250 mg/zi şi 2 g/zi; absorbţia este rapidă şi
completă (100%); volumul său de distribuţie este de 0.6 L/kg, iar T1/2 mediu de 8 ore. Doar în proporţie
de 10% este legată de proteinele plasmatice; fenobarbitalul este un metabolit de primidonă. Ca şi
în cazul fenobarbitalului nu sunt cunoscute interacţiuni medicamentoase majore care să afecteze
farmacologia primidonei.
Toxicitatea primidonei (concentraţii serice >15 mg/L) se datorează în principal acumulării de
fenobarbital22.
Topiramat
Este un antiepileptic cu spectru larg cu următoarele mecanisme de acţiune:
- blocarea canalelor de sodiu;
- potenţarea activităţii GABA;
- inhibarea potenţării receptorului pentru glutamat.
Datorită acestor acţiuni topiramatul blochează mai degrabă extinderea convulsiilor decât creşte pragul
pentru convulsii.
Se administrează oral, se absoarbe rapid şi suferă o metabolizare minimă. Nivelurile serice maxime
sunt atinse după 2-3 ore de la administrare. Se leagă în proporţie mică de proteinele plasmatice
(<15%); se elimină predominat pe cale renală cu un T1/2 de 19-23 ore.
Concentraţiile serice ale altor anticonvulsivante nu sunt afectate semnificativ de administrarea
concomitentă a topiramatului, cu excepţia unor pacienţi aflaţi sub tratament cu fenitoin care prezintă
creşterea concentraţiei serice de fenitoin după adăugarea de topiramat. Administrarea concomitentă
de fenitoin sau carbamazepină scade nivelul seric de topiramat.
Pacienţii cu insuficienţă renală prezintă un clearance scăzut al medicamentului4.
Medicamente utilizate în tratamentul tulburărilor maniacale şi depresive
Litiu
Litiul este un metal alcalin monovalent care în mod uzual lipseşte din organismul uman. Este folosit în
tratamentul psihozelor maniaco-depresive, sub formă de carbonat de litiu. Litiul este complet absorbit
după administrarea orală în 6-8 ore. Mai puţin de 10% din litiu se leagă de proteinele din plasmă şi
timpul de înjumătăţire este de 14-30 ore. Eliminarea din organism se face în special prin urină, în
procent de 95%.
În tratamentul îndelungat cu litiu se monitorizează osmolaritatea urinară, electrocardiograma, T4,
TSH, ureea serică, creatinina şi sodiul seric.
Valorile >2 mmol/L indică toxicitate, astfel:
- tremor: 1.5-2.0 mmol/L;
• confuzie/somnolenţă: 2.0-2.5 mmol/L;
• convulsii/deces: >2.5 mmol/L.
În general există o corelaţie bună între concentraţia serică a nivelului de litiu şi efectul terapeutic/toxic.
Totuşi unii pacienţi fără răspuns terapeutic prezintă niveluri serice adecvate de litiu, dar concentraţii
eritrocitare reduse. Deoarece litiul acţionează intracelular, la aceşti pacienţi determinarea concentraţiei
483
eritrocitare de litiu ar putea fi mai relevantă decât cea serică1.

Dieta cu un conţinut scăzut de sodiu determină creşterea concentraţiei de litiu prin scăderea excreţiei;
consumul excesiv de cafeină şi sodiu reduc nivelul plasmatic de litiu2.
• Medicamente
Creşteri: diuretice natriuretice (reduc clearance-ul renal al litiului), metronidazol, antiinflamatoare
nesteroidiene (ibuprofen), fluoxetin.
Scăderi: metilparaben - substanţă prezervantă pentru ser fiziologic steril, N-acetilcisteina27.
• Interferenţe analitice
În prezenţa unui ser hemolizat se pot obţine valori fals crescute.
Electrodul de litiu este uşor influenţat de prezenţa calciului ionic în probă; este posibil să se obţină
valori mai scăzute. La valori fiziologic normale ale concentraţiei de calciu ionic, influenţa acestuia este
clinic nesemnificativă.
Se poate determina litiul pentru probe care au sodiul în intervalul 105-180 mmol/L - răspunsul
electrodului de litiu depinde de concentraţia de sodiu în probă3.
Antidepresivele triciclice
Au ca mecanism de acţiune blocarea recaptării neurotransmiţătorilor adrenergici şi dopaminergici,
având drept consecinţă prelungirea acţiunii acestor mediatori excitatori. Alături de stimularea căilor
dopaminergice, antidepresivele triciclice şi în special amitriptilina au efecte anticolinergice.
Reacţiile adverse reflectă de fapt activităţile anticolinergice: uscăciune a mucoasei bucale, constipaţie,
vedere înceţoşată, hipertermie, ileus adinamic, retenţie de urină. Alte efecte exercitate asupra SNC
includ: ameţeală, slăbiciune, astenie şi letargie, alături de agitaţie, insomnie şi confuzie. Se pot
produce de asemenea convulsii, tulburări extrapiramidale şi comă.
Antidepresivele triciclice sunt utilizate adesea în tentativele de suicid de către persoanele cu depresie
aflate în tratament cu aceste medicamente.
Toxicitatea indusă prin supradozare se caracterizează printr-o stimulare excesivă SNC şi acţiuni
anticolinergice marcate: convulsii, comă, hipotensiune, depresie respiratorie, areflexie, midriază,
uscăciune a tegumentelor, halucinaţii, delir, stop cardiorespirator.
O categorie de medicamente non-triciclice cu acţiune antidepresivă marcată este reprezentată de
inhibitorii selectivi ai recaptării serotoninei (SSRI) care nu prezintă efecte anticolinergice, în schimb
pot determina reducerea libidoului şi a funcţiei sexuale: fluoxetin, paroxetin, sertralin4.
Amitriptilina
Este un antidepresiv triciclic ce este metabolizat în nortriptilină, cu activitate farmacologică similară.
Amitriptilina este medicamentul de elecţie pentru cazurile de depresie unde se urmăreşte un efect
sedativ, în timp ce nortriptilina este utilizată atunci când efectul său stimulator este considerat ca fiind
adecvat.
La concentraţii serice >1000 μg/L amitriptilina exercită un efect cardiotoxic major caracterizat prin
lărgirea complexului QRS ce poate conduce la tahicardie ventriculară şi asistolă6.
Imipramina şi desimipramina
Imipramina şi metabolitul său desimipramina sunt antidepresive triciclice utilizate în tratamentul
depresiei endogene; este nevoie de o perioadă de 1-3 săptămâni de tratament până la apariţia
efectelor terapeutice; mai sunt folosite în tratamentul enurezisului nocturn, precum şi în tulburările
484
20
obsesiv-compulsive severe.
Toxicitatea asociată cu imipramina se caracterizează prin lărgirea complexului QRS ce poate
conduce la tahicardie ventriculară şi asistolă. La unii pacienţi toxicitatea poate să apară la concentraţii
terapeutice, însă în mod obişnuit cardiotoxicitatea (blocul AV de gradul I) apare la concentraţii serice
>1000 μg/L4.
Clomipramina
Este un antidepresiv triciclic utilizat în principal în tratamentul tulburărilor obsesiv-compulsive; mai
este folosit în tulburările de panică şi depresia refractară.
Clomipramina blochează predominat recaptarea sinaptică a serotoninei; metabolitul său farmacologic
activ - norclomipramina – blochează în special recaptarea sinaptică a norepinefrinei.
Clomipramina este metabolizată într-un procent de până la 50% la primul pasaj hepatic, ceea ce
explică probabil variabilitatea interindividuală mare între dozele administrate şi concentraţiile serice
la steady state.
Efectele anticolinergice însoţesc frecvent tratamentul; toxicitatea indusă de supradozare se manifestă
similar celei determinate de alte antidepresive triciclice (cardiotoxicitate)8.
Doxepina
Este recomandată în tratamentul depresiei sau al anxietăţii la pacienţi nevrotici, alccolici sau cu
diverse suferinţe organice.
Nordoxepina este metabolitul major ce este prezent de obicei în concentraţii egale cu cele ale
doxepinei.
Ca şi în cazul altor antidepresive triciclice efectul toxic major este reprezentat de tulburările de ritm
cardiac care apar la concentraţii serice >500 μg/L. Alte efecte adverse sunt reprezentate de greaţă,
hipotensiune şi uscăciunea mucoasei bucale12.
Medicamente neuroleptice
Sunt utilizate în principal în tratamentul schizofreniei acute pentru suprimarea stării de agitaţie.
Mecanismul de acţiune al tuturor neurolepticelor constă în blocarea acţiunii postsinaptice a dopaminei
şi serotoninei la nivelul sistemului limbic şi cortexului motor.
Există căi dopaminergice specifice care conectează substanţa neagră din mezencefal cu sistemul
limbic şi cortexul motor, denumite căile mezolimbice-mezocorticale. În plus, substanţa neagră se
leagă de ganglionii bazali prin calea nigrostriatală; depleţia dopaminei la acest nivel este implicată în
apariţia bolii Parkinson. Din acest motiv, antagoniştii de dopamină vor avea frecvent ca reacţii adverse
distonie, diskinezie tardivă şi uneori parkinsonism franc.
Iniţial au fost dezvoltate două clase de neuroleptice: fenotiazinele (principalul reprezentant
fiind clorpromazina) şi butirofenonele (reprezentate de haloperidol); ambele prezintă tulburări
extrapiramidale majore.
Pe lângă efectele extrapiramidale mai pot să apară, mai ales în cazul fenotiazinelor, hipotensiune
ortostatică, colestază şi rareori anemie aplastică.
O tulburare foarte gravă care poate surveni la pacienţii care sunt extrem de sensibili la efectele
extrapiramidale ale neurolepticelor este sindromul neuroleptic malign, manifestat prin rigiditate
musculară marcată, febră înaltă, leucocitoză.
Mai recent au apărut blocante de dopamină potente cu mai puţine efecte adverse extrapiramidale:
485
risperdal (risperidone), olanzapine, quetiapine, aripiprazol4.

Clozapina
Este o benzodiazepină triciclică considerată ca fiind un medicament antipsihotic atipic. Se utilizează în
tratamentul pacienţilor cu schizofrenie sau tulburări psihoafective care au risc mare de suicid şi care
au prezentat lipsă de răspuns sau reacţii adverse majore la antipsihoticele clasice.
Deşi clozapina a fost dezvoltată în urmă cu aproximativ 30 ani, iar rezultatele iniţiale au fost
promiţătoare raportarea unor cazuri de agranulocitoză fatală au condus la evitarea medicamentului.
Cu toate acestea, clozapina a fost recent reintrodusă în terapia antipsihotică din mai multe motive:
pacienţii care nu răspund la antipsihoticele uzuale prezintă o ameliorare semnificativă sub clozapină;
agranulocitoza care se poate dezvolta doar în 1-2% din cazuri poate fi controlată prin monitorizarea
periodică a numărului total de leucocite şi a numărului absolut de neutrofile.
Tratamentul este iniţiat de obicei cu doze de 25-75 mg/zi care sunt crescute progresiv pentru a atinge
în decurs de două săptămâni o doză finală de 300-450 mg/zi. După obţinerea efectului terapeutic
scontat dozele vor fi reduse treptat, pacienţii fiind menţinuţi pe cea mai mică doză posibilă. În lipsa
unui răspuns clinic acceptabil tratmentul cu clozapină va fi întrerupt9.
Medicamente imunosupresoare
În timp ce integritatea răspunsului imun umoral şi celular este esenţială pentru prevenirea infecţiilor,
în unele situaţii, cum ar fi bolile autoimune şi transplantul de organe solide, devine vital să se suprime
activitatea acestor sisteme.
În statusul post-transplant este implicată imunitatea de tip celular. Atât în cazul reacţiilor grefă-contra-
gazdă cât şi a celor gazdă-contra-grefă limfocitele T CD4+ sunt activate atunci când un antigen străin
se leagă de antigenele HLA clasa a II-a de pe suprafaţa macrofagelor (celulele prezentatoare de
antigen). Clonele de celule T specifice se vor lega de antigen prin intermediul receptorului celulei T
(TCR); activarea TCR rezultă într-o “cascadă” de transducţie a semnalului care va conduce în final
la endocitoza antigenului în macrofage şi distrugerea acestuia în lizozomi. În această cascadă sunt
mobilizaţi ionii de calciu care determină activarea calcineurinei, o fosfatază ce formează un complex
cu calmodulinul. Calcineurina activată defosforilează factorul nuclear citosolic al celulelor T activate
(NF-AT)C şi astfel îl activează; acesta migrează către nucleu şi se leagă de omologul său (NF-AT)N.
Complexul transcripţional activ rezultat va induce sinteza de interleukină-2 (IL-2) care va fi secretată
ca un mitogen extracelular. IL-2 se leagă de receptorul său situat pe limfocitul T, pe care îl activează
prin legarea unei proteine, denumită “ţinta rapamicinei” (target of rapamycin = TOR); această proteină
activează ciclin-kinazele care facilitează progresia ciclului celular din G1 în S şi stimulează sinteza
nucleotidelor. Procesul are ca rezultat diferenţierea şi proliferarea celulelor T şi va conduce în final la
distrugerea antigenului.
Au fost dezvoltate medicamente specifice care blochează una sau mai multe din etapele menţionate
mai sus, inhibând astfel distrugerea antigenului.
Ciclosporina şi tacrolimusul sunt polipeptide ciclice care se leagă de proteinele intracelulare denumite
imunofiline (ciclosporina se leagă de ciclofilină, în timp ce tacrolimusul se leagă de imunofilina
denumită FKBP12), rezultând complexe ce blochează ulterior activarea NF-AT indusă de calcineurină
şi în consecinţă sinteza de IL-2.
Un alt agent imunosupresor - rapamicina (sirolimus) – nu exercită nici un efect asupra celulelor T, în
486
20
schimb se leagă de proteina TOR cu rol critic în activarea celulei T.

Micofenolatul mofetil (MMT) este un antibiotic ce este hidrolizat în celule în acid micofenolic liber.
Acest agent este un inhibitor potent al inozin-monofosfat dehidrogenazei şi al guanozin-monofosfat
sintetazei, împiedicând în final sinteza ADN-ului.
Corticosteroizii exercită de asemenea efecte imunosupresoare asupra imunităţii mediate celular, dar
acestea sunt mult mai puţin specifice şi însoţite de numeroase reacţii adverse4.
Ciclosporina A
Este recomandată pentru a preveni rejetul de grefă în transplantul alogenic de rinichi, ficat, inimă şi
plămâni-inimă; de asemenea mai este utilizat ca medicament de prima sau a doua linie în tratamentul
bolii acute grefă contra-gazdă survenită după transplantul de măduvă osoasă, în artrita reumatoidă
severă, cât şi în unele forme grave de psoriazis.
Nivelul sangvin maxim este atins după aproximativ 3.5 ore de la administrare; cca 20-40% din doza
administrată este absorbită intestinal şi este metabolizată la primul pasaj hepatic. Izoenzima CYP3A4
a citocromului P450 este responsbilă de metabolizarea ciclosporinei în cel puţin 30 metaboliţi.
Deoarece un număr mare de medicamente pot induce activitatea enzimei sau pot fi metabolizate de
CYP3A4 (antibiotice, antifungice sau alte imunosupresoare) asocierea acestora poate altera nivelurile
ciclosporinei în sânge şi complica astfel tratamentul.
Ciclosporina are un interval terapeutic îngust, cu reacţii adverse frecvente, ceea ce face ca
monitorizarea concentraţiei sale în sânge să fie esenţială.
Deoarece 80% din ciclosporină este sechestrată în eritrocite se recomandă ca nivelurile medicamentului
să fie determinate în probe de sânge integral. În primele 2 luni posttransplant dozele sunt ajustate
astfel încât să se menţină concentraţiile între 150 μg/L şi 400 μg/L. Concentraţiile obţinute în trough
samples pot varia însă în funcţie de protocolul clinic, tipul alogrefei, riscul de rejet, administrarea
concomitentă a unor alte imunosupresoare şi toxicitate. După primele 2 luni ţinta terapeutică este în
general mai redusă (între 75 şi 300 μg/L).
Reacţiile adverse ale ciclosporinei pot să apară în orice organ; valorile concentraţiei maxime (trough
samples) >500 μg/L sunt asociate cu nefrotoxicitate, cea mai frecventă reacţie adversă, însoţită de
hiperkaliemie, hiperuricemie, hipertensiune arterială şi hiperplazie gingivală.
Alte reacţii adverse includ efecte neurologice (tremor, convulsii, cefalee, parestezii, confuzie),
dermatologice (hirsutism, rash), hepatotoxicitate, tulburări gastrointestinale (diaree, greaţă, vărsături,
anorexie, discomfort abdominal), hematologice (leucopenie, anemie, trombocitopenie), complicaţii
infecţioase, reacţii de hipersensibilitate. În plus, există un risc crescut de limfoame, în special ale
SNC4;10.
Tacrolimus
Este un antibiotic din clasa macrolidelor cu un mecanism de acţiune similar ciclosporinei, dar cu un
efect inhibitor mai potent decât acesta. Este utilizat în prevenirea rejetului de organ.
Tacrolimus este metabolizat în ficat de către CYP3A4, astfel că nivelurile sale în sânge sunt afectate
atât de medicamentele care inhibă această enzimă (blocante ale canalelor de calciu, antifungice,
unele antibiotice), cât şi de cele care induc activitatea enzimatică (anticonvulsivante, rifampicină).
Deoarece 90% din tacrolimus se găseşte în componentele celulare din sânge se recomandă ca
nivelurile medicamentului să fie determinate în probe de sânge integral. Concentraţiile obţinute în
487
trough samples pot varia în funcţie de protocolul clinic, tipul alogrefei, riscul de rejet, administrarea
concomitentă a unor alte imunosupresoare şi toxicitate (în principal nefrotoxicitate), însă nu trebuie
să depăşească 20 µg/L.
Potenţialul toxic este similar celui al ciclosporinei: nefrotoxicitate, neurotoxicitate (tremor, cefalee),
tulburări gastrointestinale (greaţă, diaree), HTA, perturbarea metabolismului glucozei, hiperkaliemie şi
complicaţii infecţioase. Totuşi nu apare hipertrofie gingivală şi nici hirsutism. Anafilaxia este descrisă
numai în cazul administrării intravenoase4;19.
Sirolimus (Rapamicina)
Este un antibiotic similar tacrolimusului care suprimă proliferarea limfocitelor B şi T; de asemenea are
activitate antineoplazică şi antifungică.
Inhibă protein kinaza TOR şi blochează astfel ciclul celular. Nu exercită nici un efect asupra calcineurinei
şi astfel poate fi utilizat împreună cu ciclosporina şi tacrolimusul.
Sirolimusul este metabolizat de către CYP3A4, astfel că nivelurile sale în sânge sunt afectate atât de
medicamentele care inhibă această enzimă cât şi de cele care induc activitatea enzimatică.
Interacţiunea farmacocinetică între sirolimus şi ciclosporină sau tacrolimus creşte atât imunosupresia
terapeutică cât şi toxicitatea aceptor agenţi; ca urmare a folosirii combinate sunt necesare astfel doze
mai mici.
Reacţiile adverse sunt în general dependente de doză, de aceea este importantă monitorizarea
nivelurilor medicamentului în sânge. Acestea includ tulburări gastrointestinale şi trombocitopenie;
medicamentul nu pare să fie nefrotoxic4;24.
Acid micofenolic
Micofenolat mofetil este un agent imunosupresor mai nou care este utilizat în transplantul renal,
hepatic şi cardiac. După pătrunderea în circulaţie medicamentul este metabolizat imediat în forma
activă - acidul micofenolic (MPA) – care interferă cu sinteza de novo a guanozinei (acţionează selectiv
în limfocit). MPA inhibă răspunsul proliferativ al limfocitelor B şi T atât la stimularea mitogenică cât şi
la cea alospecifică; are un mecanism de acţiune similar azatioprinei.
Medicamentul este inactivat la nivel hepatic de către enzima uridin difosfat glucuronozil transferaza
(UGT) rezultând acidul micofenolic glucuronid.
Principala problemă legată de tratamentul cu micofenolat este imunosupresia excesivă care
predispune la infecţii sistemice. Din acest motiv este foarte important să se monitorizeze nivelul
sangvin al medicamentului.
Nu au fost descrise nefrotoxicitate sau neurotoxicitate în asociere cu micofenolatul4;18.
Methotrexat
Este un agent antineoplazic care inhibă enzima dihidrofolat reductaza având drept consecinţă blocarea
sintezei tetrahidrofolatului şi în final a ADN-ului.
Eficacitatea methotrexatului a fost dovedită în neoplaziile cu turnover tumoral crescut cum ar fi
leucemia acută limfoblastică, coriocarcinomul, carcinomul mamar, testicular, de faringe. În aceste
tumori se administrează de obicei în doze mari (2.5-3.3 mg/kg) ; ulterior se recurge la leucovorin (acid
folinic) pentru “salvarea“ celulelor normale.
Methotrexatul constituie de asemenea şi un important agent imunosupresor, fiind indicat în formele
severe de artrită reumatoidă şi psoriazis.
488
20
Cinetica nivelurilor steady state ale acestui medicament este bifazică : o fază rapidă cu T1/2 de 2-3 ore
şi o fază lentă cu T1/2 de 8-10 ore. Se leagă în proporţie de 50% de proteinele plasmatice. Excreţia
este de asemenea bifazică: 92% din medicament este eliminat în 24 ore, iar restul în decurs de câteva
zile.
Efectele toxice ale methotrexatului sunt numeroase:
- hematologice: leucopenie şi trombocitopenie;
- gastrointestinale: glosită, stomatită, ulceraţii, greaţă, vărsături;
- hepatice: ciroză;
- pulmonare: fibroză;
- dermatologice: urticarie şi vasculită;
- la nivel SNC (în cazul administrării intratecale): arahnoidită, leucoencefalopatie,
hipertensiune intracraniană.
Monitorizarea terapeutică a methotrexatului în probe de ser este necesară pentru urmărirea eliminării
adecvate a medicamentului după administrarea dozelor mari4;17.
Bibliografie
1. Frances Fischbach. Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests.

Lippincott Williams & Wilkins, USA, 7 Ed., 2004, 417.
2. Frances Fischbach. Minerals în Human Nutrition. In A Manual of Laboratory and Diagnostic
Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 7 Ed., 2004, 1155.
4. Matthew R. Pincus, Naif Z. Abraham. Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring. In Henry’s
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition,
2007, 308-320.
5. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Amiodarone, Serum. www.
6. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Amitriptyline and Nortriptyline,
Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
7. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Carbamazepine, Total,
8. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Clomipramine, Serum. www.
9. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Clozapine, Serum.
10. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Cyclosporine, Blood. www.
11. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Digoxin, Serum.
12. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Doxepin and Nordoxepin,
13. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Ehosuximide, Serum. www.
489

14. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Flecainide, Serum.
15. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Gabapentin, Serum.
16. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Lamotrogine, Serum. www.
17. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Methotrexate, Serum. www.
18. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Mycophenolic Acid, Serum.
19. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Tacrolimus, Blood.
20. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Theophylline, Serum. www.
21. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Phenobarbital, Serum. www.
22. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Primidone and Phenobarbital,
23. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Phenytoin, Serum.
24. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Sirolimus, Blood.
25. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Vancomycin, Trough, Serum.
26. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Valproic Acid, Total, Serum.
27. Norbert W Tietz. General Clinical Tests. In Clinical Guide to Laboratory Tests. W.B.SAUNDERS ,
USA, 3 Ed., 1995; 567.
28. Quest Diagnostics. Therapeutic Drug Monitoring. Drug Half-Life, Steady State, and
Recommended Sample Collection Time. www.questdiagnostics.com. Ref Type: Internet
Communication.
490
TESTE DE MICROBIOLOGIE
21
21 TESTE DE MICROBIOLOGIE
21.1 SFERA ORL
21.1.1 Antigen Streptococ betahemolitic grup A în exsudatul faringian
Faringita bacteriană reprezintă 5-10% din totalul faringitelor, în comparaţie cu faringita virală al cărui
procent este de 30-60%. Cel mai frecvent agent etiologic al faringitei bacteriene este streptococul
beta-hemolitic grup A; microorganismul se transmite prin contact direct între persoane, prin intermediul
picaturilor Pflϋge sau al secreţiilor nazale, de aceea riscul de îmbolnăvire este mai mare în colectivităţi
şi familie. Perioada de incubaţie a bolii variază între două până la cinci zile1;2;5.
Testul de depistare rapidă a antigenului Streptococului betahemolitic grup A este utilizat frecvent în
practica clinică, în special în pediatrie, pentru identificarea germenului în faringite acute şi începerea
promptă a tratamentului antibiotic, înainte de a aştepta rezultatele culturii care devin disponibile în 24-
48 ore. Sensibilitatea testului variază între 80-95% iar specificitatea acestuia este de 98%. Obţinerea
unui rezultat pozitiv permite iniţierea promptă a terapiei; un rezultat negativ impune însă, în prezenţa
simptomelor clinice, efectuarea culturii1;2;4.
Testul mai poate fi folosit şi la pacientii asimptomatici pentru depistarea stării de purtător; în acestii
situaţii s-a demonstrat că această investigaţie are o valoare predictivă negativă foarte bună in
comparatie cu cea a rezultatelor furnizate de cultură. Acest lucru se datorează faptului că în cazul
unei colonizări bacteriene a faringelui încărcătura bacteriană este mică, iar culturile pot fi negative
datorită inhibării germenilor de către flora bacteriană normală4.
Recoltarea probei
- se aşează pacientul pe scaun cu faţa spre sursa de lumină, gâtul în uşoară extensie şi ceafa sprijinită
de spătar;
- se deprimă baza limbii cu apăsătorul şi, în timp ce pacientul pronunţă vocala “a”, se şterg ferm cu
tamponul amigdalele şi peretele posterior al faringelui, insistând asupra zonelor inflamate, ulcerate
sau cu depozite purulente; dacă există false membrane, acestea se desprind uşor, tamponându-se
mucoasa subiacentă; atât la introducerea cât şi la scoaterea tamponului, se evită atingerea bazei
limbii şi a palatului moale.
- se introduce tamponul în tubul protector simplu fără mediu de transport, care se etichetează
corespunzător3.
Metodă – imunocromatografică3.
Valori de referinţă - Antigen streptococ betahemolitic grup A negativ3.
Bibliografie
1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and
other infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, eleventh ed., 2002, 57:
900–902.
492
21
2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infecţiilor tractusului respirator superior şi cavităţilor

conecte. Dumitru Buiuc, Marian Neguţ . ÎnTratat de Microbiologie Clinică, Edit. Medicală 1999,
12: 214–225.
4. N. Mustafa, H.Nsanze, et.al. Group A streptococcal antigen detection in schoolchildren. In
Eastern Mediterranean Health Journal ., vol.4, 1998, 260-264.
5. Weber DJ, Rutala WA, Denny FW. Management of healthcare workers with pharyngitis or
suspected streptococcal infections. In Infect Control Hosp Epidemiol 1996;17:753-61.
21.1.2 Examen microscopic al exsudatului faringian pentru fusospirili
Angina Vincent este o infecţie acută necrotizantă a faringelui determinată de o combinaţie de bacili
fusiformi (Fusiformis fusiformis – bacil Gram negativ) şi spirochete (Borrelia vincentii). Aceleaşi
microorganisme sunt implicate şi în producerea gingivostomatitei.
Tabloul clinic include odinofagie unilaterală care creşte în intensitate în decurs de câteva zile şi poate
fi asociată cu otalgie de aceeaşi parte. Pacientul prezintă de obicei o halenă fetidă.
La examenul faringelui se constată prezenţa unei ulceraţii amigadaliene bine circumscrise a cărei
bază este cenuşie şi sângerează rapid la atingere. Se poate asocia de asemenea şi o limfadenopatie
submandibulară.
Diagnosticul de angină Vincent se stabileşte pe baza examenului frotiului efectuat din exsudatul
faringian şi colorat Gram care pune în evidenţă prezenţa bacililor Gram negativi fusiformi şi a
spirochetelor, în contextul unei reacţii inflamatorii1;2.
Recoltarea probei
de spătar;
- se deprimă baza limbii cu apăsătorul şi se prelevă un tampon simplu, de la nivelul zonei ulcerate,
din care se vor efectua extemporaneu două frotiuri pentru examenul microscopic, în vederea
diagnosticării anginei Vincent.
Metodă – examen microscopic3.
Valori de referinţă – absenţi fusospirili pe lamele examinate3.
Bibliografie
1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and
other infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, eleventh ed., 2002, 57:
900–902.
493
2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infecţiilor tractusului respiratir superior şi cavităţilor

conecte. Dumitru Buiuc, Marian Neguţ . ÎnTratat de Microbiologie Clinică, Edit. Medicală 1999,
12: 214–225.
21.1.3 Examenul bacteriologic al exsudatului faringian
Tractul respirator superior cuprinde fosele nazale, nazofaringele (cu cavităţile conecte: sinusurile
paranazale şi urechea medie), orofaringele şi laringofaringele. Datorită lipsei barierelor anatomice
distincte între segmentele căilor respiratorii superioare, infecţia se poate propaga prin continuitate,
cu frecvente complicaţii prin afectarea urechii medii, a laringelui şi chiar a căilor respiratorii
inferioare1;2;6.
Faringitele şi tonsilitele sunt cele mai frecvente afecţiuni ale tractului respirator superior pentru care
pacientul se adresează medicului şi implicit laboratorului.
În diagnosticul microbiologic, laboratorul trebuie să aibă în vedere flora bacteriană care există în mod
normal în anumite situsuri anatomice. Această floră normală, care se află într-o relaţie de simbioză cu
gazda, joacă un rol important în protecţia acesteia faţă de microorganismele patogene, putând preveni
proliferarea şi invazia acestora prin diferite mecanisme1. Etajul supraglotic al tractului respirator
găzduieşte o floră bacteriană ce cuprinde peste 200 specii repartizate la nivelul crevaselor gingivale,
plăcii dentare, mucoasei jugale şi linguale, oro-faringelui, criptelor amigdaliene şi nazofaringelui,
bacteriile anaerobe dominându-le pe cele aerobe în proporţie de 5-10:12.
Etiologia faringitelor
Infecţiile virale
• Aproximativ 70% din faringite sunt de etiologie virală: rhinovirusuri, adenovirusuri, virusuri
gripale, paragripale, Coxsackie A, virusul Epstein-Barr care determină mononucleoza infecţioasă
caracterizată prin angină severă, frecvent ulcerată, adenită cervicală şi semne de afectare
sistemică1;2;6.
• Au evoluţie auto-limitantă dar, prin lezarea epiteliului respirator şi obturarea congestivă a orificiilor
sinuzale sau a trompei lui Eustachio, favorizează suprainfecţia cu bacterii din microbiota indigenă.
Infecţiile bacteriene
• Cel mai frecvent implicat este Streptococcus pyogenes (Streptococ β hemolitic grup A, PYR pozitiv).
Streptococcus pyogenes este unul dintre patogenii umani importanţi, singurul rezervor cunoscut în
natură fiind reprezentat de pielea şi mucoasele umane; imprimă gravitate faringitelor prin complicaţiile
infecţioase (sinuzite, otite medii, mastoidite, adenite cervicale supurate, abces amigdalian, flegmon
amigdalian, celulită difuză a planşeului bucal – angina Ludwig) şi post infecţioase (reumatism articular
acut, glomerulonefrită acută, cardită reumatismală). Prezenţa antigenelor Lancefield de grup A nu este
494
21
specifică pentru Streptococcus pyogenes, acestea putând fi prezente şi în cadrul grupului anginosus,
din care fac parte Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus şi Streptococcus intermedius.
Testul PYR diferenţiază Streptococcus pyogenes care este responsabil de majoritatea faringitelor
bacteriene de grupul anginosus care face parte din microbiota faringiană normală1;4;5.
Faringitele cu tulpini eritrotoxigene de Streptococcus pyogenes se însoţesc de scarlatină1;2.
• Abcesul periamigdalian apare mai frecvent la copiii peste 5 ani şi adulţii tineri, putând deveni o
infecţie gravă prin afectarea ţesuturilor adiacente, ca şi prin erodarea arterei carotide. Organismele
implicate sunt în principal: Streptococcus pyogenes, Arcanobacterium haemolyticum, Staphylococcus
aureus, anaerobii (e.g. Fusobacterium spp.şi Bacteroides)1;2.
• Streptococii β hemolitici grup C şi G pot determina faringite a căror evoluţie poate fi gravă.
• Arcanobacterium haemolyticum – poate cauza, mai frecvent la adulţii tineri, faringită şi abces
periamigdalian. Faringitele, asemănătoare celor streptococice, se însoţesc de erupţie scarlatiniformă
şi/sau adenită cervicală la circa 50% din pacienţi. Întrucât face parte din flora comensală, doar
creşterea predominantă în placa de izolare are semnificaţie clinică2;5.
• Chlamydia pneumoniae - cauză frecventă a faringitelor2.
• Mycoplasma pneumoniae - determină până la 10% din faringitele şcolarilor2.
• Neisseria gonorrhoeae - faringita gonococică apare după raporturi sexuale aberante şi evoluează
benign. Investigaţia de laborator se face doar la cerere expresă. Microscopia nu are valoare datorită
numeroaselor neisserii nepretenţioase din microbiota orofaringiană2.
• Corynebacterium diphteriae - determină faringită sau angină pseudomembranoasă gravă, însoţită
de toxemie. Complicaţiile cele mai de temut sunt cele ce implică sistemul nervos central (orbire,
comă).
• Asocierea fuso-spirochetozică - infecţie mixtă cu bacterii anaerobe (Fusobacterium spp) şi spirochete,
determină stomatita şi angina Vincent. Infecţia, relativ rară astăzi, se caracterizează prin leziuni
ulcero-necrotice care pot fi acoperite de false membrane. Afectează mai frecvent adulţii decât copiii, în
special pe cei cu igienă orală deficitară şi deficite locale sau sistemice ale apărării antiinfecţioase1;2.
• Haemophilus influenzae (doar serotipul b are implicaţii în patologie), Streptococcus pneumoniae
şi Staphylococcus aureus sunt microorganisme care, deşi frecvent izolate din exsudatul faringian şi
secreţia nazală, nu au fost confirmate ca fiind implicate în etiologia faringitelor. Statusul de purtător
pentru unul dintre aceste microorganisme, ca şi pentru Neisseria meningitidis poate avea semnificaţie
clinică pentru anumiţi pacienţi sau contacţii lor1;2.
• Creşterea predominantă şi în cantitate mare în cultură a bacililor Gram negativ, a pseudomonadelor
şi a levurilor (Candida albicans – levură din microbiota orofaringiană) poate avea semnificaţie clinică
la nou născuţi, în cazul prematurilor, a pacienţilor spitalizaţi pentru boli grave, imunodeprimaţi sau
a celor ce au urmat tratament antimicrobian care a indus disbioze importante2. De aici importanţa
stabilirii unei bune comunicări între medicul clinician şi medicul de laborator în vederea cunoaşterii
contextului clinic al pacientului.
Un caz particular de infecţie faringiană apare la copiii cu fibroză chistică, afecţiune ce trebuie
menţionată în cererea trimisă laboratorului de către medicul clinician. Unul din produsele patologice
acceptate în acest caz este exsudatul faringian profund, laboratorul comunicând prezenţa în orice
495
cantitate a următorilor germeni: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa şi Burkholderia

cepacia4.
Recoltarea şi transportul probelor
Exsudatul faringian se prelevă înainte sau după 4 ore de la toaleta cavităţii bucale sau ingestia de
alimente sau lichide.
Tehnică de recoltare
- Se aşează pacientul pe scaun cu faţa spre sursa de lumină, gâtul în uşoară extensie şi ceafa sprijinită
de spătar sau perete.
- Se deprimă baza limbii cu apăsătorul şi, în timp ce pacientul pronunţă vocala “a”, se şterg ferm cu
tamponul amigdalele şi peretele posterior al faringelui, insistând asupra zonelor inflamate, ulcerate
sau cu depozite purulente; dacă există false membrane, acestea se desprind uşor, tamponându-se
mucoasa subiacentă; atât la introducerea cât şi la scoaterea tamponului, se evită atingerea bazei
limbii şi a palatului moale.
- Se introduce tamponul în tubul protector simplu sau prevăzut cu mediu de transport (Amies sau
Stuart), care se etichetează corespunzător.
- Se prelevă:
 un tampon simplu fără mediu de transport, din care se va efectua testul rapid pentru
detectarea antigenului streptococic de grup A;
 un tampon simplu, de la nivelul zonei ulcerate, din care se vor efectua extemporaneu
două frotiuri pentru examenul microscopic, în vederea diagnosticării anginei Vincent;
 un tampon prevăzut cu mediu de transport pentru efectuarea culturii.
Transportul probelor către laborator se face în maximum 2 ore de la prelevare. Deşi probele prelevate
pe tampoane în tuburi ce conţin mediu de transport pot fi păstrate până la 24 ore, este recomandat
ca însămânţările pe mediile de cultură să se facă imediat ce probele ajung la laborator, pentru o mai
sigură recuperare a microorganismelor urmărite.
Diagnosticul de laborator
• Se însămânţează proba pe agar Columbia cu 5% sânge de berbec şi, la cerere, când medicul
clinician solicită şi flora, pe agar Chocolate.
• Se incubează aerob în atmosferă cu 5% CO2, 24 h la 37°C, cu prelungire până la 48 h dacă la prima
citire a plăcilor nu se observă coloniile caracteristice germenului urmărit.
• Coloniile caracteristice se repică în vederea obţinerii culturii pure pentru identificare.
După obţinerea unui rezultat pozitiv la latexaglutinare pentru grupul A Lancefield, se efectuează testul
imuncromatografic PYR, care permite diferenţierea între Streptococcus pyogenes (PYR pozitiv) şi
ceilalţi streptococi beta hemolitici (PYR negativ)3.
• Metoda directă, rapidă pentru detectarea antigenului Streptococ betahemolitic de grup A este
latexaglutinarea, cu o sensibilitate ce variază între 80-95% şi o specificitate de 98%. Obţinerea unui
rezultat pozitiv permite iniţierea promptă a terapiei; un rezultat negativ impune, însă, efectuarea
culturii.
• Examenul microscopic colorat Gram din probele de exsudat faringian nu este recomandat deoarece
nu se poate face o diferenţiere între patogenii suspectaţi şi flora normală de la acest nivel. Excepţie
496
21
fac următoarele situaţii:

• corelarea rezultatelor microscopiei cu izolarea predominantă şi în cantitate mare în cultură a unei
specii de Candida (albicans sau tropicalis)2;
• diagnosticul anginei fuso-spirochetozice – examinarea microscopică a frotiului colorat Gram,
urmărind prezenţa bacililor Gram negativi fusiformi şi a spirochetelor, în contextul unei reacţii
inflamatorii1;2;
• diagnosticul anginei difterice – frotiu efectuat extemporaneu ce trebuie trimis la laborator impreună
cu tampoanele şi biletul de trimitere care are obligatoriu notată suspiciunea clinică.
Criterii pentru efectuarea antibiogramei
Întrucât Streptococul β hemolitic şi-a păstrat sensibilitatea naturală la Penicilină, antibiograma se
efectuează doar la cererea medicului sau în cazul alergiei la Penicilină.
Dacă în cultură Streptococul β hemolitic se asociază cu Staphylococcus aureus, se va menţiona
în buletinul de rezultate această asociere, iar tratamentul pentru Streptococ nu se va efectua cu
Penicilină, deoarece majoritatea tulpinilor de Stafilococ sunt secretoare de penicilinază3.
Uzual, în laboratoarele Synevo se comunică:
– Streptococi β hemolitici;
– Staphylococcus aureus doar în asociere cu un Streptococ β hemolitic;
– Arcanobacterium haemolyticum;
– Neisseria gonorrhoeae3.
Bibliografie
1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and other
infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, Twelfth Edition, 2007, 54:
814–821.
2. Dumitru Buiuc, Marian Negut. Diagnosticul de laborator al infecţiilor tractusului respirator
superior şi cavităţilor conecte. ÎnTratat de Microbiologie Clinică, Edit. Medicală 2008, 12: 208–
224.
4. Lynne S. Garcia. Guidelines for Performance of Respiratory Tract Cultures. In Clinical
Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology, 2007; 3.11.3.
5. Olga Mihaela Dorobăţ. Bacteriologie Medicală, 2006, 12: 189, 19: 300- 303.
6. Richard B. Thomson, Jr. Specimen collection, transport and processing: Bacteriology. In:Patrick
R. Murray et al. - “Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. 2007 , 20: 291-333.
497
21.1.4 Examenul bacteriologic al exsudatului nazal
Rinita este cauzată cel mai adesea de virusuri (rhinovirusuri, adenovirusuri, virusuri gripale, paragripale,
Coxsackie A) şi rareori de bacterii.
Există microorganisme patogene care se găsesc la nivelul narinelor atât în stare de boală cât şi în
starea de purtător sănătos.
Examenul microbiologic al exsudatului nazofaringian este indicat pentru depistarea portajului de
germeni patogeni în căile respiratorii superioare, depistare solicitată şi indicată în scopuri epidemiologice
(e.g., stabilirea sursei de infecţie, carantinarea purtătorilor sănătoşi, evaluarea lucrătorilor din industria
alimentară)1;2;4;7.
Astfel, informaţiile privind diagnosticul clinic şi suspiciunea asupra florei implicate în infecţie sunt utile
personalului din laborator în alegerea mediilor de cultură folosite3;4.
• Staphylococcus aureus - rata portajului nazal este de cca. 30% în colectivitatea generală, ajungând
la 70% la personalul medical. În focarul epidemic prelevarea tamponului nazal trebuie repetată de 1-2
ori la interval de o săptămână pentru a diferenţia portajul de durată de cel tranzitor2.
• Streptococcus pyogenes - purtătorii nazali au potenţial epidemic mai mare decât cei faringieni2.
• Streptococcus pneumoniae - rata portajului este de 40-60% din populaţia generală2;4.
• Haemophilus influenzae - la 25-80% dintre persoanele sănătoase se evidenţiază tulpini necapsulate,
la 5-10% tulpini capsulate şi la 1- 5% tulpini de tip b5.
• Moraxella catarrhalis – datorită colonizării tractului respirator superior poate determina otită medie
sau sinuzită prin contiguitate; rata portajului este variabilă, fiind influenţată atât de factorii de mediu
cât şi genetici7.
• Klebsiella rhinoscleromatis - determină apariţia rhinoscleromului, formă rară de infecţie granulomatoasă
cronică a submucoasei nasului şi sinusurilor, faringelui şi laringelui, rar a traheei2;5.
• Klebsiella ozenae - poate fi izolată şi ea de la nivelul tractului respirator superior. Este agentul
etiologic al ozenei, afecţiune cronică, caracterizată prin atrofia mucoasei nazale, abundentă secreţie
mucopurulentă, adesea cu miros fetid2;5.
O serie de factori ce determină scăderea rezistenţei atât locale (mucoasa nazală), cât şi generale a
organismului (infecţii virale ce determină acumulări anormale de mucus şi lezarea epiteliului respirator,
alcoolismul, circulaţia sangvină pulmonară anormală, malnutriţia şi toate afecţiunile ce contribuie la
scăderea importantă a imunităţii) favorizează infecţia locală cu microorganismele amintite anterior
şi propagarea acesteia pe cale limfatică, cu dezvoltarea unor afecţiuni grave: otită, meningită,
pneumonie, endocardită, artrită septică7.
Produsul patologic de la acest nivel este uşor de obţinut (metodă neinvazivă) dar are dezavantajul de
a fi contaminat cu microbiotă saprofită rezidentă.
Tehnică de recoltare
de spătar sau perete;
498
21
- se introduce blând tamponul printr-o nară de-a lungul planşeului nazal, până atinge peretele posterior
al nazofaringelui;
- se lasă tamponul pe loc câteva secunde, apoi se roteşte uşor şi se retrage;
- se introduce tamponul în tubul protector prevăzut cu mediu de transport (Amies sau Stuart), se
etichetează şi se trimite la laborator.
Recoltarea exsudatului nazofaringian în contextul suspiciunii de sinuzită nu este recomandată, în
această afecţiune produsul patologic de elecţie fiind puncţia sinusală4.
Se recomandă recoltarea produsului patologic pe 2 tampoane:
 un tampon simplu din care se va efectua extemporaneu un frotiu ce va fi colorat Giemsa
pentru diagnosticul rinitei alergice.
Transportul probelor către laborator se face în maximum 2 ore de la prelevare. Deşi probele prelevate
pe tampoane în tuburi ce conţin mediu de transport pot fi păstrate până la 24 h, este recomandat ca
însămânţările pe mediile de cultură să se facă imediat ce probele ajung la laborator, pentru o mai
sigură recuperare a microorganismelor urmărite3..
Diagnostic de laborator
Proba se însămânţează pe mediu agar Columbia cu 5% sânge de berbec şi, la cerere (când medicul
clinician solicită şi flora) pe agar Chocolate; se incubează aerob în atmosferă cu 5% CO2, 24 h la
37°C, cu prelungire până la 48 h dacă la prima citire a plăcilor nu se observă coloniile caracteristice
germenului urmărit. Coloniile caracteristice se repică în vederea obţinerii culturii pure pentru identificare
şi antibiogramă.
Examenul microscopic pentru diagnosticul rinitei alergice - se numără polimorfonuclearele eozinofile
şi se raportează procentual la 100 de elemente albe3.
În laboratoarele Synevo se comunică prezenţa următorilor germeni în exsudatul faringian:
• Staphylococcus aureus - portaj, cu recomandarea tratamentului local în funcţie de contextul clinico-
epidemiologic;
• Streptococcus pyogenes - în orice cantitate;
• Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis - în funcţie de vârsta
pacientului;
• Moraxella catarrhalis - se efectueaza doar identificarea, antibiograma nefiind standardizată;
• Klebsiella rhinoscleromatis şi Klebsiella ozenae - doar la cererea medicului clinician.
Bibliografie
1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and other
infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, 12th ed, 2007, 54: 814–821.
conecte. Dumitru Buiuc, Marian Negut în Tratat de Microbiologie Clinică, Edit. Medicală 2008,
12: 208–224.
499
4. Lynne S. Garcia. Guidelines for Performance of Respiratory Tract Cultures. In Clinical
Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology, 2007; 3.11.1.
5. Olga-Mihaela Dorobăţ. Familia Enterobacteriaceae. În Bacteriologie Medicală. Universitatea
“Titu Maiorescu”, Romania ed. 2006; 17:276.
6. Olga Mihaela Dorobăţ. Bacteriologie Medicală, 2006, 12: 189, 19: 300- 303.
7. Richard B. Thomson, Jr. Specimen collection, transport and processing: Bacteriology. In: Patrick
R. Murray et al. - “Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. , 2007 , 20: 291-333.
21.1.5 Examenul bacteriologic al secreţiei auriculare
Patologia infecţioasă a urechii este dominată de otitele externe (infecţii ale pavilionului şi ale conductului
auditiv extern, regiuni anatomice cu floră saprofită) şi de otitele medii (infecţii ale urechii medii).
Flora saprofită a urechii externe este reprezentată de microorganismele care se întâlnesc pe
tegument:
- specii bacteriene dominante: stafilococi coagulazo-negativi şi corynebacterii;
- specii bacteriene mai rar întâlnite: micrococi, neiserii saprofite;
- genuri de fungi: Alternaria, Penicillium şi Candida (non albicans)3;5.
Otitele externe - au particularităţi proprii infecţiilor tegumentare, contaminarea putându-se produce
prin:
• înţepări sau răniri cu diferite corpuri tari: scobitori, ace, creioane;
• erizipel determinat de Streptococcus pyogenes;
• pătrunderea apei în conductul auditiv, cu macerarea consecutivă a tegumentelor de la acest nivel
poate determina apariţia „otitei înotătorilor” produsă de Pseudomonas aeruginosa (la cei care înoată
în apă dulce) sau de Vibrio alginolyticus (înotătorii din oceane)5;
• post antibioticoterapie locală îndelungată pot apărea micoze auriculare determinate de Candida
albicans sau de fungi din genul Aspergillus.
Otitele medii - au particularităţi proprii anatomiei şi fiziologiei locale, fiind mai frecvente la copiii în
vârstă de 3 luni până la 3 ani. Urechea medie (ca şi cea internă), regiune sterilă din punct de vedere
bacteriologic, se poate infecta fie prin invazia florei locale şi de vecinătate, fie în cadrul unor boli
sistemice, cu poartă de intrare respiratorie (rujeola, scarlatina)2.
Un rol important în apariţia acestora îl au afecţiunile rinofaringelui care, prin congestia şi edemul
trompei lui Eustachio, blochează drenajul normal al cavităţii şi eliminarea contaminanţilor ocazionali
proveniţi din microbiota locală3.
• la copii, amigdalitele şi faringitele determină apariţia otitelor medii prin propagarea inflamaţiei şi
infecţiei, care este favorizată de beanţa şi poziţia orizontală a trompei la această vârstă.
500
21
• vegetaţiile adenoidiene determină apariţia otitelor atât pe cale mecanică, prin volumul lor, cât şi pe
cale inflamatorie, prin infecţiile pe care le întreţin.
Principalii agenţi etiologici implicaţi în otitele medii sunt: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae si Moraxella catarrhalis5.
În otitele cronice, externe şi medii, predomină germenii anaerobi: Peptostreptococcus spp.,
Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogenica, Porphyromonas, frecvent însoţiţi de Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa sau alţi bacili Gram negativi1;5.
În otitele externe produsul patologic este reprezentat de exsudatul leziunii tegumentare a pavilionului
sau a conductului auditiv extern. Spre deosebire de acesta, prelevatul de elecţie pentru examenul
bacteriologic al otitelor medii îl reprezintă exsudatul aspirat prin timpanocenteză. În caz de perforare
spontană a timpanului prelevatul se recoltează pe un fin tampon steril3;4;5.
Se recomandă recoltarea produsului patologic pe 2 tampoane:
 un tampon simplu din care se vor efectua două frotiuri pentru examenul microscopic
În spitale se poate recurge la însămânţarea extemporanee cu lanţeta de puncţie, direct pe mediile
de cultură.
Indiferent de modalitatea de prelevare, produsul patologic este imersat în mediu de transport şi trimis
imediat la laborator. Transportul probelor către laborator se face în maximum 2 ore de la prelevare.
Deşi probele prelevate pe tampoane în tuburi ce conţin mediu de transport pot fi păstrate până la 24
h, este recomandat ca însămânţările pe mediile de cultură să se facă imediat ce probele ajung la
laborator, pentru o mai sigură recuperare a microorganismelor urmărite4.
Examenul microscopic: se efectuează două frotiuri, unul cu coloraţie Gram pentru determinarea
morfologiei germenilor şi unul cu coloraţie Giemsa, pentru aprecierea reacţiei inflamatorii3;5.
Însămânţarea pe medii de cultură: agar Columbia cu 5% sânge de berbec, agar chocolate, agar Mac
Conkey 5.
Însămânţarea se face cu dispersie, pentru a permite o apreciere semicantitativă a creşterii. Se
incubează aerob în atmosferă cu 5% CO2, 24 h la 37°C, cu prelungire până la 48 h dacă la prima citire
a plăcilor nu se observă coloniile caracteristice germenului urmărit. Coloniile caracteristice se repică
în vederea obţinerii culturii pure pentru identificare şi antibiogramă4.
Medicul clinician poate orienta investigaţiile suplimentar către cultura de fungi şi/sau cultura anaerobă,
în funcţie de contextul clinic. În cazul germenilor anaerobi, rapiditatea prelevării şi transportul în condiţii
optime sunt esenţiale în izolarea acestora.
Comunicarea şi interpretarea rezultatelor- se face corelat cu examenul microscopic direct.
În cazul otitelor externe microscopia este îngreunată din cauza numeroşilor germeni contaminanţi
prezenţi la nivelul leziunii tegumentare. Coexistenţa pe frotiu a reacţiei inflamatorii cu prezenţa
germenilor (în special intraleucocitari) ghidează microbiologul spre germenul patogen.
În cazul otitelor interne la care produsul patologic a fost recoltat prin timpanocenteză culturile sunt,
de obicei, monobacteriene, iar identificarea germenilor în vederea obţinerii antibiogramei este mult
501
uşurată.
Criterii pentru efectuarea antibiogramei
Necesitatea izolării în cultura pură, urmată de identificarea la nivel de specie şi efectuarea
antibiogramei este impusă de creşterea, în ultima vreme, a numărului agenţilor microbieni producători
de betalactamază.
Tratamentul ghidat conform antibiogramei este un tratament ţintit şi în acelaşi timp are avantajul de a
nu determina rezistenţă la antibiotice.
Menţiune: În laboratorul Synevo Bucureşti este disponibil, pentru cazurile de urgenţă, un sistem
automat de identificare bacteriană şi de efectuare a antibiogramei, cu eliberarea rezultatului în 24 ore
de la izolarea germenului în cultură pură4.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Infections of the Eyes, Ears, and Sinuses. In
Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 12th ed. 2007; 56: 832-841.
conecte. În Tratat de Microbiologie Clinică. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Editura Medicală,
România, Ediţia a II-a. 2008; 12: 208-223.
3. J.Michael Miller, Harvey T.Holmes, Karen Krisher. General principles of Specimen Collection
and Handling. In Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H.
Jorgensen, Michael A.Pfaller, Robert H. Yolken, ASM PRESS, USA, 9th ed. 2007; 20: 291-333.
5. Lynne S. Garcia. Otitis Cultures. In Clinical Microbiology Procedures Handbook, American
Society for Microbiology, 2007; 3.11.5.
502
21
21.2 SFERA OFTALMOLOGICĂ
21.2.1 Cultură din secreţie oculară

Infecţiile oculare pot afecta diferitele structuri anatomice ale globului ocular, orbita şi organele accesorii
de protecţie (sprâncene, pleoape şi glande lacrimale). Ele interesează mai frecvent organele anexe
(pleoape şi conjunctivă) decât globul ocular propriu-zis. Conjunctiva vine în contact strâns cu corneea
şi de aceea se constată adesea o infecţie dublă: keratoconjunctivita4. Portajul nazal de Staphylococcus
aureus constituie un factor favorizant pentru apariţia conjunctivitei bacteriene.
Microbiota indigenă a pleoapelor o reflectă pe cea a tegumentului. Cele mai mari densităţi microbiene
sunt realizate în glandele pilosebacee şi în orificiile glandulare, dominanţi fiind stafilococii coagulazo-
negativi. Colonizarea glandelor pilosebacee este realizată şi de specii de Propionibacterium, precum şi
de organisme anaerobe. Bacilii difteromorfi fac parte şi ei din flora găsită în mod normal pe tegumentul
şi marginea liberă a pleoapelor.
Conjunctiva şi corneea prezintă o încărcătură microbiană redusă datorită spălării prin secreţia lacrimală
antrenată de mişcările palpebrale.
De pe conjunctiva normală se pot izola:
• în aproximativ 94% din cazuri: stafilococi coagulazo - negativi;
• ocazional: bacili difteromorfi, specii de Candida, Staphylococcus aureus, diverşi streptococi, neisserii
nepretenţioase nutritiv, specii de Haemophilus, enterobacteriaceae, pseudomonade, bacili antracoizi,
fungi oportunişti şi saprofiţi;
• rar se pot izola bacterii anaerobe, sporulate sau nesporulate, micobacterii saprofite sau condiţionat
patogene şi specii ale unor fungi oportunişti sau saprofiţi: Absidia, Cryptococcus etc2.
Etiologia infecţiilor oculare este în funcţie de structura anatomică afectată1:
blefarită • bacterii (ex. Staphylococcus aureus), • virusuri (ex. Herpes simplex - HSV),
• rar, paraziţi (ex. Phthirius pubis);
conjunctivită Nou-născuţi: (la trecerea fătului prin canalul vaginal)
• Neisseria gonorrhoeae,
• Chlamydia trachomatis
La copii şi adulţi:
• Haemophilus influenzae,
• S. pneumoniae,
• S. aureus,
• Moraxella spp.,
• Chlamydia trachomatis (la adulţi trachomul),
• Alţi germeni, care nu sunt izolaţi de rutină în laboratoarele de microbiologie:
Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Treponema pallidum etc.
• fungi, virusuri (adenovirusuri, enterovirusuri, Coxsackie - virus)
keratită • Pseudomonas aeruginosa • S. aureus • S. pneumoniae • HSV.
503
Infecţiile sistemice pot determina şi infectii oculare la organisme imunocompromise (ex. pacienţi cu
HIV) dintre care amintim pe cele produse de următorii agenţi patogeni: Citomegalovirus, Pneumocystis
carinii, Cryptococcus neoformans, Candida spp. etc1.
Metode de diagnostic
• culturi bacteriene;
• culturi virale;
• metode imunoenzimatice (antigen Chlamydia trachomatis);
• tehnica imunofluorescenţei (virus herpetic);
• tehnici de biologie moleculară pentru diagnosticarea keratoconjunctivitelor virale şi chlamydiene în
laboratoare de referinţă1.
În cadrul laboratoarelor Synevo secreţia oculară se examinează doar din punct de vedere
bacteriologic3.
Pentru investigarea microbiologică a infecţiilor oculare, probele trebuie să fie recoltate în cabinetul de
oftalmologie sau în sala de operaţie de către medicului oftalmolog2.
Recoltarea trebuie să se efectueze înainte de:
• toaleta feţei, care ar îndepărta secreţiile şi exsudatul conjunctival;
• terapia antimicrobiană, topică sau sistemică (se reduce şansa izolării agentului infecţios) sau
corticoterapia (modifică citologia);
• aplicarea soluţiei de fluoresceină (denaturează coloraţiile imunofluorescente);
• machiaj (face dificil examenul citobacterioscopic)2.
În cazuri obişnuite, la cabinetul oftalmologic, recoltarea se face aşezând pacientul pe scaun cu
capul pe spate. Cu policele stâng se coboară pleoapa inferioară, pentru a evidenţia fundul de sac
conjunctival, din care se recoltează material cu ajutorul a 2 tampoane fine. Dacă pleoapele sunt mult
tumefiate, se va recolta - cu tamponul sau cu ansa de platină - direct de la nivelul unghiului interior,
fără coborârea pleoapei. În cazuri de orjelet, prelevarea se face direct4.
Aspectul ochiului şi ale organelor anexe poate fi un indiciu pentru orientarea diagnosticului, de aceea
se notează următoarele aspecte:
• prezenţa sau absenţa exsudatului conjunctival;
• aspectul exsudatului: seros, sero-purulent, purulent, muco-purulent, fibrinos, seudomembranos;
• aspectul mucoasei: edem, congestie, hemoragie, reacţie foliculară, papilară, ulceraţii etc.
Recoltarea se face obligatoriu din ambii ochi, pe tampoane separate.
Transportul probelor şi însământarea trebuie făcute imediat, întrucât marea majoritate a germenilor
din leziunile conjunctivale au o viabilitate redusă în mediul extern. Pentru determinarea antigenului
Chlamydia recoltarea se va face pe recipiente speciale3;4.
Examenul microscopic se efectuează pe frotiuri colorate Gram (pentru evidenţierea germenilor)
şi Giemsa (pentru aprecierea reacţiei inflamatorii). În conjunctivita bacteriană predomină
polimorfonuclearele neutrofile, iar în infecţiile virale limfocitele şi monocitele.
Culturile bacteriene se efectuează pe agar Columbia cu 5% sânge de berbec şi agar chocolate (cu
incubare în atmosferă de 5% CO2, 24 de ore la 35-37°C)4. Coloniile suspecte se repică şi se identifică
504
21
conform procedurilor standard pentru fiecare familie de microorganisme. La solicitarea medicului, se

efectuează culturi pe mediul Sabouraud cu Cloramfenicol pentru izolarea fungilor3.
Interpretarea culturilor bacteriene trebuie să fie în concordanţă cu examenul microscopic. Întotdeauna
bacteriile izolate din cultură trebuie să se regăsească pe frotiu pentru a putea susţine implicarea
acestora în patologie. Dacă germenele este situat intraleucocitar, cu siguranţă microorganismul izolat
este cel patogen. Se va trece la identificarea lui până la nivel de specie şi se va efectua antibiograma.
Aceasta se va realiza pe mediul Mueller-Hinton, Mueller-Hinton cu 5% sânge de berbec sau mediul
HTM (Haemophilus Test Medium) în funcţie de tipul germenului izolat. Discurile impregnate cu
antibiotic sunt de asemenea alese în funcţie de germenele izolat.
În buletinul de rezultate nu sunt comunicaţi germeni saprofiţi ca Staphylococcus epidermidis şi
Corynebactecterium spp.
automat de identificare bacteriană şi efectuare a antibiogramei, cu eliberarea rezultatului în 24 ore de
la izolarea germenului în cultură pură3.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Infections of the Eyes, Ears and Sinuses. In
Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002, 917-923.
2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor oculare. În Tratat de Microbiologie Clinica.
Dumitru Buiuc, Marian Neguţ, Ed. Medicală, România,1 ed. 1999, 319-337.
4. Ministerul Sănătăţii AdSM. Metode de laborator de uz curent. Editura Medicală, România, vol II
ed. 1997, 90-92.
505
21.3 TRACT RESPIRATOR INFERIOR
21.3.1 Examenul bacteriologic al sputei
Infecţiile tractului respirator inferior sunt determinate de virusuri, bacterii şi mai rar de fungi sau
protozoare. Majoritatea acestor infecţii apar pe cale aerogenă şi numai o proporţie redusă din cele
bacteriene sunt hematogene - metastaze septice pulmonare în cursul septicopioemiilor2.
Apariţia unei infecţii depinde atât de abilitatea microorganismului implicat de a produce boala, cât şi
de capacitatea gazdei de a preveni infecţia.
Mecanismele nespecifice care protejează tractul respirator sunt: perii nazali din pasajele convolute,
mucoasa care căptuşeşte narinele (prin secreţia de IgA), cilii şi mucoasa care căptuşeşte traheea,
reflexele de tuse şi strănut1;6.
În afara de acestea, flora normală a rinofaringelui ajută la prevenirea colonizării acestei regiuni cu
alţi germeni. Microorganisme saprofite, nepatogene pot determina suprainfecţii bacteriene după
viroze, în cazul persoanelor imunodeprimate sau în caz de lezări ale epiteliului respirator (la fumători).
Aspirarea, chiar şi a unei mici cantităţi de material orofaringian la nivel bronşic (zonă practic sterilă),
de cele mai multe ori în timpul somnului, joacă un rol important în patogenia pneumoniei1.
Sputa reprezintă secreţiile traheobronşice expectorate în cursul unui acces de tuse şi conţine prin
contaminare secundară şi secreţiile din cavitatea bucofaringiană şi nazală2;3.
Acumularea de secreţii bronşice şi expectoraţia nu sunt apanajul exclusiv al infecţiilor bronhopulmonare,
fiind întâlnite şi în alte circumstanţe patologice: afecţiuni alergice ale căilor respiratorii, bronşite
cronice.
În boli precum: traheobronşite, pneumonii, bronhopneumonii, examenul sputei reprezintă o metodă
importantă de diagnostic etiologic2;5.
Prelevarea sputei se face din expectoraţia de dimineaţă, când pacientul îşi face de obicei “toaleta
bronhiilor”. În prealabil bolnavul va efectua o gargară cu ser fiziologic steril7 sau cu apă fiartă şi răcită
dacă recoltarea se face la domiciliu. Pacientul trebuie instruit asupra obţinerii sputei propriu-zise şi nu
a salivei sau a secreţiilor nazale2-4.
Pacienţii care nu pot expectora trebuie asistaţi de cadre medicale (prin folosirea de aerosoli care
induc sputa sau poziţii drenante).
Produsul este prelevat într-un recipient steril, cu gât larg, prevăzut cu capac. În infecţiile acute este
suficient să se recolteze un volum de 1-2 ml secreţie purulentă.
Specimenul este transportat la laborator imediat pentru a fi examinat în interval de cel mult o oră
de la prelevare. Nu există modalităţi optime de conservare a probelor. Refrigerarea la 4ºC previne
multiplicarea contaminanţilor, conservă unii patogeni, dar scade până la anulare izolarea altora, de
exemplu, Haemophilus influenzae.
La tuşitorii cronici, pentru diagnosticul infecţiilor fungice bronhopulmonare, cantitatea de spută eliminată
trebuie să fie mai mare: de exemplu, toată sputa de la expectoraţia matinală sau cea expectorată în
506
21
interval de 1-2 ore. La laborator nu se primesc probe colectate în 24 de ore pentru că multiplicarea
microorganismelor saprofite determină rezultate false.
Prelevatele care şuntează contaminarea oro-faringiană sunt preferate de microbiolog, dar metodele
invazive folosite: aspiraţia traheală, bronhoscopia cu aspiraţie, aspiraţia pulmonară transtoracică etc,
fac ca numărul acestora să fie redus.
Produsul patologic primit la laborator este atent examinat macroscopic, deoarece aspectul acestuia
este particular în anumite afecţiuni:
• spută mucoasă, aerată - în bronşite acute şi astm bronsic;
• spută mucopurulentă - în traheobronşite cronice, bronhopneumonii;
• spută purulentă - în abcese pulmonare, bronşiectazii;
• spută sanghinolentă - în TBC şi neoplasme.
Pentru examenul bacteriologic propriu-zis, se pregătesc 3 băi cu aproximativ 20 ml ser fiziologic steril
în cutii Petri. Se prelevează din probă fragmente mucopurulente şi se spală succesiv în cele 3 băi2.
Manipularea se face cu o ansă cu fir gros.
De pe un fragment mucopurulent din ultima baie de spălare, se absoarbe excesul de lichid pe un
dreptunghi de hârtie de filtru şi se fac 3 frotiuri care se colorează:
• Giemsa pentru urmărirea reacţiei inflamatorii (PMN);
• Gram pentru urmărirea bacteriilor;
• Ziehl-Neelsen pentru urmărirea bacililor acido-alcoolo- rezistenţi4.
Examenul microscopic stabileşte calitatea produsului patologic hotărând astfel care vor fi probele
supuse însămânţării pe medii de cultură. Pentru acest lucru se examinează frotiul colorat Gram
cu obiectivul de 10x. Raportul celule inflamatorii/celule malpighiene mai mic de 5 indică o probă
nesatisfăcătoare (nepurulentă, având contaminare oro-faringiană masivă)2;3.
Probele găsite corespunzatoare vor fi examinate în continuare cu imersie.
Comunicarea asocierii semnificative a unei bacterii cu celulele inflamatorii din spută orientează rapid
tratamentul antimicrobian al pacienţilor pneumonici. Se iau în considerare numai germenii prezenţi
între filamentele de fibrină şi cei intraleucocitari; se va acorda puţină importanţă germenilor care
“burează” celulele poligonale mari, originare din epiteliul bucal.
În cazul bacterioscopiei prelevatelor necontaminate, pe frotiurile din exsudat pleural, probe biopsice,
prezenţa bacteriilor este semnificativă în orice cantitate3.
Frotiul colorat Giemsa oferă detalii asupra citologiei sputei, celulele expectorate fiind împărţite în
celule inflamatorii (PMN, limfocite, macrofage, eozinofile) şi celule de exfoliere a epiteliului respirator
(celule cilindrice ciliate, celule metaplazice).
Suspiciunea unei anumite etiologii trebuie comunicată laboratorului de către medicul curant deoarece
orientează microbiologul asupra alegerii mediilor de cultură3;4.
Cei mai frecvenţi agenţi etiologici ai infecţiilor tractului respirator inferior se izolează folosind
următoarele medii de cultură:
- agar Columbia cu 5% sânge de berbec – pentru germeni hemolitici;
- agar chocolate – pentru genurile Haemophilus şi Neisseria;
- agar Mac Conkey – pentru bacili Gram negativi.
507
La solicitarea medicului, se efectuează culturi pe mediul Sabouraud cu Cloramfenicol pentru izolarea

fungilor5.
Însămânţarea porţiunilor purulente spălate se face cu dispersie pentru a permite aprecierea
semicantitativă a creşterii. Plăcile se incubează în exicator cu lumânare (mai puţin agarul Mac
Conkey), la 37º C până a doua zi când se examinează.
Interpretarea culturilor - este considerat agent patogen bacteria izolată predominant şi în cantitate
mare (++ sau +++), care aparţine aceleiaşi categorii microscopice cu bacteria asociată semnificativ
celulelor inflamatorii pe frotiul Gram din spută2. Rolul etiologic al unor condiţionat patogeni izolaţi în
cantităţi reduse(+) şi pentru care frotiul Gram nu a demonstrat o asociere semnificativă cu celulele
inflamatorii este discutabil.
Coloniile implicate în procesul infecţios sunt identificate la nivel de specie şi este efectuată
antibiograma (tratamentul corect şi ţintit este cel conform antibiogramei).
În tabelul de mai jos, este prezentată clasificarea celor mai frecvenţi germeni implicaţi în pneumonii,
în funcţie de vârsta pacienţilor:1
Vârsta Agenţi etiologici

< 60 ani • Streptococcus pneumoniae • Mycoplasma pneumoniae • Virusuri respiratorii
• Chlamydia pneumoniae • Haemophilus influenzae
> 60 ani • Streptococcus pneumoniae • Virusuri respiratorii • Haemophilus influenzae
• Bacili Gram negativi • Staphylococcus aureus
Există numeroşi agenţi bacterieni care pot cauza pneumonii şi nu sunt detectaţi de rutină în culturile
bacteriologice: genul Mycobacterium, Chlamydia, Nocardia, Bordetella, Legionella şi Mycoplasma
pneumoniae, ele necesitând proceduri speciale pentru detecţie1.
În laboratoarele Synevo nu se fac determinări virusologice şi culturi pentru BK din spută5.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Infections of the Lower Respiratory Tract. In
Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002; 56: 884-898.
2. Dumitru Buiuc. Examenul microbiologic al sputei în diagnosticul infecţiilor tractusului respirator
inferior. În Microbiologia Practică - Un ghid în studiul şi practica medicinii, ed. 1982; 26: 239-245.
3. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator inferior. În Tratat de
Microbiologie Clinică. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Editura Medicală, România, 1 ed. 1999; 13:
233-270.
4. Kimberle C.Chapin, Patrick R.Murray. Principles of Stains and Media. In Manual of Clinical
Microbiology. Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H. Jorgensen, Michael A.Pfaller, Robert
H. Yolken, ASM PRESS, USA, 8 ed. 2003; 18: 257-261.
5. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog
6. Olga-Mihaela Dorobăţ. Flora microbiană normală a corpului uman. În Bacteriologie Medicală.
508
21
Universitatea “Titu Maiorescu”, Romania ed. 1997; 33: 323-330.

7. Richard B.Thomson JR., J.Michael Miller. Specimen Collection, Transport, and Processing:
Bacteriology. In Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H.
Jorgensen, Michael A.Pfaller, Robert H. Yolken, ASM PRESS, USA, 8 ed. 2003; 20: 286-330.
509
21.4 TRACT GASTROINTESTINAL
21.4.1 Amprenta anală

Amprenta anală este cea mai eficientă metodă de depistare a ouălor de Enterobius vermicularis.
Paraziţii adulţi colonizează temporar intestinul subţire, iar după fecundare femelele migrează în
colon (mai ales în zona cecului). Când toate ouăle ajung la aproximativ acelaşi stadiu de dezvoltare,
femelele migrează şi le depun în pliurile anale, în timpul nopţii. Pruritul puternic este datorat prezenţei
femelei în pliurile anale, ceea ce determină ca gazda să se scarpine involuntar, astfel încât ouăle
ajung pe lenjeria şi pe degetele persoanei în cauză. Aceste caracteristici ale ciclului biologic al
Enterobius vermicularis duc la concluzia că o metodă coproparazitologică clasică (examen direct, în
strat gros, etc.) este inutilă, deoarece ouăle localizate în pliurile anale sunt evidenţiate cel mai eficient
prin metoda amprentei anale.
Avantajul metodei constă în faptul că poate detecta la un prim examen peste 50% din cazuri, faţă de
un examen coproparazitologic obişnuit care poate detecta doar 10 - 15% din cazuri.
Pentru a exclude un diagnostic de enterobioză sunt necesare 7 examene efectuate la interval de 2
zile.
În cazul obţinerii unui rezultat pozitiv, se recomandă să fie investigaţi şi ceilalţi membrii ai familiei (mai
ales copiii)1;3.
Pregătire pacient - recoltarea se face dimineaţa, înainte de efectuarea toaletei perineale sau a
defecării3.
Tehnica de recoltare
Materiale necesare:
- bandă adezivă transparentă sau celofan
- baghete de sticlă
- eprubete de sticlă
- lame de microscopie
Pregătirea materialului
- unul din capetele baghetei de sticlă se acoperă pe o distanţă de 1-2 cm cu bandă adezivă sau
celofan; în acest din urmă caz, celofanul se prinde cu un inel de cauciuc;
- bagheta astfel preparată se introduce într-o eprubetă de sticlă, fiind imobilizată cu un dop de vată.
Modul de lucru
- se scoate bagheta cu celofan din eprubetă;
- se apropie de zona perianală a pacientului, introducând capătul baghetei 1-3 mm în anus;
- se roteste uşor bagheta astfel încât eventualele ouă din pliurile mucoasei anale să fie desprinse şi
să adere de pelicula de celofan;
- se desprinde pelicula de celofan de pe bagheta şi se depune pe o lamă de microscopie curată, fără
510
21
zgârieturi, asigurându-se că pelicula este bine întinsă, evitand formarea bulelor de aer1-4.
Metodă - examen microscopic direct2.
Un rezultat pozitiv nu exclude prezenţa altor patogeni.
Un rezultat negativ nu exclude în general infecţia; acesta se poate datora unei excreţii intermitente a
parazitului1.
Bibliografie
1. Dan Steriu. Infecţii produse de helminţi. În Infecţii parazitare, Editura Ilex, Bucureşti, 2003, 247-
250.
3. Simona Radulescu, Meyer Ernest. Nematode intestinale. În Parazitologie medicală, Editura All,
Bucureşti, 1992, 230, 283.
4. World Health Organisation Geneva Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology, 1991.
21.4.2 Antigen Giardia
Giardia lamblia - un protozoar flagelat - este agentul etiologic al giardiozei. Parazitul prezintă două
forme: vegetativă şi chistică şi se localizează în intestinul subţire, mai ales la nivelul duodenului. Forma
chistică reprezintă forma de înmulţire, de rezistenţă a parazitului în mediul extern, şi în acelaşi timp
stadiul infectant. Pe măsură ce fluxul intestinal poartă formele vegetative (rezultate din dechistarea
chisturilor ingerate) către porţiunile terminale ale intestinului, începe procesul de închistare. Chisturile
sunt eliminate odată cu materiile fecale şi sunt foarte rezistente în condiţii de temperatură şi umiditate
scăzute, precum şi în apa clorinată. Infecţia se realizează pe cale digestivă prin intermediul mâinilor
murdare, a alimentelor şi apei contaminate1;4.
Metoda imunoenzimatică de detectare a antigenului Giardia în fecale prezintă avantajul de a detecta
şi chisturile distruse, spre deosebire de examenul microscopic, care poate detecta numai chisturile
intacte 2;3.
Pregătire pacient
Pacientul va evita:
- înainte de recoltare: examenul radiologic gastrointestinal baritat, administrarea de laxative;
- în săptămâna premergatoare recoltării, administrarea anumitor medicamente : bismut, Metamucil,
uleiuri minerale, Tetraciclină, antiamoebiene, antidiareice, antiacide2;5.
Specimen recoltat - materii fecale din orice moment al zilei; se recoltează câte o porţiune de mărimea
unei alune, din 3 locuri diferite ale bolului fecal 2. Cantitatea optimă de materii fecale este de aproximativ
511
2 g din scaun format sau aproximativ 2 ml din scaun lichid3.

Cauze de respingere a probei
- specimen obţinut cu uleiuri minerale, bismut, compuşi de magneziu;
- recipient murdar pe exterior;
- specimen contaminat cu urina2;5.
Recipient de recoltare - recipient de unică folosinţă pentru fecale bine închis cu capac; este interzisă
adăugarea de substanţe conservante2;5.
Stabilitate probă - câteva ore la temperatura camerei sau la frigider până a doua zi4.
Prelucrare necesară după recoltare - conform instrucţiunilor specifice de lucru. Analiza se execută
din materii fecale proaspăt emise (de preferat). Dacă acest lucru nu este posibil proba va fi păstrată
la 2-8°C2;5.
Metodă - imunoenzimatică (ELISA)2 .
Valori de referinţa - Antigen Giardia în fecale negativ2.
Rezultatele testului trebuie interpretate în context clinic.
Nu există o relaţie între valoarea absorbanţei probei la testul ELISA şi relevanţa clinică.
Un rezultat pozitiv nu exclude prezenţa altor patogeni.
Un rezultat negativ nu exclude în general infecţia; acesta se poate datora unei excreţii intermitente a
parazitului.
Un rezultat echivoc se poate datora unei diseminări inegale a parazitului în probă; în acest caz trebuie
investigatã a doua suspensie din aceeaşi probă de scaun sau dintr-o nouă probă1-3.
Bibliografie
1. Dan Steriu. Infecţii produse de protozoare. În Infecţii parazitare, Editura Ilex Bucuresti, 2003, 32-
33.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Giardia lamblia,
Direct Detection by EIA. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication
4. Simona Radulescu, Meyer Ernest. Protozoare parazite. În Parazitologie medicală, Editura All,
1992, 52-60, 297.
5. World Health Organisation Geneva. Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology, 1991.
512
21
21.4.3 Antigen Helicobacter pylori în materii fecale

Infecţia cu Helicobacter pylori este o cauză majoră de gastrită cronică şi ulcer peptic; de asemenea,
studiile epidemiologice efectuate în ultimii ani au confirmat asocierea infecţiei persistente cu un risc
crescut de apariţie a cancerului gastric.
În plus, această bacterie este responsabilă pentru majoritatea cazurilor de limfoame de tip MALT
(forme de neoplazii hematologice, caracterizate prin proliferarea celulelor din ţesutul limfoid asociat
mucoasei digestive)2.
Principalul rezervor de infecţie sunt indivizii H. pylori pozitivi, iar contactul interuman, intrafamilial
reprezintă cea mai importantă cale de transmitere, în principal în prima copilărie.
În ţările în curs de dezvoltare pot interveni şi alte căi de transmitere, de exemplu prin intermediul
apei1;2.
Infecţia evoluează în multe cazuri asimptomatic. Atunci când se însoţeşte de manifestări clinice,
pacienţii prezintă în mod obişnuit o simptomatologie de tip dispeptic cu: disconfort abdominal, dureri
abdominale, greaţă, arsuri, regurgitaţii, senzaţie de plenitudine după mese1;3.
Există două categorii de metode diagnostice ale infecţiei:
1. invazive: prin endoscopie digestivă superioară sunt prelevate mici porţiuni de la nivelul mucoasei
stomacului sau duodenului (biopsie). Detecţia microorganismului în materialul bioptic se poate face
prin examen microscopic, cultură sau prin testul ureazei (prezenţa acestei enzime este un indicator
al infecţiei cu H. pylori);
2. non-invazive: testul respirator cu uree şi depistarea antigenului H.pylori în materiile fecale.
Metodele invazive produc un disconfort semnificativ pacienţilor, de aceea mulţi dintre aceştia refuză
endoscopia, mai ales cea de control, la 4 săptămâni după încheierea tratamentului.
Forurile internaţionale recomandă folosirea mijloacelor neinvazive de diagnostic, ca alternativă la
metodele invazive, la pacienţii sub 45 ani, fără simptome de “alarmă” care să impună endoscopia
(pierdere ponderală nejustificată, sângerări digestive, vărsături repetate, etc). Testul respirator cu uree
are un cost ridicat şi este rareori disponibil3.
În laboratorul Synevo, printr-o tehnica imunocromatografică se detectează antigenul H. pylori eliminat
în materiile fecale. Testul are o acurateţe de peste 90% atât pentru diagnostic, cât şi pentru confirmarea
eradicării infecţiei după tatament (pentru populaţia adultă şi pediatrică deopotrivă) şi prezintă avantajul
unui cost mai redus, în comparaţie cu celelalte metode.
Metoda imunocromatografică este capabilă să deceleze o concentraţie minimă de 25 ng/mL. Sistemul
este specific pentru Helicobacter pylori şi nu reacţionează încrucişat cu genul Campylobacter care
prezintă cea mai relevantă asemănare genomică cu Helicobacter pylori4;5.
Pregătire pacient - testul nu necesită o pregatire prealabilă. Este bine ca pacientul să nu se afle
sub tratament antibiotic care ar putea interfera cu determinarea H. pylori. Se recomandă evitarea
contactului cu urina sau apa.
Specimen recoltat - materii fecale proaspăt emise; se recoltează câte o porţiune de mărimea unei
513
alune, din 3 locuri diferite ale bolului fecal4. Cantitate recomandată – 1-2 g de materii fecale formate
sau 1-2 ml de materii fecale lichide5.
Recipient de recoltare - recipient de unică folosinţă pentru fecale; este interzisă adăugarea de
substanţe conservante4.
Prelucrare necesară după recoltare - analiza se execută pe materii fecale proaspăt emise (de
preferat). Dacă acest lucru nu este posibil proba va fi păstrată la 2-8°C sau la –20°C4.
Stabilitate probă - după recoltare, proba trebuie păstrată la frigider şi transportată la laborator în
maximum 24 de ore de la colectare. Daca se depăşeşte această perioadă, proba trebuie congelată
la – 20°C4.
Metodă - imunocromatografică4.
Valori de referinţă - Antigen Helicobacter pylori negativ4.
Bibliografie
1. Angela Sopa, Camelia Diaconu, Alice Balaceanu. Consideraţii asupra rolului cu Helicobacter
pylori în patologia digestivă. În Medicina Modernă [11] 2005. Ref Type: Journal (Full)
2. Bernhard Lembcke. Helicobacter pylori infection. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and
Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH,
Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998 436-438.
3. Consensul de la Maastricht. Managementul infecţiei cu Helicobacter pylori în practica medicului
generalist 2-2002. În Stetoscop 18. 2003. Ref Type: Journal (Full).
5. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Helicobacter
pylori stool antigen. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication
21.4.4 Antigen Rotavirus şi Adenovirus în materiile fecale
Diareile acute la sugarul şi copilul mic sunt în marea majoritate a cazurilor de etiologie infecţioasă,
fiind determinate în ordinea frecvenţei de virusuri, bacterii şi, mult mai rar, de protozoare patogene2.
Rotavirusurile reprezintă o cauză frecventă de gastroenterită la pacienţii pediatrici4. Climatul de iarnă
favorizează infecţia cu rotavirusuri, care determină până la 85% din cazurile de diaree la copiii sub
vârsta de 3 ani. În sezonul cald, frecvenţa îmbolnăvirilor cu rotavirus scade la 40%2.
Boala este puternic contagioasă şi se poate asocia cu simptome respiratorii. Scaunele sunt lichide sau
gleroase, cu mucus şi sânge, precedate frecvent de vărsături şi febră. Afecţiunea este autolimitantă
(5-8 zile), dar poate avea o evoluţie severă la pacienţii imunodeprimaţi. În 5-10% din cazuri se poate
514
21
instala o intoleranţă secundară la lactoză4;5.

Calea fecal-orală şi rolul “mâinii murdare” sunt principalele modalităţi de transmitere a infecţiei. Există
o susceptibilitate particulară dependentă de vârstă, în sensul că numărul receptorilor pentru rotavirus,
situaţi pe enterocit, scade odată cu înaintarea în vârstă, ceea ce evoluează paralel cu scăderea
susceptibilităţii la această infecţie. Sunt posibile epidemii în colectivităţile aglomerate de sugari şi copii
de vârstă mică2.
La adulţi infecţiile cu rotavirus sunt de obicei asimptomatice, cu excepţia pacienţilor care au primit
transplant de măduvă osoasă şi a persoanelor vârstnice instituţionalizate care pot prezenta o evoluţie
severă7.
La debut şi în faza acută a bolii particulele de rotavirus sunt excretate în cantităţi mari în materiile
fecale (108 particule virale/g scaun)3 astfel că este posibilă detectarea antigenului cu ajutorul unor
teste ce utilizează anticorpi specifici legaţi de o fază solidă. Rata rezultatelor pozitive obţinute poate
varia în funcţie de vârstă, anotimp, localizare geografică, categoria de pacienţi investigată7.
Adenovirusurile umane (51 serotipuri identificate până în prezent) pot determina o varietate mare de
afecţiuni, ce includ infecţii respiratorii, oculare şi gastrointestinale. Această varietate se explică prin
existenţa numeroaselor serotipuri şi prin tropismul tisular diferit al adenovirusurilor. Adenovirusurile
enterice (tipurile 40-41) constituie un agent patogen important al gastroenteritei copilului, fiind
implicate în unele epidemii sporadice de diaree survenite în comunităţile de copii dar şi în spitale1;6.
Transmiterea infecţiei în aceste situaţii se face pe cale fecal-orală.
Diareea acută infantilă se manifestă clinic prin scaune apoase, însoţite de febră şi vărsături, cu o
durată medie de 8-12 zile. Aproximativ 2-5% din cazurile de boală diareică acută la copii mici sunt
cauzate de adenovirusurile 40 şi 41.
Au fost raportate uneori şi alte serotipuri de adenovirus în diareea infantilă, cum ar fi 2, 3, 8 şi 311.
Detecţia directă a antigenului Adenovirus în scaun în faza acută a bolii diareice cu ajutorul anticorpilor
specifici legaţi de faza solidă constituie o metodă de diagnostic rapid1;3.
Recomandări pentru efectuarea antigenului Rotavirus şi Adenovirus - suspiciune clinică de
gastroenterită virală4.
Specimen recoltat - materii fecale proaspete, emise spontan3.
Recipient de recoltare - recipient steril cu capac pentru fecale, fără mediu de transport3.
Volumul probă - 2 mL de materii fecale lichide sau aproximativ 1 g de materii fecale semiformate3.
Stabilitatea probei - proba de materii fecale este stabilă 72 ore la 2-8°C3.
Antigen Rotavirus în materii fecale negativ.
Antigen Adenovirus în materii fecale negativ3.
Un rezultat negativ nu exclude infecţia. Rezultate fals-negativ pot să apară în următoarele situaţii:
- recoltare şi/sau transport inadecvat al probei (contaminare cu detergenţi sau folosirea de
conservanţi);
- nivel redus al particulelor virale, sub limita de detecţie a metodei6.
515
Pacienţii trebuie investigaţi în paralel şi pentru o posibilă etiologie bacteriană a sindromului diareic,
prin efectuarea coproculturii3.
Bibliografie
1. Elizabeth G. Rhee, Dan H. Barouch. Adenoviruses. In Mandell, Douglas, and Bennett’s

Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, Churchill Livingstone, Elsevier,
2010, 2027-2031.
2. I. Gherghina, D.Matei, M.Aloman, M.Iusan, E.Ionita. Actualităţi în diareea acuta la sugar si
copilul mic. În Medicina Modernă, dec. 2005.
4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Rotavirus,
Direct Detection Immunoassay. www.labcorp.com . 2010. Ref Type: Internet Communication
5. Maria Condor, Doina Luca. Diareea acuta la copil. În Medicina Familiei, nr.18-19, 1997.
6. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Adenovirus Antigen, EIA
Stool. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
7. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Rotavirus Antigen, Feces.
21.4.5 Clostridium difficile - toxine A/B

Clostridium difficile – un bacil Gram pozitiv anaerob sporulat - este responsabil de producerea colitei
pseudomembranoase şi a diareei induse de antibiotice.
Deşi toxinele C. difficile au fost evidenţiate mai demult de către cercetători, de abia în 1970 a fost
confirmat rolul deţinut de acestea în dezvoltarea colitei pseudomembranoase1.
C. difficile produce cel puţin 2 toxine denumite A şi B. Toxina A, o enterotoxină, determină creşterea
secreţiei de fluide şi inflamaţie la nivelul mucoasei intestinale. Toxina B care prezintă in vitro o acţiune
citotoxică de aproximativ 1000 ori mai puternică decât toxina A acţionează sinergic cu aceasta. În
timp ce toxina A este produsă de aproape toate tulpinile de C. difficile implicate în apariţia bolii, s-a
demonstrat recent că unele tulpini secretă numai toxina B4.
Colita indusă de C.difficile rezultă ca urmare a unui dezechilibru a florei bacteriene a colonului,
colonizării cu C.difficile şi producerii de toxine. Tratamentul antibiotic este responsabil de alterarea
florei iar ţinta principală a infecţiei o reprezintă persoanele spitalizate. Colonizarea se produce pe
cale fecal-orală. De asemenea, C. difficile formează spori termorezistenţi care pot persista în mediul
înconjurător de la câteva luni până la câţiva ani. Atunci când contaminarea este prevalentă se pot
516
21
produce epidemii de diaree în spitale şi alte unităţi de îngrijire. Flora intestinală normală se opune
colonizării, însă tratamentul antibiotic, prin suprimarea florei, facilitează proliferarea C.difficile1.
Boala a fost descrisă iniţial la pacienţii care au primit tratament cu clindamicină, însă la ora actuală se
consideră că orice antibiotic poate genera colită pseudomembranoasă. În studii care au cuprins un
număr mare de pacienţi, mai mult de 70% din cazuri au fost asociate cu administrarea de cefalosporine
(în special de generaţia a doua şi a treia)3. Urmează în ordinea frecvenţei ampicilina şi amoxicilina. Mai
puţin implicate sunt macrolidele şi celelalte peniciline. Aminoglicozidele, flurochinolonele, trimetoprim-
cotrimoxazol, imipenem şi meropenem pot genera ocazional boala. Chiar şi o scurtă administrare
a unui antibiotic poate genera colita. Riscul este mai mare în cazul tratamentelor prelungite şi a
asocierilor de antibiotice1.
Persoanele vârstnice şi pacienţii imunodeprimaţi reprezintă categoriile cele mai susceptibile de a
dezvolta colită indusă de C. difficile. Deşi copiii mici sunt adesea purtători de tulpini de Clostridium
difficile secretante de toxine, infecţia clinic manifestă la această grupă de vârstă este neobişnuită.
Colonizarea cu C. difficile generează un spectru larg de condiţii clinice, de la o stare de purtător
asimptomatic, diaree uşoară autolimitantă până la colită pseudomembranoasă şi colită fulminantă.
Complicaţiile cele mai grave sunt reprezentate de megacolonul toxic, perforaţia de colon şi peritonita.
Majoritatea pacienţilor dezvoltă diaree în cursul sau imediat după iniţierea tratamentului antibiotic.
Totuşi, 25-40% din pacienţi nu devin simptomatici mai devreme de 10 săptămâni de la încheierea
antibioticoterapiei. Au fost descrise şi unele cazuri de boală apărută spontan, la pacienţi fără tratament
antibiotic în antecedente1;3;4.
Cel mai frecvent, tabloul clinic include:
- diaree uşoară sau moderată, rar sanguinolentă;
- dureri abdominale colicative;
- anorexie;
- febră.
Diagnosticul de colită indusă de C. difficile trebuie suspectat la orice pacient cu diaree care a primit
tratament antibiotic în ultimele 2 luni şi/sau diareea a debutat după 72 ore (sau mai mult) de la
spitalizare.
Detecţia toxinelor produse de C. difficile este importantă pentru stabilirea unei terapii adecvate. Dacă
manifestările clinice nu se remit la întreruperea tratamentului antibiotic incriminat, se recomandă
administrarea per os de vancomicina, metronidazol sau bacitracină.
Cultura de rutină a bacteriei nu este recomandată datorită izolării frecvente de tulpini care nu sunt
secretoare de toxine3.
Testul efectuat în laboratorul nostru detectează toxina A şi/sau B în materii fecale printr-o tehnică
imunocromatografică2.
Specimen recoltat - materii fecale proaspăt emise; cantitatea recomandată este 1-2 g de materii
fecale formate sau 1-2 ml de materii fecale lichide; nu sunt acceptate probe recoltate pe tampon
rectal3.
Recipient de recoltare - recipient de unică folosinţă pentru fecale; este interzisă adăugarea de
substanţe conservante2.
517
Prelucrare necesară după recoltare - analiza se efectuează pe materii fecale proaspăt emise în
maxim 3 ore de la recoltare (de preferat). Dacă acest lucru nu este posibil proba va fi păstrată la 2-8°C
maximum 3 zile. În vederea procesării, o anumită cantitate din proba omogenizată este tratată cu un
diluent special pentru solubilizarea toxinelor şi centrifugată pentru separarea supernatantului2.
Stabilitate probă - după recoltare, proba trebuie transportată cât mai repede la laborator; proba este
stabilă 3 zile la 2-8°2.
Metodă – imunocromatografică. O cantitate din proba diluată se amestecă cu soluţia conjugat 1
(conţine anticorpi monoclonali specifici faţă de Clostridium difficile toxina A şi toxina B conjugaţi cu
microparticule colorate) cât şi cu soluţia conjugat 2 (conţine anticorpi specifici anti-toxina A şi anti-toxina
B biotinilaţi). Un anumit volum din acest amestec este transferat într-o fereastră dedicată a casetei
testului; caseta conţine streptavidină imobilizată în banda testului şi anticorpi anti-imunoglobulină de
capră în banda controlului. Anticorpii specifici se vor lega de antigenul din probă şi forma complexe
antigen-anticorp de tip “sandwich”. Complexele migrează prin capilaritate, ajung în zona care conţine
banda testului, se leagă de streptavidina prezentă la nivelul fazei solide şi pot fi vizualizate sub forma
unei benzi colorate în negru, de orice intensitate, în fereastra rezultatelor. În absenţa toxinei A şi/sau
B din probă nu se va vizualiza nici o bandă. Testul este validat numai dacă se obţine o bandă colorată
în negru, de orice intensitate, în fereastra controlului2.
Clostridium difficile toxina A/B – Negativ.
Rezultatele sunt exprimate calitativ: pozitiv/negativ2.
Un rezultat negativ nu exclude prezenţa unei afecţiuni asociate cu C. difficile. Un rezultat fals-negativ
poate avea următoarele cauze:
- recoltare, transport sau păstrare improprie a probei;
- niveluri scăzute de toxine A/B, sub limita de detecţie a metodei;
- degradarea toxinelor2;4.
Bibliografie
1. Craig A Gronczewski, MD, Jonathan P Katz, MD. Clostridium Difficile Colitis. eMedicine
Gastroenterology (update August 2006). Ref Type: Internet Communication.
3. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Clostridium
Difficile Toxins A and B, EIA. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
4. www.mayomedicallaboratories.com. Test Catalog. Clostridium Difficile Toxins A and B, Feces. Ref
518
21
21.4.6 Coprocitogramă
Coprocitograma este o tehnică uzuală, care stabileşte un diagnostic prezumtiv în diareea infecţioasă,
ca urmare a examenului microscopic al materiilor fecale2.
Este indicată ca o procedură preliminară în stabilirea etiologiei unui sindrom diareic acut, având în
vedere faptul că rezultatul unei coproculturi standard se obţine după cel puţin 72 ore1;2.
Coprocitograma indică de obicei prezenţa eritrocitelor şi a leucocitelor în număr mare. Testul are
semnificaţie dacă există un număr de polimorfonucleare (PMN) mai mare de 10/hpf (câmp microscopic
cu putere mare - obiectiv 40x). Cel mai frecvent implicaţi sunt germenii din grupul Shigella, Salmonella,
Campylobacter, Escherichia coli enteroinvaziv şi enterohemoragic2. Cu cât este mai mare numărul de
leucocite prezente în materii fecale, cu atât mai mare este probabilitatea existenţei unui agent patogen
invaziv1.
Bacteriile cu acţiune enterotoxigenă si virusurile determină scaune diareice apoase, cu puţine
elemente celulare şi coprocitograma nu arată prezenţa unei reacţii inflamatorii2.
Recomandări pentru efectuarea coprocitogramei - diagnosticul diferenţial al sindroamelor diareice
acute3.
Specimen recoltat - materii fecale prospete emise spontan3.
Recipient de recoltare - recipient cu capac pentru fecale, fără mediu de transport3.
Volumul probei – aproximativ 1 g3.
Transportul probei - se aduce proba la laborator imediat dupa recoltare, la temperatura camerei3.
Metodă - examen microscopic al frotiului efectuat din materii fecale şi colorat cu albastru de
metilen3;4.
Condiţii asociate cu un număr crescut de leucocite (>10 PMN/hpf), eritrocite şi mucus în scaun sunt:
colita difuză indusă de administrarea de antibiotice, colita ulceroasă, shigeloza, salmoneloza, infecţiile
cu Yersinia, Campylobacter, E. coli enteroinvaziv şi enterohemoragic1;3.
Condiţii asociate cu un număr modest de leucocite în scaun includ: shigeloza la debut ce afectează
intestinul subţire, colita indusă de antibioticoterapie şi amoebiază3.
Condiţii asociate cu absenţa leucocitelor în scaun sunt următoarele: infecţiile virale, holera, infecţiile
cu bacterii enterotoxigene (Staphylococcus, Clostridium), giardioza1;3.
Salmonella typhi poate induce un răspuns monocitar3.
Leucocitele pot fi absente în scaun într-un procent de 10-15% din cazurile de infecţie cu bacterii
enteroinvazive.
Pe de altă parte, prezenţa leucocitelor în fecale este asociată şi cu afecţiuni non-infecţioase (ex. boli
inflamatorii idiopatice ale intestinului subţire)3.
519
Bibliografie
1. Frances Fischbach. Stool Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott
Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009; 302-303.
2. I. Gherghina, D.Matei, M.Aloman, M.Iusan, E.Ioniţă. Actualităţi în diareea acută la sugar şi
copilul mic. În Medicina Moderna, dec.2005.
3. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. White Blood
Cells (WBC), Stool. www.labcorp.com . 2010. Ref Type: Internet Communication
4. Maria Condor, Doina Luca. Diareea acută la copil. În Medicina Familiei, nr.18-19, 1997.
21.4.7 Coprocultura
Sindromul diareic este, ca frecvenţă, al treilea sindrom întâlnit în practica medicală.
Deşi majoritatea pacienţilor prezintă o infecţie autolimitantă, există şi forme severe, caracterizate prin
scaune frecvente (3-40/zi), de consistenţă redusă (uneori apoasă), cu pierderi lichidiene mari, ce pot
duce la dezechilibru hidroelectrolitic însoţit de tulburări hemodinamice grave (colaps cardiovascular)
cauzatoare de deces.
Etiologie
Parazitară Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica1;3
Bacteriană - Enterobateriaceae patogene: Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli
aerobă enteropatogen, enterotoxigen, enterohemoragic, enteroinvaziv, enteroaderent,
enteroagregativ, Yersinia enterocolitica1;3
- Enterobacteriaceae condiţionat patogene: Klebsiella spp. (sindromul diareic al
noului născut), Serratia marcescens (“sindromul scutecului roşu” - prin colonizare
anormală cu această bacterie la nou născuţi)
- Vibrio cholerae, Vibrio parahaemoliticus
- Alţi bacili Gram negativi: Aeromonas, Alcaligenes, Plesiomonas
- Coci Gram pozitivi: Staphylococcus aureus1;3
Bacteriană Bacillus cereus, Clostridium difficile (enterocolită pseudomembranoasă post
anaerobă antibioterapie), Clostridium perfringens, Clostridium botulinum1;3
Microaerofilă Campylobacter spp3
Micotică Candida albicans3
Virală Norwalk virus, Rotavirus, Adenovirus1;3
Prelevarea trebuie făcută cât mai aproape de debutul bolii şi înaintea instituirii oricărui tratament
520
21
antimicrobian.
• Prelevarea din scaun emis spontan - este de preferat şi se indică în toate formele de diaree acută
când emisia de materii fecale este frecventă.
• Pentru examinări bacteriene şi parazitare, prelevarea se face cu “linguriţa” coprorecoltorului, vizând
porţiunile lichide şi, mai ales, cele mucoase şi/sau sangvinolente, dacă există. Volumul recoltei trebuie
să fie de minim 5 ml sau 3-5 cm3 dacă scaunul este format3 .
• Pentru izolări sau examene virusologice se prelevă 5-10 cm3 materii fecale sau minim 5 ml dacă
scaunul nu este format3 .
• Prelevarea rectală – este recomandată în:
- shigelozele cronice, unde raclarea mucoasei rectale cu sonda ori tamponul oferă şanse mai mari
izolării;
- investigarea purtătorilor de Shigella şi Salmonella, cu excepţia celor de S. Typhi.
Pentru acest tip de prelevare se folosesc sonde Nelaton (nr.14-16) ori tampoane adecvate, astfel: cu
tamponul, umectat în soluţie salină izotonă (a nu se folosi geluri lubrefiante), se penetrează sfincterul
anal prin rotire lentă, introducându-se intrarectal aproximativ 15 cm. Se va proceda identic şi cu
sonda Nelaton, la care se adaptează o seringă (10 ml) cu care se fac 1-2 aspiraţii. După prelevare,
sondele şi tampoanele se introduc în recipiente sterile ce conţin mediu de conservare, se etichetează
corespunzător şi se trimit la laborator3 .
Transportul probelor şi prelucrarea lor se face în max. 2 h dacă au fost recoltate în recipiente fără
mediu de transport, sau pot fi păstrate până la 24 h la temperatura camerei, dacă s-au recoltat în
recipiente ce conţin mediu de transport Cary-Blair, ce asigură o bună viabilitate a patogenilor intestinali
bacterieni. Excepţie de la aceste reguli fac probele recoltate în suspiciunea de infecţie cu Shigella spp,
bacterie foarte sensibilă, ce necesită însămânţare pe mediile de cultură imediat după prelevare3;4 .
Pentru etiologia virală, probele care nu se prelucrează imediat trebuie păstrate la - 70°C3 .
Izolarea bacteriilor aerobe
• Se însămânţează proba pe două medii de cultură, unul slab selectiv (Mac Conkey) şi unul moderat
selectiv (Hektoen) şi se incubează 24 h la 35-37ºC, urmărindu-se culturile la 24 şi 48 h pentru apariţia
coloniilor caracteristice. Pentru genul Vibrio, mediul selectiv recomandat este BSA (agar săruri biliare),
iar pentru levuri- mediul Sabouraud cu Cloramfenicol.
• Pentru a creşte şansele de izolare, proba este subcultivată pe medii de îmbogăţire ce favorizează
multiplicarea patogenilor (e.g., bulion selenit acid de sodiu pentru Salmonella spp., apă peptonată
alcalină sau bulion cu taurocolat şi peptonă la pH=8,0-9,0 pentru Vibrio de unde, după incubare, se
pot efectua frotiuri şi culturi din partea superioară a mediului). Se incubează 24 h la 35-37°C, apoi se
fac treceri pe mediile de cultură.
• Coloniile caracteristice fiecărui gen vor fi repicate în vederea indentificării la nivel de specie si
aglutinarii cu seruri specifice
Izolarea levurilor
Microscopia
• pe frotiuri colorate Gram se urmăreşte prezenţa levurilor în cantitate mare şi predominantă faţă de
flora bacteriană fecaloidă diminuată2.
521
• este decisivă pentru cultivarea materiilor fecale în vederea izolării şi cuantificării levurilor.
Cultivarea pe mediul Sabouraud cu Cloramfenicol, cu urmărire la 48–72 h3.
În vederea stabilirii etiologiei micotice a sindromului diareic se va efectua examenul cantitativ al
levurilor, respectiv determinarea numărului de unităţi formatoare de colonii micotice per g sau ml de
materii fecale, semnificativ cantitativ fiind un număr >109UFC/g sau ml materii fecale3 .
În laboratoarele Synevo, se comunică următorii agenţi patogeni enterici:
• Salmonella spp., • Shigella spp., • E coli (EPEC - numai la copii <2 ani -, EHEC, EIEC), • Klebsiella
spp - la copii până în 2 luni, atunci când pe mediile de cultură creşterea este predominantă, • Candida
albicans.
De asemenea, menţionăm că în laboratoarele nostre nu se efectuează culturi pentru virusuri2.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Gastrointestinal tract infections. In Bailey and
Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002; 62, 965-969.
2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref TypeCatalog.
3. Marian Negut. Diagnosticul de laborator in sindromul diareic infectios. În Tratat de Microbiologie
Clinică. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Editura Medicală România, 1 ed. 1999, 349-386.
4. Richard B.Thomson J, J.Michael Miller. Specimen collection, transport and processing :
Bacteriology. In Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray et al, ASM PRESS, USA, 8
ed. 2003; 20, 312-313.
21.4.8 Examen coproparazitologic
Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea examenului coproparazitologic

Prin acest examen este detectată prezenţa unor paraziţi cu localizare intestinală, în limitele impuse de
ciclul biologic al fiecărui parazit:
Protozoare: Giardia lamblia, Trichomonas intestinalis, Entamoeba spp., Blastocystis hominis
Helminţi
• Nematode: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Strongyloides
stercoralis
• Trematode: Fasciola hepatica
• Cestode: Taenia spp., Hymenolepis nana, Diphyllobotrium latum1;3;6.
522
21
Paraziţii intestinali sunt răspândiţi ubicuitar, infestările fiind mai frecvente în zonele cu instalaţii de apă
deficitare.
Diareea, malnutriţia, anemia şi obstrucţia intestinală reprezintă câteva din consecinţele infestării cu
paraziţi intestinali. Protozoarele pot determina diaree şi/sau malabsorbţie atât prin secreţia de toxine
cât şi prin invadarea sau doar aderarea la mucoasa intestinală prin mecanisme necunoscute.
Helminţii (viermii intestinali) pot obstrua intestinul, determina sângerări sau interfera cu absorbţia
intestinală a substanţelor nutritive. Larvele sau ouălele pot disemina în zone extraintestinale şi induce
inflamaţie sau distrucţii tisulare.
Unii paraziţi din categoría protozoarelor sau helminţilor pot habita tractul intestinal al omului şi
animalelor fără a provoca manifestări clinice5.
Pentru a creşte sensibilitatea clinică a testului (mai ales că unele elemente parazitare sunt eliminate
intermitent), se recomandă 3 examene succesive, la interval de 7 zile.
După tratarea unei parazitoze examenul coprologic de control se va efectua după un interval de timp
variabil în funcţie de diagnostic. Astfel, după tratamentul unei infecţii cu protozoare controlul se va
efectua după 3-4 săptămâni iar în infecţiile cu helminţi după 1-2 săptămâni1;3;5;6.
Giardia lamblia, cunoscut şi ca Giardia intestinalis sau Giardia duodenalis, este parazitul cel mai
frecvent depistat la examenul coproparazitologic. Reprezintă un organism unicelular (protozoar)
prevăzut cu flageli care îi asigură mobilitatea. Este localizat în intestinul subţire (duoden şi jejun)
unde se ataşează de microvilii enterocitelor prin intermediul unui disc adeziv. Datorită multiplicării sale
extrem de rapide numărul elementelor parazitare poate depăşi 1 milion/cm. Consecinţele infestării
sunt astfel tulburări de digestie şi absorbţie intestinală, cu spolierea treptată a organismului-gazdă
de substanţele nutritive necesare. De asemenea, parazitul poate acoperi mucoasa duodeno-jejunală
pe suprafeţe întinse constituind adevărate bariere mecanice care reduc şi mai mult capacitatea de
absorbţie a principiilor nutritive şi a vitaminelor7.
Parazitul prezintă două forme de viaţă: trofozoit sau stadiul vegetativ şi chist sau stadiu de rezistenţă.
Are o înmulţire simplă prin diviziune binară. Parazitul posedă un rezervor animal, format în special din
rozătoare (castor, hamster, etc), dar şi câine4.
Boala se transmite pe cale digestivă (fecal-orală) prin mâini murdare, consum de fructe şi/sau legume
nespălate, precum şi de apă contaminată cu forma chistică a parazitului. Cel mai frecvent sunt afectaţi
copiii mici din creşe şi grădiniţe, precum şi rudele acestora. Infecţia se transmite cu uşurinţă deoarece
doza infectantă a chisturilor este redusă (~ 10 chisturi), chisturile sunt rezistente la clorinarea apei şi
pot supravieţui câteva săptămâni în apa rece, precum şi datorită existenţei rezervoarelor animale5.
După ingestie, procesul de dechistare are loc la nivelul duodenului şi în treimea proximală a duodenului
şi jejunului sub acţiunea sucurilor digestive. Dechistarea este un proces rapid, terminându-se în 10
minute şi este semnalată de emergenţa flagelilor ventrali, ieşirea acestora fiind urmată de întreg
trofozoitul. Trofozoitul se fixează de enterocit, se hrăneşte cu conţinutul intestinal şi, în decurs de 15-
30 minute de la dechistare, începe să se dividă prin fisiune binară. Pe măsură ce parazitul antrenat de
fluxul intestinal, este împins în aval către colon, trofozoitul se autoprotejează de microambientul local
prin conversie în forma chistică. Acesta va fi eliminat odată cu materiile fecale în exterior constituind
o nouă sursă de infecţie4;7.
523
Tabloul clinic include:

• infecţii silenţioase (mai ales la adulţi);
• giardioza acută: boală diareică acută combinată cu un sindrom gazos şi dispeptic biliar;
• giardioza cronică: disconfort digestiv persistent, episoade diareice alternând cu tranzit intestinal
normal sau chiar încetinit.
Malabsorbţia de diverse grade este o complicaţie dezvoltată în aproximativ 10-15% din cazuri,
atât în formele acute cât şi cronice de boală. Alături de aceasta pot apărea alergodermii polimorfe
complexe4.
Diagnosticul giardiozei se stabileşte cel mai frecvent prin examenul microscopic al materiilor fecale
(depistarea chisturilor) precum şi prin testul imunoenzimatic (identicarea antigenul Giardia în scaun).
Determinarea anticorpilor specifici nu prezintă utilitate datorită persistenţei îndelungate a acestora
chiar şi în urma tratamentului eficace.
În absenţa instituirii tratamentului chisturile continuă să fie eliminate în mediul înconjurător timp de
săptămâni sau luni4;7.
Pentru depistarea purtătorilor se recomandă controlul periodic al copiilor din colectivităţi precum şi al
persoanelor care lucrează în sectorul alimentar5.
Entamoeba histolytica
Este o amoebă intestinală obligatoriu patogenă, hematofagă, capabilă să invadeze ţesuturile
intestinale şi extraintestinale4. Reprezintă agentul etiologic al amibiazei, boală cu evoluţie cronică ce
este endemică în regiunile tropicale si subtropicale umede, în special în India, Sri Lanka, Vietnam,
Cambodgia, Indonezia, Malaezia.
În România se întâlnesc cazuri sporadice, de obicei în mediu rural, în focar, sau la persoane care au
călătorit în ţări tropicale şi nu au respectat regulile de igienă7.
E. histolytica prezintă două forme morfologice: trofozoit sau stadiul vegetativ şi chist sau stadiu de
rezistenţă. Rezervorul de infecţie este reprezentat de omul purtător de forme chistice. Transmiterea se
face pe cale digestivă prin intermediul mâinilor murdare sau prin consumul de alimente contaminate
cu ajutorul unor artropode (muşte, gândaci de bucătărie). Transmiterea hidrică este rară dar are un
potenţial epidemic4.
Parazitul se localizează la nivelul colonului, în special în colonul descendent şi sigmoid unde, datorită
efectului său citolitic şi proteolitic asupra ţesuturilor, determină leziuni grave – abcese cu aspect de
„buton de cămaşă”; în acest stadiu parazitul este hematofag. Tabloul clinic clasic este similar celui
din dizenterie, cu scaune numeroase (15-20/zi), sărace cantitativ, însoţite de dureri abdominale şi
tenesme rectale care sunt refractare la tratamentul cu antibiotice uzuale.
În absenţa tratamentului, trofozoiţii de E. histolytica se pot răspândi pe cale hematogenă la ficat,
plămân sau creier, unde provoacă abcese amoebiene asociate cu un prognostic rezervat7.
Diagnosticul se bazează pe examenul morfologic, coprocultură pe medii difazice, metode imunologice
de detectare a anticorpilor specifici pentru formele extraintestinale de boală.
Examenul morfologic constă în evidenţierea parazitului sub formă de trofozoit în cursul stadiului acut,
diareic de boală, sau sub formă de chist în stadiile de acalmie sau de purtător de parazit. Diagnosticul
524
21
morfologic poate fi practicat coproparazitologic (direct, pe probe concentrate sau pe frotiuri colorate)
ori pe fragmente bioptice intestinale recoltate prin colonoscopie4.
Entamoeba coli
Este o amibă comensală care intră în alcătuirea florei intestinale normale, având rolul de a menţine un
echilibru între diversele populaţii microbiene locale.
Nu are capacitate invazivă şi nici nu este hematofagă; prezintă ambele forme biologice de viaţă -
trofozoit şi chist – cu o înmulţire prin diviziune binară. Devine patogenă numai în condiţiile alterării
imunităţii locale, cel mai adesea după tratamente antibiotice prelungite. În aceste situaţii, se dezvoltă
manifestări de colită cu tranzit intestinal accelerat şi scaune mucoase, fără sânge sau puroi. Deseori
apar şi manifestări cutanate de hipersensibilizare.
Diagnosticul se bazează pe examenul coproparazitologic, cu identificarea trofozoiţilor sau a mai mult
de 5 formaţiuni chistice parazitare pe cîmpul microscopic4.
Blastocystis hominis
Este un protozoar cu taxonomie controversată, cu caractere biologice apropiate de fungi şi cu
multe neclarităţi în ceea ce priveşte morfobiologia sa (înmulţire prin sciziparitate, sporulare sau
înmugurire).
Prezintă 4 forme morfologice majore:
• forma vacuolară - comensală, cel mai frecvent identificată, cu aspect de “rulment”;
• forma amoeboidală - identică cu cea vacuolară, cu excepţia formei neregulate datorată pseudopodelor;
nucleii sunt poziţionaţi central iar vacuolele sunt absente;
• forma granulară - considerată forma oportunistă; prezintă 1-6 nuclei periferici iar citoplasma este
ocupată de numeroase granule de dimensiuni variabile;
• forma chistică – controversată mult timp; existenţa sa este în prezent bine documentată, însă pentru
a o identifica sunt necesare tehnici speciale de laborator.
Blastocystis hominis este un parazit cosmopolit, fiind întâlnit mai frecvent în regiuni cu deficienţe igienice;
este comensal şi cu potenţial oportunist fiind implicat în infecţii severe la pacienţii imunodeprimaţi.
Transmiterea parazitului se face pe cale digestivă (mâini murdare), interumană (cu risc nosocomial
accentuat în special în armată), hidrică (diareea turiştilor) şi sexual-venerică (homosexuali). Rezevorul
animal de parazit a fost până nu demult controversat, dar se acceptă riscul zoonotic, cu precădere de
la porc, cal şi rozătoare.
Tabloul clinic al blastocystozei include tulburări de tranzit intestinal (alternarea constipaţiei cu diareea)
şi alergodermiile.
Examenul coproparazitologic reprezintă principala metodă de identificare a parazitului. Conform opiniei
majorităţii specialiştilor decelarea unui număr minim de 5 elemente parazitare pe cîmpul microscopic
reprezintă criteriul de diferenţiere între comensalism şi patogenicitate4.
Ascaris lumbricoides
Este un vierme cilindric (nematod) specific omului, cu dezvoltare obligatorie pe sol (geohelmint) şi
525
răspândire ubicuitară. Prezintă dimorfism sexual, femela având dimensiuni de 25-31 cm şi masculul
de 15-25 cm.
Ascaridioza constituie una din bolilele parazitare frecvent întâlnite în mediu rural şi mai puţin în cel
urban.
Rezervorul de infecţie este reprezentat de omul parazitat cu Ascaris lumbricoides, femela fiind
capabilă să depună zilnic în intestinul uman cca 200 000 ouă. Ajunse pe sol odată cu fecalele,
ouăle neembrionate în momentul depunerii vor deveni embrionate după 5-7 zile de stagiu pe sol,
la temperaturi de 20-24 ºC şi umidiate peste 10%. Omul se poate contamina cu ouă embrionate
prin intermediul mâinilor murdare şi prin ingerarea de legume/fructe nespălate. Insectele (muşte,
gândaci) au un rol important în poluarea alimentelor cu ouă de Ascaris. După ce pătrund în intestinul
omului sănătos (în special copii) ouăle îşi pierd învelişul protector şi pun în libertate embrionul (larva);
acesta traversează activ peretele intestinal şi prin intermediul circulaţiei sangvine şi limfatice ajunge
în parenchimul hepatic, unde staţionează o perioadă de 4-5 zile. Ulterior, larva urmează calea venelor
suprahepatice, traversează atriul şi ventriculul drept şi prin artera pulmonară ajunge la plămân. În
staţia pulmonară larva suferă două năpârliri, rezultând în final un element ciliat care prin mişcări de
autopropulsie rupe septurile interalveolare şi ascensionează prin bronhiole către faringe. În cavitatea
orofaringiană larva poate urma două căi: fie va fi eliminată în exterior prin expectoraţie, fie va ajunge
în intestin prin deglutiţie; în ultima situaţie, larva are nevoie de 60-75 zile pentru a atinge stadiul de
adult. Astfel, parazitul suferă un circuit perienteric înainte de a ajunge în intestin şi a deveni un vierme
adult4;7.
Tabloul clinic reflectă etapele ciclului parazitar, existând manifestări provocate de larvele pulmonare şi
de adulţii de la nivelul intestinului subţire:
- pneumonia interstiţială tranzitorie hipereozinofilică Loeffler: tuse spastică, wheezing, expectoraţie
seroasă ce conţine eozinofile şi cristale Charcot-Leyden;
- alergii polimorfe;
- enterita ascaridiozică: dureri periombilicale, vărsături, tulburări de tranzit intestinal; numărul paraziţilor
din intestin poate depăşi cifra de 40; la acest nivel exercită o acţiune mecanică, spoliatoare şi toxică
putând genera obstrucţii intestinale şi malnutriţie protein-calorică.
Diagnosticul ascaridiozei este morfologic prin identificarea macroscopică a viermilor adulţi sau
evidenţierea la examenul microscopic a ouălelor neembrionate sau embrionate4.
Trichuris trichiura (tricochocefal)

Este un nematod geohelmint, hematofag şi specific omului. Adulţii trăiesc în cec şi colon prezentând
dimensiuni medii: femela 3.5-5 cm lungime iar masculul 2-3.2 cm. Corpul este disproporţionat, primele
3/5 anterioare fiind subţiri şi efilate (cu rol în fixarea de mucoasa intestinală) iar cele 2- posterioare
groase, plonjând în lumenul intestinal.
Femela elimină ouălele prin materiile fecale, ajungând în contact cu solul. Geombrionarea durează
aproximativ 5-8 săptămâni. Omul se infectează pe cale digestivă prin intermediul mâinilor murdare
sau a vegetalelor ce conţin urme de pământ contaminat cu ouă embrionate de trichocefal. Ajunse
în intestinul omului ouălele sunt digerate şi pun în libertate larvele care se vor matura în decurs de
526
21
o săptămână la nivelul vilozităţilor intestinale. După această perioadă larvele se întorc în lumenul
intestinal şi migrează spre cec, unde se stabilizaeză ca forme adulte, mature sexual.
Printre caracteristicile trichocefalului se numără capacitatea de a se insinua sub mucoasa intestinală
prin intermediul capătului proximal, crearea unor denivelări cu zone microulcerate la locul de pătrundere
şi hematofagia. Rezultă astfel o reacţie inflamatorie intestinală difuză, uneori cu aspect granulamatos,
similar celui descris în boala Crohn.
Tabloul clinic este influenţat de încărcătura parazitară şi reactivitatea gazdei; se pot înregistra atât forme
asimptomatice asociate cu o încărcătură parazitară redusă, cât şi forme severe, asemănătoare bolilor
inflamatorii intestinale (diaree sanguinolentă însoţită de tenesme rectale şi dureri colicative, mai ales
în fosa iliacă dreaptă). O complicaţie severă la copil o reprezintă prolapsul rectal. Hemoleucograma
indică constant eozinofilie 10-15%.
Diagnosticul se stabileşte prin identificarea ouălelor de trichocefal la examenul coproparazitologic şi,
în cazurile grave, prin vizualizarea viermilor adulţi la rectocolonoscopie1;4.
Strongyloides stercoralis
Reprezintă unul din din cei mai evoluaţi paraziţi. Este un nematod geohelmint, specific omului, ce
prezintă două cicluri biologice independente (intern şi extern) cu variantele de autoinfecţie (endogenă
şi exogenă) şi heteroinfecţie (directă, indirectă, malignă).
În mod surprinzător, femela este vivipară eliminând direct prin orificiul uterin larve rabditoide,
neinfecţioase, care ajung odată cu materiile fecale în exterior.
Ciclul direct de heteroinfecţie
În contact cu solul larva rabditoidă se transformă prin năpârlire în larvă strongyloidă infecţioasă
care poate supravieţui în condiţii prielnice 2-3 săptămâni. Omul se infectează pe cale cutanată:
larva penetrează tegumentul intact şi ajunge prin circulaţia sangvină şi limfatică la plămăni, unde
staţionează cca 2 săptămâni. După ce suferă o nouă năpârlire, larva rupe septurile interalveolare şi
ascensionează prin bronhiole către faringe; din cavitatea orofaringiană ajunge prin deglutiţie în intestin
unde va atinge stadiul de adult.
Ciclul indirect de heteroinfecţie
În condiţii neprielnice de mediu larva rabditoidă ajunsă la sol se poate transforma direct în stadiul de
adult liber. Aceşti paraziţi adulţi sunt capabili să se reproducă în sol, întreţinând astfel un rezervor
teluric în aşteptarea condiţiilor favorabile dezvoltării larvelor infecţioase.
Autoinfecţia
Este posibil ca în organismul parazitat larvele rabditoide să se transforme în larve infecţioase, în
urma unor modificări metabolice. Condiţiile care favorizează acest fenomen sunt constipaţia şi igiena
precară. Autoinfectarea se poate produce în lumenul duodeno-jejunal, regiunea perianală şi epiteliul
bronşic; stă la baza cronicizării bolii.
Hiperinfecţia sau ciclul malign
În condiţii de imunodepresie sistemică larva strongyloidă apare in situ la nivelul intestinului subţire.
Acesta va traversa peretele intestinal şi va disemina pe calea circulaţiei limfatice şi sangvine în
numeroase organe: ficat, plămăni, rinichi şi mai ales creier. Rata de mortalitate este ridicată.
527
Tabloul clinic include:

• manifestări cutanate: alergodermii;
• tulburări intestinale (enteropatia strongyloidozică): sindrom diareic cronic, graţă persistentă, dureri
colicative episodice;
• manifestări respiratorii: tuse cu expectoraţie seroasă, dispnee cu wheezing, dureri toracice;
• tulburări neuropsihice: anxietate, depresie;
• manifestări sistemice nespecifice: stare subfrebilă.
Hemograma indică eozinofilie 10-15%.
Diagnosticul strongyloidozei se bazează pe depistarea larvelor rabditoide în fecale, lichid duodenal,
spută sau lavaj bronholaveolar. În cazurile severe sunt necesare biopsii duodeno-jejunale4.
Fasciola hepatica
Este un trematod hermafodit cu localizare la nivelul căilor biliare. Este răspândit în zonele temperate,
inclusiv România, rezervorul animal fiind reprezentat de ovine.
Adultul de Fasciola hepatica elimină oul neembrionat, neinfecţios prin bilă; oul traversează nemodificat
tubul digestiv şi se excretă prin materiile fecale.
Pentru a-şi continua ciclul biologic oul trebuie să ajungă în ape stătătoare calde unde embrionează
şi, în decurs de 3 săptămâni, formează prima larvă – miracidium. Această formă larvară trebuie să
întâlnească o gazdă intermediară – un melc din genul Lymnaea – în interiorul căreia se va genera
în final larva infecţioasă denumită cercar. După ce părăseşte corpul melcului, cercarul înoată liber
în apă, începe să secrete substanţe mucoide şi se înconjoară de un perete, devenind metacercar.
Metacercarii sunt întâlniţi pe plantele acvatice, în mod particular în culturile de salată verde Cresson.
Omul şi ierbivorele se infectează prin consumul de salată sau plante acvatice sau chiar apă
contaminate cu metacercari. Ajuns în intestinul uman peretele metacercarului va fi digerat rapid
iar larva rezultată va urma un traseu invaziv prin peretele intestinal, cavitatea peritoneală, capsula
hepatică şi va atinge în final canaliculele biliare, în interiorul cărora se maturează în decurs de 3 luni.
În traiectul său parazitul va provoca efecte mecanice de tip iritativ şi hemoragic, precum şi acţiuni
toxice şi hipersensibilizante.
Tabloul clinic reflectă etapele de dezvoltare a parazitului şi include:
• faza migratorie sau acută: febră, stare generală alterată, prurit, dureri abdominale predominant în
hipocondrul drept, diaree muco-sanguinolentă; eozinofilia este marcată (20-40%) iar testul hemoragiilor
oculte în scaun este pozitiv ca urmare a hemobiliei;
• faza obstructivă sau cronică: icter/subicter mecanic, asociat cu episoade colicative biliare;
• faza ectopică: formă aberantă de fascioloză ce cuprinde fascioloza cutanată şi fascioloza buco-
faringiană (datorată consumului de ficat de miel, mai ales în regiunile din Orientul Mijlociu şi Africa
de Nord).
Diagnosticul se bazează pe detectarea antigenelor sau anticorpilor specifici prin metode
imunoenzimatice în faza acută şi cea obstructivă a bolii şi pe evidenţierea ouălelor de Fasciola
hepatica la examenul coproparazitologic sau în lichidul duodenal1;4.
528
21
Genul Taenia
Face parte din clasa cestodelor şi include două specii: Taenia saginata şi Taenia solium. Paraziţii se
caracterizează printr-un corp aplatizat şi segmentat (în jur de 800-2000 segmente denumite proglote),
de dimensiuni mari şi un cap (scolex) care prezintă organisme de fixare la peretele intestinal (ventuze
şi/sau cârlige). Pentru a fi asigurată dezvoltarea lor biologică aceşti paraziţi au nevoie de două sau
mai multe gazde.
Rezervorul de infecţie este reprezentat de omul purtător de tenie în stadiul adult ale cărei proglote
terminale, pline cu ouă (50 000-250 000/segment), se desprind în lumenul intestinal şi sunt eliminate
activ în mediul exterior, prin forţarea sfincterului anal, independent de defecaţie. De aici, odată cu
hrana, pot ajunge în intestinul unor animale care deţin rolul de gazdă intermediară şi care vor face
forma larvară a infecţiei (cisticercoza).
Taenia saginata este un vierme plat cu dimensiuni mari (8-12 m), având un număr de 1000-2000
segmente, în timp ce Taenia solium are lungimi cuprinse între 2 şi 8 m şi prezintă 800-1000 segmente.
Gazda intermediară este reprezentată de bovine în cazul Taeniei saginata şi de porcine în cazul
Taeniei solium. Omul se infestează prin consumul de carne de vită/porc insufucient preparată termic,
care conţine formele larvare (cysticercus bovis şi respectiv cysticercus cellulosae)7. În tubul digestiv
al omului, corpul veziculos al larvei este digerat iar scolexul se evaginează şi se fixează de mucoasa
intestinului cu ajutorul ventuzelor. După aproximativ 60-65 zile se va atinge stadiul adult, omul
constituind astfel gazda definitivă pentru tenie4.
Tabloul clinic este dominat de eliminarea de proglote terminale; simptomatologia digestivă este
similară celei din sindromul de colon iritabil: diaree mucoidă, uneori cu mulaje tubulare intestinale
de mucus, însoţită de dureri abdominale cu carcater colicativ, greaţă, apetit modificat (bulimie sau,
dimpotrivă, anorexie), scădere ponderală.
Diagnosticul se bazează fie pe examenul macroscopic al proglotelor eliminate, fie prin evidenţierea
microcopică a ouălelor de tenie4;7.
Hymenolepis nana
Este un vierme plat, segmentat (prezintă circa 200 segmente) cu o lungime de 2-4 cm, specific omului.
Parazitul nu are nevoie de o altă gazdă în cursul dezvoltării sale biologice, astfel că omul reprezintă
atât gazda definitivă cât şi cea intermediară.
Rezervorul de infecţie îl constituie omul purtător de parazit, simptomatic sau nu, care elimină în
mediul înconjurător odată cu materiile fecale ouălele embrionate. Omul sănătos se infectează pe cale
digestivă prin intermediul mâinilor murdare sau consumul de vegetale contaminate cu ouă embrionate
de Hymenolepis nana. De asemenea, există posibilitatea unei autoinfecţii endogene, datorită numărului
foarte mare de paraziţi (zeci-sute) care populează intestinul la un moment dat.
În intestinul omului se dezvoltă atât formele larvare (cisticercoizi) cât şi formele adulte; ciclul se
numeşte autoxen şi are o durată totală de 21-30 zile7.
Infecţiile mici şi medii cu Hymenolepis nana pot evolua asimptomatic; în cursul infecţiilor masive se
întâlneşte tabloul clinic de abdomen cronic dureros: colici abdominale, tranzit intestinal alternant,
tulburări de apetit, scădere ponderală, tulburări neuropsihice nespecifice.
529
Diagnosticul se bazează în principal pe identificarea ouălelor caracteristice la examenul

coproparazitologic4;7.
Dyphilobothrium latum (botriocefal)

Este o cestodă cu corpul plat format din 2000-4000 segmente (proglote) şi cu o lungime de 10-16 m.
Se fixează în intestinul omului cu ajutorul a două ventuze, situate la nivelul scolexului ce are o formă
ovoidal-migdalată caracteristică.
Parazitul are nevoie în cursul dezvoltării sale biologice de două gazde intermediare (un crustaceu din
genul Cyclops şi peşti răpitori: ştiucă, biban, crap, mihalţ) în organismul cărora se vor dezvolta larvele.
Omul sănătos se infectează pe cale digestivă prin consumul de peşte crud şi icre ce conţin larve
închistate7. În intestinul omului scolexul evaginează şi se fixează cu ventuzele de mucoasă; stadiul
de adult este atins după 70-90 zile, omul constituind astfel gazda definitivă pentru parazit. Viermele
adult elimină un număr mare de ouă (până la un milion/zi) care vor fi excretate în mediul înconjurător
odată cu materiile fecale.
Botriocefalul nu distruge enterocitul şi în consecinţă nu provoacă un sindrom de malabsorbţie. În
schimb, exercită o acţiune de spoliere selectivă prin consumul de vitamină B12 şi acid folic; de
asemenea, prin poziţionarea sa în jejunul superior poate bloca receptorii pentru factorul intrinsec.
Din aceste motive se întâlneşte frecvent în botriocefaloză anemia megaloblastică. Alături de
posibilitatea expulzării spontane a viermelui în cursul defecţiei persoanele afectate mai pot prezenta
o simptomatologie digestivă similară teniazei.
Diagnosticul se bazează în principal pe identificarea ouălelor de botriocefal la examenul
coproparazitologic4.
Pregătire pacient
Pacientul va evita:
- în săptămâna premergătoare recoltării, administrarea anumitor medicamente: bismut, Metamucil,
unei alune, din 3 locuri diferite ale bolului fecal2.
- specimen contaminat cu urină2;8.
Stabilitate probă - examinarea promptă a scaunului este importantă pentru scaunele lichide sau moi
care ar putea conţine trofozoiţi de protozoare; scaunele formate, care pot conţine chişti de protozoare,
ouă sau larve de helminţi pot rămâne câteva ore la temperatura camerei sau până a doua zi la
frigider6.
530
21
Prelucrare necesară după recoltare - analiza se executa din materii fecale proaspat emise (de
preferat); dacă acest lucru nu este posibil, proba va fi păstrată la 2-8ºC 2;8.
Metodă – examen macroscopic + examen microscopic direct (între lamă şi lamelă)2;8.
Valori de referinţă – absente elemente parazitare intestinale2.
Examenul macroscopic
Examinarea se face direct in recipientul in care s-a prelevat proba, cu ohiul liber sau cu lupa de
mână, utilizând o baghetă de sticlă sau o ansă. Se observă culoarea, mirosul, consistenţa scaunului,
prezenţa de mucus, puroi, sânge, precum şi de elemente suspecte ca fiind parazitare. Dintre
elementele parazitare se pot observa:
- proglote de Taenia spp.
Proglotele de Taenia saginata (rar vizibile în materiile fecale, deoarece se elimină prin orificiul anal
între defecaţii) sunt dreptunghiulare de 2 cm lungime/0,5 cm lăţime, au uterul bine dezvoltat, prevăzut
cu 20-30 de ramificaţii închise în deget de mănuşă, pline cu ouă şi au mişcări periodice caracteristice.
Proglotele de Taenia solium au dimensiuni de 2 cm lungime/6-8mm lăţime, uterul lor prezintă 7-10
ramificaţii laterale, închise în deget de mînuşă pline de ouă) fără a prezenta mişcări.
- viermi adulţi de Ascaris lumbricoides.
Au corpul cilindric, de culoare roz-albicioasă şi prezintă striuri discrete longitudianle. Se va preciza
sexul viermelui eliminat. Femelele au 20-30 cm lungime/5-6 mm grosime. Masculii sunt mai mici, au
15-20 cm lungime şi extremitatea posterioară încurbată.
Examenul microscopic direct
Se examinează între lamă şi lamelă o cantitate mică de materii fecale (1.5 – 2 mg), prelevată din
diferite părţi ale probei, amestecată în ser fiziologic sau soluţie Lugol.
Pentru realizarea preparatelor se folosesc lame curate, degresate. Pe o lamă se pune o picătură de
ser sau soluţie Lugol. Cu ajutorul unei baghete se prelevă o mică cantitate din proba de examinat şi
se amestecă pe lamă cu picătura de ser sau soluţie Lugol. Se acoperă cu o lamelă.
Preparatul trebuie examinat cât mai repede pentru a se evita uscarea. Se utilizează lamele de 18/18
mm dimensiuni, astfel încât marginile lor să fie cuprinse în interiorul marginilor lamei. Suspensia
trebuie să fie uniformă, iar lamela aşezată orizontal, nu înclinat.
Preparatul se examinează în intregime, deplasând lama de la stânga la dreapta şi de sus în jos.
Examinarea se face cu obiectiv 10x sau 20x, iar identificarea fiecărui element parazitar decelat se
face cu obiectivul 40x; se utilizează oculare 10x.
La examinarea microscopică se pot depista diferite specii de paraziţi.
Giardia lamblia
Poate apare sub două forme: trofozoit (forma vegetativă) şi chist. Forma vegetativă se întâlneşte
excepţional, doar în scaunele apoase, în stadiul acut al bolii, mai ales la copii (în 5-10% din cazuri).
Trofozoitul este piriform de 15 µm lungime/6-10 µm lătime. Are corp cu simetrie bilaterală cu 2 nuclei,
4 perechi de blefaroplaşti şi 4 perechi de flageli, un disc adeziv şi un axostil.
531
Fig. 21.4.8.1 Trofozoiţi de Giardia lamblia (după MicrobeLibrary.com)
Chistul este ovalar are 9-13 µm lungime / 6µm lăţime. Are o membrană externă fină, dublă, 4 nuclei
şi un mănunchi de flageli. Nucleii au o dispoziţie variabilă, frecvent sunt grupaţi la o extremitate a
celulei.
În axul chistului se observă resturi flagelare cu dispoziţie sinuoasă, în formă de S.
Fig. 21.4.8.2 Chisturi de Giardia lamblia

(preparat nativ în soluţie salină – imagine din colecţia proprie a laboratorului)
În preparatul nativ efectuat în soluţie Lugol chisturile sunt evidente fiind colorate în brun.
Cu obiectivul de 40 x se detectează detalii structurale şi aspecte diferite:
a) chisturi mari, oval rotunde, colorate brun deschis; sunt chisturi tinere, recent formate, bine
hidratate; dubla membrană se observă net, dar nucleii şi mănunchii de flageli sunt mai estompaţi;
b) chisturi de dimensiuni medii, ovale, colorate brun inchis; dublul contur se distinge mai greu, dar
interiorul chistului este net.
c) chisturi mici albastre sau palid cenuşii; sunt rar obervate (2-3%); nu au contur dublu şi au interior
omogen; sunt chisturi neviabile.
532
21
Fig. 21.4.8.3 Chist de Giardia lamblia

(preparat nativ în soluţie Lugol, – imagine de la www.dpd.cdc.gov)
Entamoeba histolytica
Chistul matur este rotund, cu dimensiuni de 10-20 µm şi cu un număr constant de 4 nuclei;
conţinutul chistului este relativ compact, fiind întâlnite 1-4 baghete cu capete rotunjite, denumite
corpi siderofili sau cromatoizi.
Fig. 21.4.8.4 Chist de Entamoeba histolytica

(preparat nativ – imagine de la www.dpd.cdc.gov)
Entamoeba coli
Chistul matur are dimensiuni variabile (10-30 µm), cu un perete gros, dublu-lamelar şi un conţinut
granular uniform ce îi conferă în preparatele proaspete o coloraţie gri-cenuşie; numărul nucleilor
este constant de 8, aşezaţi în acelaşi plan sau în planuri diferite.
533
Fig. 21.4.8.5 Chist de Entamoeba coli

(preparat nativ – imagine de la www.dpd.cdc.gov)
Blastocystis hominis
Forma vacuolară (considerată de unii drept chist) este sferică sau elipsoidală şi are în medie 8-10
µm. Poate prezenta o capsula proeminentă; conţine o vacuolă mare centrală, clară, delimitată de
o bandă subţire neregulată din citoplasmă, la nivelul căreia se găsesc nucleii şi granulele dispuse
periferic.
Deţine în general un nucleu, dar uneori poate avea 2-4 nuclei sau chiar mai mulţi. La formele binucleate,
nucleii pot fi dispuşi la cei doi poli, iar la formele tetranucleate la periferia celulei.
Fig.21.4.8.6 Blastocystis hominis – formă vacuolară

(preparat nativ în soluţie salină – imagine de la www.dpd.cdc.gov)
Ascaris lumbricoides. Oul este oval, de 65-80 µm/ 50 µm. Prezintă un înveliş dublu: un înveliş extern,
gros, cu aspect mamelonat caracteristic şi un înveliş intern de natura chitinoasă, neted, transparent,
534
21
stratificat.
Oul neembrionat prezintă în interior celula-ou, înconjurată de masa vitelină, retractată, lăsând un
spaţiu liber între ea şi învelişurile externe. Forma şi dimensiunile oului embrionat sunt asemănătoare
cu ale celui neembrionat, dar în interiorul lui se dezvoltă o larvă cilindrică de 250 µm, răsucită în jurul
său, în forma literei S, ocupând în întregime interiorul oului.
Fig. 21.4.8.7 Ou de Ascaris lumbricoides

Trichiuris trichiura (Tricocefalul). Oul este oval, brun, de 50 / 22 µm. Prezintă un înveliş extern gros şi în
interior celula-ou inconjurată de masa vitelină. La cei doi poli există dopuri albuminoase transparente,
care conferă oului un aspect caracteristic de lămâie.
Fig. 21.4.8.8 Ou de Trichuris trichiura

Strongyloides stercoralis.
Deoarece ouăle eclozează imediat după emisie şi eliberează larve în lumenul intestinal, în materiile
fecale se vor evidenţia doar larve.
Larvele rabditoide măsoară 250-300 µm, au un esofag “bicameral” (o porţiune proximală cilindrică de
calibru redus şi un segment distal globulos “în bulb de ceapă”) şi o extremitate posterioară ascuţită.
535
Fig. 21.4.8.9 Larvă rabditoidă de Strongiloides

(preparat nativ în soluţie salină - imagine din colecţia proprie a laboratorului)
Fasciola hepatica
Ouăle sunt neembrionate, cu dimensiuni de 140/ 80 µm, culoare galben brună, prezentând la
exterior o coajă subţire, deformabilă, cu un opercul la un pol, iar în interior celula ou înconjurată de
masa vitelină.
Fig. 21.4.8.10 Ou de Fasciola hepatica

Taenia solium şi Taenia saginata. Ouăle sunt embrionate, rotund-ovalare, având dimensiuni de 30-
50 µm. Prezintă o coroană periferică striată caracteristică, alcătuită din trei membrane embrionare;
conţin în interior o substanţă vitelină galben-maronie şi un embrion hexacant, cu 6 cârlige dispuse în
perechi.
536
21
Fig. 21.4.8.11 Ou de Taenia spp.

(preparat nativ în soluţie salină - imagine din colecţia proprie a laboratorului)
Hymenolepis nana. Ouăle sunt transparente, având dimensiuni de 47/37 µm. Prezintă un embrion
hexacant (cu trei perechi de cârlige) şi un inveliş dublu alcătuit dintr-o membrana externă fragilă şi
o membrana internă densă, cu două proeminenţe care-i conferă aspect de lămâie şi de la nivelul
cărora pornesc 4-8 filamente dispuse între cele două membrane ale oului.
Fig.21.4.8.12 Ou de Hymenolepis nana

Diphylobothrium latum. Ouăle sunt neembrionate, au aspect oval, culoare brună şi dimensiuni de
70/45 µm. Prezintă un înveliş extern dedublat, cu un opercul la unul din poli şi o mică proeminenţă
(carenă) la polul opus; în interior se găseşte celula-ou înconjurată de masa vitelină1;2 ;4 ;6.
537
Fig.21.4.8.13 Ouă de Diphylobothrium latum

(preparat nativ în soluţie Lugol – imagine de la www.dpd.cdc.gov)
Un rezultat pozitiv indică prezenţa parazitului dar aceasta nu implică întotdeauna că parazitul este
responsabil pentru simptomele pacientului5.
Un singur examen negativ nu exclude posibilitatea infestării parazitare.
Examenul pentru Giardia poate fi negativ în stadiile precoce ale infestării, în infestări cronice şi la
pacienţii care elimină ciclic parazitul.
Rezultate fals negative pot să apară dacă în săptămâna care precede testul, s-au administrat
bariu, bismut, Metamucil, uleiuri minerale, Tetraciclină, medicamente antiamoebiene, antidiareice,
antiacide.
În toate aceste cazuri se recomanda determinarea de antigen Giardia în fecale1;3..
Acest test nu este indicat pentru depistarea Toxoplasmei gondii, Toxocarei canis, Plasmodium spp sau
Trichomonas deoarece aceste organisme nu apar în materiile fecale.
Ouăle de Enterobius vermicularis sunt rar întâlnite în materiile fecale (doar în infestările masive)
datorită particularităţilor ciclului evolutiv. Atunci când există suspiciunea clinică se indică efectuarea
amprentei anale.
Pentru identificarea ouăchiştilor sporozoarelor digestive (Cryptosporidium parvum şi Cyclospora
cayetanensis) este necesară efectuarea de froturi colorate cu coloraţii speciale (Ziehl-Neelsen
modificată Hendricksen-Pohlentz)4.
Bibliografie
1. Dan Steriu. Infecţii parazitare, Editura Ilex, Bucureşti 2003, 26-34, 152-155, 161-166, 221-226,
231-234, 243-246, 247-250.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Giardia
538
21
lamblia by EIA and Ova and Parasites Examination. www.labcorp.com. 2003. Ref Type: Internet
Communication.
4. Lidia Lazăr. Compendiu de parazitologie medicală – Paraziţii în Patologia Umană. Editura
Universitară “Carol Davila”, Bucureşti, 2006.
5. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Parasitic Examination. www.
6. Simona Rădulescu, Meyer Ernest. Diagnosticul bolilor parazitare. În Parazitologie medicală,
Editura All, Bucureşti, 1992, 271-275.
7. Valeriu Ştefănoiu. Diagnosticul infecţiilor parazitare. Prezentare Congres SRML 2010.
8. World Health Organisation Geneva Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology, 1991.
539
540
21
21.4.9 Examen coproparazitologic (direct + examinare în strat gros)
Prin metoda de examinare în strat gros se pot decela ouăle de helminţi (cu precădere ouăle cu coajă
groasă) cu localizare intestinală: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Taenia spp, etc.
Avantajele metodei:
1. Examinându-se o cantitate mai mare (de aproximativ 7 ori) de materii fecale decât în cazul
examenului direct, creşte probabilitatea de depistare a ouălor, chiar şi în cazul infestărilor cu eliminare
redusă a acestora în materiile fecale.
2. Majoritatea ouălor îşi păstrează caracteristicele morfologice, fiind uşor de identificat.
Pentru o creştere a eficienţei examenului coproparazitologic şi o diagnosticare cât mai corectă a
infestărilor parazitare cu localizare intestinală este recomandată utilizarea ambelor metode, atât
examenul direct cât şi examinarea în strat gros (metoda Kato-Miura), precum şi efectuarea a 2 - 3
examene coproparazitologice, la interval de 7-10 zile1 ;3.
Pregătire pacient - pacientul va evita:
- în săptămâna premergătoare recoltării, administrarea anumitor medicamente: bismut, Metamucil,
unei alune, din 3 locuri diferite ale bolului fecal2.
Cauze de respingere probei
- specimen contaminat cu urină2;4.
Stabilitate probă - câteva ore la temperatura camerei sau până a doua zi, la frigider4.
Prelucrare necesara după recoltare - analiza se execută din materii fecale proaspat emise (de
preferat); dacă acest lucru nu este posibil, proba va fi păstrată la 2-8°C2;5.
Metodă - examen microscopic direct (între lamă şi lamelă)2;4.
Valori de referinţă - examen negativ pentru paraziţi2.
Această metodă este mai puţin eficientă în identificarea paraziţilor flagelaţi (de exemplu, Giardia
lamblia) şi a amoebelor (de exemplu, Entamoeba spp) deoarece, în soluţia de lucru, chisturile pot
avea un contur retractat, făcând dificilă identificarea lor1;3.

541
Bibliografie
1. Dan Steriu. Infecţii parazitare, editura Ilex Bucureşti, 2003, 26-34, 152-155, 161-166, 221-226,
231-234, 243-246, 247-250.
3. Simona Rădulescu, Meyer Ernest. Diagnosticul bolilor parazitare. În Parazitologie medicală,
editura All, Bucureşti, 1992; 276.
4. World Health Organisation Geneva Basic Laboratory Methods în Medical Parasitology, 1991.
542
21
21.5 TRACT UROGENITAL
21.5.1 Antigen Chlamydia trachomatis
Chlamydia este o bacterie de dimensiuni foarte mici, obligatoriu intracelulară datorită faptului că nu
îşi poate sintetiza ATP-ul, fiind cultivabilă doar în celulele vii eucariote (ouă embrionate sau culturi
celulare) 2;3;4;5.
Pe baza analizelor genetice membrii Ordinului Chlamydiales au fost împărţiţi în două genuri:
• genul Chlamydia care cuprinde trei specii, dintre care cea mai importantă este C.
trachomatis;
• genul Chlamydophila ce cuprinde şase specii, mai importante fiind C. pneumoniae, C.
psittaci, C.abortus1;2;3;4;6.
Chlamydiile au perete şi membrană celulară asemănătoare bacteriilor Gram negative; au formă
cocoidă şi sunt imobile. Diferă însă de toate microorganismele prin ciclul lor de creştere particular,
asigurat de 2 forme distincte: corpusculul elementar (CE), adaptat existenţei extracelulare, CE fiind
foarte infecţios şi corpusculul reticulat (CR), adaptat mediului intracelular (intracitoplasmatic), forma
neinfecţioasă. După ataşarea lor de celulă, CE traversează peretele celular prin intermediul unui
fagozom şi rămân în vezicula fagocitară pe toată perioada ciclului lor de viaţă. La scurt timp de la
pătrunderea în celulă, CE se transformă în CR, care au o talie mai mare şi încep să se dividă binar
în interiorul vacuolelor (“incluziile chlamydiene intracitoplasmatice”). Apoi CR se reorganizează în CE
astfel încât după 48-72 de ore întreaga citoplasmă a celulei poate fi înlocuită de incluzii care conţin
sute/mii de CE. Eliberarea CE se poate produce prin extruziunea incluziilor sau prin liza celulelor
gazdă1;2;3.
Două componente din structura membranei externe a corpusculului elementar (CE) joacă un rol
important în diagnostic: proteina majoră a membranei de suprafaţă – MOMP (major outer membrane
protein) şi antigenele lipopolizaharidice. MOMP este o proteină transmembranară ce induce apariţia
de anticorpi monoclonali, specifici anti-MOMP, rolul lor în imunitate nefiind neelucidat. Antigenele
lipopolizaharidice sunt antigenele majore detectate prin teste serologice specifice infecţiilor produse
cu Chlamydia1;2.
Chlamydia trachomatis
Este întâlnită aproape în exclusivitate la om. Ea determină până la 50% din uretritele nongonococice.
Se cunosc 15 serovaruri, toate implicate în patologia umană:
• serovarurile A, B, Ba, C: determină conjunctivită acută (cu posibilă cronicizare: trachomul);
• serovarurile D – K pot determina:
- la bărbaţi, în principal uretrită acută (eventuala cronicizare conduce la uretrită cronică, prostatită,
epididimită, proctită, sindrom Reiter, infertilitate);
- la femei, sindrom uretral acut, bartolinită, cervicită, endometrită, salpingită (cu apariţia ulterioară de
boală inflamatorie pelvină, sarcină ectopică, infertilitate), periapendicită, perihepatită (sindrom Hugh-
Curtis);
543
• serovarurile L1, L2, L3 determină limfogranulomatoză veneriană (maladia Nicolas Favre), având
tropism pentru ţesuturile limfatice1;2;3;4;5;.
Chlamydia trachomatis se poate transmite la nou-născut în timpul naşterii, determinând pneumonia
neonatală, şi, mai rar infecţii vaginale, faringiene şi enterice neonatale.
Infecţia cu C. trachomatis se asociază cu creşterea ratei de transmitere a infecţiei HIV4.
Sunt disponibile mai multe metode de laborator pentru diagnosticul infecţiei cu Chlamydia
trachomatis:
• culturi de celule (HeLa, McCoy etc.) - reprezintă metoda de referinţă (foarte laborioasă);
• examen direct pe frotiu colorat Giemsa - poate evidenţia incluziile intracitoplasmatice; are sensibilitate
mai redusă, dar poate fi utilizat în diagnosticul conjunctivitei;
• detectarea antigenului prin metode imunochimice: imunofluorescenţă directă (DFA), teste
imunoenzimatice (EIA) sau teste rapide (imunoperoxidaze, latex) - are sensibilitate mai redusă decât
culturile de celule şi nu este indicată în infecţiile asimptomatice;
• evidenţierea unor secvenţe de acizi nucleici prin hibridizare (Nucleic Acid Hybridization-NAH) sau
amplificare genică (Polimerase Chain Reaction - PCR) - are sensibilitate mai mare decât culturile de
celule;
• examen serologic - are valoare limitată pentru diagnosticul infecţiilor genitale joase cu C. trachomatis,
dar este valoros pentru diagnosticul infecţiilor asociate cu salpingită, infertilitate mecanică, perihepatită,
epididimită, sindrom Reiter4,5; .
Determinarea antigenului Chlamydia în secreţii urogenitale reprezintă o metodă cost-eficientă pentru
diagnosticul infecţiei6.
Pentru detecţia antigenului C.trachomatis în secreţiile genitale este necesară recoltarea de celule
epiteliale din zonele suspecte, de obicei cu tamponul, prin rotire viguroasă. Secreţiile purulente (dacă
există) trebuie îndepărtate înaintea recoltării probei. Pot fi utilizate tampoane de bumbac, Dacron sau
calcium alginate1;4;6. După recoltare tamponul va fi introdus în tubul furnizat de către laborator.
În cazul suspiciunii de coinfecţie cu Neisseria gonorrhoeae, se recoltează întâi proba pentru aceasta
şi apoi cea pentru determinarea antigenului C. trachomatis4.
Zonele recomandate pentru recoltare sunt:
• uretra anterioară la bărbaţi - prin introducerea tamponului 2-4 cm pe uretră şi rotire uşoară;
• colul uterin la femei - din canalul endocervical, deoarece C.trachomatis are tropism pentru celulele
zonei tranziţionale. Nu se recomandă recoltarea secreţiei vaginale pentru determinarea antigenului
Chlamydia.
Testul mai poate fi efectuat la bărbaţi din primul jet de urină - care reprezintă primii 5-10 ml urină
recoltaţi la cel puţin o oră de la ultima micţiune. Nu este necesar şi nu reprezintă un avantaj obţinerea
primului jet din urina de dimineaţă6.
Stabilitatea probei – probele urogenitale sunt stabile 7 zile la 2-8 ºC.
Metodă - imunochimică prin tehnica ELFA (enzyme-linked immunofluorescence assay): se utilizează
anticorpi monoclonali direcţionaţi împotriva antigenelor lipopolizaharidice (LPS) ale Chlamydiei;
rezultatele pozitive şi echivoce sunt confirmate cu ajutorul unui test de blocare.
544
21
Valori de referinţă - Antigen Chlamydia negativ6.

Orice rezultat trebuie interpretat în context clinic. Un rezultat negativ nu exclude infecţia cu
C.trachomatis.
Obţinerea unui rezultat pozitiv indică o infecţie curentă6.
Colectarea probei este esenţială pentru determinarea antigenului Chlamydia. Personalul care face
recoltarea trebuie să fie bine instruit pentru a evita eventualele rezultate fals negative ca urmare a
erorilor de recoltare.
Rezultatele obţinute în urma determinării antigenului Chlamydia din urină trebuie interpretate cu
prudenţă în cazul în care se suspectează o infecţie urinară.
Un rezultat negativ nu exclude infecţia; în cazul suspiciunii clinice se recomandă determinarea
Chlamydia trachomatis ADN.
Detectarea Chlamydiei prin culturi de celule este singura metodă ce poate fi folosită în vederea
documentării unui eventual abuz sexual1;2;4.
Bibliografie
1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Obligate Intracellular and Nonculturabile
Bacterial Agents. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 510-524.
2. Gail L. Woods, David H. Walker - Chlamydial, Rickettsial, and Mycoplasmal Infections. Henry’s
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 21st ed, 2007, 1000- 1015.
3. J.D.C.Diaconu, O.A.Coman, V.Benea.Tratat de terapeutica dermato-venerologică. În Viaţa
Medicală Românească, România ed. 2002, 780-790.
4. James B.Mahony, Brian K.Coombes, Max A.Chernesky.Chlamydia and Chlamydophila. In
Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray et al., ASM PRESS, USA, 8th ed. 2003, 991-
1004.
5. Koneman’s - Diagnosis of Infections,Caused by Viruses, Chlamydia, Rickettsia, and Related
Organisms In: Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th ed., 2006, 23: 1328-1419.
21.5.2 Antigen Neisseria gonorrhoeae în secreţii urogenitale
Gonoreea, infecţie cauzată de Neisseria gonorrhoeae, constituie una din cele mai frecvent întâlnite
boli cu transmitere sexuală. Deoarece microorganismul necesită condiţii speciale de cultivare s-au
dezvoltat teste rapide pentru punerea în evidenţă a antigenului gonoreic ce pot fi un instrument util în
diagnosticul infecţiei.
545
Testul efectuat în laboratorul Synevo are la bază o metodă imunologică ce foloseşte anticorpi mono-
şi policlonali pentru identificarea specifică a antigenului N. gonorrhoeae. Acest test este ideal pentru
screening-ul probelor ce conţin o încărcătură bacteriană ≥ 1 x 105/mL. Are o sensibilitate de 98.3% şi
o specificitate de 97.8%1.
Recoltarea probei
Pentru recoltare sunt recomandate următoarele probe:
• la femei secreţie vaginală recoltată prin introducerea tamponului în vagin şi rotire uşoară a
acestuia;
• la bărbaţi secreţie uretrală recoltată prin introducerea tamponului 2-4 cm pe uretra anterioară şi rotire
uşoară;
Tampoanele vor fi transportate la laborator fără a folosi mediu de transport. În cazul în care pacienţilor
trebuie să li se recolteze mai multe probe (pentru cultură, antigen Chlamydia sau Mycoplasma) se va
preleva mai întâi secreţia pentru antigenul N. gonorrhoeae1.
Stabilitate probă – testul va fi efectuat in aceeasi zi1.
Valori de referinţă - Antigen N. gonorrhoeae negativ1.
Investigaţia constituie un test screening pentru detectarea antigenului Neisseria gonorroeae. Dacă
rezultatul testului este negativ dar simptomatologia clinică este sugestivă pentru prezenţa infecţiei se
recomandă o nouă recoltare a probei cu efectuarea examenului microscopic şi a culturii1.
Bibliografie
21.5.3 Cultură şi identificare Mycoplasma hominis şi Ureaplasma urealyticum
Mycoplasmele sunt cunoscute ca fiind cele mai mici forme biologice ce pot supravieţui singure.
Spre deosebire de toate celelalte bacterii, aceste procariote nu au perete celular. Mycoplasmele
sunt ubicuitare regnului vegetal şi animal, dar Mycoplasma spp. şi Ureaplasma urealyticum
colonizează şi infectează omul şi nu se găsesc la animale. Ele reprezintă cele 2 genuri ale familiei
Mycoplasmataceae5.
Mycoplasmele fac parte din flora microbiană a omului şi se găsesc în special la nivelul orofaringelui,
tractului respirator superior şi tractului urogenital. De aceea, ele sunt considerate în principal
microorganisme comensale.
546
21
Implicarea M. genitalium, M. pirum, M. penetrans şi M. fermentans în bolile umane este incertă;

habitatul şi transmisia acestor mycoplasme sunt necunoscute.
Sunt cunoscute 3 specii a căror izolare prezintă semnificaţie (M. pneumoniae, U. urealyticum şi M.
hominis) deoarece rolul lor în infecţiile umane este foarte bine stabilit: U. urealyticum şi M. hominis se
pot izola din tractul genito-urinar, în timp ce M. pneumoniae se izolează din tractul respirator.
Mycoplasmele şi ureaplasmele pot coloniza tractul genital al nou-născuţilor în timpul naşterii.
Ureaplasma a fost izolată la aproximativ 1/3 din fetiţe, iar Mycoplasma spp. într-un procent mai mic,
în timp ce la băieţi această colonizare este mai redusă. De asemenea atât mycoplasmele cât şi
ureaplasmele au fost izolate de la nivelul nasului şi faringelui la 15% dintre nou-născuţi.
În general, această colonizare nu persistă peste vârsta de 2 ani, însă, odată cu pubertatea apare din
nou colonizarea cu aceşti germeni, ca urmare a începerii vieţii sexuale.
Colonizarea tractului genital cu Ureaplasma este de patru ori mai frecventă decât cea cu Mycoplasma
spp. şi este mai frecventă la femei decât la bărbaţi. Prezenţa lor este dificil de interpretat, aceasta
reflectând probabil colonizarea2.
Variabilitatea antigenică, capacitatea de a suprima răspunsul imun al gazdei, rata mică de proliferare
şi localizarea intracelulară ar putea explica natura cronică a infecţiilor cu Mycoplasma spp. şi
incapacitatea frecventă a gazdei de a suprima infecţia prin răspunsuri imune şi non-imune3.
Unele specii, de ex. M. pirum, M. penetrans şi M. fermentans au fost implicate drept cofactori infecţioşi
în infecţia cu HIV, fiind detectate în aproximativ 20% din cazuri. Ele pot influenţa patogeneza infecţiei
cu HIV prin activarea sau supresia specifică şi directă a sistemului imun, producţia de superantigene,
cu alterări ulterioare ale răspunsurilor imune, sau prin contribuţia la stresul oxidativ. Infecţia cu HIV ar
putea creşte susceptibilitatea acestor pacienţi la infecţii cu diferite specii de mycoplasme, de ex. M.
fermentans3.
Aspecte clinice
Infecţiile provocate de mycoplasme sunt asimptomatice în 30-70% din cazuri.
Mycoplasma hominis şi Ureaplasma urealyticum sunt implicate într-o gamă variată de afecţiuni
urogenitale: boală inflamatorie pelvină, sterilitate, avort septic, uretrite nongonococice la bărbaţi, rar
orhiepididimite, sindrom uretral la femei, infecţii puerperale acute (subacute şi cronice), pielonefrite,
peritonite, sindrom Reiter. Anumite serotipuri sunt implicate în etiopatogenia infertilităţii4.
Dismicrobismul vaginozelor include frecvent şi M. hominis. Tot M. hominis poate da, rareori, vaginite
prepubertare1.
Transmiterea se poate face prin contact direct între gazde, vertical de la mamă la făt, prin infecţii
nosocomiale şi prin transplant.
Din totalul uretritelor nongonococice, 20-25% sunt provocate de M. hominis, U. urealyticum şi M.
genitalium. Aceşti agenţi colonizează vaginul femeilor care au contact cu mai mulţi parteneri. Clinic se
manifestă ca: vaginite, cervicite, bartholinite, febră puerperală şi chiar sterilitate.
Ureaplasma poate cauza inflamaţii placentare, poate invada sacul amniotic, provocând infecţii
persistente şi complicaţii la naştere. Mycoplasma hominis şi Ureaplasma urealyticum au fost izolate,
în aproximativ 10% din cazuri, din sângele femeilor cu febră puerperală sau avort, dar nu şi de la
femeile afebrile care au avut avorturi sau la gravidele sănătoase.
547
La persoanele cu sistem imun intact, M. hominis şi U. urealyticum sunt, de obicei, germeni comensali
ai mucoasei tractului genital inferior, prezenţa lor nefiind asociată cu manifestari clinice. Virulenţa lor
este scăzută, comportându-se ca oportunişti. Prezenţa lor în această zonă în procente diferite este
explicată prin modul de comportament şi se referă la: statutul economic, comportamentul sexual şi
numărul partenerilor sexuali5.
Infecţiile cu M. hominis şi U. urealyticum, alături de Chlamydia trachomatis, sunt considerate boli
venerice “de generaţia a III-a”; infecţiile evoluează cronic şi produc o serie de complicaţii, afectând
calitatea vieţii individului. Aceste persoane pot rămâne mult timp “purtători sănătoşi” ai infecţiei, surse
în vehicularea agenţilor infectioşi pe cale sexuală.
În vederea reducerii morbidităţii se impun: depistarea şi tratarea corectă a bolnavilor, controlul periodic
al acestora pentru evitarea recidivelor şi educaţia sanitară în rândul populaţiei active sexual.
Diagnosticul de laborator
Probele corespunzătoare pentru cultivarea mycoplasmelor sunt: sânge, lichid sinovial, lichid amniotic,
LCR, urină, secreţie prostatică, spermă, spută, lichid pleural, lavaj bronho-alveolar etc., în funcţie
de condiţiile clinice şi de suspiciunea de diagnostic. În laboratoarele Synevo se efectuează numai
determinări din secreţii urogenitale: secreţie vaginală, secreţie uretrală, urină primul jet doar la bărbati
şi spermă4.
Recoltarea secreţiilor vaginale şi uretrale se efectuează pe tampon; se va asigura rotirea viguroasă
a tamponului pentru obţinerea de celule potenţial infectate cu mycoplasme. Tamponul va fi introdus în
recipientul furnizat de laborator.
Determinarea mai poate fi efectuată la barbaţi din urină-primul jet după centrifugare (din sediment),
din spermă sau după masaj prostatic. Nu se recoltează probe dacă s-au administrat lubrifianţi sau
antiseptice locale. Se recomandă tampoane de Dacron, calcium alginate sau poliester, cu mâner de
plastic sau aluminiu, deoarece alte materiale pot avea un efect inhibitor asupra mycoplasmelor.
Mycoplasmele sunt microorganisme foarte sensibile în condiţii de mediu cald şi uscat. De aceea,
probele trebuie recoltate pe mediu de transport corespunzător.
Probele pot fi păstrate 48 de ore la 2-8ºC.
Prelucrarea probelor, valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor
În laboratorul Synevo pentru cultura şi identificarea Mycoplasma hominis şi Ureaplasma urealyticum
se foloseşte un kit ce combină cultura în bulionul selectiv cu stripul ce conţine 22 teste. Bulionul
furnizează condiţii optime de creştere a Mycoplasmei (pH, substraturi, asocierea mai multor factori de
creştere). Dacă o cultură în bulion este pozitivă, atunci substraturile specifice (uree pentru Ureaplasma
spp şi arginină pentru M. hominis) şi indicatorul de culoare roşu fenol prezente în bulion vor conduce
la schimbarea culorii, ca urmare a creşterii pH–ului.
După inoculare, bulionul este dispersat în strip, iar citirea se face la 24 ore şi la 48 ore. Acesta
furnizează simultan rezultate pentru identificare, apreciere semicantitativă şi testarea susceptibilităţii
la 9 antibiotice (Doxiciclină, Josamicină, Ofloxacină, Eritromicină, Tetraciclină, Ciprofloxacină,
Azitromicină, Claritromicină, Pristinamicină).
Ureaplasma urealyticum – Negativ.
548
21
Mycoplasma hominis – Negativ.

În cazul unor rezultate pozitive sunt posibile două situaţii:
- Ureaplasma urealyticum şi/sau Mycoplasma hominis >104 UFC/probă; va fi comunicată
antibiograma;
- Ureaplasma urealyticum şi/sau Mycoplasma hominis <104 UFC/probă; va fi comunicată antibiograma
împreună cu următorul comentariu: “Având în vedere că Mycoplasama hominis şi Ureaplasma
urealyticum fac parte din flora comensală a mucoasei tractului urogenital, medicul va interpreta
oportunitatea tratamentului in funcţie de contextul clinic”.
Rezultatul echivoc se comunica atunci când trusa nu poate fi interpretată.
Acest aspect apare datorită prezenţei în probă a florei microbiene (alta decât Mycoplasma şi
Ureaplasma) dotată cu echipament enzimatic care metabolizează substraturile specifice şi virează
indicatorul de culoare din trusă. În acestă situaţie va fi comunicat rezultatul echivoc împreună cu
următorul comentariu: “Probă contaminată bacterian, rugăm repetarea recoltării după efectuarea
tratamentului adecvat”4.
Bibliografie
1. Daniela Bădescu. Identificarea Micoplasmelor şi Ureaplasmelor. În Tratat de Microbiologie Clinică.

Dumitru Buiuc, Marian Neguţ, Editura Medicală, România, Editia a II-a. 2008; 36:928-934.
2. J.D.C.Diaconu, O.A.Coman, V.Benea. Tratat de terapeutică dermato - venerologică. În Viaţa
Medicală Românească, România ed. 2002, 790-793.
3. Ken B.Waites, David Taylor-Robinson. Mycoplasma and Ureaplasma. In Manual of Clinical
Microbiology. Patrick R. Murray et al, ASM PRESS, USA,9-Th Edition. 2007;64:1004-1020.
5. Olga-Mihaela Dorobat.Familia Mycoplasmataceae. In Bacteriologie Medicala. Universitatea “Titu
Maiorescu”, Romania ed. 2006;32:429-435.
21.5.4 Examenul bacteriologic al secreţiei uretrale
Uretra masculină reprezintă calea ascendentă de acces a infecţiei spre tractul urinar inferior şi tractul
genital. Tractul genital masculin, alcătuit din prostată, canale ejaculatoare, vezicule seminale, canale
deferente, epididim, testicule este, în mod normal, steril. Această condiţie este asigurată prin acţiunea
mecanică a micţiunii şi ejaculării, şi mai ales prin acţiunea antibacteriană a unui polipeptid (care
conţine zinc) eliminat prin secreţia prostatică2.
Clasificarea infectiilor de tract genital masculin
549
În funcţie de localizare, infecţiile genitale masculine se clasifică în: uretrite, prostatite, epididimite şi
orhite.
Uretritele
În funcţie de etiologie se împart în:
• uretrite gonococice – cu mai multe forme clinice: în peste 70% din cazuri au evoluţie acută, cu
disurie marcată şi scurgere uretrală frecvent purulentă, iar în aproximativ 5–10% din cazuri infecţia
evoluează inaparent. Netratată, gonoreea se cronicizează şi pot apărea complicaţii (prin propagare
canaliculară şi limfatică la prostată şi epididim) şi sechele (stricturi uretrale). Infecţia se poate generaliza
pe cale sangvină şi pot apărea interesări articulare (localizare metastatică)2. Uretritele gonococice pot
apărea şi în cazul infecţiilor duble (de exemplu, gonococ + C. trachomatis sau U. urealyticum), în care
perioada de incubaţie a celeilalte infecţii este mai mare decât a celei gonococice. Pe de altă parte, pot
apărea uretrite cu Cryptococcus neoformans, posibil favorizate de terapia cu tetracicline a gonoreei.
Există şi cazuri de reinfecţii gonococice, eventual consecutive unui eşec terapeutic în cazul tulpinilor
de N. gonorrhoeae secretoare de beta-lactamază2.
• uretrite non-gonococice – evoluează cu disurie mai puţin intensă şi se însoţesc doar în aproximativ
38% din cazuri de scurgere uretrală, care este arareori purulentă. Etiologia este dominată de C.
trachomatis (50%), urmată de Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis,
virus Herpes simplex. Bacilii Gram negativi pot fi implicaţi ca agenţi etiologici la pacienţii cu stricturi
uretrale sau la cei cu fimoză. În cazuri rare sifilisul poate debuta cu şancru uretral2.
Prostatite
Evoluează cu reacţie inflamatorie în secreţia prostatică, bacteriurii şi piurii intermitente. Apar, de
obicei, pe cale ascendentă, pornind de la o uretrită.
Clasificare:
• prostatite bacteriene:
- acute: cel mai frecvent determinate de N. gonorrhoeae;
- cronice: mai frecvent - C. trachomatis, Enterobacteriaceae, pseudomonade, enterococi; mai
rar Staphylococcus saprophyticus, Trichomonas vaginalis. Pot apărea localizări metastatice
în infecţii sistemice (tuberculoză sau micoze – blastomicoză, coccidioidomicoză, criptococoză,
histoplasmoză)
• prostatite non-bacteriene: rar Candida spp.
Prostatodinia reprezintă un sindrom caracterizat prin simptomatologie asemănătoare prostatitei, dar
fără reacţie inflamatorie în secreţia prostatică1,2.
Epididimite
Apar tot ca infecţii ascendente, ca urmare a unei prostatite sau uretrite. Ca factor favorizant amintim
traumatismele locale (instrumentaţie urologică), mai ales în condiţii de bacteriurie.
Din punct de vedere etiologic se descriu:
- epididimite bacteriene nespecifice: cel mai frecvent cauzate de Enterobacteriaceae, urmate de
pseudomonade şi ocazional coci Gram pozitivi;
- epididimite cu transmitere sexuală: produse de C. trachomatis, N. gonorrhoeae;
- epididimite în boli sistemice: apar rar în tuberculoză, blastomicoză.
Complicaţii posibile:
550
21
- extinderea infecţiei: orhiepididimită, hidrocel, infarct testicular, abcese scrotale cu posibilă

fistulizare;
- cronicizare;
- supuraţii, ce necesită intervenţii chirurgicale1,2.
Orhite determinate de:
- virusuri: virusul urlian şi virusul Coxsackie B, ce infectează testiculele uni- sau bilateral, pe cale
hematogenă;
- bacterii: infecţia apare prin contiguitate de la o epididimită1,2.
Diagnosticul uretritelor
Prelevarea probei trebuie efectuată la cel puţin 2 ore de la ultima micţiune cu ajutorul unui tampon
steril. La pacienţii cu secreţie discretă se recomandă reducerea ingestiei de lichide începând din ziua
premergătoare recoltării, iar prelevarea se efectuează înainte de micţiunea matinală.
Când proba nu poate fi prelevată de la nivelul meatului urinar, se recoltează intrauretral cu tamponul
sau cu ansa de platină. Examinarea necesită recoltarea a 2 tampoane (pentru microscopie şi cultură).
Se inserează blând tamponul pe uretră cca 2 cm, se roteşte şi se retrage uşor. Recoltarea celui de-al
doilea tampon se va efectua prin inserarea lui mai profund decât primul cu cca 1 cm. De corectitudinea
recoltării depinde evidenţierea C. trachomatis (care se multiplică intracelular) şi mycoplasmelor (care
aderă de uroepiteliu)2;3.
În cazul suspiciunii de infecţie cu Trichomonas vaginalis recoltarea se efectuează înainte de micţiunea
matinală; tamponul se imersează în 1 ml soluţie salină izotonă încălzită la 37ºC pentru examen
microscopic direct2;3. În laboratoarele Synevo se utilizează mediul Vagicult.
Pentru examen microscopic colorat se efectuează 2 frotiuri: unul colorat Gram (pentru aprecierea
morfologiei şi tinctorialităţii bacteriene) şi cel de-al doilea colorat Giemsa (pentru aprecierea reacţiei
inflamatorii).
Însămânţarea se realizează pe agar Columbia cu 5% sânge de berbec, agar chocolate (ambele
incubate 24 – 48 de ore, în atmosferă cu 5% CO2) şi geloză lactozată (cu incubare 24 de ore în
atmosferă obişnuită) în funcţie de suspiciunea clinică3.
Germenii izolaţi se identifică până la nivel de specie şi se efectuează antibiograma, ţinând cont de
corelarea culturii cu examenul microscopic.
Pentru evidenţierea C. trachomatis şi Mycoplasma spp. consultaţi capitolele respective. Mycoplasmele
izolate în cantitate > de 10000 unităţi au semnificaţie clinică, în cantităţi mai mici, se consideră
portaj2.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Genital tract infections. In Bailey and Scott’s
Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002, 939-953.
2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital masculin. În Tratat de
Microbiologie Clinică. Dumitru Buiuc, Marian Neguţ, Medicală, România,1 ed. 1999, 295 - 304.
551
21.5.5 Examen microscopic preparat prospăt

şi colorat şi cultură din secreţie vaginală
Flora normală a tractului genital feminin variază în funcţie de pH-ul şi concentraţia de estrogeni a
mucoasei, aflate în strânsă corelaţie cu vârsta, astfel:
- prepubertar şi postmenopauză flora este dominată de stafilococi şi corinebacterii (aceeaşi floră pe
care o găsim pe suprafaţa epiteliului);
- la femeile active sexual flora microbiană se modifică, fiind alcătuită din Enterobacteriaceae,
streptococi, stafilococi, bacterii anaerobe (lactobacili, bacili anaerobi nesporulaţi, coci anaerobi).
Lactobacilii reprezintă flora microbiană vaginală normală la aceste femei.
Streptococul hemolitic grup B (Streptococcus agalactiae) este prezent în flora vaginală şi poate fi
transmis la nou - născuţi (cu apariţia de complicaţii neonatale)1.
Clasificarea infectiilor de tract genital feminin
Infecţiile genitale feminine reprezintă o cauză frecventă de consult ginecologic. Ele pot evolua ca:
• infecţii endogene, determinate de microorganisme din flora vaginală normală;
• infecţii exogene, cauzate în special de microorganisme cu transmitere sexuală:
- bacterii (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis - serotipurile D-K, Treponema
pallidum)
- virusuri (Herpes simplex - tip 2, Papillomavirus)
- protozoare (Trichomonas vaginalis).
O altă clasificare împarte infecţiile de tract genital feminin în:
• infecţii genitale joase - afectează vulva, vaginul şi cervixul - apar, de obicei, ca urmare a unui contact
sexual infectant sau ca urmare a unui dezechilibru al florei genitale normale.
• infecţii genitale înalte - interesează uterul, trompele uterine, ovarele - apar frecvent ca extindere
a infecţiilor genitale joase. Se consideră că microorganismele existente în vagin şi
cervix pătrund în cavitatea uterină şi pot ajunge prin endometru la nivelul trompelor şi al
ovarelor1;2.
Infecţiile genitale joase
Infecţiile vulvare pot fi bacteriene, virale, micotice sau parazitare şi se pot manifesta fie izolat, fie
asociate cu vaginite. Pot fi:
- infecţii comune: foliculite, furuncule, piodermite;
- infecţii specifice: Trichomonas vaginalis, infecţii micotice, Treponema pallidum, Herpes simplex - tip
2, Papillomavirus (mai ales 6 şi 11);
- mai rar Sarcoptes scabiae.
Bartholinita (inflamaţia glandelor Bartholin, situate la joncţiunea dintre vulvă şi vagin), poate fi
determinată de Neisseria gonorrhoeae, C. trachomatis sau prin exacerbarea florei genitale locale.
Blocarea conductului glandular prin procesul inflamator poate determina un abces din care se pot
izola germeni aerobi şi anaerobi.
Vaginita (descrisă de cele mai multe ori ca vulvovaginită) poate fi:
- specifică: produsă de fungi, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Papilomavirus;
552
21
- nespecifică: - produsă prin multiplicarea florei vaginale normale;

- produsă de corpi străini – în cazul prezenţei de dispozitive contraceptive sau, la fetiţe,
prin introducerea accidentală a corpilor străini în vagin.
Staphylococcus aureus, prezent în vagin la 5-10% dintre femeile sănătoase, poate cauza scurgeri
purulente şi şoc toxic în condiţiile utilizării de tampoane hiperabsorbante în perioada menstruală.
La fetiţe sunt posibile vulvovaginite cu N. gonorrhoeae, C. trachomatis sau Streptococcus pyogenes.
În cazurile cu igienă precară sunt posibile cazuri de vulvovaginite cu Enterobius vermicularis, prin
migrarea parazitului în vagin.
Vaginoza - sindrom infecţios neinflamator - constă în înlocuirea florei lactobacilare normale cu specii
bacteriene anaerobe (Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphyromonas spp, Peptostreptococcus
spp, Mobiluncus spp) asociate cu Gardnerella vaginalis. Aceste specii bacteriene fac parte din flora
normală a vaginului, dar în cazul vaginozelor multiplicarea lor este de până la 1000 ori mai mare. Deşi
infecţia evoluează cu precădare în perioada de activitate sexuală, ea poate apărea şi la adolescente
şi preadolescente.
Cervicita
Exocolul uterin poate fi afectat de:
- T. vaginalis, Candida albicans – infecţii ce evoluează ca cervico-vaginite;
- Papillomavirus (mai ales tipurile 16 şi 18) – implicat în etiologia neoplaziilor cervicale
intraepiteliale;
- Herpes simplex tip 2 – evoluează cu leziuni ulcerative endo şi exocervicale.
Endocolul uterin poate fi sediul infecţiilor cu:
- N. gonorrhoeae – poate evolua asimptomatic la aproximativ 30% dintre femeile infectate.
Contaminarea mucoasei uretrale şi rectale poate determina localizări concomitente la
aceste nivele, cu manifestări clinice de uretrită sau proctită;
- C. trachomatis (serotipurile D-K) - nu determină vaginită. Deseori, pacientele au infecţie
cu etiologie dublă (gonococ cu Chlamydia). În laboratoarele Synevo se poate diagnostica
infecţia cu C.trachomatis prin depistarea antigenului în secreţia recoltată de la nivelul
endocolului. Nu se recomandă recoltarea din fundul de sac posterior (pot apărea rezultate
fals negative)1,2,3.
Diagnosticul infecţiilor genitale joase
Recoltarea produselor patologice se efectuează în cabinetele de ginecologie, cu instrumentar adecvat,
de obicei din fundul de sac vaginal posterior.
În momentul recoltării este bine a se efectua (chiar în cabinetul de consultaţie) două teste rapide care
pot orienta diagnosticul:
- determinarea pH-ului secreţiei vaginale cu ajutorul hârtiei indicator (un pH>5 poate indica
infecţie cu T. vaginalis sau prezenţa vaginozei);
- testul aminelor volatile (“whiff test”) – prin adăugarea câtorva picături de soluţie KOH 10%
peste secreţia vaginală recoltată pe valvă. Degajarea unui miros dezagreabil de peşte
alterat conduce la suspiciunea de vaginoză2.
În cadrul laboratoarelor Synevo, secreţia vaginală se recoltează pe două tampoane şi două lame de
microscopie:
553
- un tampon se introduce în recipientul Vagicult (un mediu special de îmbogăţire şi depistare

a Trichomonas vaginalis şi levurilor) din care se va efectua preparat proaspăt între lamă şi
lamelă. Examinarea se face cu obiectiv de 10x şi 40x şi permite evidenţierea parazitului T.
vaginalis, a levurilor – înmugurite şi hife - şi a reacţiei inflamatorii (intensă în trichomoniază,
discretă în candidoză şi absentă în vaginoză);
- cel de-al doilea tampon recoltat pe mediu de transport (Amies sau Stuart) va fi utilizat pentru
însămânţare pe medii de cultură;
- lamele de microscopie vor fi colorate Gram (pentru aprecierea florei vaginale) şi Giemsa
(pentru aprecierea reacţiei inflamatorii)3.
În condiţii normale, pe frotiul colorat Gram se observă bacili Gram pozitivi, drepţi sau uşor încurbaţi
cu laturile paralele, cu grosimea şi lungimea variabile până la polimorfism, uneori filamentoşi, care
reprezintă flora lactobacilară (bacili Döderlein, vezi figura 21.5.5.1)2. În vaginoze, flora lactobacilară
este înlocuită cu bacili Gram variabili (G. vaginalis, Bacteroides spp.) şi bacili Gram negativi încurbaţi
(Mobiluncus) – vezi figura 21.5.5.2. Vaginoza se caracterizează prin prezenţa de “clue cells” – celule
vaginale superficiale ce prezintă pe suprafaţa lor abundentă floră bacteriană (vezi figura 21.5.5.3).
Prezenţa formaţiunilor rotund-ovalare Gram pozitive este sugestivă pentru candidoza vaginală (vezi
figura 21.5.5.4)1;2.
Fig. 21.5.5.1: Lactobacillus spp.

(coloraţie Gram, x1000, imagine din colecţia proprie a laboratorului)
Aspect normal al unui prelevat vaginal: prezenţa a numeroase celule epiteliale pavimentoase,
polimorfonucleare puţine, bacili Doderlein
Fig. 21.5.5.2: Mobiluncus spp. Şi Gradnerella vaginalis

554
21
Fig. 21.5.5.3: Frotiu sugestiv pentru vaginoza bacteriană:

Fig. 21.5.5.4 Levuri prezente în secreţia vaginală

Vizualizarea cocilor Gram negativi “in diplo” cu aspect de boabe de cafea localizaţi predominant
intraleucocitar indică foarte probabil infecţia cu Neisseria gonorrhoeae (vezi figura 21.5.5.5).
Trichomonas vaginalis se observă cel mai bine pe preparatul nativ. Are formă rotund-ovalară cu
dimensiuni de 7-23/5-15 μm. Prezintă în mod normal 4 flageli anteriori şi unul posterior care îi conferă
o motilitate rapidă. De asemenea se mai pot observa membrana ondulantă şi un axostil care se mişcă
în lungul celulei. Parazitul mai poate vizualizat şi pe frotiul Gram (vezi figura 21.5.5.6).
Fig. 21.5.5.5 Neisseria gonorrhoeae

555
Fig. 21.5.5.6 Trichomonas vaginalis

Însămânţarea secreţiei recoltată pe tamponul cu mediu de transport se face pe mediul agar Columbia
cu 5% sânge de berbec şi un mediu lactozat cu incubare în atmosfera obişnuită 18 – 24 de ore la 35–
37ºC. Microorganismele izolate se identifică până la nivel de specie şi se efectuează antibiograma doar
la germenii a căror prezenţă a fost regăsită şi pe frotiul colorat Gram, alături de reacţia inflamatorie.
Se urmăreşte, de asemenea, prezenţa Streptococcus agalactiae la femeile gravide în ultimul trimestru
de sarcină3.
Dacă există suspiciunea de infecţie cu N. gonorrhoeae, incubarea se face în atmosferă cu 5% CO2.
În cazul suspiciunii de candidoză, proba se va însămânţa pe mediul Sabouraud cu Cloramfenicol3.
Candida albicans este normal prezentă în vaginul a 15 – 20% din femei, ajungând la 30% în trimestrul
al III-lea de sarcină. Prin urmare, este semnificativă pentru o infecţie cu Candida spp. colonizarea
masivă a vaginului2. După izolarea în cultură a levurilor se va trece la identificarea şi efectuarea
antifungigramei3.
La fetiţe, recoltarea se va face de la nivelul orificiului de deschidere a vaginului sau se poate recolta
endovaginal, dacă există instrumentar adecvat; se urmăreşte în special diagnosticarea vulvo-
vaginitelor cu S. pyogenes şi N. gonorrhoeae2.
Diagnosticul bartolinitei se face prin colectarea exsudatului purulent cu ajutorul a două tampoane: unul
pentru microscopie şi unul pentru însămânţare pe medii de cultură. Incubarea trebuie făcută atât în
condiţii de aerobioză cât şi anaerobioză; se urmăreşte în special prezenţa N. gonorrhoeae. În cazul
unui puroi “steril” se suspicionează infecţia cu C. trachomatis sau Ureaplasma urealyticum1,2.
Infecţiile genitale înalte
În funcţie de localizare:
- la nivelul mucoasei uterine: endometrite;
- dacă inflamaţia cuprinde şi muşchiul uterin: endomiometrite.
Infecţia acută survine: - postpartum sau postabortum (vaginoza fiind factor de risc) şi după explorări
sau intervenţii endouterine (histerosalpingografie, implantare de sterilet).
Etiologia lor este variată, fiind implicate bacterii aerobe şi anaerobe ce fac parte din flora endogenă
vaginală: Streptococ grup B, enterococi, Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis, bacili Gram
negativi anaerobi, Mycoplasma hominis, Clostridium perfringens (în avort septic provocat),
Streptococcus pyogenes etc2.
556
21
În 10 – 20% din cazuri, endometritele acute pot evolua cu bacteriemie.

Endometritele cronice (asociate cu endocervicite şi salpingite) pot fi determinate de C. trachomatis
(prin propagare ascendentă) sau Mycobacterium tuberculosis (pe cale hematogenă).
Inflamaţia epiteliului endotubar sau a trompei în general (salpingita) poate fi produsă de:
- M. tuberculosis, N. gonorrhoeae, C.trachomatis – prin propagare intracanaliculară;
- flora aero – anaerobă vaginală (în endometrite postabortum sau postpartum);
- inflamaţia mezosalpinxului şi a peritoneului ce acoperă ligamentul larg: anexita.
Deoarece localizarea anatomică precisă a infecţiei este greu de stabilit, se utilizează denumirea de
boală inflamatorie pelvină (diagnostic laparoscopic)2.
Diagnosticul infecţiilor genitale înalte
Recoltarea produsului patologic se realizează prin introducerea unui cateter sau a unei sonde
sterile în cavitatea uterină, la care se adaptează o seringă sterilă şi se aspiră lichid endometrial;
apoi se ataşează la seringă un ac steril, se protejează vârful acului cu un tampon de vată steril, se
îndepărtează bulele de aer, se obturează vârful acului cu un dop de cauciuc şi se trimite la laborator
în cel mai scurt timp.
În endometritele postpartum sau postabortum se efectuează şi hemoculturi pe medii aerobe şi
anaerobe.
În boala inflamatorie pelvină la care se suspectează infecţia cu C. trachomatis se poate recurge la
examen serologic.
Pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei genitale se recoltează sânge menstrual sau mucoasa
uterină chiuretată în perioada premenstruală2. În cadrul laboratoarelor Synevo nu se prelucrează
produse patologice pentru depistare BK.
Probele primite la laborator:
• se examinează microscopic pe frotiuri colorate Gram şi Giemsa;
• se însămânţează pe medii de cultură: agar Columbia cu 5% sânge de berbec (o placă pentru
incubare aerobă şi una pentru incubare anaerobă) şi agar Mac Conkey2,3.
Speciile bacteriene izolate se identifică până la nivel de specie şi se efectuează antibiograma. Testarea
sensibilităţii la antibiotice nu se efectuează în cazul germenilor anaerobi3.
Bibliografie
2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital feminin. În Tratat de
Microbiologie Clinică. Dumitru Buiuc, Marian Neguţ, Medicală, România,1 ed. 1999, 304-318,
672 - 675.
557
21.5.6 Cultură secreţie genitală pentru Streptococ grup B

(Streptococcus agalactiae)
Streptococcul agalactiae face parte din flora bacteriană normală a tractului genital feminin, tractului
respirator superior şi digestiv inferior. Colonizarea vaginală arată contaminarea de la nivelul rectului,
tractul gastrointestinal fiind principalul rezervor al organismului. Această colonizare este de obicei
asimptomatică sau poate aprărea sub forma unei vaginite care dispare după tratament.
Rata de colonizare vaginală este de 10-30%, fără diferenţe semnificative între femeile însărcinate şi
cele cu status fiziologic normal.
Transmiterea la nou-născut se realizează vertical în timpul travaliului şi este favorizată de: ruptura
prematură a membranelor cu 18 ore sau mai mult înaintea naşterii, febra în timpul travaliului şi travaliul
prematur - înainte de 37 săptămâni.
La nou-născut streptococii de grup B produc două tipuri de infecţii: timpurii şi tardive.
Infecţiile timpurii apar începând de la câteva ore de la naştere până la 7 zile, iar manifestările sunt cele
ale unei septicemii care se poate asocia cu meningita şi pneumonia.
Infecţiile tardive apar după 7 zile, până la 3 luni de la naştere, mai frecvent sub formă de meningită.
Prevenirea acestor infecţii se poate realiza în majoritatea cazurilor prin chimioprofilaxia intrapartum a
femeilor purtătoare de streptococ de grup B.
CDC (Centers for Disease Control and Prevention) în colaborare cu AAP (American Academy of
Pediatrics ) şi ACOG (American College of Obstetrics and Gynecology) au stabilit pentru prima dată
recomandările privind prevenirea infecţiilor neonatale cu Streptococcus agalactiae în 1996. Pentru a
scădea incidenţa acestor infecţii, în anul 2002 CDC a elaborat un ghid şi recomandă testarea tuturor
femeilor în săptămânile de sarcină 35-37 în vederea depistării portajului vaginal şi rectal de streptococ
de grup B1;2;3;4.
Recoltarea probei
Se va recolta probă pe tampon vaginal şi/sau rectal. Tamponul va fi introdus în tubul cu mediu de
transport (Amiens sau Stuart) şi transportat la laborator3.
Prelucrarea probelor şi comunicarea rezultatelor
Însămânţarea secreţiei recoltată pe tamponul cu mediu de transport se face pe mediul agar Columbia
cu 5% sânge de berbec, după care tamponul este imersat în mediul de îmbogăţire lichid BHI. Incubarea
se face în atmosfera obişnuită timp de 18 – 24 de ore la 35–37ºC.
A doua zi se citeşte cultura de pe mediul solid şi se face trecerea pe mediul agar Columbia cu 5%
sânge de berbec a tamponului pus la îmbogăţire. In funcţie de aspectul macroscopic al culturii se
efectuează testele necesare identificării.
Dacă pe mediu se va dezvolta Streptococul hemolitic de grup B, acesta se va comunica împreună cu
antibiograma3.
Bibliografie
558
21
2. Centers for Disease Control and Prevention, “Prevention of Perinatal Group B Streptococcal
Disease: Revised Guidelines From CDC,” MMWR, 2002, 51(RR-11):1-22.
4. Violeta Cristea. Streptococcus agalactiae un potenţial patogen în patologia ginecologică.
În Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, Revista Societăţii Române de
Microbiologie, Vol 54, Nr 1/2009.
21.5.7 Spermograma
Sperma este un produs complex la formarea căruia contribuie întregul tract reproductiv al bărbatului:
testicule, epididime, canale deferente, vezicule seminale, prostata şi glandele bulbo-uretrale. Lichidul
spermatic este constituit din două părţi distincte: plasma seminală (rezultată în special din secreţia
prostatei, veziculelor seminale şi glandelor bulbouretrale) şi elementele figurate (spermatozoizii şi/sau
celulele germinale provenite din testicul).
Testiculele produc spermatozoizii (care reprezintă aproximativ 5% din volumul spermei). Spermatozoizii
sunt stocaţi în porţiunea ampulară a ductelor deferente până la eliberarea lor în procesul de ejaculare.
Aici spermatozoizii sunt metabolic inactivi datorită mediului acid şi a aportului scăzut de oxigen. S-a
estimat că în această zonă spermatozoizii pot supravieţui aproximativ o lună1;5;6.
Veziculele seminale produc aproximativ 60% din volumul spermei. Acest lichid vâscos cu pH neutru
sau uşor alcalin este galben sau intens pigmentat ca rezultat al conţinutului mare în flavone care sunt
responsabile de fluorescenţa în lumina ultravioletă. Aici se află şi originea fructozei, care constituie
substratul energetic necesar mobilităţii spermatozoizilor1;6.
Prostata contribuie la formarea a 20% din volumul spermei. Acest lichid lăptos secretat de prostată
este uşor acid (pH=6,5) datorită acidului citric. Secreţia prostatică mai este bogată în fosfatază acidă
şi enzime proteolitice responsabile de coagularea şi lichefierea spermei1;6.
Epididimele, ductele deferente, glandele bulbouretrale şi glandele uretrale generează 10-15% din
volumul spermei, fără a se cunoaşte semnificaţia biochimică. Epididimul secretă mai multe proteine
cu rol în capacitatea de fertilizare a spermei1;5;6.
Recomandări pentru efectuarea spermogramei
Diagnosticul infertilităţii masculine (incluzând azoospermia, oligozoospermia, astenozoospermia,
teratozoospermia), evaluarea eficienţei vasectomiei, diagnosticul hematospermiei (vezi figura 21.5.7),
evaluarea eventualelor sechele ale parotiditei epidemice (apărută la adolescenţi sau adulţi) asupra
ţesutului spermatogen, a efectelor criptorhidiei şi ale varicocelului asupra spermatogenezei2;5;6.
Pregătire pacient - Pacientul :
- va avea o perioadă de abstinenţă sexuală de 3-5 zile7;
- nu va folosi prezervativ pentru recoltare;
559
- cu o 1 săptămână înainte de recoltare va opri medicaţia în curs, dacă acest lucru este posibil4.
Specimen recoltat - spermă.
Pentru o apreciere corectă a fertilităţii se recomandă 3 sau mai multe determinări în decurs de 2-3
luni4.
Rezultate concludente se obţin în urma recoltării prin masturbare. Dacă din motive psihologice sau
religioase această metodă nu este accesibilă, se acceptă şi proba recoltată prin metoda contactului
sexual întrerupt3.
Recipient de recoltare - recipient de unică folosinţă, steril4.
Cantitate recoltată - toată cantitatea emisă4.
Cauze de respingere a probei - specimen care a fost transportat cu întârziere la laborator, sau la o
temperatură diferită de 37°C4.
Prelucrare necesară după recoltare
Recomandabil este ca sperma să fie examinată la max. 20 min după emisie, pentru a putea aprecia
timpul de lichefiere. Dacă se renunţă la această informaţie examinarea se poate face în maximum 3
ore de la emisie.
Până la lichefiere ori până la examinare sperma se menţine la 37°C.
După lichefiere, sperma se examinează în camera de numărat Burker Türk pentru aprecierea numărului
de spermatozoizi. Pentru aprecierea mobilităţii şi a morfologiei acestora, se va face examinarea
între lamă şi lamelă. Dacă mobilitatea spermatozoizilor este mai mică de 50%, se va folosi tehnica
eozină-nigrozină pentru aprecierea viabilităţii. O viabilitate normală necesită teste suplimentare care
să elucideze substratul mobilităţii reduse (determinarea fructozei, a anticorpilor IgA din spermă şi a
anticorpilor antispermatozoizi din ser)7.
Stabilitate probă - 3 ore la 37°C. Nu se păstrează sperma la o temperatura diferită de 37°C4, în nici
o etapă a examinărilor.
Metodă - examinare macroscopică şi microscopică a spermei 3;4;5;7. Pentru aprecierea viabilităţii se
face coloraţia eozină-nigrozină4.
Valori de referinţă3;4;5;7.
Tip Valoare
Volum spermă 2-5 mL
Aspect spermă Normal
Timp de fluidificare completă 0-30 min.
pH spermă 7.12-8
Număr spermatozoizi 20-120 mil./mL
Spematozoizi mobilitate normală 60-100 %
Spermatozoizi mobilitate redusă 0-40 %
Spermatozoizi imobili 0-10%
Spermatozoizi aspect normal 70-100 %
Spermatozoizi forme aberante 0-30 %
Spermatozoizi viabili 80-100%
560
21
O clasificare acceptată a mobilităţii este cea pe tipuri de mobilitate:

- tip”a”: mobilitate rapidă, cu bătăi ale cozii in fascicul strâmt, însoţite de mişcări laterale ale capului,
permiţând o progresie în linie dreaptă;
- tip”b”: cu mişcări ale cozii, dar fără mişcări ale capului, fără deplasare în linie dreaptă sau cu
deplasare rectilinie, dar lentă;
- tip”c”: vibraţii frenetice şi anarhice determinănd doar mişcări pe loc;
- tip”d”: spermatozoizi imobili, adesea confundaţi cu cei morţi8.
În cazul laboratorului nostru raportarea se face doar pe cele trei tipuri de mobilitate menţionate în tabel
(tipul „a” şi tipul „b” fiind menţionaţi la spermatozoizii cu mobilitate normală).
În cazul în care formele aberante de spermatozoizi depăşesc 10% se vor menţiona modificările
morfologice ale acestora şi proporţia în care acestea apar.
Transportarea spermei de la domiciliu la laborator:
- face puţin probabilă aprecierea corectă a timpului de fluidificare sau de lichefiere4;7.
- poate afecta mobilitatea spermatozoizilor prin expunere la o temperatură diferită de 37°C4.
• Medicamente care influenţează negativ determinarea: azathioprin, cimetidină, ciclofosfamidă,
estrogeni, fluoximesterone, ketoconazol, methotrexate, metiltestosteron, nitrofurantoin (efect
tranzitoriu), carmustin, procarbazină, sulfasalazină, vincristină4.
Fig. 21.5.7 Hematospermie (imagine din colecţia proprie a laboratorului)
Bibliografie
1. Exarcu, I.Teodorescu. 1989. Testiculul. În Fiziologia şi fiziopatologia sistemului endocrin, 934-

954.
2. Exarcu, I.Teodorescu. 1989. Fiziopatologia testiculului. În Fiziologia şi fiziopatologia sistemului
endocrin, 956-981.
3. Henry, John Bernard. 1998. Seminal fluid. In Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods, 516-522.
5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide.
6. Wallach Jaques. 2001. Afectiuni endocrine. În Interpretarea testelor de diagnostic, 883-885.
561
7. Kvist U.; Bjorndahl L. 2002. Manual on basic semen analysis, 5-24.

8. Ungureanu M-C, Mogos V., Zbranca E. Explorarea infertilităţii masculine - spermocitograma,
teste asupra capacităţii fecundante a spermatozoizilor. În Romanian Journal of Endocrinology
and Metabolism, vol.1, no. 2, 2002.
21.5.8 Urocultura
Infecţiile de tract urinar (ITU) sunt afecţiuni inflamatorii produse de diferite microorganisme care
ajung la nivelul aparatului urinar, unde se multiplică şi determină în timp modificări în funcţionarea
normală a rinichilor şi a căilor urinare.
După localizare, ITU pot fi joase, când sunt afectate uretra şi vezica urinară şi înalte, când sunt
cuprinse şi ureterele şi rinichii1,2.
După simptomatologie, ITU pot fi asimptomatice - bacteriurie fără simptomatologie clinică şi
simptomatice - când apare bacteriurie însoţită de reacţie inflamatorie (piurie) şi manifestări clinice.
În mod normal tractul urinar este steril, exceptând uretra distală, care este colonizată cu bacterii
provenite de pe tegumentul perineal, iar la femei şi din vulvă. Aceste bacterii contaminează accidental
urina vezicală în cazul unei recoltări inadecvate a probei de urină.
Raportul pe sexe a incidenţei ITU variază în funcţie de vârstă, astfel: în primul an de viaţă, ITU sunt mai
frecvente la băieţi (consecinţă a fimozelor şi parafimozelor întâlnite la această vârstă), apoi raportul
tinde să se egalizeze în prima copilărie, după care este dominat de sexul feminin, incidenţa crescând
proporţional cu vârsta (fiind asociată cu activitatea sexuală şi sarcina). Diferenţa dintre sexe dispare
însă la vârstnici, prin creşterea prevalenţei la bărbaţi, datorită afecţiunilor prostatei.
ITU sunt favorizate de anomaliile structurale şi neurologice care interferă cu fluxul urinar şi de bolile
sistemice (de exemplu diabetul şi neoplaziile).
La pacienţii vârstnici, taraţi, imunodeprimaţi şi la copii ITU pot evolua asimptomatic sau nespecific
(febră, tulburări digestive, scădere în greutate).
Încă din 1956 E. H. Kass a stabilit că este semnificativ pentru ITU pragul de 105 UFC pentru bacilii
Gram negativi/mL urină; pentru genul Staphylococcus pragul este 5x104 UFC/mL, iar pentru Candida
albicans 104 UFC/mL1;2.
Recoltarea probelor
Rezultatul investigaţiilor microbiologice depinde de calitatea recoltării şi a transportului probelor:
• în condiţii obişnuite se va preleva prima urină de dimineaţă sau la cel puţin 4 ore de la ultima
micţiune; înaintea începerii tratamentului cu antibiotice;
• în situaţii de urgenţă se poate recolta proba de urină în orice moment – pe cererea către laborator se
va menţiona dacă timpul de la ultima micţiune <4h;
• în cazul urmăririi eficienţei tratamentului cu antibiotice, se va repeta recoltarea după 48-96 ore;
• înaintea recoltării probei se va face o toaletă locală riguroasă cu apă şi săpun;
562
21
• proba va fi recoltată din jetul urinar mijlociu, fără a întrerupe fluxul, într-un recipient steril; pentru a
preveni contaminarea probei, evitaţi să atingeţi recipientul de zona genitală;
• pentru recoltarea probei la sugari se va utiliza punga pediatrică (conform instrucţiunilor primite la
recepţia laboratorului);
• proba va fi transportată cât mai repede la laborator (în 1-2 ore)3.
Metode de lucru
Urocultura poate fi efectuată prin mai multe metode: metoda diluţiilor, metoda ansei calibrate, sistemul
Uricult Plus, ultimul fiind utilizat şi în cadrul laboratoarelor Synevo (vezi fig. 21.5.8).
Fig. 21.5.8 Sistemul Uricult Plus
Sistemul Uricult Plus este alcătuit din 3 medii de cultură ce permit creşterea celor mai frecvent întâlniţi
agenţi etiologici ai infecţiilor urinare.
După însămânţare incubarea se face la 35-37°C timp de 18-24 de ore. Rezultatele obţinute (numărul
de UFC/mL) sunt semicantitative1;2;3.
Interpretarea şi comunicarea rezultatelor
În tabelul de mai jos este prezentată interpretarea rezultatelor obţinute la urocultură în funcţie de
modul de recoltare şi statusul clinic al pacientului, conform ghidurilor europene de analiză a urinei
(ECLM-EUG European Urinalysis Guidelines – 2000).
Metoda de recoltare şi statusul clinic Nr. semnificativ de colonii (UFC/mL)

Recoltare din jetul mijlociu, timpul de la ultima ≥ 103
micţiune <4h, pacient simptomatic
Recoltare din jetul mijlociu, timpul de la ultima ≥ 104-5
micţiune >4h, pacient simptomatic
Probă recoltată prin cateterism vezical la ♂ ≥ 103
Probă recoltată prin cateterism vezical la ♀ ≥ 104
Bacteriurie asimptomatică ≥ 105
Recoltare prin puncţie suprapubiană Orice creştere bacteriană
563
Comentarii:
Probele de urină recoltate prin nefrostomă şi puncţie suprapubiană sunt considerate în mod normal
sterile şi rezultatul este comunicat clinicianului indiferent de numărul de UFC/mL.
Rezultatele semicantitative ale probelor recoltate din jetul mijlociu se vor comunica ţinând cont de
următoarele situaţii:
• Absenţa creşterii se comunică prin: ’’Bacteriurie < 103 UFC/mL (fără semnificaţie clinică).
1000 UFC/mL = pragul de detecţie al uroculturii uzuale
UFC = unităţi formatoare de colonii’’.
• Prezenţa unei singure specii bacteriene în cantitate de 103-104 UFC sau 104-105 UFC necesită
informaţii suplimentare de la medicul clinician (prezenţa simptomatologiei clinice, timpul de la ultima
micţiune, control după tratament). În absenţa oricărei date clinice de la medicul trimiţător se comunică
germenul identificat până la nivel de specie şi cantitatea creşterii, astfel: ”Bacil .... între ........ UFC/mL..
Rezultatul va fi interpretat în context clinic.
Numărul UFC/mL semnificativ pentru infecţia urinară depinde de metoda de recoltare şi statusul clinic
(vezi tabelul de mai sus). Dacă medicul consideră necesar se va solicita antibiograma după o nouă
recoltare a probei”.
• Prezenţa a trei sau mai multe specii bacteriene în cantitate mai mică de 100 000 se va comunica:
’’ Bacteriurie < 100 000 UFC/mL (prezente 3 specii bacteriene) - posibilă contaminare. Vă rugam să
repetaţi recoltarea”.
• Prezenţa a două tipuri de izolate care depăşesc fiecare 105 UFC/mL urină reprezintă cel mai frecvent
o contaminare. În această situaţie se ia legătura cu clinicianul şi se solicită o nouă probă recoltată în
condiţii de igienă corectă. Dacă din a doua probă se izolează în cantitate semnificativă aceleaşi bacterii,
se confirmă relevanţa clinică a izolatelor şi se testează sensibilitatea celor 2 germeni la antibiotice.
Infecţia mixtă este confirmată doar în aproximativ 10% din cazurile în care pacienţii recoltează probele
de urină din jetul mijlociu şi la aproximativ 36% din pacienţii cateterizaţi.
• Prezenţa mai multor germeni, izolaţi fiecare în cantitate de cca. 105 UFC/mL de urină indică o
contaminare grosieră. Raportarea acestor probe ca fiind pozitive şi efectuarea antibiogramei (la
care din germeni?) este eronată şi dăunătoare pentru pacient. În acest caz rezultatul se comunică:
„Bacteriurie > 100 000 UFC/mL (prezente 3 specii bacteriene) – posibilă contaminare. Vă rugăm să
repetaţi recoltarea”.
• În cazul prezenţei unei singure specii bacteriene în cantitate ≥ 105UFC/mL urină se continuă cu
identificarea până la nivel de specie şi se efectuează antibiograma, iar rezultatul se raportează:’’ Bacil
.... > 100 000 UFC/mL”.
În cazul în care medicul/pacientul solicită simultan cu urocultura şi examenul biochimic al urinei
medicul de laborator poate efectua comentarii suplimentare pentru clarificarea rezultatelor obţinute
(dacă nu sunt disponibile alte date clinice):
- leucociturie semnificativă la examenul biochimic al urinei + urocultură negativă: „Discordanţă
între examenul biochimic de urină şi urocultură. Pacient sub tratament antibiotic sau cu
afecţiune uro-genitală?”;
- examen biochimic normal + urocultură cu > 105UFC/mL: „Discordanţă între examenul
564
21
biochimic de urină şi urocultură. Posibil debut de infecţie urinară sau urină incorect
conservată.”;
- leucociturie semnificativă la examenul biochimic al urinei + urocultură cu < 105UFC/mL:
„Discordanţă între examenul biochimic de urină şi urocultură. Pacient sub tratament
antibiotic? Recoltarea probei s-a efectuat corect?” 2;3.
Bacterii patogene în urocultură
Germenii cel mai frecvent întâlniţi în etiologia ITU sunt:
• bacili Gram negativi glucozo-fermentativi (Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Enterobacter,
Citrobacter, Morganella, Providencia);
• bacili Gram negativi glucozo-nefermentativi (Pseudomonas, Acinetobacter);
• coci Gram pozitivi (Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,
Streptococcul hemolitic grup B).
• Corynebacterium urealyticum - cauza ITU la pacienţii cu tratamente antibiotice prelungite sau
intervenţii urologice.
Candida albicans determină uretrocistite la pacienţii diabeticii cu un control metabolic suboptimal1,2.
Un diagnostic microbiologic corect necesită informaţii clinice despre pacient, acestea putând fi oferite
de către medical curant prin intermediul fişei de microbiologie, care trebuie atent şi corect completată
cu datele pacientului (vârstă, sex, sarcină, tratament cu antibiotice, patologie urinară asociată).
automat de identificare bacteriană şi efectuare a antibiogramei, cu eliberarea rezultatului în 24 ore de
la izolarea germenului în cultură pură3.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Infections of the urinary tract. în Bailey and
Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, twelfth edition. 2007,57:842-855.
2. Buiuc Dumitru, Negut Marian,Diagnosticul de laborator al infecţiilor tractusului urinar.In:”Tratat de
microbiologie clinica” Editia a II-a. 2008, 14:255-277.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog
565
21.6 MICOLOGIE
21.6.1 Cultură şi identificare fungi
Fungii sunt microorganisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care conţin chitină în peretele
celular.
Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut şi acceptat în micologia medicală.
Acesta permite împărţirea fungilor în trei tipuri principale6:
• filamentoşi – microorganisme pluricelulare, cu talul alcătuit din filamente tubulare ce pot fi
septate, denumite hife;
• levuriformi – microorganisme unicelulare, de forma rotundă sau alungită ce se multiplică
în principal prin burjeonare;
• dimorfici – o categorie aparte de microorganisme, care pot apărea sub 2 forme, în funcţie
de condiţiile de mediu: forma de levuri se gaseşte în ţesuturile organismelor parazitate sau
la 37˚C in vitro, iar forma filamentoasă apare când sunt cultivate la temperatura camerei
sau la 30˚C, pe medii uzuale.
Infecţiile fungice şi în special cele determinate de levuri au crescut semnificativ în ultimii ani.
Semnificaţia clinică a levurilor din prelevatele patologice:
Limita dintre patogen şi nepatogen poate fi este foarte greu de precizat, levuri considerate
nepatogene cu 1-2 decenii în urmă sunt astăzi recunoscute ca agenţi patogeni în cazul gazdelor
imunocompromise.
Apariţia conflictului între levuri şi gazdă este favorizată de o serie de factori endogeni sau exogeni,
care fie induc gazdei o stare de imunosupresie, fie modifică cantitativ raportul existent între levuri şi
celelalte categorii de microorganisme.
Factorii favorizanţi endogeni sunt reprezentaţi de: vârstă (nou născuţi prematuri, vârsta a III-a),
stările fiziologice particulare (graviditatea). Factorii favorizanţi exogeni includ: corticoterapia, terapia
imunosupresoare post-transplant, antibioticoterapia prelungită, intubaţia endotraheală prelungită,
dispozitivele protetice, radioterapia.
Levurile pot fi izolate din produsele patologice primite în laboratorul clinic în următoarele situaţii:
• contaminarea probei prin manevre defectuoase în cursul prelevării,
• colonizarea cu levuri a unor suprafeţe (tegument, mucoase) sau cavităţi,
• infecţia cu aceste microorganisme.
În cazul prelevatelor din situsuri normal sterile, prezenţa levurilor indică infecţie, dacă s-au luat toate
măsurile de prevenire a contaminării în timpul recoltării. În cazul probelor provenite din situsuri
nesterile, cu microbiotă proprie, coroborarea datelor clinice, epidemiologice şi de laborator este
absolut necesară pentru interpretarea semnificaţiei clinice a levurilor1;2;3.
În funcţie de situsul de izolare, fungii cei mai frecvent întâlniţi sunt:
• Lichid cefalorahidian: Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida
566
21
tropicalis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum;.

• Sânge: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans,
Histoplasma capsulatum, Candida lusitanie, Candida krusei, Trichosporon spp., Coccidioides
immitis, Malassezia furfur;
• Tract genitourinar: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis,
Penicillium spp., Candida krusei, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Cladosporium
spp., Aspergillus spp., Trochosporon spp., Alternaria spp.;
• Tract respirator: Candida spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Geotrichum candidum, Fusarium
spp., Acremonium spp., Scopulariopsis spp., Trichosporon spp., Histoplasma capsulatum,
Coccidioides imitis;
• Piele şi fanere: Candida albicans, Acremonium spp., Alternaria spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis
spp., Geotrichum spp., Cladosporium spp., Trichophyton spp., Epidermophyton flocossum,
Microsporum spp., Criptococcus neoformans1;2;3;5.
Recoltarea şi transportul probelor - joacă un rol important în acurateţea diagnosticului, orice
întârziere în procesarea probelor poate duce la scăderea şanselor de a izola agentul etiologic.
Viabilitatea levurilor poate fi afectată de căldura excesivă sau de frig, fiind recomandat ca transportul
probelor să se facă la temperatura ambiantă, iar procesarea lor în cel mai scurt timp (aproximativ 2
ore).
Deşi aproape orice ţesut sau fluid poate fi supus izolării şi identificării fungice, cele mai importante
specimene sunt reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secreţie genitală, exsudat
faringian, spută, aspirat transtraheal şi lichid pleural, ţesuturi din plăgi, lichid cefalorahidian, sânge,
urină şi materii fecale1;2;3.
În cadrul laboratoarelor Synevo pentru infecţiile fungice se efectuează două tipuri de analize: cultură
şi identificare fungi cu antifungigramă pentru fungi de tip levuriform şi cultură şi identificare fungi
dermatofiţi.
În cadrul examenului cultură şi identificare fungi cu antifungigramă se urmăreşte izolarea în special a
levurilor. Diagnosticul complet constă în examen microscopic şi cultură.
Examenul microscopic urmăreşte prezenţa, forma şi dimensiunile formaţiunilor levurice: blastospori,
pseudohife, hife, eventual artrospori. Detalii precum prezenţa sau absenţa capsulei, modul de
înmugurire vor fi reţinute ca aspecte importante pentru viitoarea identificare. La pacienţii sub tratament
antifungic este posibilă evidenţierea levurilor la examenul microscopic în absenţa creşterii acestora
pe mediile de cultură.
Cultivarea produselor patologice se face pe agar Sabouraud cu Chloramfenicol şi Gentamicină, mediu
care inhibă multiplicarea bacteriilor contaminante şi permite o bună dezvoltare a levurilor.
Pe mediile de cultură levurile de interes medical se dezvoltă în 48-72 de ore de incubare, în anumite
suspiciuni diagnostice perioada de urmărire prelungindu-se până la 7 zile.
Temperatura de incubare după însămânţare este în concordanţă cu zona anatomică de provenienţă
a probei: 36-37°C pentru prelevatele interne şi profunde sau de 30°C pentru prelevatele superficiale
567
(piele şi fanere).
După obţinerea primoculturii se verifică obligatoriu puritatea acesteia, deoarece contaminarea
bacteriană compromite etapele ulterioare de identificare a speciei. În acest scop se efectuează frotiuri
colorate Gram care vor fi examinate la microscop cu obiectivul de imersie. În cazul prezenţei bacteriilor
se fac repicări în vederea purificării culturii1;3;5;6.
Identificarea culturilor şi determinarea sensibilităţii la antifungice
Uzual, se face cu ajutorul unui sistem biochimic standardizat bazat pe fermentarea a 7 zaharuri
şi un test enzimatic. Cu ajutorul acestui sistem se pot identifica următoarele specii: Candida spp.,
Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula.
Pentru determinarea sensibilităţii la antifungice se foloseşte tot un sistem standardizat, ce permite
testarea următoarelor antifungice: Amfotericina B, Nystatin, Flucytosine, Fluconazol, Ketoconazol,
Miconazol, Econazol.
Pentru tulpinile ce nu pot fi identificate utilizând sistemul menţionat anterior, se foloseşte un alt
sistem biochimic bazat pe fermentarea a 13 zaharuri şi 3 teste enzimatice, ce permite identificarea
următoarelor specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae,
Geotrichum spp., Prototheca wickerhamii.
Determinarea sensibilităţii la antifungice pentru aceste specii se face cu ajutorul unui sistem standardizat
ce permite testarea la: Amfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, 5-Fluorocytosine,
Itraconazol.
În cazul în care din produsele patologice se dezvoltă fungi filamentoşi, identificarea acestora se
realizează pe baza aspectului macroscopic al culturii şi morfologia microscopică a organelor de
fructificare. Antifungigrama nu se efectuează în cazul izolării acestor specii de fungi4.
Bibliografie
1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Laboratory methods in basic mycology.
In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 629-716.
2. Deanna A. Sutton Specimen Collection, Transport and Processing: Mycology. Patrick R.
Murray, Michael A. Pfaller, Robert H. Yolken, Ellen Jo Baron, James H. Iorgensen. In Manual of
Clinical Microbiology, 9th ed. 2007,1728-1737.
3. Koneman’s, Mycology. In Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th ed., 2006, 21:
1153-1247.
4. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010 Ref. Type: Catalog
5. Malcolm D. Richardson & David Warnock. In Fungal infection, Diagnosis and Management, 3rd
ed., 2003, 2,14-28.
6. Mihai Mares, Olimpia Bazgan, Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de fungi : Dumitru
Buiuc, Marian Neguţ - Tratat de Microbiologie Clinică. Ediţia a II-a, Edit. Medicală 2008,38,
953-1030.
568
21
21.6.2 Identificare dermatofiţi (examen microscopic direct şi cultură)
Dermatofiţii produc infecţii care afectează zonele superficiale ale corpului: epidermă şi fanere (păr,
unghii). Deşi sunt considerate cel mai adesea “ boli banale’’, rata morbidităţii înalte şi consecinţele de
ordin local şi psihic pot fi foarte importante pentru pacient4.
Principalii agenţi etiologici implicaţi în producerea dermatomicozelor aparţin genurilor Epidermophyton,
Microsporum şi Tricophyton1.
Potrivit originii lor, fungii dermatofiţi sunt împărţiţi în 3 categorii4:
• specii antropofile, care se transmit direct prin contact interuman sau indirect prin lenjerie sau
obiecte contaminate;
• specii zoofile, care se transmit la om prin contactul cu un animal infectat;
• specii telurice, care se transmit prin contactul solului cu leziuni cutanate;
Fungii dermatofiţi se individualizează prin cel puţin două caractere cu impact direct asupra identificării
lor în laboratorul clinic:
• folosesc keratina ca element nutritiv (sursă de azot), ceea ce explică tropismul lor pentru epidermă,
păr şi unghii; sunt de obicei incapabile să penetreze ţesutul subcutanat;
• prezintă caractere morfologice particulare: hife în formă de candelabru, de coarne de cerb, uneori
spiralate şi macroconidii caracteristice, complet diferite de ale altor fungi2.
Genul Tricophyton este capabil să invadeze părul, epiderma şi unghiile, în timp ce genul Microsporum
doar părul şi epiderma iar genul Epidermophyton afectează epiderma şi unghiile. Principalele specii
de dermatofiţi izolate din probe clinice sunt în ordinea frecvenţei: Tricophyton rubrum, Tricophyton
mentagrophytes, Epidermophyton flocossum, Tricophyton tonsurans, Microsporum canis şi
Tricophyton verrucosum1.
Micozele cutanate sunt probabil cele mai frecvente infecţii fungice la om şi sunt de obicei denumite
cu termenul latin tinea (“vierme inelar”). Macroscopic, leziunea are un aspect inelar, marginea sa
constituind zona de infecţie activă, progresivă; vindecarea se produce în zona centrală a inelului.
Pentru a indica zona corpului afectată se folosesc de asemenea termeni latini: tinea corporis (corp),
tinea cruris (zona inghinală), tinea capitis (scalp, păr), tinea barbae (barbă), tinea unguium (unghii)3,4.
Deoarece tratamentul dermatomicozelor este îndelungat, costisitor şi cu potenţial toxic, este necesar
ca mai întâi să se stabilească cu certitudine diagnosticul pe baza examenului micologic. Acesta se
impune cu necesitate deoarece există numeroase afecţiuni asociate cu leziuni dermatologice similare
celor induse de dermatofiţi:
- psoriazis;
- eczeme (vulgară, atopică sau de contact);
- intertrigouri de diverse etiologii;
- onicodistrofii în cadrul unor afecţiuni: psoriazis, insuficienţă venoasă cronică a membrelor inferioare,
genodermatoze;
- streptococia scuamoasă a scalpului1;2;3.
Metode de diagnostic
569
• examen microscopic direct al produsului recoltat;

• cultură dermatofiţi3.
Recoltarea probelor
Probele din care se solicită identificarea dermatofiţilor sunt reprezentate de raclate epidermice,
unghiale sau fire de păr. Recoltarea probelor de la nivelul leziunilor se efectuează prin raclarea unei
porţiuni de epidermă sau unghie, cât mai aproape de ţesutul sănătos, cu ajutorul unui bisturiu sau lamă
de microscop; firele de păr afectate sunt prelevate prin smulgere cu o pensetă. Înainte de efectuarea
examenului microscopic şi a culturii probele vor fi introduse în recipiente sterile şi transportate la
laborator; în nici un caz nu vor fi menţinute la frigider1;3.
Examenul microscopic
Microscopia directă examinează scuamele sau firele de păr în preparat umed montat între lamă şi
lamelă cu soluţie 20% KOH. Se lasă preparatul în repaus aproximativ 30 minute pentru dilacerare.
Pentru clarificarea prelevatelor din unghii se va folosi o soluţie de KOH mai concentrată (25%). Se
examinează iniţial cu obiectivul mic, după care se va folosi obiectivul mare pentru detalii morfologice.
Se urmăresc:
- scuamele pentru prezenţa fragmentelor de hife hialine septate, ramificate şi a
artroconidiilor;
- firele de păr pentru a aprecia invazia ectotrix sau endotrix; mărimea artroconidiilor orientează
diagnosticul2;3,4.
Părul infectat cu anumiţi dermatofiţi produce fluorescenţa caracteristică la UV trecută prin filtrul Wood,
această fluorescenţă verde, vie, strălucitoare putand fi vizualizată doar într-o cameră obscură. Trebuie
reamintit însă că numai unii dintre dermatofiţii capabili da a invada părul pot produce fenomenul
fluorescenţei (M. audouini, M. ferrugineum, M. canis). Deasemenea trebuie menţionat că numai
porţiunile pe deplin invadate ale tijei dezvoltă fluorescenţă. În infecţiile recente este posibil ca porţiunea
fluorescentă a părului să nu fi părăsit foliculul pentru a putea fi detectată. Din acest motiv simpla
examinare în fluorescenţă cu eliberarea unui rezultat negativ este incorectă4.
Izolarea în cultură pură
Pentru însămânţarea materialului patologic pe medii de cultură, perii parazitaţi, scuamele, materialul
unghial sunt mai întâi fragmentate şi apoi inoculate pe suprafaţa mediilor în cel puţin patru puncte şi în
două tuburi pentru a avea suficiente şanse de a obţine o cultură pozitivă. Probele se însămânţează pe
două medii lichide cu rol de îmbogăţire (Sabouraud lichid şi BHI) şi pe două medii solide (Sabouraud
cu Cloramfenicol + Gentamicină şi Mycosel agar).
Incubarea se face la 30°C timp de 30 de zile înainte de a fi considerate negative. Majoritatea fungilor
dermatofiţi cresc după 7-14 zile de incubare.
Culturile pozitive necesită efectuarea de subculturi. Acestea oferă avantajul de a creşte mult mai
rapid, colonia are loc mult mai mult pentru dezvoltare şi permite o apreciere a aspectului macroscopic
avers/revers, necesar identificării finale.
Diagnosticul micologic se face corelând timpul necesar dezvoltării coloniei, aspectul macroscopic al
culturii şi morfologia microscopică a organelor de fructificare3,4.
570
21
Un examen micologic complet necesită corelarea rezultatului obţinut la examenul microscopic cu cel
de la cultură dermatofiţi. Este posibil ca examenul microscopic direct să fie negativ în prezenţa unei
culturi pozitive, deoarece mediul de cultură favorizează dezvoltarea dermatofiţilor.
Culturile vor fi urmărite o perioada de 30 zile până la comunicarea unui rezultat negativ. În cazul unui
rezultat pozitiv se va preciza genul căruia îi aparţine dermatofitul izolat3.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic
Microbiology. Mosby, USA, 12 ed. 2007, 50: 629-716.
2. Dumitru Buiuc. Identificarea fungilor. În Tratat de Microbiologie Clinică. Dumitru Buiuc, Marian
Neguţ, Ed. Medicală, România,1 ed. 1999, 319-337.
4. Violeta Cristea. Fungii dermatofiţi - implicaţii în patologie. În Revista Stetoscop, 2008, 80
571
21.7 SÂNGE ŞI LICHIDE PUNCŢIE
21.7.1 Hemocultura
Hemocultura constituie una din metodele cele mai importante şi delicate pentru laboratorul de
microbiologie. Sângele, fiind în mod normal steril, izolarea şi identificarea unei bacterii sau a unui fung
în hemocultură are o semnificaţie diagnostică considerabilă13.
Bacteriemia este prezenţa în sânge a bacteriilor provenite dintr-un focar septic sau de pe o mucoasă
lezată. Frecvent starea bacteriemică este lipsită de expresie clinică sau se însoţeşte numai de frison
şi febră la care se pot adauga simptome şi semne proprii condiţiei care a determinat descărcarea
bacteriemică.
Septicemia este termenul clinic prin care se defineşte o bacteriemie importantă cu evoluţie clinică
neregulată, imprevizibilă şi gravă, acompaniată de frisoane, febră neregulată, toxemie, hipotensiune,
prostraţie, erupţii cutanate polimorfe şi variate, metastaze septice tisulare sau viscerale. Gravitatea
sindromului septicemic lasă pe al doilea plan simptomatologia focarului infecţios primar, care trebuie
însă întotdeauna căutat1.
Germeni implicaţi în:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli şi alte enterobacterii, stafilococ
Septicemie coagulazo-negativ (SCN), Pseudomonas spp, Streptococcus spp, bacterii
anaerobe, levuri
Endocardită Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp
Pneumopatii Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae
Meningite Neisseria meningitidis
În funcţie de poarta de intrare:
Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus
Pulmonară
influenzae
Cutaneo-mucoasă Staphylococcus spp1
( cateter, dren )
Extracţii dentare Streptococcus spp.
Digestivă Enterobacterii, bacterii strict anaerobe, Enterococcus spp.
(biliară, intestinală)
Ginecologică Bacterii strict anaerobe, E.coli, Enterococcus spp.
Infecţii şi obstrucţii urinare Enterobacterii, Enterococcus spp.
Principiul hemoculturii
Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente în sânge. Sângele,
prelevat în condiţii de strictă asepsie, este însămânţat în flaconul de hemocultură a cărui compoziţie
favorizează dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi şi microaerofili11.
572
21
Principalii factori de îmbogăţire încorporaţi în mediu care favorizează dezvoltarea germenilor sunt:
• asociere de peptone, cazeină şi gelatină pentru aportul de aminoacizi;
• extract de levuri pentru aportul de vitamine;
• hemine şi NAD care permit dezvoltarea Haemophilus şi favorizează creşterea unor germeni
pretentioşi nutritiv cum sunt Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp şi alţi
anaerobi;
• vitamina B6, element indispensabil în dezvoltarea streptococului deficient întâlnit în
endocardite şi a stafilococului;
• CO2 element important pentru creşterea germenilor din speciile: Neisseria, Brucella,
Haemophilus, Streptococcus , Campylobacter.
Multiplicarea bacteriilor depinde însă şi de o serie de factori independenţi de condiţiile de cultivare:
densitatea germenilor în sânge, stadiul lor de multiplicare, prezenţa în sânge a unor substanţe
inhibitorii.
Bacteriemiile şi fungemiile adulţilor evoluează în general cu un număr redus de microorganisme
circulante (între 1-30 UFC/mL sânge). La nou-născut, sugar şi copilul mic concentraţia depăşeşte 100
UFC/mL. În general, între gravitatea infecţiei, prognostic şi concentraţia bacteriilor din sânge există o
relaţie direct proporţională3.
Bacteriile captate în flaconul de hemocultură pot fi:
• intacte, libere în plasmă, în faza de multiplicare activă şi vor continua să se dividă rapid în
bulionul de hemocultură, sau în faza de repaus şi vor începe să se multiplice la sfârşitul
fazei de latenţă corespunzătoare adaptării la mediul nutritiv al flaconului;
• mai mult sau mai puţin lezate sau mascate de acţiunea sistemului anticorp-complement,
antibiotice, fagocitate de polimorfonucleare sau monocite şi se vor dezvolta după autoliza
leucocitelor dacă rămân viabile;
• bacterii în forme L (deficiente nutriţional) a căror creştere necesită un mediu adaptat
(hipertonic şi bogat în factori de creştere)12.
Creşterea bacteriilor în hemocultură poate fi întârziată sau împiedicată dacă nu se utilizează un
anticoagulant în mediul de cultură, deoarece microorganismele riscă să fie capturate în cheagul de
fibrină. În acelaşi timp, unele anticoagulante pot fi toxice faţă de anumiţi agenţi patogeni la fel ca
antibioticele prezente în sânge. Aceste obstacole pot fi înlăturate dacă se utilizează polyanetholsulfonat
de sodiu (SPS), un anticoagulant netoxic care favorizează proliferarea bacteriană prin neutralizarea
activităţii bactericide a serului uman şi inhibarea acţiunii unor antibiotice (Streptomicină, Kanamicină,
Gentamicină, Polymixină B). SPS-ul poate avea rol inhibitor asupra unor suşe de Peptostreptococcus,
Neisseria, efect neutralizat de prezenţa gelatinei în mediul de cultură.
Sunt comercializate sisteme semiautomate sau automate computerizate pentru detecţia rapidă a bacteriilor
în hemoculturi. Principiile pe care se bazează aceste sisteme sunt multiple. Le menţionăm doar pe cele pe
care le utilizăm în cadrul laboratorului Synevo: detecţia directă a producerii CO2, prin:
- scanarea seriată a eşantioanelor de gaz rezultat în urma creşterii bacteriene în flaconul de
hemocultură, ca în sistemul BACTEC (BACTEC 9050);
- forţarea fluidului de cultură (sub presiunea CO2 degajat) să treacă într-un compartiment semnal
573
de unde poate fi examinat microscopic şi subcultivat, ca în OXOID SIGNAL SYSTEM9.

Recomandări pentru determinare
Se face la indicaţia medicului în anumite situaţii clinice cum sunt:
• toate cazurile cu febră de origine neprecizată, mai ales dacă se acompaniază de semne clinice
evocatoare de infecţie;
• sepsis, şoc septic;
• pacienţi cu endocardită acută;
• sindrom sugestiv pentru infecţie sistemică cu germeni specifici (febră enterică, bruceloză,
leptospiroză);
• infecţii localizate severe (meningite, pneumonii, supuraţii intraabdominale).
Hemocultura este în plus motivată la:
• bolnavii imunodeprimaţi (cancer, toxicomani);
• pacientul care este supus unei agresiuni medicale (cateter, dializă sau intervenţii chirurgicale) şi
prezintă o stare febrilă;
• în anumite situaţii particulare (femeie însărcinată, pacient cardiac, diabetic, cu insuficienţă renală,
insuficienţă hepatică) când pacientul prezintă febră de origine neprecizată8.
Pregătirea pacientului
Prelevarea se efectuează înainte de tratament antimicrobian, conform evoluţiei predictive a curbei
febrile sau în momentul în care bolnavul semnalează apariţia frisonului. În cazul în care acest lucru nu
este posibil, sângele va fi prelevat imediat înaintea administrării unei noi doze de antibiotic. Se indică
prelevarea a trei probe intermitente în decurs de 24 de ore; în urgenţe ritmul este la un interval de
30-60 de minute6.
Specimen recoltat - sânge venos, de preferinţă à jeun (pe nemâncate), hiperlipemia putând împiedica
evidenţierea unei creşteri bacteriene în mediul lichid.
Zona de elecţie pentru puncţie este reprezentată de venele plicii cotului. Procedura de prelevare
respectă normele de asepsie şi antisepsie necesare pentru a evita contaminarea probei cu bacterii
rezidente în flora tegumentară. După recoltarea sângelui, proba de 10 mL sânge, recoltată în seringă
se introduce în recipientul cu mediul de cultură Signal prin înţeparea capacului de cauciuc al acestuia
în condiţii de strictă asepsie. Flaconul se agită blând pentru omogenizarea acestuia în masa mediului.
Pentru sistemul BACTEC recoltarea se face în recipientul de hemocultură pe principiul sistemelor
închise cu vid.
Proba se etichetează şi se transportă în cel mai scurt timp de la recoltare la laborator, la temperaturi
cât mai apropiate de 37ºC (cutie izotermă)8.
Materiale necesare - seringă sterilă de 10 mL; flacon cu mediu de cultură Signal8; flacon cu mediul
de cultură (BACTEC PLUS AEROBIC/F şi PLUS ANAEROBIC/F4;10;14 , BACTEC PÈDS PLUS™/F5
potrivit pentru probele pediatrice şi volume mici de sânge) pentru sistemul BACTEC.
Cantitate recoltată - adult:10 mL; copil:3-5 mL (Signal ) şi între 3-10 mL la adult şi 1-3mL la copil
(BACTEC)8.
• probe neetichetate;
574
21
• probe incorect recoltate (nu s-au respectat regulile de antisepsie);

• transport necorespunzător8.
Prelucrare necesară după recoltare – Sistem Signal: se ataşează camera de expansiune livrată în
acelaşi kit. Se incubează la 37ºC. Durata incubării la termostat şi urmărirea probei este în medie de 7
zile. Se impune incubare mai prelungită la pacienţii cu endocardită subacută, la probele prelevate sub
antibioticoterapie (până la 14 zile) sau când urmărim microorganisme exigente8.
Sistem BACTEC: se scanează codul de bare de pe flacon la cititorul de cod de bare şi se introduce
flaconul în poziţia indicată. Odată ce uşa este închisă, procesul începe automat. Aparatul are o
capacitate de 50 flacoane. El monitorizează permanent flacoanele de hemocultură incubate la 35oC.
Flacoanele sunt agitate continuu pentru a favoriza creşterea bacteriană. Flacoanele pozitive sunt
semnalizate sonor şi vizual. Sistemul efectuează automat controlul de calitate la fiecare 10 minute.
Softul integrat administrează datele despre probe2.
Metodă de lucru
A. Pentru kit-ul Signal-Oxoid; acesta este compus din:
a) recipient cu mediu Signal; compoziţia acestui mediu permite dezvoltarea germenilor aerobi,
anaerobi şi microaerofili, ceea ce provoacă o creştere a presiunii detectată prin indicatorul de creştere
adaptat flaconului (camera de expansiune);
b) camera de expansiune pentru mediu; în cazul multiplicării bacteriene şi creşterii presiunii, o parte
din amestecul sânge/bulion trece în această cameră şi indică activitate bacteriană (hemocultura
pozitivă)4.
Pentru urmărirea probelor se foloseşte metoda clasică:
• Examinarea macroscopică - vizuală - de două ori pe zi, a flacoanelor de hemocultură pentru a
căuta semnele creşterii bacteriene. Este posibil ca aspectul flaconului să orienteze asupra bacteriei
în cauză, de exemplu:
a) turbiditate - bacili Gram negativi aerobi, Staphylococcus spp, Bacteroides spp;
b) hemoliză - Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Lysteria spp, Clostridium spp, Bacillus
spp;
c) producere de gaz - bacili Gram negativi aerobi şi anaerobi;
d) coaguli - Staphylococcus aureus.
• Examinarea microscopică a preparatului proaspăt şi a frotiului colorat Gram efectuate din flaconul
de hemocultură.
Menţiune: constanta agitare a recipientelor în primele 24h de incubare îmbunătăţeşte creşterea marii
majorităţi a bacteriilor aerobe9;15.
Interpretarea culturilor în sistemul Signal
Absenţa creşterii - mediul din recipientul Signal rămâne limpede şi nu trece de manşonul verde al
camerei de expansiune. În primele 6-12 ore de incubare se pot face subculturi oarbe (inocularea pe
geloză chocolat în atmosfera de CO2 la 35ºC pentru alte 48h sau în bulion thyoglicolat cu resazurină)
şi frotiuri care se vor colora Gram (examinare microscopică).
Recipientele cu creştere absentă vor fi reincubate şi urmărite în continuare.
Hemocultura pozitivă - dacă în sângele de cercetat au existat germeni care s-au multiplicat în mediul
575
de cultură (hemocultură pozitivă), mediul va trece în camera de expansiune şi se va ridica deasupra

manşonului verde al acesteia.
B. Pentru sistemul BACTEC principiul de lucru este următorul:
Prin activitatea metabolică microorganismele din flacon eliberează CO2, iar flacoanele conţinând
un marker de activare care devine fluorescent în contactul cu CO2 detectează prezenţa acestuia.
Fotodetectorul aparatului măsoară nivelul de fluorescenţă şi trimite datele spre computer. Măsuratoarea
este interpretată de sistem în funcţie de parametrii de pozitivitate programaţi în prealabil. Computerul
identifică flaconul pozitiv care este semnalat auditiv şi vizual prin aprinderea unui beculeţ. Pe ecranul
de afisaj al aparatului apare poziţia grafică a flaconului detectat pozitiv.
Fiind un sistem complet automat flacoanele sunt monitorizate la fiecare 10 minute ceea ce permite
detectarea imediată a flacoanelor pozitive .
Protocolul de monitorizare este de 7 zile - dar dezvoltarea microorganismelor poate fi detectată după
8 ore2;4;10;14.
C. Hemoculturile pozitive se prelucrează astfel:
Sistemul Signal: Se prelevează din zona inferioară a camerei de expansiune o cantitate mică de
mediu. Accesul în camera de expansiune se face prin partea superioară a acesteia, printr-o manevră
sterilă. Această manevră nu poate contamina conţinutul recipientului Signal.
Sistemul BACTEC: printr-un ac ataşat flaconului se prelevează o cantitate de mediu din care se
execută frotiuri şi se însămânţează pe mediile de cultură2.
Mediul prelevat se foloseşte pentru:
a) întindere de frotiuri pe lame de microscopie; acestea se examinează după colorare Gram.
În raport cu rezultatul citirilor se fac repicări.
b) repicări pe medii solide şi lichide în funcţie de bacteria evidenţiată microscopic: geloză-
sânge/Columbia-sânge, agar-chocolat, Levine/MacConkey, Sabouraud cu Cloramfenicol,
bulion thioglycolat cu resazurină.
c) plăcile se incubează, în funcţie de bacteria evidenţiată microscopic, la o temperatură de
35ºC-37ºC în conditii de aerobioză, în atmosferă cu 5-7% CO2 sau în anaerobioză (GasPack
+amestec reducător) pentru 48-72 de ore. Se examinează coloniile izolate.
d) teste necesare pentru identificare: ID catalaza, trusa de identificare stafilococ, trusa de
identificare streptococ, discuri de Optochin, factori X, V şi XV, medii politrope pentru
enterobacterii, reacţia oxidazei, teste API ( API 20E , API 20NE, API NH, etc) teste pentru
identificarea levurilor. Identificarea se poate face şi automat pe sistemul Vitek.
e) testarea sensibilităţii la antibiotice sau antifungice prin metoda difuzimetrică sau automată
pe Vitek9.
D. Eliberarea rezultatelor
a) rezultat parţial prin frotiu colorat Gram – se consemnează şi se anunţă telefonic;
b) rezultat definitiv după izolarea, identificarea bacteriei şi efectuarea antibiogramei sau
antifungigramei.
Interpretarea rezultatului final se face în funcţie de contextul clinic şi de numărul flacoanelor pozitive
576
21
în raport cu cele recoltate9.

Hemoculturi pozitive
Se iau în considerare:
• mai multe hemoculturi pozitive cu un germen patogen;
• mai multe hemoculturi pozitive cu un germen obişnuit comensal într-un anumit context clinic;
• 1 hemocultură pozitivă cu germeni patogeni cunoscuţi (Salmonella spp);
• 1 hemocultură pozitivă cu germeni potenţial patogeni în context clinic evocator cum ar fi: Streptococcus
pneumoniae în pneumopatii, enterobacterii în infecţii urinare, stafilococ coagulazo-negativ în infecţii
de cateter.
Se exclud:
• 1 hemocultură pozitivă cu un germen comensal fără context clinic: suprainfecţie cu stafilococ
coagulazo-negativ, corynebacterii, streptococ non-grupabil;
• pe un teren imunologic deprimat se iau în considerare şi aceste bacterii;
• pe un teren imunologic normal se repetă hemocultura.
Hemoculturi negative
• recoltarea probei s-a realizat după antibioticoterapie;
• recoltarea s-a realizat tardiv în cursul bolii (apar anticorpii);
• cantitate insuficientă de sânge recoltat;
• timp de observaţie prea scurt;
• mediu de cultură greşit ales.
Hemoculturi pozitive pentru mai multe specii bacteriene
În cazul în care s-au izolat mai multe specii bacteriene într-un singur flacon sau din flacoane diferite
ale aceluiaşi pacient, acestea se ţin în observaţie în următoarele situaţii :
• bolnav imuno-deprimat;
• bolnav comatos;
• cateter menţinut timp îndelungat.
Specii bacteriene izolate în funcţie de perioada de creştere
• în primele 1-2 zile cresc: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, enterobacterii;
• după 3 zile cresc: bacilii Gram negativi non-fermentativi, bacteriile anaerobe;
• la 4-5 zile: Haemophilus spp şi stafilococul coagulazo-negativ;
• la 6-7 zile: speciile de Candida;
• la 9 zile: corynebacteriile9.
• tratament antimicrobian aplicat înaintea prelevării;
• contaminarea sângelui cu flora exogenă;
• cantitate insuficientă de sânge prelevat;
• frecvenţa şi momentul recoltărilor greşit stabilite;
• mediu de incubare şi repicare greşit alese;
• timp de incubare necorespunzător1;6;12.
577
Bibliografie
1. Akiyama H., Kanzaki H., Tada J., Arata J. Coagulase-negative staphylococci isolated from
various skin lesions. In D Dermatol, 25: 563-8. 1998. Ref Type: Journal (Full).
2. Becton Dickinson and Co., Bactec 9050. Sisteme pentru microbiologie Becton Dickinson,
Sparks, Maryland 21152 USA, 1997
3. Dumitru Buiuc. Hemocultura în diagnosticul infecţiei. În Tratat de Microbiologie Clinică. Dumitru
Buiuc, Marian Neguţ, Editura Medicală, România, 2 ed. 2008, 165-182.
4. Goldenbaum P., Stafford E., Talbot B. Laboratory Study of the Neutralization of Antimicrobials by
Resin-Containing Blood Culture Medium, Sixth European Congress of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases, 1993, 28-31.
5. Hardy L., Crowther L., Goldenbaum P., Beaty S.. Sixth European Congress of Clinical
MIcrobiology and Infectious Diseases, 1993, 28-31.
6. Joseph M.Civetta, Robert W.Taylor, Robert R. Kirby. Critical care. In Lippincott Raven ed. 1997;
28:405-412.
7. Koontz FP., Flint KK., Reynolds JK., Allen S. Multicenter Comparison of High Volume (10ml) nr
BACTEC Plus and the Standard (5ml) nr. BACTEC System. In Diagn. Microbiol. Infect. Dis.,
1991, 14: 111-8.
8. Kumar P.J., Clark M.L. In Clinical Medicine. Bailliere Tindall, UK, 2 ed. 1990, 710-720.
10. Levievre H., Gimenez M., Vandenesch F. and al. Multicenter Clinical Comparison of Resin-
Containing Bottles with Standard Aerobic and Anaerobic Bottles for Culture of Microorganisms
from Blood. In Eur.J. Clin. Microbiol. Infect.Dis., 1997, 16:669-674.
11. Loulergue J., Avril J.L., Omwanga D. Hemocultures. In Etude des produits pathologiques.
Maury- Imprimeur S.A ed. 1987, 41-45.
12. Philippona A., Paul C., Nevot P. L’hemoculture. In Rev.Prat , 33:1929-38. 1983. Ref Type:
Journal (Full)
13. Reimer L.G, Wilson M.L., Weinstein M.P. Update on detection of bacteriemia and fungemia. In
Clin. Microbiol. Rev., 10:445-465. 1997. Ref Type: Journal (Full).
14. Rohner P., Pepey Beatrice, Auckenthaler R., Advantage of Combining Resin with Lytic BACTEC
Blood Culture Media. In J. Clin. Microbiol., 1997, 35(10): 2634-8
15. Weinstein M.P. Current blood culture methods and systems: clinical concepts, technology and
interpretation of results. In Clin.Infect.Dis , 23:40-46. 1996. Ref Type: Journal (Full).
578
21
21.7.2 Examenul bacteriologic al lichidului cefalo-rahidian
Meningitele bacteriene sunt boli acute severe care, datorită sechelelor neuro-psihice şi mortalităţii
crescute, reprezintă o urgenţă maximă atât pentru clinician, cât şi pentru personalul laboratorului de
microbiologie clinică1.
Lichidul cefalorahidian apare ca secreţie a plexurilor coroide din ventriculii cerebrali şi prin difuziune
liberă din ţesutul nervos. Format în ventriculii cerebrali, LCR trece în spaţiul subarahnoidian prin trei
foramene ale ventriculului IV. Resorbţia LCR prin vilii şi granulaţiile arahnoidiene este în echilibru cu
secreţia.
Rolul fiziologic al LCR este de protecţie biomecanică (amortizare şi menţinere a formelor anatomice proprii
SNC) şi biodinamică (eliminarea surplusului de lichid interstiţial, menţinerea homeostaziei mediului în care
funcţionează neuronii). Barierele hematomeningee şi hematoencefalică reduc accesul agenţilor infecţioşi,
al metaboliţilor toxici, dar şi al chimioterapicelor către LCR şi ţesutul nervos3.
Infectarea SNC se poate produce:
• Hematogen, în cursul unor bacteriemii (când se depăşesc 104 UFC/ ml sânge) sau viremii cu diferite
porţi de intrare;
• Prin contiguitate, din focare infecţioase juxtameningiene: otite medii acute, sinuzite, mastoidite;
• Din exterior, după fracturi craniene (meningite traumatice cu cel mai variat spectru etiologic), puncţii
rahidiene sau intervenţii chirurgicale pe nevrax (meningite iatrogene, eventual cu tulpini bacteriene de
spital) şi la pacienţi cu anomalii congenitale (meningocel ş.a.).
• Rar pe cale intraneurală: virusul rabic prin nervii senzitivi periferici, ocazional virusul Herpes simplex
prin rădăcinile nervului trigemen sau ale nervilor sacraţi1;3.
Infecţiile SNC pot evolua ca:
• Meningite purulente cauzate cel mai frecvent de bacterii;
• Meningite cu lichid clar şi evoluţie acută: sunt determinate mai frecvent de virusuri, uneori de
leptospire. Ocazional au variate alte cauze (chimice, fizice, alergice, neoplazii, focare supurative
parameningeale);
• Meningite cu lichid clar şi evoluţie cronică: posibilă etiologia tuberculoasă, sifilitică sau fungică;
• Encefalite şi meningoencefalite mai frecvent de etiologie virală;
• Abcese cerebrale1;3.
Etiologia infecţioasă a meningitelor şi meningoencefalitelor este variată:
• Virusuri: enterovirusuri, paramixovirusuri, adenovirusuri;
• Bacterii: N. meningitidis, Str. pneumoniae, Str. agalactiae, H. influenzae, S. aureus,
L.monocitogenes, M. tuberculosis şi rar Enterobacteriaceae, Spirochete;
• Fungi: Candida albicans, Cryptococcus neoformans;
• Paraziţi: Toxoplasma gondii, Naegleria fowleri, Plasmodium spp1;3.
Prelevarea şi transportul probelor
Prelevarea probelor de LCR este de competenţa exclusivă a specialiştilor infectionişti, neurologi sau
neurochirurgi şi se realizează prin puncţionarea spaţiului subarahnoidian la nivel lombar, suboccipital
579
şi mai rar ventricular în condiţii strict aseptice şi de preferat înaintea administrării de antibiotice3.
Meningitele bacteriene “decapitate” prin tratament antimicrobian pot evolua cu lichid clar şi creează
adesea mari probleme de diagnostic.
Cantitatea de 5–10 mL LCR satisface necesităţile pentru examenele biochimice şi microbiologice, iar
fragmentarea probei încă de la recoltare în doua tuburi sterile minimalizează riscul contaminării prin
splitare ulterioară1;2;3. Când cantitatea recoltată este mai mică se va comunica laboratorului ce teste
vor fi efectuate prioritar. Procesarea unei cantităţi mult prea mici poate indica un rezultat fals negativ,
acest lucru fiind mult mai dăunător pentru pacient decât efectuarea unei noi puncţii lombare1.
În momentul recoltării se pot face aprecieri asupra presiunii şi aspectului lichidului.
Tuburile recoltate sunt etichetate la patul bolnavului şi trimise la laborator împreună cu cerea de
analize solicitate care trebuie să cuprindă: numele şi prenumele pacientului, vârsta, diagnosticul şi
dacă este sub tratament antibiotic. Proba se transportă imediat la laborator fără a fi refrigerată sau
termostatată1,2,3.
Examinarea bacteriologică a LCR
Examenul macroscopic evidenţiază transparenţa, culoarea şi fluiditatea5.
LCR-ul normal are transparenţa, fluiditatea şi claritatea “apei de stâncă”, fiind incolor.
În funcţie de patologie pot să apară următoarele aspecte: roşu opalescent în hemoragii meningiene
prin boala de fond sau roşu transparent prin accident de puncţie, aspect “lacat” în hemoragii meningiene
mai vechi sau xantocrom (cu diferite nuanţe de galben) datorită methemoglobinei sau bilirubinei.
Caracteristicile LCR normal şi modificările microbiologice, citologice şi biochimice ale LCR în meningite
sunt evidenţiate în tabelul următor.2
Tip de Aspect LCR Examen Examen citologic Examen biochimic
meningită microbiologic
• clar 0 – 3 limfocite/ Proteine = 15 - 40 mg/dl
LCR normal • Incolor • Steril mm3 Glucoză = 50 - 70 mg/dl
Acid lactic = 35 mg/dl
Cloruri = 680 – 730 mg/dl
Meningita • opalescent • Depistare rapidă Proteine > 100 mg/dl
bacteriană • purulent - microscopică, PMN > 1000/ Glucoză < 40 mg/dl
acută antigenică mm3 Acid lactic > 35 mg/dl
• Izolare
• clar sau Proteine > 100 mg/dl
Meningita • uşor • Depistare rapidă Glucoză < 40 mg/dl
TBC opalescent • Izolare Limfocite ~ 200 Acid lactic > 35 mg/dl
• cu val de mm3 Cloruri < 600 mg/dl
fibrină
Meningita • clar • Depistare rapidă Predomină Proteine > 100 mg/dl
micotică sau - microscopică, limfocitele Glucoză < 40 mg/dl
• opalescent antigenică 100 – 500/mm3 Alcool etilic – prezent
• Izolare
580
21
Meningita • clar • Steril Limfocite Proteine = 15 - 100 mg/dl

virală sau bacteriologic 500 – 1000/mm3 Glucoză = 50 - 70 mg/dl
• opalescent • Se poate izola Acid lactic = 35 mg/dl
virusul Cloruri = 680 – 730 mg/dl
Examenul citologic - constă în numărarea elementelor în suspensie şi determinarea tipului de celule

din sediment.
Numărarea elementelor în suspensie se face pe lichidul necentrifugat şi se exprimă în număr de
elemente pe mm3. Numărătoarea se efectuează cel mai frecvent în camera Fuchs-Rosenthal (vezi
fig.19.7.1).
În acest scop, o cantitate din LCR-ul bine omogenizat se introduce într-o altă eprubetă pentru a se
evita contaminarea ulterioară. În funcţie de aspectul macroscopic al lichidului se procedează astfel:
• LCR clar sau opalin –se prelevă aseptic cu pipeta Pasteur o cantitate mică de lichid suficientă pentru
a umple camera de numărat Fuchs-Rosenthal (vezi fig.19.7.2);
• LCR hemoragic – se adaugă acid acetic glacial în proporţie de o picătură la zece picături de LCR; se
aşteaptă 1-2 minute pentru liza hematiilor, apoi cu pipeta Pasteur se umple camera de numărat;
• LCR tulbure, purulent - se face o diluţie de 1/10 sau eventual 1/100 în ser fiziologic. În acest caz,
numărul de celule obţinut va fi înmulţit cu 10 sau 100 în funcţie de diluţia folosită5.
Fig.21.7.2.1 Camera Fuchs Rosenthal
Fig.21.7.2.2 Pipetare în camera Fuchs Rosenthal
581
Camera Fuchs-Rosenthal are o suprafaţă de 16 mm2, o înălţime de 0.2 mm şi un volum de 3.2 mm2.
Dacă densitatea celulelor este mică se face numărătoarea pe toate cele 16 pătrate ale camerei şi se
împarte suma la 3 pentru a afla numărul celulelor pe mm3 (vezi fig.19.7.3).
Dacă densitatea celulară este mai mare se numără 5 pătrate mari delimitate de linii triple3,5, această
valoare reprezentând numărul de celule pe mm3 .
Fig.21.7.2.3 Numărătoarea elementelor în camera Fuchs Rosenthal
Concomitent cu numărătoarea de elemente în camera de numărat, cantitatea de LCR rămasă în tubul

primar primit la laborator se centrifughează 15-20 minute la 3000 rotaţii/min, pentru determinările
ulterioare.
După centrifugare supernatantul este colectat într-un tub steril şi folosit pentru decelarea de antigene
solubile, iar sedimentul este folosit pentru frotiuri şi culturi bacteriene.
Pentru realizarea frotiurilor se folosesc lame curate, degresate, de preferinţă noi, pentru a avea
siguranţa că nu au bacterii restante de la examinari anterioare. Sedimentul se întinde cu ansa sau cu
pipetă Pasteur pentru a obţine un strat continuu de celule din centrul lamei spre periferie. Se prepară
4 frotiuri din care 2 vor fi fixate şi colorate Gram şi respectiv albastru de metilen, 1 frotiu va fi colorat
May - Grunwald - Giemsa şi unul va rămâne de rezervă.5
În cazul în care există suspiciune de meningită cu Cryptococcus neoformans se execută un preparat
proaspăt între lama şi lamelă din sediment cu tuş India1. Prezenţa de formaţiuni rotund ovalare,
capsulate (halou mare, clar şi incolor) care pot fi înmugurite este sugestivă pentru Cryptococcus
neoformans.
Pe frotiul colorat Gram se evidenţiază prezenţa germenilor, morfologia, tinctorialitatea, frecvenţa şi
localizarea (intra sau extraleucocitari).
Lamele colorate May-Grunwald-Giemsa şi albastru de metilen se utilizează pentru examenul citologic.
Se apreciază procentual tipul elementelor: PMN, limfocite, notându-se în acelaşi timp aspectul lor.
Cultivarea este un mijloc de diagnostic specific, dar necesită 24 - 48 de ore şi poate fi negativă în cazul
prezenţei germenilor neviabili sau dacă pacientul a început tratamentul antibiotic.
582
21
Însămânţarea sedimentului se efectuează pe plăci preîncălzite la termostat.

Se vor folosi: agar Columbia cu 5% sânge de berbec, agar chocolate, geloză lactozată şi bulion
thioglycolat. În funcţie de examenul bacterioscopic, pot fi adăugate şi alte medii (Sabouraud).
Mediile sunt incubate la 37°C, eventual în atmosfera cu 5% CO2 pentru medii ca agar Columbia cu
5% sânge de berbec şi agar chocolate.
Apariţia culturii este urmărită zilnic timp de 3 zile pe mediile solide şi 5 zile în tubul cu bulion
thioglycolat.1,3
În cazul culturilor pozitive se continuă identificarea până la nivel de specie şi efectuarea
antibiogramei.
Dacă bacterioscopia atestă prezenţa unei mari densităţi bacteriene în proba de LCR (zeci de bacterii
pe câmp microscopic examinat cu mărire de 1000x), se poate încerca antibiograma din cultura
primară, ale cărei rezultate urmează a fi confirmate prin antibiogramă pe subcultura standardizată3.
Având în vedere limitele examenului microscopic şi ale culturilor, s-au pus la punct metode de detectare
a antigenelor solubile în LCR: CIE, Latex-aglutinare, Coaglutinare, ELISA şi RIA.
În cadrul laboratoarelor Synevo, pentru detectarea antigenelor solubile se foloseşte ca test rapid
reacţia de latex-aglutinare. Tehnica de lucru este conform foii de kit.4
Un rezultat negativ nu exclude posibilitatea infecţiei cu germenul testat deoarece antigenele bacteriene
pot fi prezente în concentraţie mai mică decât limita de detecţie a reactivilor utilizaţi4.
Un rezultat pozitiv trebuie, de asemenea, urmat de izolarea germenului, identificarea şi testarea
sensibilităţii la antibiotice4.
Examenul citologic, bacterioscopia şi latex-aglutinarea permit microbiologului eliberarea unui rezultat
parţial, necesar clinicianului în orientarea tratamentului de prima intenţie4.
Bibliografie:
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, and Alice S. Weissfeld. Meningitidis and other infections of the
central nervous system.In Diagnostic Microbiology, 2002, 58:907-916.
2. Buiuc T. Dumitru. Examenul lichidului cefalorahidian în diagnosticul infecţiilor sistemului nervos
central. În Microbiologia Medicală - Ghid pentru studiul şi practica medicinei, 1992, 290-294.
3. Buiuc Dumitru, Neguţ Marian. Examenul lichidului cefalorahidian în diagnosticul infecţiilor
sistemului nervos central. În Tratat de microbiologie clinică, 1999, 10:186-199.
5. Ministerul Sănătăţii. Academia de Ştiinţe Medicale. Metode de laborator de uz curent. Vol. II.
Bucuresti. Ed. Medicală, 1977, 71-81.
583
21.7.3 Examenul microbiologic al lichidelor de puncţie

(lichide pleurale, peritoneale, pericardice şi articulare)
Exsudatele şi transsudatele cavităţilor închise reprezintă reacţia de tip inflamator sau neinflamator
a seroaselor respective faţă de anumiţi excitanţi, care duce la acumularea de lichid în exces între
membrana viscerală şi parietală.
Procesele inflamatorii au la bază o varietate de condiţii etiologice. În marea majoritate a cazurilor,
acestea sunt infecţii locale, rezultate din procesele inflamatorii ale organului respectiv sau a celor
din vecinătate, traumatisme infectante sau pot să reprezinte o localizare a unor boli generale de
tip septicemic. În mod normal acestea sunt arii sterile din punct de vedere microbiologic, dar pot fi
infectate de toate cele patru categorii de microorganisme: bacterii, fungi, virusuri şi paraziţi1.
Rezultatul investigaţiilor microbiologice depinde de calitatea recoltării şi transportul probelor2. În
cadrul laboratorului Synevo lichidele de puncţie pot fi procesate atât în sistem clasic, cât şi în sistem
automat.
Pentru sistemul automat recoltarea se face la patul bolnavului direct în flacoanele ce asigură condiţii
aerobe şi anaerobe şi sunt transportate imediat la laborator1.
Metoda clasică necesită concentrarea lichidului de puncţie prin centrifugare într-o eprubetă sterilă, 15
minute la 3500 rotaţii/minut3.
În cazul prezenţei coagulului în lichidul recoltat, acesta se omogenizează pentru a elibera bacteriile1.
După centrifugare supernatantul este colectat într-un tub steril, iar sedimentul este folosit pentru
frotiuri şi culturi bacteriene.
Pentru realizarea frotiurilor se folosesc lame curate, degresate, de preferinţă noi pentru a avea
siguranţa că nu au bacterii restante de la examinari anterioare. Sedimentul se întinde din centrul lamei
spre periferie cu ansa sau cu pipeta Pasteur pentru a obţine un strat continuu de celule. Se prepară 4
frotiuri, din care 2 vor fi fixate şi colorate Gram şi respectiv albastru de metilen, un frotiu va fi colorat
Giemsa şi unul va rămâne de rezervă3.
Pe frotiul colorat Gram se evidenţiază prezenţa germenilor, morfologia, tinctorialitatea, frecvenţa şi
localizarea lor (intra sau extraleucocitari).
Lamele colorate Giemsa şi albastru de metilen se utilizează pentru examenul citologic. Se apreciază
procentual tipul elementelor: PMN, limfocite, notându-se în acelaşi timp aspectul lor.
Cultivarea este un mijloc de diagnostic specific, dar necesită 24 – 48 de ore şi poate fi negativă în
cazul germenilor neviabili sau dacă pacientul a început tratamentul antibiotic.
Se pot folosi: agar Columbia cu 5% sânge de berbec, agar chocolate, geloză lactozată şi bulion
thioglycolat. În funcţie de examenul bacterioscopic, pot fi adăugate şi alte medii (Sabouraud).
Mediile sunt incubate la 37°C, eventual în atmosfera cu 5% CO2 pentru medii ca agar Columbia cu 5%
sânge de berbec şi agar chocolate.
Apariţia culturii este urmărită zilnic timp de 3 zile pe mediile solide şi 5 zile în tubul cu bulion
thioglycolat1;3.
În cazul culturilor pozitive se continuă identificarea până la nivel de specie şi se efectuează
584
21
antibiograma.
În eventualitatea pozitivării, exclusiv a bulionului thioglycolat, se notează ziua de incubare şi nivelul la
care a avut loc creşterea (suprafaţă, profunzime), se fac frotiuri şi treceri pe medii solide, cu incubare
atât în condiţii aerobe cât şi anaerobe.
În cazul suspiciunii unei infecţii cu anaerobi este necesară recoltarea în recipiente speciale care
menţin condiţiile de anaerobioză. Însămânţarea se face atât aerob (de rutină), cât şi anaerob1.
Interpretarea culturilor
Pe lângă bacteriile patogene şi cele comensale sunt responsabile de infecţii (la pacienţii cu boli cronice
debilitante, imunosupresaţi, datorită tehnicilor invazive, protezelor etc). Evaluarea corectă presupune
ca recoltarea, transportul şi prelucrarea să fie conform standardelor, astfel încât organismele izolate
să provină de la locul infecţiei şi să nu fie contaminanţi.
Flora bacteriană întâlnită este variată. Astfel, în lichidele pleurale infectate predomina cocii Gram pozitivi:
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae,
Pseudomonas, dar se pot întâlni frecvent şi germeni anaerobi din genurile Fusobacterium sau
Bacteroides singuri sau în asociaţie.
În etiologia peritonitelor, asociaţia de germeni Gram pozitivi şi Gram negativi aerobi şi anaerobi
este frecventă; indiferent de cauza peritonitei, germenii care predomină sunt de tip enteric: E. coli,
Bacteroides, Enterococcus, Staphylococcus, Pseudomonas3.
Infecţia lichidelor articulare este în mod obişnuit monobacteriană şi frecvent reprezentată de stafilococi,
streptococi, neisserii şi bacili Gram negativi.
Agenţii etiologici ai pericarditelor sunt de cele mai multe ori virusurile: Enterovirusurile, Adenovirusurile,
iar infecţiile bacteriene şi fungice sunt de obicei asociate cu acestea1.
Un loc deosebit în etiologia pleureziilor o are genul Mycobacterium, însă în cadrul laboratoarelor
Synevo nu se efectuează culturi pentru bacilul Koch2.
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Normally Sterile Body Fluids, bone and bone
marrow and solid tissues. In Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology, Mosby, USA, 11 ed. 2002,
984-994.
3. Ministerul Sănătăţii. Academia de Ştiinţe Medicale. Metode de laborator de uz curent. Vol. II.
Bucuresti. Ed. Medicala, 1977, 81-85.
585
21.8 COLECŢII PURULENTE
21.8 Cultură produs provenit din colecţii purulente
Supuraţiile pot afecta orice ţesut şi organ cu acumulare de puroi în interstiţiile cutanate (pustule,
hidrosadenită, furuncule, abcese, gome), în ţesuturile musculo-scheletale (abcese, flegmoane,
osteomielită), în ganglionii limfatici, în viscere (abcese), în cavităţi preformate (sinusuri paranazale,
meninge, peritoneu, sinovialele articulare).
În ceea ce priveşte rolul laboratorului de microbiologie, trebuie luată în considerare relevanţa culturilor
polimicrobiene, valoarea identificării şi testării sensibilităţii unuia sau mai multor microorganisme.
Informaţiile privind localizarea plăgii, semnele clinice de infecţie sau prezenţa necrozei asociată
cu miros specific, terapia antimicrobiană, îl vor ghida pe microbiolog în stabilirea unui diagnostic
corect1;2.
Tipuri de infecţii
Bacteriologia plăgilor variază în funcţie de locul anatomic şi de mecanismul de producere (traumatism,
manopere chirurgicale, arsuri).
Infecţiile tegumentului şi ale ţesutului subiacent sunt dominate de piodermitele stafilococice
(furunculoză, foliculită, hidrosadenită) şi streptococice (erizipel, impetigo, pemfigus, celulită). Infecţiile
subacute sau cronice pot avea ca etiologie germeni din genul Actinomyces şi Nocardia (abcese
granulomatoase, celulite profunde) sau Mycobacterium (ulcere)2.
Infecţiile postoperatorii variază în funcţie de locul anatomic: plăgile localizate în zone relativ sterile
rămân, de obicei, neinfectate în timp ce în chirurgia abdomenului inferior infecţiile rareori pot fi evitate,
având ca etiologie flora tractului gastrointestinal.
Infecţiile din cadrul arsurilor se asociază cu septicemie şi o rată ridicată de mortalitate.
Infecţiile pot fi aerobe/anaerobe, cele mai frecvente bacterii izolate fiind: S.aureus, Streptococcus
spp., Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Candida, Aspergillus şi Mucor spp., bacterii anaerobe,
inclusiv Clostridium şi Bacteroides1.
Plăgile produse prin muşcături se pot infecta cu germenii de la nivelul cavităţii bucale a animalului,
etiologia fiind variată: Pasteurella spp., S. aureus, streptococi alfa hemolitici, Enterobacreriaceae, coci
anaerobi Gram pozitiv, bacili anaerobi Gram negativi, Fusobacterium spp2.
Etiologia infecţiilor din ulcerul de gambă şi cel de decubit este polimicrobian, germenul cel mai
frecvent implicat fiind S. aureus. Alţi germeni implicaţi: Streptococcus spp., Enterococcus spp.,
Enterobacteriaceae, Ps. aeruginosa, Acinetobacter, Peptostreptococcus spp., Bacteroides şi
Prevotella spp3;7.
Procedeul prelevării este diferit în funcţie de localizarea leziunilor şi de el depinde stabilirea unui
diagnostic microbiologic corect:
 recoltarea aseptică prin biopsie, cu debridare4;
 abraziunea dermică, cu obţinerea de mostre tisulare, fără a fi la fel de invazivă ca biopsia6;
 recoltarea prin puncţionare şi aspirare cu seringă sterilă - în cazul plăgilor profunde
586
21
insuficient drenate sau fistulizate (în special cele de la nivelul ganglionilor);

 recoltarea cu tampon steril, deşi este frecvent folosită, poate ridica probleme de diagnostic
microbiologic dacă prelevarea se face de la suprafaţa plăgii, din puroi şi nu din profunzimea
ei din ţesut sângerând. Se vor recolta 2 tampoane sterile: unul fără mediu pentru efectuarea
frotiurilor colorate Gram şi Giemsa, celălalt pentru însămânţări pe mediile de cultură;
 prezenţa unui volum mare de lichid necesită recoltarea prin aspirare cu seringă sterilă,
metodă recomandată şi în cazul lichidului din abces.
Transportul şi procesarea probelor se vor face în maxim 2h, dar acest interval de timp poate fi prelungit
dacă tamponul este prevăzut cu mediu de transport1;2;6;7.
Examenul microscopic colorat Gram reprezintă o etapă esenţială în stabilirea unui diagnostic
microbiologic corect.
Se va nota prezenţa leucocitelor, a germenilor şi a trabeculelor de fibrină, elemente ce confirmă
prezenţa procesului infecţios. Frotiul Gram nu poate stabili etiologia aerobă/anaerobă cu excepţia
Clostridium perfringens - bacterie Gram pozitiv sporulată.
Mediile de cultură folosite sunt:
 Columbia agar cu 5% sânge de berbec;
 geloză chocolate;
 geloză lactozată (CLED).
Setul poat fi completat cu medii pentru anaerobi (bulion thioglycolat) sau mediu Sabouraud cu
Chloranfenicol, ţinând cont de locul de prelevare şi rezultatul frotiului Gram (prezenţa bacteriilor Gram
pozitiv sporulate sau a unor formaţiuni rotund – ovalare Gram pozitive).
Incubarea se face 18 – 24h la 37°C cu prelungirea încă 24 – 48h în cazul culturilor negative al căror
frotiu evidenţiază prezenţa celulelor inflamatorii şi a germenilor.
Culturile pentru izolarea levurilor se urmăresc 5 – 7 zile.
Identificarea până la nivel de specie şi testarea sensibilităţii la antibiotice se vor face pentru:
 germenii potenţial patogeni (S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, etc);
 germenii izolaţi de la pacienţii cu infecţii de cateter şi de la nivelul ţesuturilor normal sterile;
 germenii izolaţi în cultură pură cu o creştere > 2+, rezultatul coroborându-se cu frotiul Gram
(prezenţa celulelor inflamatorii şi a germenilor)4;5;6.
Se limitează la speciile semnificative clinic. Produsele patologice recoltate pe tampon sunt supuse
riscului de a conţine contaminanţi faţă de cele recoltate prin aspirarea cu ac şi seringă sterile, după
decontaminarea tegumentului1;4.
Frotiu Gram: prezenţa celulelor inflamatorii, a celulelor epiteliale scuamoase şi a microorganismelor
Cultură:
 rezultat negativ: absenţa creşterii germenilor sau a florei microbiene patogene;
 rezultat pozitiv: identificarea la nivel de specie şi testarea sensibilităţii pentru izolatele cu
semnificaţie clinică5.
587
Bibliografie
1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Skin.Soft Tissue and Wound infections. In
Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002; 972-984.
2. Connie R. Mahon, George Manuselis. Textbook of Diagnostic Microbiology. 2-nd ed. 2000;
27:921-930.
3. E.J.Diamantopoulos, D.Haritos, G.Yfandi, et al. (1998), Management and outcome of severe
diabetic foot infections., In Exp. Clin.Endocrinol.Diabetes 106:346-352.
4. J.A.Neil, C.L.Munro. (1997), A comparison of two culturing methods for chronic wounds. In
Ostomy Wound Manage 43:20-30.
6. N.Pallua, P.C.Fuchs, et al. (1999), A new technique for quantitative bacterial assessment on
burn wounds by modified dermabrasion. In J. Hosp.Infect. 42:329-337.
7. P.G.Bowler, .J.Davies. (1999), The microbiology of infected and noninfected leg ulcers. In
Int.J.Dermatol. 38:101-106.
588
EXAMEN CITOLOGIC
CERVICO-VAGINAL
22
22 EXAMEN CITOLOGIC CERVICO-VAGINAL
(TEST PAPANICOLAOU)
22.1 Examen citologic cervico-vaginal (test Papanicolaou)

Sinonime: PAP test , citologie cervico-vaginală Babeş-Papanicolaou, frotiul cervico-vaginal.
Informaţii generale şi recomandări:
Cancerul colului uterin este o problemă de sănătate publică în întreaga lume, afectând cu precădere
femei între 35-50 ani aflate în perioada activă socială şi profesională. Dintre ţările Uniunii Europene,
România prezintă una dintre cele mai ridicate rate a mortalitaţii prin cancer de col uterin, principalul
tip de cancer genital şi a doua cauză de deces prin cancer la femeile din ţara noastră6. Depistarea
leziunilor colului uterin într-o etapă timpurie a carcinogenezei şi abordarea integrată a informaţiilor
clinice şi citologice, cu modularea conduitei diagnostice şi terapeutice conform unor protocoale larg
acceptate reprezintă cheia în scăderea incidenţei leziunilor de grad înalt şi a cancerului invaziv. În ţările
în care se desfăşoară programe de screening, acestea şi-au dovedit eficienţa, incidenţa cancerului de
col uterin scăzând foarte mult.
HPV (human papilloma virus) este considerat cauza majoră a cancerului de col uterin. Transformarea
celulelor agresate viral în celule displazice şi apoi în celule canceroase necesită însă şi existenţa altor
factori. Infecţia cu HPV care este considerată o boală cu transmitere sexuală, apare mai frecvent în
legătură cu: debutul precoce al vieţii sexuale, promiscuitate, parteneri multipli, fumat. Există categorii
cu risc de a dezvolta o leziune displazică şi chiar cancer invaziv în urma infecţiei HPV, respectiv
paciente cu nivel scăzut al imunităţii care nu pot elimina virusul sau localiza leziunile determinate de
acesta. În acelaşi timp este important şi genotipul viral, deoarece există peste 100 tulpini de HPV,
dintre care aproximativ 40 au tropism pentru tractul genital inferior.
Pe criterii epidemiologice acestea au fost clasificate în:
- cu risc scăzut (low-risk): 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 81 şi CP6108, care rareori determină
leziuni care progresează spre leziuni de grad înalt şi cancer;
- probabil cu risc crescut: 26, 53, 66;
- cu risc crescut (high-risk): 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 68, 73 şi 82.1
INFECğøE
INCUBAğIE
(1-6 luni)8
Leziune acută
Creútere activă
(3-6 luni)8 Răspunsul imun
Regresie completă Leziune persistentă

(>90%)8 <10%8
Fig. 22.1: Istoria naturală a infecţiei HPV: în urma infecţiei cu HPV apare o leziune acută, care în funcţie
de intervenţia răspunsului imun al gazdei poate regresa sau poate da o leziune persistentă.
590
EXAMEN CITOLOGIC CERVICO-VAGINAL
(TEST PAPANICOLAOU) 22
Cea mai eficientă şi larg utilizată metodă, folosită în multe ţări în cadrul programelor de screening
pentru cancerul colului uterin, care se poate realiza relativ cu uşurinţă asupra unei populaţii largi, este
reprezentată de citologia cervico-vaginală,.
În general, Pap testul se recomandă a fi efectuat periodic la intervale de 3 ani între 21 şi 65 ani sau
la 3 ani de la începutul vieţii sexuale, deoarece se consideră că majoritatea infecţiilor cu HPV sunt
contactate in primii ani de la debutul vieţii sexuale (18-25 ani)8.
Citologia cervico-vaginală care se realizează în laboratorul Synevo beneficiază de avantajele
tehnologiilor de vârf din acest domeniu: recoltare în mediu lichid, îmbogăţirea masei celulare cu
eliminarea detrisurilor şi a altor elemente ce pot interfera cu rezultatul, colorare automată, analiză
computerizată.
Citologia in mediu lichid (LBC) ajută la scăderea semnificativă a cazurilor nesatisfăcătoare faţa de
testele convenţionale, reducând astfel nevoia repetării nejustificate a prelevării.
Prin recoltarea in mediu lichid, întreaga probă recoltată este trimisă la laborator pentru procesare, fără
pierderea sau deteriorarea celulelor recoltate.
Procesul de prelucrare realizează separarea, reducerea detritusurilor (sânge, mucus) şi a celulelor
inflamatorii, cu conservarea caracteristicilor necesare pentru interpretare, permiţând o vizualizare mai
rapidă şi mai calitativă a celulelor relevante clinic.
Procesarea şi colorarea lamelor se realizează în sistem automat pentru asigurarea unei calităţi ridicate
şi a unor rezultate standardizate.
Sistemul de analiză computerizată scanează toate frotiurile în mediu lichid sau convenţionale şi
ajută la îmbunătăţirea calităţii interpretării lor prin direcţionarea atenţiei patologului asupra câmpurilor
microscopice care cel mai probabil conţin anomalii, prin clasificarea frotiurilor conform unui sistem de
cuantificare a riscului bazat pe măsurarea a sute de parametri celulari.
Prin acest sistem se realizează o detecţie crescută a cazurilor HSIL-pozitive atât pe LBC cât si pe
preparatul convenţional, precum şi îmbunataţirea detecţiei LSIL pe cele convenţionale.
Sistemul poate reduce semnificativ timpul de examinare şi, implicit, timpul în care este elaborat
diagnosticul final, fără a scădea rata de detecţie a leziunilor importante clinic.
Pregătire pacientă - cu 24-48 ore înainte de recoltarea probei trebuie să fie evitate: raporturile
sexuale, lavajul vaginal, alte tratamente intravaginale (geluri, creme, contraceptive, dezinfectante,
lubrifianţi) sau alte manevre intravaginale (tampoane intravaginale, explorare vaginală).
- Se recomandată recoltarea în afara perioadei menstruale, în perioada de mijloc a ciclului menstrual,
iar în cazul infecţiilor, după tratarea acestora.
- În cazul procedurilor medico-chirurgicale, se recomandă recoltarea înainte de examinarea manuală,
înainte sau la minim 24 ore postcolposcopie cu aplicaţie de acid acetic, la 3 luni de la recoltări
anterioare, iar în cazul electrorezecţiilor, polipectomiilor ca şi postpartum ar trebui să existe un interval
de 1.5-3 luni4;7.
Specimen recoltat - celule ale zonei exocervicale, endocervicale şi de tranziţie dintre acestea (zona
de transformare). Zona de transformare reprezintă sediul cel mai frecvent al leziunilor preneoplazice
(turn-over crescut, expusă microtraumatismelor, sensibilitate crescută la acţiunea HPV), acolo unde
epiteliul scuamos al exocolului se continuă cu cel de tip glandular de la nivel endocervical prin
591
(TEST PAPANICOLAOU)
intermediul unei zone de metaplazie scuamoasă.

Recoltare - se efectuează cu ajutorul periuţei cervicale cu cap detaşabil. Pentru recoltarea în mediu
lichid sunt recomandate dispozitivele din plastic. După recoltare, partea detaşabilă a instrumentului
este introdusă în flaconul cu mediu lichid, fără a se efectua alte manevre asupra suprafeţei care
conţine materialul celular.

Fig.22.2: Periuţa Cervex-Brush10 Fig. 22.3: Flacon fixare şi transport10

Instrucţiuni de recoltare - După vizualizarea colului uterin se inseră partea centrală a periuţei în
canalul endocervical astfel încât marginile mai scurte să vină în contact cu exocervixul. De obicei nu
se recomandă ştergerea colului uterin înainte de recoltare, dar la nevoie se poate tampona uşor cu
un tifon7. Cu partea centrală fixă, se roteşte complet periuţa în sensul acelor de ceasornic de cinci
ori 5.
Proba astfel recoltată trebuie imediat fixată pentru a se evita deteriorarea probei. În acest scop se
detaşează capătul periuţei care conţine materialul recoltat şi se introduce în recipientul cu mediu
lichid.
Fig.22.4: Detaşare capăt recoltare10

Se acoperă flaconul cu capacul, se înşurubează pentru a nu se varsa lichidul, se etichetează imediat
(sau înaintea recoltării probei) şi se transportă la laborator împreună cu fişa de însoţire a pacientei în
vederea prelucrării.
! După recoltarea cu periuţa nu este necesară efectuarea altor manevre (de descărcare)
asupra capătului de recoltare. La laborator este trimis flaconul în care se găsesc: lichidul
fixator şi capătul detaşabil al periuţei.
592
Este foarte important ca, pe lângă corectitudinea recoltării, proba să fie însoţită şi de datele clinice
cât mai complete ale pacientei: vârsta, data ultimei menstruaţii, data recoltării, antecedente medicale,
tratamente, metode de contracepţie, rezultate anterioare ale Pap testului etc3;8.
Stabilitate probă - termenul de păstrare a mediului lichid fără proba recoltată este de 36 luni de
la data fabricaţiei la temperatura camerei (15-30°C). După recoltare, proba cu materialul celular se
poate păstra 6 luni la 2-10°C sau 4 săptămâni la temperatura camerei (15-30°C)5.
Metodă - citologie în mediu lichid, coloraţie Papanicolaou. Prelucrarea şi colorarea LBC se realizează
în mod automat. Lamele sunt scanate şi analizate prin sistemul computerizat care asistă medicul în
elaborarea rezultatului.
Avantajele LBC:
- recoltare facilă şi rapidă, fără riscul distrugerii sau deteriorării celulelor;
- 100% din celulele epiteliale diagnostice recoltate sunt transferate la laborator;
- fixare mai eficientă în mediul de transport;
- înlăturarea majorităţii factorilor de obscurare şi realizarea unui frotiu alcătuit dintr-un singur
strat de celule uniform distribuit, concentrat într-o zonă mică, facilitând interpretarea şi
îndeplinirea condiţiilor de acceptabilitate;
- scăderea numărului de probe ce trebuie repetate în urma raportării ca fiind
nesatisfăcătoare;
- compatibil cu sistemul automat de îmbogăţire celulară, colorare şi interpretare asistată de
calculator.
Fig.22.5: Frotiu convenţional Fig. 22.6: LBC
Limite şi interferenţe:
- factori care ţin de calitatea tehnică: nerespectarea condiţiilor privitoare la pregătirea
pacientelor sau la momentul recoltării. Ex: recoltare în perioada menstruală, folosire de
lubrifiante intravaginale înaintea/în timpul recoltării etc.
- factori fiziologici sau patologici care ţin de paciente: sarcină, lehuzie, postpartum (interval
de 6-8 săptămâni), atrofie (se poate recomanda terapie trofică locală cu estrogeni),
radioterapie.
- celularitatea scăzută a frotiului poate limita posibilitatea elaborării unui diagnostic (criteriul
593
(TEST PAPANICOLAOU)
acceptabilităţii). Totuşi, preparatele se vor examina pentru a determina cauzele probabile ale
acestei deficienţe, care în anumite condiţii poate fi normală, sau pentru prezenţa celulelor
atipice, caz în care se precizează în buletinul de analiză că preparatul are celularitate la
limită sau scăzută. LBC şi sistemul de „imbogaţire celulară” ajută la îndeplinirea acestui
criteriu, dar există un minim necesar de 5000 de celule3.
- absenţa celulelor endocervicale sau metaplaziate semnifică eşantionarea inadecvată a
zonei endocervicale, iar aceasta se specifică în buletinul de raportare.
- factorii de obscurare pot interfera cu interpretarea atunci cand afectează >75%
(nesatisfăcător) sau 50-75% dintre celule (satisfăcător, dar parţial obscurat). Cea mai mare
parte a acestor inconveniente sunt înlăturate prin recoltarea în mediu lichid3.
- calitatea celulelor importante pentru diagnostic poate fi influenţată de manevre medico-
chirurgicale locale practicate anterior recoltării: examinare manuală, aplicaţie lugol/acid
acetic, recoltări anterioare, electrorezecţii etc.
- Pap testul reprezintă un instrument foarte util de screening folosit în depistarea precoce sau
în stadii incipiente ale cancerului cervical, dar trebuie urmat întotdeauna de alte investigaţii
înainte de a se lua o decizie terapeutică. Pap testul triază eficient pacientele care vor
efectua investigaţii suplimentare (colposcopie) în vederea stabilirii de către medicul clinician
a atitudinii terapeutice.
Cauze de respingere a probei:
- probă necorespunzătoare: flacon deteriorat, mediu de transport absent/insuficient, absenţa
din flacon a capătului de recoltare al periuţei;
- probă neetichetată, fişă incompletă fără datele clinice şi de identificare complete ale
pacientei.
Rezultate, elaborarea diagnosticului:
În urma prelucrării şi examinării probei, rezultatul se elaborează conform Sistemului de raportare a
citologiei colului uterin Bethesda 20013.
Termeni utilizaţi:
- acceptabilitatea specimenului;
- modificări non-neoplazice - NILM;
- anomalii ale celulelor epiteliale scuamoase: ASC-US, ASC-H, LSIL, HSIL, SCC;
- anomalii ale celulelor glandulare-AGC, AIS, adenocarcinom.
1. ACCEPTABILITATEA SPECIMENULUI: criteriile necesare a fi îndeplinite de un preparat
pentru a fi raportat ca fiind satisfacător pentru interpretare sunt:
• de celularitate minimă: chiar dacă metoda LBC înlătură cea mai mare parte
dintre inconvenientele frotiurilor convenţonale, asigurând ajungerea în laborator
a 100% din materialul recoltat şi selectarea masei celulare importante pentru
diagnostic, există un minim necesar de celule scuamoase bine conservate şi uşor
de vizualizat pentru elaborarea diagnosticului (5000)3.
• prezenţa celulelor endocervicale sau din zona de transformare: indică
recoltarea corespunzătoare a frotiului cu eşantionarea zonei de transformare
594
(minim 10 celule endocervicale sau metaplaziate bine conservate, izolate sau

grupate). Precizarea prezenţei/ absenţei celulelor endocervicale/metaplaziate nu
este necesară în leziunile de grad înalt sau invazive3.
• factori de obscurare: sânge, mucus etc. Se consideră că un frotiu este
nesatisfăcător atunci când >75% dintre celulele scuamoase sunt acoperite şi
parţial obscurat dar satisfăcător pentru interpretare dacă 50-75 % dintre celule
sunt obscurate, cu condiţia ca pe frotiu să nu fi fost identificate celule atipice. LBC
are avantajul că înlătură cei mai mulţi dintre aceşti factori3.
*ASCCP 2007 recomandă în caz de teste nesatisfăcătoare repetarea la 2-4 luni, repetare la
12 luni pentru cele cărora le lipseşte componenta endocervicală sau parţial obscurate7.
2. NILM - frotiu negativ pentru leziuni intraepiteliale sau maligne;

• microorganisme: paraziţi (Trichomonas vaginalis), organisme fungice
compatibile cu Candida, modificări ale florei vaginale compatibile cu diagnosticul
de vaginoză, bacterii sugestive pentru genul Actinomyces, modificări celulare
sugestive pentru infecţia cu Virus Herpes Simplex (HSV);
• alte modificări non-neoplazice: modificări celulare reactive asociate cu:
inflamaţia, iradierea, dispozitive contraceptive intrauterine; prezenţa de celule
glandulare (status posthisterectomie), atrofie.
3. ALTELE: celule endometriale la femei >40 ani.
4. ANOMALII ALE CELULELOR EPITELIALE:

 SCUAMOASE:
• Celule scuamoase atipice: - cu semnificaţie nedeterminată (ASC-US);
- nu se poate exclude HSIL (ASC-H).
• Leziuni scuamoase intraepiteliale de grad scăzut (LSIL) - includ modificări
induse de HPV; displazia uşoară; CIN1.
• Leziuni scuamoase intraepiteliale de grad înalt (HSIL) - includ leziunile:
CIN2 (displazia moderată) şi CIN3 ( displazia severă şi carcinomul in situ).
• Carcinom cu celule scuamoase.
 GLANDULARE:
• Celule atipice (endocervicale, endometriale, glandulare) cu semnificaţie
neprecizată (AGC-NOS).
• celule atipice (endocervicale, glandulare) sugestive pentru neoplazie (FN).
• adenocarcinom endocervical in situ (AIS).
• adenocarcinom: endocervical, endometrial, extrauterin, cu semnificaţie
neprecizată (NOS).
5. Alte leziuni maligne.
595
(TEST PAPANICOLAOU)
596
Interpretarea rezultatelor, recomandări:

Rezultatul Pap testului trebuie interpretat prin corelarea cu datele clinice ale pacientelor precum şi cu
alte investigaţii efectuate. Astfel, în funcţie de suspiciunea ridicată în urma Pap testului, prin integrarea
în contextul clinic de către medicul curant, se pot formula recomandările privitoare la conduita
terapeutică şi diagnostică ce trebuie urmată. Asociaţiile profesionale medicale din domeniu au elaborat
o serie de recomandări asupra atitudinii de urmat în funcţie de rezultatele Pap testului1;2;6.
• NILM - semnifică absenţa leziunilor intraepiteliale sau a malignităţii. Această categorie este
folosită şi pentru a raporta prezenţa colonizării cu microorganisme, dar şi a leziunilor reactive
sau reparatorii ale celulelor ca răspuns la infecţii, iradiere, DIU etc..
Raportarea celulelor glandulare benigne posthisterectomie poate semnifica: adenoză, prolaps
salpingian, metaplazie etc.
Tot în categoria NILM sunt incluse şi modificările induse de atrofie.
• Celulele endometriale la femei cu vârste peste 40 ani. Acestea pot sugera riscul unei
patologii endometriale care pentru femeile în premenopauza este mic (în general patologie
benignă: polipi, hiperplazie simplă), în timp ce la femeile în postmenopauză ele pot indica
necesitatea investigării endometrului prin corelarea cu semnele şi simptomele clinice, terapii
hormonale etc. Prezenţa celulelor endometriale este normală pe specimenele menstruale sau
din timpul fazei proliferative a ciclului menstrual.
• CELULE SCUAMOASE ATIPICE:

ASC-US: - semnifică prezenţa de celule epiteliale atipice a căror semnificaţie nu poate fi precizată.
Modificările celulelor epiteliale sunt mai importante decât cele din procesele
inflamatorii, dar nu suficiente pentru interpretarea ca leziune intraepitelială.
- prezintă un risc pentru o leziune de grad înalt de 10-20%9.
- în general există trei recomandări: 1. repetare la 4-6 luni;
2. testare HPV - cu risc înalt;
3 .colposcopie.
* La adolescente (<20 ani) se repetă citologia anual timp de doi ani, iar în cazul unor rezultate
pozitive repetate pentru ASC-US, se recurge la colposcopie cu biopsie.
ASC-H: - sugerează prezenţa unor celule epiteliale atipice sugestive pentru leziuni intraepiteliale
de grad înalt, dar care nu întrunesc pe deplin criteriile cantitative sau calitative pentru
calificarea ca HSIL.
- 50% din citologiile cu ASC-H ascund riscul unei leziuni de grad inalt9;
- din aceste motive, ghidurile internaţionale recomandă efectuarea colposcopiei cu
biopsia ariilor suspecte2,6.
LSIL: - sugerează modificări ale celulelor epiteliale scuamoase compatibile cu o leziune
597
(TEST PAPANICOLAOU)
intraepitelială de grad scăzut. Termenul de leziune intraepitelială se referă la faptul că

modificările celulare sunt strict localizate la nivelul epiteliului de acoperire al colului uterin,
fără a depăşi membrana bazală, deci fără potenţial invaziv. Într-o leziune de grad scăzut
modificările atipice sunt prezente doar la unele dintre celulele scuamoase.
- în această categorie sunt încadrate modificările celulare induse de HPV şi CIN1
(displazia uşoară);
- reprezintă indicaţie pentru colposcopie cu biopsia leziunilor suspecte.
*femei în postmenopauză:unele paciente pot prezenta celule atipice (atipie de menopauză) care nu
necesită tratament.
**adolescente (<20 ani): este preferată urmărirea clinică prin repetare la 12 luni a citologiei timp de
2 ani. Atitudinea de expectativă este justificată de faptul că la adolescente, datorită sistemului imun
competent, majoritatea leziunilor dispar de la sine, faţă de o rată de regresie spontană mai scăzută
la femeile adulte.
***femei însărcinate: colposcopie înainte (pentru excluderea unei leziuni invazive) şi după naştere.
HSIL: - sugerează prezenţa unei leziuni intraepiteliale de grad înalt în care atipiile celulare sunt
mai mari şi afectează o proporţie mai mare din celulele epiteliale, dar sunt încă limitate la
epiteliul de acoperire al colului uterin fără a depăşi membrana bazală.
- apare ca urmare a persistenţei şi evoluţiei unei leziuni de etiologie HPV.
- include modificări CIN2 (displazia moderată) şi CIN3 (displazia severă şi CIS).
- conform recomandărilor, necesită confirmare imediată prin colposcopie şi biopsie.
*la femeile însărcinate, colposcopia poate exclude o leziune invazivă.
**la adolescente este recomandată colposcopia şi biopsia zonelor suspecte. În caz de biopsie
pozitivă cu displazie moderată, atitudinea recomandată este de urmărire colposcopică şi prin
citologie la 6 luni timp de 2 ani, cu repetarea biopsiei dacă leziunea persistă, caz în care este
indicată electrorezecţia. În caz de displazie severă pe biopsie se impune excizia leziunii.
SCC: - indică prezenţa unei leziuni neoplazice invazive care a depăşit stadiul de leziune
intraepitelială prin extensia dincolo de membrana bazală.
• CELULE GLANDULARE ATIPICE:
AGC: - această categorie reuneşte modificările atipice ale celulelor epiteliului glandular
superioare celor din leziunile reactive sau reparatorii dar insuficiente pentru neoplazie.
- dacă este posibilă identificarea originii, atunci se precizează în raport, în caz contrar
sunt încadrate în categoria NOS.
- dacă modificările celulare sunt sugestive pentru prezenţa unei leziuni neoplazice, se
precizează în raport ca fiind sugestive pentru neoplazie. Specificaţia NOS este folosită
atunci când nu este posibilă precizarea potenţialului neoplazic al celulelor glandulare
atipice.
- se recomandă colposcopie cu biopsia ariilor suspecte şi chiuretaj endocervical în cazul
celulelor glandulare atipice cu origine endocervicală sau biopsie endometrială pentru
598
cele endometriale.
* la femeile >35-40 ani sau <35 ani cu sângerări anormale este indicată investigarea
endometrului.
AIS: - semnifică prezenţa unei leziuni neoplazice limitată la epiteliul glandular endocervical fără
a depăşi membrana bazală.
- este indicaţie de excizie, conizaţie sau histerectomie în funcţie de caz.
Adenocarcinomul endocervical, endometrial sau extrauterin (ovarian, salpingian): este o
leziune care a depăşit epiteliul de suprafaţă şi are capacitate invazivă.
• Alte neoplasme: în această categorie sunt incluse tumorile primare rare ale colului uterin
(carcinomul cu celule mici, carcinosarcomul, tumori germinative, limfoame etc.), precum şi cele
secundare (endometru, rect, vezică urinară) sau de origine metastatică (sân, melanom etc.).
ASC-US +
Pap test la 4-6 luni Testare HPV Colposcopie. *adolescente<20 ani
-
ASC-US+ +HPV risc Pap test
înalt anual
Pap test la 4-6 luni Colposcopie Colposcopie ASC-US+
-
Pap test anual
Pap test anual ACS-US+
Colposcopie
Fig.22.7: Recomandări ASC-US9.
Fig 22.8: Recomandări ASC-H9.
599
(TEST PAPANICOLAOU)
LSIL+
Colposcopie+biopsie
+ -
Excizie Pap test la 6-12 luni Testare HPV
- -
Screening Screening
Fig.22.9: Recomandări LSIL9.
HSIL+
Colposcopie +biopsie
+ -
Excizie
Fig.22.10: Recomandări HSIL9.
AGC+
Colposcopie + chiuretaj endocervical Biopsie endometrial
Fig.22.11: Recomandări în AGC9.
AIS+
Excizie ConizaĠie Histerectomie
Fig. 22.12: Recomandări AIS9.
600
Bibliografie
1. Alexander Meisels, Carol Morin. Modern Uterine Cytopathology. Moving to the Molecular Smear.
ASCP Press, Chicago, IL, 2007, 155-162; 369-375.
2. Wright TC, Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, Solomon D. 2006 consensus
guidelines for the management of women with abnormal cervical cancer screening tests. In
Journal of Low Genital Tract Disease, 2007.
3. Diane Solomon, Ritu Nayar. Sistemul Bethesda de raportare a citologiei colului uterin, Ed.
Medicală Calisto, 2009.
4. H.F.Nauth, Gynecological Cytology, Georg ThiemeVerlag, 2007, 335-338.
5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. Ref type: Internet
Communication.
6. M. Arbyn, A. Anttila, J. Jordan, G. Ronco, U. Schenck, N. Segnan, H. Wiener, A. Herbert & L.
von Karsa. European Guidelines for Quality Assurance in Cervical Cancer Screening. Second
Edition—Summary Document, In Annals of Oncology 21, 2010: 448–458
7. M. Arbyn, A. Herbert, U. Schenck, P. Nieminen, J. Jordan, E. Mcgoogan, J. Patnick, C.
Bergeron, J-J. Baldauf, P. Klinkhamer, J. Bulten and P. Martin-Hirsch. European guidelines for
quality assurance in cervical cancer screening: recommendations for collecting samples for
conventional and liquid-based cytology. In Cytopathology 2007, 18, 133– 139.
8. Marluce Bibbo, David C. Wilbur, Comprehensive Cytopathology, Third Edition, Saunders
Elsevier 2008.
9. Richard Mac DeMay, The Pap Test, ASCP Press, Chicago, 2005;
10. www.bd.com
Abrevieri:
AGC - celule glandulare atipice
AIS - adenocarcinom in situ
ASC - celule scuamoase atipice
ASC-US - celule scuamoase atipice cu semnificaţie nedeterminată
ASC-H - celule scuamoase atipice fără a se putea exclude o leziune de grad înalt
ASCCP - American Society of Colposcopy and Cervical Pathology
CIN - neoplazie cervicală intraepitelială
CIS - carcinom in situ
HPV - virusul papilloma uman
HSIL - leziune scuamoasă intraepitelială de grad înalt
LBC - Liquid Base Cytology - citologie în mediu lichid
LSIL - leziune scuamoasă intraepitelială de grad scăzut
NILM - negativ pentru leziuni maligne intraepiteliale
NOS - (no other specifications) fără alte specificaţii
SCC - carcinomul scuamocelular
TBS - The Bethesda System
601
(TEST PAPANICOLAOU)
22.2 ANEXA Formular utilizat la recoltarea probelor si raportarea rezultatelor

FORMULAR DE RECOLTARE-PAP TEST
Nume úi prenume: ..........................................................................Vârstă:..............CNP:...................................................................

Adresa:...........................................................................................Telefon/e-mail.:..............................................................................
U.M. (data ultimei menstruaĠii):............................͕ sarcină ͕ lehuzie ͕ lactatie ͕ menopauză de ...........ani
ContracepĠie: ͕ medicamentoasă:..................................... ͕ DIU ͕ altele:...............................................................
Antecedente ͕ medicale / ͕ chirurgicale ginecologice:...............................................................................................................
Tratamente: ͕ biopsie ͕ excizie ͕ conizaĠie ͕ histerectomie: ͕subtotală/͕ totală
͕ radioterapie ͕ chimioterapie ͕ hormonoterapie:..............................................................................
Citologie anterioară: data..................................... Rezultat:................................................................................................
Recoltat la (data/ora/locul):..................................... Recoltat de: ..................................................................................

Motivele recomandarii:.......................................... Medic:...........................................................................................
Metodă: mediu lichid, coloraĠie automată Papanicolaou ͕ scanare computerizată ͕ interpretare manuală
Raportare (conform Sistemului de Raportare Bethesda 2001):
I. Acceptabilitatea specimenului:
͕ SATISFĂCĂTOR: ͕ celule endocervicale /͕ metaplaziate
͕ NESATISFĂCĂTOR: ͕ neprocesat / ͕ procesat si examinat dar nesatisfăcător.
II. Categorii generale :
͕ NILM (frotiu negativ pentru leziuni intraepiteliale sau maligne):
- MICROORGANISME : ͕ Trichomonas vaginalis;
͕ Fungi cu morfologie sugestivă pentru specii de Candida;
͕ Modificarea florei vaginale sugestivă pentru vaginoză bacteriană;
͕ Bacterii morfologic compatibile cu specii de Actinomyces;
͕ Modificări celulare sugestive pentru infecĠia cu Virus herpes simplex;
͕ altele:..............................................................................................................................................
- Alte modificări NON NEOPLAZICE:
͕ MODIFICĂRI CELULARE REACTIVE asociate cu: ͕ INFLAMAğIA / ͕ IRADIEREA / ͕ DIU;
͕ ATROFIE;
͕ CELULE GLANDULARE STATUS POSTHISTERECTOMIE.
͕ CELULE ENDOMETRIALE LA FEMEI>40 ani;
͕ ANOMALII ALE CELULELOR EPITELIALE:
͕ SCUAMOASE: ͕ GLANDULARE:
͕ ASC-US (celule scuamoase atipice cu semnificaĠie ͕ Celule atipice NOS (cu semnificaĠie nedeterminată):
nedeterminată) ͕ Endocervicale
͕ ASC-H (celule scuamoase atipice care nu pot exclude o ͕ Endometriale
leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt); ͕ Glandulare
͕ LSIL (leziune intraepitelială scuamoasă de grad scăzut): ͕ Celule atipice în FAVOAREA NEOPLAZIEI:
͕ CIN 1 (displazie usoară) / ͕ HPV ͕ Endocervicale
͕ HSIL (leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt): ͕ Glandulare
͕ CIN 2 (displazie moderată) ͕ AIS (adenocarcinom endocervical in situ)
͕ CIN 3 (displazie severă úi CIS); ͕ Adenocarcinom: ͕endocervical ͕endometrial
͕ HSIL cu suspiciune de invazie. ͕extrauterin ͕NOS
͕ SCC-carcinom cu celule scuamoase.
͕ALTE LEZIUNI MALIGNE:.............................................................................................................................
Interpretare:..........................................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................................................................
Recomandări úi sugestii (conform asociaĠiilor profesionale):...........................................................................................................
͕ repetare: ͕ după tratament antiinflamator; ͕ la 3-6 luni; ͕ la un an; ͕ screening .
͕ testare HPV ͕ colposcopie ͕ biopsie ͕ curetaj:͕endocervical / ͕ endometrial
Analiza automată (BD FocalPoint GS): ͕da/͕nu
rezultat:............................................................................................................
Concluzii:...............................................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................................................................
Data: ...................... Medic anatomopatolog
602
CONTACT
Call center Synevo Bucureşti

Tel: 021 9666, 021 208 28 28
Synevo Laborator Central

Str. Industriilor nr.25, Chiajna, Ilfov
Tel: 021 407 07 00 / 021 316 21 63
Fax: 021 316 21 60
office@synevo.ro
Synevo Bucureşti Grozovici

Str. Dr. Calistrat Grozovici nr.6, Sector 2, Bucureşti
Tel: 021 316 21 65/66
Fax: 021 316 21 62
Synevo Bucureşti Titulescu

Bd. N. Titulescu nr. 94, bl. 14, Sector 1, Bucureşti
Tel: 021 223 24 69/70
Fax: 021 223 37 29
Synevo Bucureşti Plevnei

Calea Plevnei 96, Sector 1, Bucureşti
Tel: 021 315 09 15/25
Fax: 021 315 09 21
Synevo Bucureşti Unirii

Str. Bibescu Vodă 1, bl. P4, Sector 4, Bucureşti
Tel: 021 337 10 17/44
Fax: 021 337 10 47
Synevo Bucureşti Titan

Bd. N. Grigorescu nr. 41, parter, Sector 3, Bucureşti
Tel: 021 341 00 66
Fax: 021 341 00 60
Synevo Bucureşti Vitan

Calea Dudeşti 104-122, demisol, în Policlinica Vitan,
Sector 3, Bucureşti
Tel: 021 323 53 68
Fax: 021 323 53 67
CONTACT
Synevo Bucureşti Lizeanu

Str. Făinari nr. 26, bl. 50, parter, Sector 2, Bucureşti
(lângă magazinul Mega Image)
Tel: 021 210 10 30
Fax: 021 210 70 60
Synevo Bucureşti Fundeni

Str. Sportului nr. 53A, Sector 2, Bucureşti
Tel: 021 208 28 28
Fax: 021 241 41 55
Synevo Bucureşti Caritas

Str. Maximilian Popper nr. 8-10, Sector 3, Bucureşti
Tel: 021 9666
Synevo Pitesti
Str. Dr. Victor Babeş nr.12, Piteşti, jud. Argeş
Tel: 0248 280 812
Fax: 0248 280 811
Synevo Ploiesti
Str. Vasile Lupu nr. 2, bl. 32F, parter, Ploieşti, jud.
Prahova
Tel: 0244 545 383
Fax: 0244 545 384
Synevo Râmnicu Vâlcea

Calea lui Traian nr. 183, bl. 15, parter, Râmnicu
Vâlcea, jud. Vâlcea
Tel: 0250 744 401
Fax: 0250 744 402
Synevo Cluj Napoca

Str. Republicii nr. 34-36, Cluj Napoca, jud. Cluj
Tel: 0264 430 451
Fax: 0264 430 452
Synevo Cluj Napoca

Str. Moţilor nr. 9, Cluj Napoca, jud. Cluj
Tel: 0264 430 450/453
Fax: 0264 430 454
CONTACT
Synevo Cluj
Str.Primăverii nr.8, ap.182, parter, Cluj Napoca, jud.
Cluj
Tel/fax: 0264 425 048
Synevo Satu Mare

Str Prahovei nr.22, Satu Mare
(vis-a-vis de Spitalul Judeţean)
Tel: 0261 744 010 / 011
Fax: 0261 877 251
Synevo Satu Mare

Str. Gh. Lazăr nr. 1-2, Satu Mare
(fosta Policlinica Veche)
Tel: 0261 877 250
Fax: 0261 877 252
Synevo Constanţa
Str. Ştefan cel Mare nr. 133, Constanţa, jud.
Constanţa
Tel/fax: 0241 549 049
Synevo Constanţa
Bd. Tomis nr. 145, Constanţa, jud. Constanţa
(în incinta Policlinicii nr. 1 a Sp. Clinic Judeţean)
Tel/fax: 0241 615 785
Synevo Medgidia
Str. Ion Creangă nr. 18, Medgidia, jud. Constanţa
Tel: 0241 821 796
Fax: 0241 821 797
Synevo Suceava
Bd. 1 Decembrie 1918 nr. 21, Suceava, jud. Suceava
Tel: 0230 511 261
Fax: 0230 511 515
Synevo Câmpulung Moldovenesc

Str. Sirenei nr. 24, Câmpulung Moldovenesc, jud.
Suceava
Tel/fax: 0230 314 867
CONTACT
Synevo Gura Humorului

P-ţa Republicii nr.13, Gura Humorului, jud. Suceava
Tel/fax: 0230 314 867
Synevo Rădăuţi
Calea Bucovinei nr. 34A, Rădăuţi, jud. Suceava
Tel: 0230 564 883
Fax: 0230 564 815
Synevo Rădăuţi
Str. Putnei nr.1, bl.21, sc.J, parter, Rădăuţi, jud.
Suceava
Tel: 0230 564 886
Synevo Iaşi
Str. Cloşca nr. 8, bl B2, Iaşi
(în incinta complexului comercial Ştefan cel Mare)
Tel: 0232 219 971
Fax: 0232 218 299
Synevo Iaşi
Str Lăpuşneanu nr. 17, Iaşi
Tel: 0232 222 217
Fax: 0232 222 218
Synevo Bacău
Str. Marasesti nr.151, sc, B, parter, Bacau
Tel: 0234 549 549
Fax: 0234 549 548
Synevo Timişoara
Str. Splaiul Tudor Vladimirescu nr. 10, demisol,
Timişoara, jud. Timiş
Tel: 0256 200 039/42/53
Fax: 0256 200 033
Synevo Timişoara
Str. Calea Martirilor 1989 nr. 21, Timişoara, jud. Timiş
Tel: 0256 200 042
Fax: : 0256 200 033
CONTACT
Synevo Arad
Str. Banu Maracine, nr. 24, bl.1/A, sc. D, parter, Arad,
jud. Arad
Tel: 0257 338 228 / 229
Fax: 0375 392 002
Synevo Craiova
Str. Alexandru Macedonski nr. 53, corp C2, Craiova,
jud. Dolj
Telefon: 0251 530 040 / 532 299 / 532 294
Fax: 0251 530 044
Synevo Craiova
Str. Tabaci nr. 28 , Craiova, jud. Dolj
Telefon: 0251 530 121
Fax: 0251 530 120
Synevo Braşov
Str. Aurel Vlaicu nr. 2, Braşov, jud. Braşov
Telefon: 0268 424 072 / 073 / 074
Fax: 0268 424 075
Synevo Braşov
Str.Calea Bucureşti Nr.7, Braşov, jud. Braşov
Telefon: 0268 310 076
Tipărirea acestui Ghid a fost posibilă şi cu ajutorul sponsorilor
Concept grafic:
Editare grafică şi tipar:

grafixvcsmedia.ro
Mulţumiri tuturor !

Volumul 3: Ghidul Serviciilor Medicale Al Laboratoarelor Synevo

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Volumul 3: Ghidul Serviciilor Medicale Al Laboratoarelor Synevo

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE

18.1.2.1 Polipoza adenomatoasă familială................................................................. 151

18.3.6 ADN viral hepatita B (cantitativ)........................................................................ 332

20.2.11 Titan în ser...................................................................................................... 468

17.7 TESTE PENTRU EVALUAREA SISTEMULUI COMPLEMENTULUI

17.7.1 Complement hemolitic total (CH100)

Sinonime – CH100, CH50, complement seric total6.

1. Frances Fischbach, Total hemolytic complement (CH50). In A Manual of Laboratory and

17.7.2 C1 inhibitor esteraza (dozare proteină)

Pregătire pacient - à jeun (pe nemâncate) sau postprandial2.

17.7.3 C1 inhibitor esteraza (activitate)

are o masă moleculară de ~105 KDa.

plin; probe care nu au sosit la laborator congelate2.

17.7.4 Mannose-binding-lectin (MBL) în ser

17.8.1 Interleukinele (IL)

adecvate răspunsului inflamator2.

1. Florence Allantaz, D. Chaussabel, J. Banchereau, et al, “Microarray-based identification of novel

17.8.2 Interleukina 1β (IL-1β)

efecte procoagulante9 şi de stimulare a hematopoiezei (efect sinergic cu factori de creştere locali)8;9.

3. Florence Allantaz, D. Chaussabel, J. Banchereau, et al, “Microarray-based identification of novel

17.8.3 Interleukina 6 (IL-6)

17.8.4 Interleukina 8 (IL-8)

se adresează secundar şi altor celule, precum bazofilele şi un subset de limfocite T (CD4/CD8)3;4.

17.8.5 Interleukina 10 (IL-10)

eozinofilelor, reducerea nivelului său fiind implicată în patogeneza bolilor alergice2;3.

17.8.6 Receptorul solubil pentru interleukina-2

17.8.7 Interferon gamma (IFNγ)

17.8.8 Factor de necroză tumorală alfa (TNF-α)

Informaţii generale şi recomandări pentru determinarea TNF-α

17.9 TESTE DE IMUNOFENOTIPARE LIMFOCITARĂ

17.9.1 Imunofenotipare limfocitară - profil imun de bază

Informaţii generale despre sistemul imun

Celule Celule Celule Celule Celule

Tabel 17.9.1.1 Markeri pentru diferenţierea celulelor B

MARKER CTL naive Tem Tcm

Tabel 17.9.1.2 Proprietăţile CTL

generarea de limfocite T şi B self-reactive potenţial dăunătoare - toleranţa imună centrală - şi de a

MARKER Celule T naive Celule T efectoare Celule T de memorie

Tabel 17.9.1.3 Markeri pentru diferenţierea celulelor T

Fig. 17.9.1.1 Evoluţia naturală a infecţiei HIV (Adaptare după http://mcb.berkeley.edu/courses)10

Profilul imun de bază şi recomandări pentru efectuarea acestui test

Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant5.

1. ARUP Laboratories. Test Directory: Lymphocyte Subset Panel 5 - Total Lymphocyte

Cornelia M. Weyand. Fundamental Principles of the Immune Response. In Clinical Immunology.

17.9.2 Imunofenotipare limfocitară - imunitate antitumorală

Mecanisme efectoare ale imunităţii

Celule - Inhibarea creşterii tumorale Acţiunea supresivă a Referinţe legate de

Celule NK - citotoxice prin granzime/perforine sau - suprimă activitatea Trzonkowski et al.

Imunofenotipare limfocitară - profil tumoral şi recomandări pentru efectuarea acestui test

• limfocitele T totale (CD3+);

17.9.3 Imunofenotipare limfocitară – profil autoimun

pentru LES, anticorpii anti-topoizomeraza-1 în formele difuze de sclerodermie).

Recipient de recoltare - vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant5.

17.9.4 Imunofenotipare limfocitară – profil infecţii cronice

17.9.5 Imunofenotipare limfocitară - sindroame limfoproliferative

Tabel 17.9.5.1: Reactivii consens pentru evaluarea iniţială a neoplaziilor hematopoietice16

NEOPLAZIILE LIMFOIDE MATURE

CD5 uniform, sIg slab, CD10+

CD5 uniform, sIg intens, CD11c úi CD22 intens,

CD5 uniform, sIg slab, CD5-, CD10-, CD103-

* Se recomandă ciclina D1 (FISH sau IHC)

Neoplaziile limfoide cu celulă T şi NK matură

Tabel 17.9.5.4: Markeri pentru diagnosticul leucemiei acute limfoblastice8