FIZIOLOGIA SÂNGELUI - Numărarea leucocitelor

Noţiuni teoretice
Leucocitele (globulele albe) sunt o populaţie celulară neomogenă. În funcţie de prezenţa
granulaţiilor citoplasmatice vizibile în microscopia optică se clasifică în:
-granulocite,
-agranulocite (monocite si limfocite).
La rândul lor, granulocitele se pot diferenţia după afinitatea pentru diferiţi coloranţi în:
-neutrofile – granulaţii violet cu afinitate pentru coloranţi neutrii;
-bazofile – granulaţii violet-negre, afinitate pentru coloranţi bazici;
-eozinofile – granulaţii roşii, afinitate pentru coloranţi acizi.
După aspectul microscopic al nucleului pot fi cu nucleu unic (reniform-monocit, rotund şi
mare-limfocit) sau nucleu cu mai mulţi lobi (polimorfonucleare eozinofile şi bazofile au nucleu cu
2-3 lobi, iar neutrofilele de la 1 la 5 lobi în funcţie de vârsta neutrofilului).
Monocitele reprezintă un stadiu intermediar al macrofagelor.
Limfocitele se clasifică în două mari tipuri: limfocitele B - răspunzatoare de răspunsul imun
umoral; ele sunt specializate în producerea de anticorpi, pe care îi secretă după ce s-au
transformat în plasmocite- şi limfocite T - celulele sistemului imun a căror maturare se face în
timus (de unde şi denumirea lor) şi sunt responsabile de răspunsul imun de tip celular. Limfocitele
T se diferenţiază în patru populaţii:
- limfocitele T CD4 auxiliare sau T helper - secretă citokine sau interleukine, molecule care
le permit să coopereze cu alte celule;
- limfocitele T CD8 care pot fi limfocitele citotoxice, capabile să distrugă celulele infectate
de un virus sau limfocitele T supresoare, al caror rol este acela de a controla răspunsurile
imunitare.
- celulele NK (din engleză, natural killer, „ucigaş natural”) sunt celulele înrudite cu
limfocitele T, cu care ele împart anumiti markeri membranari. Celulele NK sunt dotate cu o
activitate citotoxica naturală, pe care ele o exercită în mod spontan pentru a distruge celulele
infectate de virusuri sau celule neoplazice.
Leucocitele sunt componente mobile ale sistemului imun. Unele îndeplinesc rol de celule
prezentatoare de antigen (limfocitul B), şi sunt profund implicate în diverse etape ale răspunsului
imun, iar altele au rol auxiliar în acest proces, fiind implicate însă în tipuri particulare de răspuns
imun, cum este apărarea antiparazitară în cazul eozinofilelor sau reacţiile de tip alergic în cazul
bazofilelor şi mastocitelor.

Tehnica de lucru – numărarea manuală a leucocitelor

Principiul este acelaşi ca la numărarea manuală a eritrocitelor, se numără leucocitele după
prealabila lor diluare cu o soluţie care distruge hematiile, folosind acelasi tip de camera de
numărat prezentată mai sus.
Recoltarea sângelui:
Se poate folosi sânge venos recoltat pe anticoagulant sau sânge capilar din pulpa
degetului. La nou-născuţi se recoltează prin înţeparea călcâiului.
Ca şi la numărătoarea hematiilor, se folosesc pipete Potain care au o capacitate de 11
volume. Au acelaşi aspect cu pipeta Potain pentru hematii cu menţiunea că reperul în amonte de
porţiunea dilatată a pipetei este 11.
 Diluarea hematiilor:
După ce s-a aspirat sângele, ţinând în continuare pipeta orizontală, se aspiră până la
reperul 11 soluţie Turk (lizează hematiile, iar conţinutul în albastru de metilen colorează nucleii
leucocitelor). Sângele va fi împins în zona dilatată a pipetei şi diluat 1/20 dacă sângele a fost
aspirat până la diviziunea 0,5, respectiv de 1/10 pentru sângele aspirat până la diviziunea 1.
Pentru omogenizarea diluţiei se agită pipeta aproximativ 3 minute.
Umplerea camerei de numărat:
Se lasă să picure o cantitate mică de sânge diluat la interfaţa lamela/hemocitometru, care
va difuza prin capilaritate în reţeaua suprafeţei de numărat.
Numărarea leucocitelor:
Camera de numărat se aşează la microscop. Examinând reţeaua cu obiectivul 10x se
numără nucleii leucocitelor care se află în interiorul a 50 de pătrate mari plus cele suprapuse
peste două laturi alăturate fiecărui pătrat mare (latura dreapta şi cea de jos).
Calculul numărului de leucocite/mm3 de sânge:
Se face media numărului de leucocite/pătrat, iar rezultatul se corectează pentru volum şi
diluţie. Astfel numărul obţinut se înmulţeşte cu 250 (volumul unui pătrat este 1/250mm2) şi cu
10 pentru diluţia 1/10, respectiv 20 la diluţia 1/20.
Valori normale:
La naştere, numărul de leucocite este cuprins între 15.000-25.000/mm3, pentru ca
ulterior să scadă, la vârsta de 12 ani valorile fiind similare cu cele ale adultului, 5.000-9.000/mm3
sânge.
Variaţii:
Creşterea numărului de leucocite poartă numele de leucocitoză. Poate fi atât fiziologică,
cât şi patologică şi apare:
-după efort fizic;
-postprandial;
-în sarcină (creşte numărul de neutrofile);
-la marii fumători (creşte numarul de neutrofile);
-in perioada de menstruatie creşte numărul de neutrofile;
-majoritatea infecţiilor bacteriene;
-leucemii.
Scăderea numărului de leucocite se numeşte leucopenie şi se intâlneşte la vârstnici, unele
infecţii virale, postchimioterapie sau radioterapie, în contextul unor situaţii care generează
pancitopenie.
Numărătoarea de leucocite este de obicei completată cu informaţiile oferite de frotiul de
sânge periferic pe care se poate număra fiecare tip de leucocit şi se pot face aprecieri asupra
morfologiei acestuia. Formula leucocitara reprezintă raportul procentual al diferitelor tipuri de
leucocite.

Tehnica de lucru pentru determinarea formulei leucocitare

Principiul constă în numărarea la microscopul optic folosind obiectivul cu imersie, 100 de
leucocite de pe un frotiu de sânge periferic colorat May-Grumwald-Giemsa, notând şi numărul
din fiecare tip de leucocit.
Efectuarea frotiului:
 O picătură de sânge proaspăt, recoltat din pulpa degetului, se pune pe o lama curăţată şi
degresată, apoi se întinde în strat foarte subţire folosind o altă lamă înclinată la 45º.
Se usucă prin agitare, la temperatura camerei, şi se colorează rapid folosind soluţie May-
Grumwald-Giemsa. Apoi se spală la robinet şi se usucă la temperatura camerei.
Citirea formulei leucocitare:
Folosind obiectivul cu imersie (90x), se porneşte de la marginea frotiului şi se numără, în
zig-zag spre celalalt capat, 100 de leucocite notând separat fiecare tip de leucocit.

Valori normale:
La adult: La copil:
neutrofile 60-70%; neutrofile 30-60%;
eozinofile 1-4%; eozinofile 4%;
bazofile 0,5-1%; bazofile 1%;
monocite 6-10%; monocite 4-8%;
limfocite 25-32%. limfocite 30-60%.

Variaţii:
Neutrofilele au diametrul de aproximativ 15μ, numeroase enzime în granulaţiile
citoplasmatice cu rol important în apărarea antibacteriană şi nucleu polilobat. Formula Arneth se
referă la procentul de neutrofile cu 1, 2, 3, 4 sau 5 lobi nucleari (normal 1 lob=5%, 2 lobi=35%, 3
lobi=40%, 4 lobi=18% si 5 lobi=2%). Cu cât neutrofilul este mai bătrân, cu atât nucleul are mai
mulţi lobi. Formula Arneth poate devia la stânga când sunt multe neutrofile tinere în circulaţie
(în infecţii sau după hemoragii acute) sau la dreapta, când dominante sunt neutrofilele
îmbătrânite (după splenectomie – scade rata de distrugere a leucocitelor; iradiere; invazie
neoplazica medulară).
Creşterea numărului de neutrofile (neutrofilie) se asociază:
-infecţiilor acute cu bacterii, fungi şi unele virusuri,
-debutului infarctului miocardic ca răspuns nespecific inflamator la apariţia ţesutului de
necroză,
-paraneoplazic (cancere pulmonare, gastrice, uterine, cerebrale; limfoame),
-după administrarea de cortizon sau derivaţi ai acestuia,
-intoxicaţia cu plumb, benzen, digitala sau mercur,
-la fumători,
-în sarcină,
-idiopatic.
Scăderea numărului de neutrofile (neutropenie) poate fi determinată de
-reducerea proliferării medulare a liniei granulocitare (iradiere),
-proliferare medulară crescută însă cu generarea de forme imature prin deficit de
vitamina B12 si folaţi, care se distrug în măduvă,
-infecţii/ inflamaţii severe (se consumă/distrug la nivelul focarului inflamator/ infecţios),
-distrugerea masivă a neutrofilelor în hipersplenism, boli autoimune cu formarea de
anticorpi anti-leucocitari,
-malnutriţia,
-alcoolismul,
-administrarea de piramidon, cloramfenicol, fenilbutazona.
 Bazofilele („mastocite circulante”) au dimensiuni similare cu neutrofilele, citoplasma
bazofilă, nucleu in forma de „S” si granulaţii citoplasmatice specifice care conţin histamină,
heparină, serotonină, bradikinin si SRSA (slow reacting substance of anaphylaxis). Datorită
conţinutului de substanţe vasoactive din granulaţiile citoplasmatice, bazofilul este implicat în
reacţiile de tip alergic. Numărul lor scade după administrarea de preparate cortizonice şi poate fi
crescut în leucemia granulocitară cronică.

Eozinofilele au diametrul tot de 15μ şi conţin în citoplasma granulaţii cu fosfatază alcalină

şi alte hidrolaze. Eozinofilia (creşterea numărului de eozinofile) apare în:
-infecţii parazitare (trichineloza, echinococoza, teniaza, ascaridioza) sau cu protozoare
(Plasmodium, Pneumocystis),
-reacţii alergice (anafilaxie, urticarie, febra fânului, astm),
-boli dermatologice precum eczemele, psoriazisul, prurigo,
-leucemia cu eozinofile,
-ereditar.
Numărul de eozinofile se reduce după administrarea de preparate cortizonice.

Monocitele, cele mai mari celule sanguine (diametrul de 20-40μ), sunt celule de tranzit
între măduvă şi sistemul reticulo-histiocitar. Au nucleu reniform şi cromatină „în tablă de şah”,
iar citoplasma este albastru-cenuşiu, „ca cerul după furtună”. Creşterea numărului de monocite
(monocitoza) se asociază:
-mononucleozei infecţioase (boala sărutului), infecţie cu virusul Epstein-Baar,
-leucemia monocitară,
-tuberculoza (limfo-monocitoză).

Limfocitele, cele mai mici celule sanguine (diametrul de 6-10μ), prezintă nucleu rotund-
ovalar, „în pată de cerneala”, care ocupă aproape toată celula şi citoplasma uşor bazofilă, „ca
cerul senin”. Pe frotiul de sânge periferic nu se pot deosebi limfocitele T şi B.
Limfocitoza este fiziologic întâlnită la copii. Patologic se întâlneşte în:
-leucemia limfatica cronică,
-majoritatea infecţiilor virale,
-unele infecţii bacteriene (sifilis, tuberculoză).
Limfopenia poate fi dată de distrugerea măduvei hematogene secundar iradierii/
chimioterapiei, tratamentului cortizonic, boala Cushing (hipersecreţie de hormoni
glucocorticoizi) şi stresul acut.