PROBLEME DE DIAGNOSTIC

PARTICULARITILE DIAGNOSTICULUI DE
LABORATOR N HAIRY CELL LEUKEMIA
Particularities of laboratory diagnosis in Hairy Cell Leukemia
Cercettor tiinific, medic primar medicin de laborator Violeta Carmen Moraru
Centrul de Hematologie i Transplant Medular, Institutul Clinic Fundeni, Bucureti

REZUMAT
Leucemia cu celule proase Hairy Cell Leukemia (HCL) este o form rar delimfoproliferare cronic a
adultului, caracterizat prin splenomegalie, pancitopenie frecvent i prezena de celule mononucleare
anormale n snge, mduva osoas i splin.
Termenul de Hairy Cell Leukemia a fost adoptat pentru a scoate n eviden prelungirile fine ale celulelor
mononucleare anormale.
Celule Hairy exprim o mare varietate de molecule de adeziune i receptori de ghidare n traficul lor regulat
n interiorul sistemului reticuloendotelial. Studii imunologice complexe arat c celulele Hairy au un fenotip
complex, exprimnd simultan, dar n proporii diferite, markeri specifici mai multor linii celulare.
Cuvinte cheie: celule Hairy, examen citomorfologic, imunohistochimie, imunofenotipare

ABSTRACT
Hairy Cell Leukemia is a rare form chronic lymphoproliferative of the adult, characterized by splenomegaly,
frequent pancytopenia and presence of abnormal mononuclear cells in blood, marrow and spleen.
The term was adopted to point out fine cytoplasmic projections of mononuclear cells, Hairy Cells show a great
variety of adhesion molecules and receivers conduct in theyr regular traffic inside reticuloendothelial system.
Immunological complex studies show that Hairy Cells have a complex fenotype, they are expressing simultaneous,
but in different proportions, specific markers for more cellular lines.
Key words: Hairy cells, cytomorphological exam, immunohistochemistry, immunphenotyping

Hairy Cell Leukemia (leucemia cu celule proase) este o form rar de limfoproliferare cronic
a adultului, caracterizat prin splenomegalie, pancitopenie frecvent i prezena de celule mononucleare anormale n snge, maduv osoas i splin.
(1)
Ea reprezint 2% din totalul leucemiilor i 1%
din totalul limfoamelor maligne. Boala survine la
grupuri etnice diferite, are o distribuie geografic
extins, fiind semnalat pe toate continentele, dar
inegal; HCL este foarte rar n Japonia.
Predomina net la sexul masculin, raportul brbai/femei = 3-5/1. Vrsta medie general n momentul diagnosticului este de 52 de ani, aproximativ
jumtate dintre cazuri apar ntre 40 i 60 de ani, nu
au fost semnalate cazuri de HCL la copii i
adoleseceni.

Celula de origine: n prezent este unanim

acceptat c celulele Hairy sunt limfocite B neoplazice, care au rearanjri clonale ale genelor pentru
imunoglobuline i exprim pe suprafa antigene
de difereniere pan B: CD19, CD 20, CD 22,
imunoglobuline de suprafa adesea cu multiple
izotipuri ale lanurilor grele, predominnd izotipurile . (3)
Totdeauna lipsesc: determinantul Ki 67 nuclear
i determinanii membranari: CD5, CD2, CD23.
Celulele imunoglobuline G pozitive exprim
preferenial IG3. Exprimarea frecvent a Ig3 i IgA,
a determinanilor HLA-DR i FMC7, absena Ag.
CD21 i exprimarea markerului plasmocitar precoce: PCA 1 demonstreaz c celula Hairy este o
celul aflat ntr-un stadiu tardiv n diferenierea

Adresa de coresponden:
Dr. Violeta Carmen Moraru, Centrul de Hematologie i Transplant Medular, Institutul Clinic Fundeni, Bucureti
e-mail: violeta.moraru@gmail.com

44

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 1, An 2012

45

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 1, An 2012

celulelor B, un stadiu de preplasmocit. Mutaia somatic a genelor pentru regiunea variabil a imunoglobulinelor n Hairy Cell Leukemia sugereaz c
celulele neoplazice se gsesc ntr-un stadiu postfolicular al diferenierii, posibil la nivelul unei celule B cu memorie. Celulele Hairy exprim i alte
antigene de suprafa, care nu se gsesc de obicei
pe limfocitele B, acestea fiind:
1. CD11c care este exprimat de obicei pe monocite i neutrofile, el fiind de obicei prezent pe
celulele leucemice ale tuturor pacienilor cu HCL i
rareori pe celulele leucemice din alte boli
limfoproliferative.
2. CD25: cu mare afinitate pt. IL 2, exprimat
de altfel de celulele T activate.
3. CD103: cunoscut ca antigen limfocitar mucos
uman, deoarece este exprimat n primul rnd de
limfocitele T intraepiteliade.
De obicei, fiecare din aceste antigene este exprimat de mai puin de 3% din limfocitele B sanguine normale. Limfocitul B CD103 pozitiv poate
fi echivalentul normal al celulelor Hairy leucemice.(3)
Studii imunologice arat c celulele Hairy au un
fenotip complex, exprimnd simultan, dar n proporii diferite, markerii specifici mai multor linii
celulare.
Labilitatea fenotipic, particularitatea imunologic de baz a celulelor Hairy, poate fi legat de o
mobilitate extrem a structurii de membran,
printr-un fenomen de capping (rearanjarea antigenelor pe suprafaa celulei) foarte rapid, care se
petrece spontan sau provocat n cursul evoluiei.
O alt explicaie a diversitii fenotipice ar fi
aceea c procesul de malignizare se petrece n compartimentul celulelor stem ntr-un stadiu precoce al
diferenierii celulelor limfoide pluripotente, inducnd emergena unei linii neoplazice hibride, cu
punct de plecare splenic. (2)

ROLUL CITOKINELOR N PATOGENEZA HCL

A fost de mare interes rolul citokinelor n patogeneza HCL. (7)
IL-2 (Interleukina 2): o trstur a HCL subtipul
clasic este reactivitatea CH (celule Hairy) cu
antiTAC (CD25), care detecteaz lanurile ale
receptorului IL2. Prin imunofluorescen, aceste
celule pot s exprime i lanurile ale receptorului
IL2, dei acestea nu au fost confirmate utiliznd
alte tehnici.
n contrast, celulele Hairy din HCL subtipul
Variant exprim lanurile (dar nu exprim
lanurile ).

Creterea nivelului seric de receptori IL2 a fost

gsit la pacienii de HCL netratai (fiind evident c
celulele leucemice elibereaz receptorul IL-2).
Nivelul seric de receptori IL2 este corelat cu
extensia bolii cnd se constat creterea acestuia.
Dup terapia efectiv cu IFN se constat descreterea nivelului seric de receptori IL-2.
TNF (Factorul de Necroz Tumoral ): (4)
s-a demonstrat c stimuleaz creterea celulelor
Hairy; CH pot, de asemenea, produce TFN i
nivelul seric al acestuia este n cretere n leucemia
cu celule Hairy, nivel corelat cu masa celulelor tumorale.
Receptorul TFN poate fi detectat n serul
acestor pacieni, iar nivelul acestuia descrete dup
tratamentul cu IFN (Interferon ).
Aceste date sugereaz c producia de TFN de
ctre CH poate juca un rol important n patogeneza
acestei boli: stimuleaz creterea CH i produce pancitopenia prin inhibiia funciei normale a mduvei.
IL6 (Interleukina 6): nivelul seric al acestor
citokine este n cretere n HCL. Secreia de IL6
este marcat crescut de celulele Hairy incubate cu
TNF. (8)

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR N HCL

Snge periferic: peste dou treimi dintre pacieni
prezint pancitopenie moderat sau sever.
Anemia se gsete la 70-80% dintre cazuri, cel
mai frecvent fiind moderat, normocitar i normocrom. Foarte rar poate avea caracter hemolitic.
Trombocitopenia uoar sau moderat (mai
mic de 100.000/l) apare la 70-80% dintre pacieni.
Pot exista i alterri funcionale plachetare, constnd
n deficit de agregare sau eliberare redus de factor
3 trombocitar.
Majoritatea cazurilor de HCL au la debut
leucopenie, puine cazuri au un numr normal sau
uor crecut de leucocite, numai 10-15% dintre pacieni avnd mai mult de 100.000/l. Excepional,
s-au raportat cazuri cu leucocitoz marcat, de
peste 200.000/ l, dei astfel de cifre se ntlnesc de
obicei la aa numita HCL Varianta.
*HCL Varianta: Este n prezent o entitate
distinct de boal intermediar, ntre HCL i
leucemia prolimfocitar B. (5)
Particulariti:
1. Morfologic: este diferit de HCL tipic, celulele au cromatina diferit, cu aspect de
reea/ plas; nucleoli vizibili;
2. Leucocitoza: > 40.000/l;
3. Imunofenotiparea (vezi diagnosticul diferenial prin imunofenotipare).

46

Neutropenia este trstura hematologic major

prin frecvena i intensitatea sa, fiind sever (sub
1000/l) la 60% dintre cazuri i foarte sever (sub
500/l) la 25% dintre cazuri.
Monocitopenia este prezent att n sngele
periferic, ct i n mduva osoas. Frecvent apare o
limfocitoz relativ i anomalii ale subpopulaiilor
de limfocite B i T.
Examenul citomorfologic al frotiului de snge
periferic evideniaz celulele Hairy (acestea variind
ntre 3 i 90%). La coloraia panoptic apar ca
celule mononucleare: cu form: rotund, ovalar,
poligonal, cu diametrul de 10-20 m, mai mari
dect limfocitele, cu margini dantelate sau estompate. Nucleul este mare: rotund/indentat/ovoid.
Rareori poate aprea polilobat (putnd fi confundat
cu celulele din cursul unor limfoame T sau leucemii).
Cromatina nuclear este fin, cu aspect spongios,
uniform dispersat, ca o sticl mat; nucleolii sunt
abseni sau slab evideniai pe frotiurile obinuite.
Postsplenectomie, apar celule Hairy (CH), cu
nucleu ondulat, biconcav sau cu aspect de halter.
Celulele Hairy (CH) sunt mai uor de pus n
eviden pe frotiurile efectuate din concentrat leucocitar. Cnd numrul i morfologia CH sunt
necaracteristice pe frotiul de snge, este absolut necesar examenul n contrast de faz pe preparate
proaspete, efectuate din concentrat leucocitar.
La examenul n contrast de faz CH apar cu
numeroase prelungiri citoplasmatice fine, asemntoare firelor de pr, care au sugerat, de fapt, denumirea dat celulelor.
Examenul citomorfologic al mduvei osoase,
puncia aspiratorie: la 50% dintre pacieni mduva
osoas este inaspirabil sau prezint material hipocelular nesatisfctor pentru diagnostic.
Cnd se extrage suc medular, celularitatea este
frecvent redus i rareori normal. Procentul de CH
variaz pe frotiuri ntre 5-90%. Cel mai bine pstrate sunt megakariocitele i eritroblastii, n schimb
granulocitele sunt de obicei rare sau chiar absente.
Deseori apar frecvente limfocite, plasmocite i mai
rar, mastocite.
Izoenzima 5 a Fosfatazei Acide: caracteristica
specific citochimic a CH este reacia pozitiv
pentru izoenzima 5 a Fosfatazei Acide rezistent la
denaturarea cu acid tartric (TRAP). Enzima lizozomal i ribozomal dei nu este absolut patognomonic pentru CH, n 5% dintre cazuri fiind
negativ, totui TRAP are specificitate mare i este
valoroas pentru diagnosticul de HCL.
Dup terapia cu Interferon, pozitivitatea reaciei
pentru TRAP scade sau chiar se negativeaz.

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 1, An 2012

Aceast reacie este indicat pentru confirmarea

diagnosticului de HCL i diferenierea CH fa de
celulele din alte leucemii sau limfoame prin evidenierea unei activiti puternice, difuze, rezistente
la inhibiia cu TARTRAT. (7)
Fosfataza Alcalin Leucocitar (FAL): este o
enzim lizozomal prezent exclusiv n neutrofilele
mature. Este utilizat n identificarea formelor
stabile de HCL unde activitatea FAL este normal,
fa de formele active de boal cu neutropenie
sever, n care activitatea FAL este foarte crescut
(valori normale ntre 10 i 100 uniti Kaplow).
Examenul Histopatologic al mduvei osoase:
biopsia de os este obligatorie pentru diagnosticul
de HCL, deseori aspectul histopatologic al mduvei
osoase, fiind primul sau singurul examen care permite stabilirea diagnosticului. Aspectul histopatologic al mduvei osoase reprezint diagnosticul de
certitudine. (8)
Leziunile medulare din HCL prezint dou
caracteristici:
a) Infiltraie medular cu celule Hairy;
b) Mielofibroz;
a) Infiltraia medular: se datoreaz proliferrii
CH, dar natura hairy (prelungirile citoplasmatice)
nu apare pe seciunile histologice.
Aceast infiltraie este recunoscut dup aspectul
rarefiat, monoton, de fagure de miere, constituit
din celule de talie medie, uniforme, cu nuclei
ovalari, bine conturai, distanai unii de alii, nconjurai de un halou clar, perinuclear, la examenul
cu obiectiv mic.
Mai rar, nucleii pot fi rotunzi sau uor incizai,
neregulai ori cu aspect fuziform.
La data diagnosticului, mduva este cel mai
frecvent hipercelular, cu infiltraie complet, cu
aspect monomorf, cu vacuole de grsime reduse
sau absente. La o treime dintre cazuri, infiltraia cu
CH e mai redus, parial pstrndu-se zone cu hematopoiez normal, constituit predominant din
insule eritroide (ce conin precursori imaturi) i
megakariocite. Granulocitele sunt reduse sau absente.
Extrem de puini pacieni au mduv osoas hipocelular, foarte gras, cu CH izolate dispuse
printre celulele adipoase, sau o mduv care mimeaz aspectul de anemie aplastic, cu care se
poate confunda.
b) Mielofibroza, al doilea caracter lezional medular, este constant i apare evident n zonele de
proliferare a CH. Mielofibroza const n densificarea marcat a fibrelor de reticulin stromale,
fibroza colagen clar fiind de obicei absent.

47

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 1, An 2012

Examenul imunohistochimic: coloraiile imunohistochimice ale seciunilor de mduv osoas sunt

utile att pentru diagnostic, ct i pentru urmrirea
postterapeutic. Majoritatea anticorpilor folosii
pentru detectarea markerilor asociai HCL (de
exemplu: anticorpii anti CD103 ca i B-ly) necesit
prelucrarea mduvei prin congelare, deoarece antigenele, pe care ei le recunosc, sunt distruse prin
fixarea i prelucrarea standard. n schimb, anticorpul
anti CD20 poate fi folosit pe seciunile prelucrate
obinuit (prin includere n parafin) pentru evidenierea celulelor B, care apoi pot fi evaluate pentru
morfologia caracteristic CH. (6)
De asemenea, anticorpul monoclonal numit
DBA.44 poate fi folosit pe preparate de mduv
obinuite, pentru CH reziduale. De aceea, imunohistochimia este mult mai sensibil comparativ cu morfologia convenional n depistarea celulelor neoplazice reziduale din mduv, dup tratament. (5,6)
Imunofenotiparea: utilizarea anticorpilor monoclonali a adus progrese remarcabile n definirea
originii i naturii CH. Nu exist un singur anticorp
care s poat identifica un antigen unic pentru CH.
Exist ns modele cu o anumit expresie a markerilor de suprafa, care pot fi utilizate pentru a
deosebi CH leucemice de cele ale altor boli limfoproliferative de tip B. (9)
Configuraia antigenic cea mai caracteristic a
CH cuprinde antigene de suprafa: CD11c, CD22,
CD25, CD103, HLA-DR, care au fost gsite pe
celule leucemice B ale tuturor pacienilor cu HCL.
TABELUL 1. Diagnosticul diferenial fenotipic n HCL
SIg
Ag. celule - B
CD19
CD20
CD22
CD79a
CD79b
CD5
CD10
CD23
CD11c
CD25
CD103
FMC7
HC2
TRAP

HCL
+++

HCL - V
++

B - PLL
+++

++
++
++
++
-/ +
+++
+++
+++
++
+++
++

++
++
++
?
-/ +
++
-/ +
++
-/ +
-/ +

++
++
++
++
++
+/ ?
+/ ++
-

SLVL LLC TIPIC

+++
+

++
++
++
++
-/ +
++
+/ ++
+/ +/ -

+
+
+
++
++
++
+
-/ +
-

Legenda:
HCL: Hairy Cell Leukemia
HCL-V: Hairy Cell Leukemia - Varianta
B-PLL: Leucemia Prolimfocitar - B
SLVL: Limfomul Splenic cu Limfocite viloase
LLC: Leucemia Limfatic Cronic
TRAP: Fosfataza Acid Rezistent la Denaturarea cu Acid Tartric

Dac i alte leucemii i limfoame B pot exprima

CD11c i CD25, totui, CH se caracterizeaz prin
intensitatea i uniformitatea absolut, cu care ele i
exprim aceste antigene.
Expresia antigenului CD103 este foarte rar ntlnit i n alte boli limfoproliferative B. Citometria
n flux multiparametric este capabil s detecteze
CH cnd acestea reprezint sub 1% dintre limfocitele prezente n snge sau mduva osoas.
Diagnosticul molecular: utilizat n monitorizarea tratamentului i diagnosticul bolii minime reziduale. (10,11)
Boala minim rezidual pote fi cuantificat n
prezent prin tehnica RQ-PCR (Reacia n Lan cu
Polimeraza Relativ cantitativ), aceasta fiind mult
mai sensibil comparativ cu flow-citometria i
imunohistichimia, n detectarea bolii minime reziduale.
PCR reprezint o tehnologie de mare putere
pentru amplificarea selectiv a unor secvene specifice ARN sau ADN. Tehnica este ingenioas i
simpl conceptual.
Analiza molecular a confirmat originea celulelor leucemice, stabilit anterior prin studiile
imunofenotipice. Ambele gene Ig. (H i L) sunt
rearanjate practic n toate cazurile de HCL.

MUTAIA BRAF V600E

BRAF este cea mai frecvent gen mutant ce
codific o proteinkinaz n cancerul uman, aceasta
fiind o component a familiei de serin threonin
kinase RAF.
n structura proteinei BRAF n poziia 600 a fost
identificat substituia aminoacidului acid glutamic
cu valina. Frecvena acestei mutaii BRAF-V600E
la pacienii cu HCL este de 100% fiind mult mai
nalt comparativ cu alte neoplasme: cancerul tiroidian 40%, histiocitoza cu celule Langerhans 55%.
Analiza mutaiei BRAF ca un nou instrument de
diagnostic are potenialul s disting HCL de alte
limfoproliferri cronice sau limfoame cu celule B,
cu trsturi clinice asemntoare, ca de exemplu:
HCL-Varianta, Limfomul de zona marginal splenic.
Detectarea mutaiei BRAF-V600E n probele
coninnd proporii sczute de celule Hairy necesit
tehnici moleculare cu sensibilitate nalt i reproductibilitate.

48

REVISTA MEDICAL ROMN VOLUMUL LIX, NR. 1, An 2012

BIBLIOGRAFIE
1. Bouroncle B.A. Hairy cell leukemia, Lymphoma (Switerland), 1994, 14,
supl.1,1
2. Cannon T., Mobarek D., Wegge J., Tabbara I.A. Hairy cell leukemia,
current concepts, Cancer Invest. 2008; 26:860-865
3. Venkataraman G., Aguhar C., Kreitman R.J., Yuan C.M., StetlerStevenson M. Characteristic CD103 and CD123 expression pattern
defines hairy cell leukemia: usefulness of CD123 and CD103 in the
diagnosis of mature B-cell lymphoproliferative disorders. Am J Clin
Pathol. Oct 2011; 136(4):625-30
4. Tretin l., Pizzolo G., Zambello R., et al. Leukemic cells in hairy cell
leukemia and B cell chronic lymphocytic leukemia release soluble TNF
receptors.Leukemia 1995, 9:1051-1055
5. Matutes E., Woherspoon A., Brito-Papule V., Cathovsky D. The
natural history and clinicopathological features of the variant form of
Hairy cell leukaemia, Leukemia, 2001, 15:184-186
6. Sherman M.J., Hanson C.A., Hoyer J.D. An assessment of the
usefulness of immunohistochemical stains in the diagnosis of hairy cell
leukemia. Am J Clin Pathol. Sep 2011; 136(3):390-9

7. Poliak A. Hary cell leukemia, biology, clinical diagnosis, unusual

manifestations and associated disorders, Rev. Clin. Hemathol., 2002
June; 6:366-88
8. Bethel K.J., Sharpe R.W. Pathology of hairy cell leukemia. Best Pract
Res. Clin Haematol 2003; 16:15-31
9. Maryalice Stetler-Stevenson, Prashant R. Tembhare Diagnosis of
HCL by Flow Cytometriy, NIH, NCI, 9000 Rockville, June 2011, vol. 52,
no. 82, pages 11-13
10. Michael Grewer How I treat Hairy cell leukemia, Blood, January 2010,
Vol. 115, No.1
11. Enrico Tiacci M.D., Vladimir Trifonov Ph.D, Gianluca, Schavoni,
Ph.D, et al. Molecular diagnosis, The NEW England Journal of
Medicine, 2011 June, 16, 364:2305-2315