FROTIUL DE SNGE

Executarea unui frotiu de snge constituie o tehnic de baz a microscopiei clinice. Un

preparat hematologic este inutilizabil dac este realizat cu o tehnic necorespunztoare, care
distruge morfologia elementelor celulare. Numai un frotiu corect executat permite o
interpretare microscopic de calitate, util diagnosticului.
Lamele pe care se execut frotiul trebuie s fie perfect curate i degresate, altfel nu
se obin preparate bune.
Tehnica executrii frotiului: Se pune o pictur de snge (capilar sau venos pe
anticoagulant) pe captul din dreapta al unei lame care st pe masa de lucru. Lama de ntins (o
lam lefuit la un capt) se aplic mai la stnga, ntr-un unghi de 45. Se aduce lama de ntins
spre dreapta, pn ce atinge pictura de snge. Aceasta, datorit fenomenului de tensiune
superficial, umple rapid unghiul format de lama ntins cu lama suport. Cu un gest uniform
se mpinge acum lama de ntins de la dreapta spre stnga.






Frotiul este bine executat dac:
- Nu acoper toat lama fiind mai n gust dect aceasta;
- Are margini drepte i franjuri la extremitatea terminal;
- Are grosimea potrivit elementele fiind distribuite uniform, fr a fi deformate sau
distruse.
Imediat dup ntindere, lama se agit puternic, pentru a obine o uscare rapid. Uscarea
lent duce la ratatinarea celulelor.
Se noteaz cu creionul pe frotiu identitatea preparatului.
Coloraia cea mai frecvent utilizat este coloraia panoptic de tip May Grnwald-Giemsa
(MGG) sau Wright, care permit o bun analiz cromatic i evidenierea tuturor detaliilor
morfologice ale componentelor celulare, necesare identificrii lor.
Coloraia May-Grnwald Giemsa. Este o coloraie panoptic care d numeroase detalii
morfologice i de aceea este mult folosit n hematologia curent.
Colorarea unui frotiu poate fi executat imediat dup ntinderea lui sau n primele 24
de ore de la preparare.
Pentru a realiza o colraie cu cele mai frumoase nuane, trebuie folosit ap distilat
neutr.
- lamele cu frotiurile se aeaz pe baia de colorare:
- se acoper cu soluie May-Grnwald i se las 3 minute, pentru fixare.
- se adaug o cantitate egal de apdistilat neutr i se las 1 minut i
jumtate (diluat cu ap soluia May-Grnwald devine colorant)
- se scurge colorantul
- se acoper lamele cu soluie Giemsa diluat, preparat extemporaneu (1
pictur colorant la 1 ml de ap, dup calitatea colorantului, proporia poate
varia de la 1 la 4 picturi la 1 ml de ap). Se las 15-20 de minute, timp
care poate crete la 30-35 de minute n cazul unor preparate foarte bogate
n elemente nucleate.
- splare sub jet de ap
- uscare la aer.
Examinarea frotiului este macroscopic urmrind aspectul frotiului (subire i omogen, cu
margini drepte , paralele i termonat cu franjuri) i culoarea (roz-violacee i omogen) i
microscopic, cu obiectiv uscat i cu obiectivul cu imersie.
Examinarea cu obiectiv uscat se realizeaz pentru orientare urmrind:
- coloraia corect (eritrocite roz-portocalii, nucleii leucocitelor albatrii-
purpurii, granulaiile din citoplasma neutrofilelor roz-cafeniu, granulaiile
eozinofilelor roii portocalii strlucitoare);
- dispoziia eritrocitelor normal, n rulouri sau agglutinate;
- densitatea celulelor nucleate i compararea cu cifra numrtotii directe;
- distribuia celulelor pe frotiu (dac pe marginea frotiului sunt de 3 ori mai
multe celule dect n centrul acestuia, frotiul este inadecvat interpretrii);
- prezena de celule anormale sau imature, mai ales pe marginile i n
franjurile frotiului;
- prezena de artefacte de uscare sau colorare;
- alegerea zonei adecvate pentru examinarea cu imersia, aproximativ ntre
1/3 medie i 1/3 terminal, aproximativ 25% din lungimea frotiului.
Un frotiu impropriu pentru examinare prezint eritrocite suprapuse sau deformate, eritrocite
cu contur dublu (lam nedegresat), zone ntinse cu eritrocitele mari, prea etalate, poligonale
sau sferoidale, cu pierderea palorii centrale leucocite dstruse, zone rotunde necolorate etc.
Examinarea cu obiectivul cu imersie permite cercetarea n amnunt a detaliilor morfologice
ale celulelor sanguine, eritrocite, leucocite i trombocite.
Studiul eritrocitelor urmrete:
- talia,
- concentraia i distribuia hemoglobinei,
- proprietile tinctoriale,
- forma,
- prezena de incluzii,
- distribuia pe frotiu.
Talia: eritrocitele normale au dimensiuni aproape uniforme corespunznd unui diametru ntre
7,2-7,9 m (normocite), aproximativ aceeai mrime cu nucleul unui limfocit mic, normal..
Existena pe acelai frotiu a unor eritrocite cu dimemsiuni diferite se exprim ca anizocitoz
care poate fi ca form uoar (+), moderat (++) sau marcat (+++). Un diametru mai mare de
9 m caracterizeaz macrocitele. Eritrocitele cu diametrul mai mic de 6 m se numesc
microcite.
Concentraia i distribuia hemoglobinei alturi de forma de disc biconcav determin culoarea
caracteristic, roz-portocaliu, cu o arie central mai clar care nu trebuie sa reprezinte mai
mult de 1/3 din suprafat celulei. O paloare central crescut sugereaz scderea concentraiei
de hemoglobin (hipocromie), indicnd reducerea sintezei hemoglobinei. Creterea extrem a
zonei palide poate determina aspectul de anulocit, eritrocitul rmnnd numai cu o ram
subire de hemoglobin. Hematiile care apar intens colorate pierzndu-si aria central palid
au grosime crescut prin modificarea formei sau mrimii lor (sferocite, megalocite). Unele
eritrocite pot prezenta o distribuie anormal a hemoglobinei cu un disc central nconurat de
dou cercuri concentrice, unul clar intermediar i altul marginal format din hemoglobin dnd
acestora aspectul de semn de tras la int (acestea se ntlnesc mai frecvent n talasemie,
postsplenectomie, hemoglobinopatia C).
Proprietile tinctoriale determin n cazul eritrocitelor normale culoarea specific crmizie.
Eritrocitele care prezint o tent violet se numesc policromatofile i dac au dimensiuni puin
mai mari dec eritrocitele obinuite sunt reticulocite. Tot reticulocite dar foarte tinere au
culoarea gri-albastr.
Forma eritrocitelor normale este de disc biconcav. Modificrile de form sunt foarte variate i
numeroase. Prezena acestora este indicat prin termenul general de poichilocitoz fiind
neces precizarea tipului de modificare.


Tabelul nr. Modificrile de form ale eitrocitelor i strile de boal n care apar

Terminologie Aspect Stri i boli asociate
Eliptocit (ovalocit) Celul elipsoidal sau ovalar Eliptocitoz ereditar
Talasemie
Anemie megaloblastic
Anemie mieloftizic
Megalocit (macrocit
ovalar)
Eritrocit mare cu form de ou,
fr paloare central
Anemii megaloblastice
Diseritropoez
Sferocit (microsferocit) Eritrocit rotund cu paloare
central absent sau mic
Sferocitoza ereditar
AHAI
Posttransfuzional
AH cu corpi Heinz
Hemoliza cu fragmentare cu
form de sfer
Stomatocit (celul cu
gur, disc uniconcav,
Eritrocit cu form sferic cu o
singur concavitate, cu o gropi
Sferocitoz ereitar
Stomatocitoza ereditar
celul ciuperc) mic, cu zona paloare central, ca
o fisur.
Alcoolism, ciroz
Boli obstructive hepatice
Defecte ale pompei de
sodiu.
Codocit (clopot) Eritrocit cu aspect de semn de
tras la int
HemoglobinozaC, S
Talasemie
Boli hepatice obstructive
Anemie feripriv
Postsplenectomie
Acantocit (spur cell) Eritrocit cu spini neregulai Alcoolism
Boli hepatice
Postsplenectomie
Malabsorbie
Abetalipoproteinemie
Echinocit (burr cell
celul crenelat)
Eritrocit cu spiculi mici, egali,
distribuii uniform.
Uremie
Deficit de piruvatkinaz
Hipopotasemie
Carcinom gastric i ulcer
gastric sngernd
Posttransfuzie imediat
Schizocit (celul
fragmentat, celul n
coif)
Eritrocit rupt cu form de
jumtate de disc cu 2-3
extremiti ascuite sau un mic
fragment neregulat
AH microangiopatic (PTT,
CID, vasculit,
glomerulonefrit, LED,
rejecie de gref renal)
Hemoliz, valv cardiac
(proteze sau valve
patologice)
Arsuri severe
Hemoglobinurie de mar
Drepanocit (celul n
secer, sickle cell)
Form de semilun cu centru
dens
Drepanocitoz
Hemoglobinoz C-Harlem
Hemoglobinoz Memphis/S
Dacriocit (celul n Celul cu o singur prelungire MMM
lacrim, rachet de
tenis)
sau extremitate ascuit Talasemie
Anemie mieloftizic
Leptocit (celul n
picot, celul subire)
Eritrocit subtire plat cu
hemoglobin la periferie
Talasemie
Boli hepatice obstructive
(+/- deficit de fier)
Keratocit (celul cu
corn)
Spiculi rezultai din vacuol rupt
Celula apare semilunar sau cu
form de fus
CID
Protez valvular

Prezena de incluzii n eritrocite este intotdeauna patologic

Tabelul nr. Incluzii n eritrocite i reticulocite

incluzii Compoziia lor Tipul de
celul
Aspectul n
coloraia
panoptic
Semnificaia Prezente n:
Punctaii
bazofile
Precipitate
patologice de
ribozomi
(ARN
residual)
reticulocit Granule
albastre
dispersate cu
numr i
talie
variabil
Anomalii ale
ribozomilor
Intoxicaii cu Pb
Talasemie
Anemii
megaloblastice
Diseritropoieze
Corpi
Hawell-
Jolly
Resturi
nucleare
Cromozomi
aberani
Reticulocit
i eritrocit
Unice sau
numeroase
granule
mici, sferice,
dense,
violacee
Splin absent
sau ineficient
Hipersplenism
Postsplenectomie
Anemii
hemolitice
Anemii
megaloblastice
Diseritropoeze
Inele
Cabot
Rest din fusul
mitotic
reticulocit Filament
subire
inelar sau ca
numrul 8
Mitoze
anormale
Anemii
hemolitice
Anemii
megaloblastice
Diseritropoeze
Corpi
Heinz
Hemoglobin
denaturat
Eritrocit
rar
reticulocit
Rar vizibili Denaturarea
hemoglobinei
prin substane
oxidantesau
defecte
ereditare
Anemii
hemolitice
Hemoglobine
instebile
Talasemie
Siclemie

Parazitul
malariei
plasmodium eritrocit Inel cu
pecete,
rozet sau
gamei
Malarie Malarie

Distribuia pe frotiu n mod normal este uniform pe toat ntinderea frotiului. Apariia unor
agregate n rulouri, asemntoare fiicurilor din monezi, separate de zone libere, indic o
paraproteinemie, fie din mielom multiplu fie din macroglobulinemia Waldenstrm. Cnd
rulourile sunt reale ele sunt distribuite pe toat suprafaa frotiului. Dac se ntlnesc doarn
partea iniial groas a acestuia ele reprezint un artefact. Formarea de aglutinate pe frotiu
poate semnifica o AHAI cu anticorpi la rece.
Studiul leucocitelor
Leucoccitele sunt reprezentate prin elemente granulocitare nesegmentate i segmentate
(neutrofile, eozinofile i bazofile) i elemente mononucleate (monocite, limfocite i
plasmocite). Exaninarea acestora pe frotiul de snge arat o distribuie neuniform, celulele
mari, monocitele i polinuclearele avnd tendina s se concentreze pe marginea frotiului i n
franjuri. Dup o examinare cu obiectiv uscat, pentru compararea rezultatelor obinute la
numrtorile n hemocitometru sau la analizorul automat cu prezena lor pe frotiu, se trece la
identificarea diverselor tipuri de leucocite innd cont de: mrimea celulei, caracteristici ale
nucleului (poziia, forma, culoarea, structura cromatinian, membrana nuclear, prezena i
aspectul nucleolilor), citoplasma (raportul nucleocitoplasmatic, culoarea, prezena haloului
perinuclear, granulaiile numr, culoare, mrime, distribuie).
Polinuclearul neutrofil:
- diametru 12-15;
- nucleu format din mai multe segmente unite prin puni de cromatin;
structur cromatinian grosolan;
- citoplasma roz-palid cu granulaii numeroase, punctiforme, violacei.
n sngele periferic normal apar i cteva neutrofile nesgmentate, cu nucleu n form de
potcoav.
Polinuclearul eozinofil:
- diametru 12-15 ;
- nucleu de obicei bilobat (n desag);
- citoplasma plin de granulaii mari, egale ntre ele, de culoare portocalie,
refringente.
Polinuclearul bazofil:
- diametrul 10-13;
- nucleu polilobat, cu lobi nucleari incomplet separai, mai palid colorat;
- citoplasma cu granulaii grosolane, inegale ca form i mrime, albstrui-
negre, care acoper n parte i nucleul.
Monocitul:
- cel mai mare dintre leucocite, cu diametrul ntre 15-25;
- nucleu mare central de form variabil- rotund, ovalar, reniform, n
potcoav structur cromatinian fin caracteristic, pieptnat sau n
tabl de ah;
- citoplasm abundent albastr- cenuie, cu granulaii foarte fine azurofile,
ca un praf.
Limfocitul:
- diametrul ntre 10-16 ( cu ct limfocitul este mai tnr diametrul este mai
mare);
- nucleu rotund, de obicei excentric, intens colorat n violet, cu agregate
dense de cromatin;
- citoplasma palid albastr (uneori conine cteva granulaii azurofile.
Plasmocitul:
- celul rotund sau elipsoidal;
- nucleu excentric, rotund, n grmezi dense de cromatin;
- citoplasm intens bazofil, uor grunjoas uneori cu vacuole; halou
perinuclear.

Formula leucocitar sau numrtoarea difereniat a leucocitelor const n
diferenierea i clasificarea procentual a diferitelor tipuri de leucocite prezente pe frotiul de
snge.
Tehnic: se parcurge frotiul cu obiectivul cu imersie, deplasnd preparatul ntr-un singur sens
i n zig-zag, surprinznd att elemente marginale ct i cele din mijlocul lamei. Pe msur ce
se ntlnesc leucocite, ele se noteaz dup diversele tipuri celulare. Se examineaz n total 100
de elemente i se stabilete procentul fiecrui tip de leucocit. Exactitatea rezultatelor crete cu
ct numrul elementelor examinate este mai mare. Dac n marginile frotiului sau n franjuri
exist de 3 ori mai multe celule mari comparativ cu restul frotiului se renun la examinarea
acestui frotiu pentru ca numrtoarea difereniat nu ar fi reprezentativ. Nesegmentatele i
segmentatele pot fi raportate separat sau mpreun. Clasicele formule de clasificare a
neutrofilelor, Arneth (dup numrul de lobi nucleari -1-5) i Schilling (mparte neutrofilele n
nesegmentate -mielocite, metamielocite, nesegmentate- i segmentate)prezint mai mult
interes istoric dect valoare practic n prezent utilizndu-se numai expresia de deviere la
stnga pentru a exprima modificarea raportului ntre neutrofilele n favoarea elementelor
tinere. Este valoroas separarea limfocitelor mici de limfocitele reactive sau atipice fr s
fie necesar mprirea lor n limfocite mari, mijlocii i mici. n suta de celule numrate
trebuie incluse toate leucocitele identificabile, normale sau anormale. Celulele ruptwe sau
degenerate nu trebuie incluse n numrtoare. Celulele din alte serii (eritroblati,
megacarioblati, fragmente de megacariocite) se noteaz separat i se exprim la 100 de
leucocite identificabile. Orice cretere procentual a unui tip celular impune aflarea valorii
sale absolute calculat din numrul total de leucocite i procentul tipului celular respectiv
obinut la efectuarea formulei leucocitare. De exemplu: nr. leucocite = 9000/mm
3
i
limfocitele = 55%, nr. absolut de limfocite = 55 x 9000 : 100 = 4950/mm
3
.
Tabelul nr. Valori normale relative i absolute ale leucocitelor

vrsta Leucocite
X 10
3
/l
nesegmentate segmentate eozinofile bazofile limfocite monocite
% Nr./l % Nr./l % Nr./l % Nr./l % Nr./l % Nr./l
La natere 9 - 30 9,1 1650 52 9400 2,2 400 0,6 100 31 5500 5,8 1050
6 luni 6 -17,5 3,8 450 28 3300 2,6 300 0,4 50 59 6800 5,2 600
1 an 6-17,5 3,1 350 28 3200 2,5 300 0,4 50 63 7500 4,6 550
4 ani 5,5-15,5 3 370 39 3500 2,6 280 0,5 50 59 6300 5 530
6 ani 5-14,5 3 250 48 4000 2,8 250 0,6 50 50 4500 5 450
10 ani 4,5-13,5 3 240 51 4200 2,4 200 0,6 50 39 3300 4,2 350
14 ani 4,5-13 3 240 53 4200 2,5 200 0,5 40 38 3000 4,4 350
16 ani 4,5-13 3 230 54 4200 2,5 200 0,5 40 37 2900 4,7 380
20 ani 4,5-11,5 3 230 57 4200 2,7 200 0,5 40 33 2500 5,0 380
adult 4,5-11 3 230 57 4200 2,7 200 0,5 40 33 2500 5,0 380

n primele cteva zile dup natere predomin granulocitele neutrofile dar apoi scad i de la 2
sptmni pn la 4 5 ani limfocitele reprezint majoritatea leucocitelor. Dup 5 ani
limfocitele scad treptat i la 20 de ani numrul lor este aproximativ jumtate din numrul de
granulocite care devin i rmn tipul celular predominant pentru tot restul vieii adulte. n
perioada neonatal exist o uoar monocitoza care dureaz primele 2 sptmni, dup care
numrul absolut de mooncite scade meninndu-se relativ constant toat copilria. Fa de
normal se pot nregistra modificri variate: neutrofilie sau neutropenie, limfocitoz sau
limfopenie, monocitoz sau monocitopenie, bazofilie.
Granulocitele neutrofile din snge reflect fidel starea funcional a mduvei osoase n strile
reactive sau n cele maligne. Numrul limfocitelor i monocitelor nu reflect corect formarea
acestora, informaia corect obinndu-se doar n urma punciei i biopsiei de mduv osoas,
ganglioni sau splin.
La pacienii cu leucopenie este necesar prepararea frotiurilor din concentrat leucocitar.
Anomalii morfologice leucocitare:
- anomalii de talie: granulocite gigante sau poliploide (mielodisplazii,
postterapie citostatic)
- anomalii nucleare: hipersegmentarea granulocitelor (deficit de catalizatori),
absena segmentrii sau hiposegmentarea + condensare cromatinian
anomalie Pelger-Huet (mielodisplazii, mieloproliferri acute sau cronice),
celule limfoide cu nuclei convolui sau cerebriformi (limfoproliferri de tip
T), nuclei picnotici, degenerai etc.
- Anomalii citoplasmatice: neutrofile hipo sau agranulare (infecii severe,
mielodisplazii, mieloproliferri cronice)granulaii mari, intens colorate,
numite granulaii toxice (septicemii, infecii severe) granulaii uriae n
neutrofile, limfocite i monocite (anomalia Chediak- Higashi), prezena de
incluzii albastre deschis n neutrofile- corpii Dohle (infecii, arsuri, sarcin,
mielodisplazii) etc
Studiul trombocitelor presupune:
- examinarea morfologiei i a eventualelor anomalii ale acesteia (anizocitoz
trombocitar, modificri ale glomerulului, vacuolizri etc.
- evaluarea numeric
- aglutinabilitatea
Pe frotiul colorat MGG trombocitele sunt cele mai mici elemente, cu diametrul de 2-4
microni, forma sferic sau ovoidal i prezint central granulaii azurofile care sunt
nconjurate de o zon de citoplasm albastr. Modificri morfologice intereseaz talia i/sau
aspectul trombocitelor, modificri structurale ale hialomerului sau granulomerului.
Trombocitele tinere sunt mai mari dact cele adulte i prezena lor n numr mare indic
eliberarea acestora din rezerve precum i o regenerare medular activ. Megatrombocitele
sunt trombocite eliberate prematur din mduv .Acestea sunt de obicei rotunde i conin
granule multiple ntens colorate.
Examinarea frotiului asigur i controlul numrtorii directe realizndu-se o estimare
semicantitativ. Frotiurile de snge fr anticoagulant permit estimarea numrului de
trombocite dup numrul i mai ales mrimea grupelor de trombocite. Gsirea pe margini i n
franjuri a unor grupe de 15-30 de trombocite indic un numr normal. Prezena de trombocite
izolate sau n grupe mici de 2-5-8 trombocite arat trombocitopenie, iar existena unor grupe
mari de 80-100 trombocite arat un numr crescut. Estimrile numrului de trombocite se pot
efectua i din sngele recoltat pe EDTA, cnd trombocitele nu agreg. n acest caz, dac n
toate cmpurile microscopice ale examenului cu imersie se gsesc 8-15 trombocite, izolate
sau n grupuri mici (un trombocit la fiecare 10-30 eritrocite) se consider un numr normal de
trombocite. Un numr de 1-2 trombocite la cteva cmpuri arat un numr sczut. Dac pe
fiecare cmp microscopic se afl 25-30 de trombocite, izolate sau aglutinate numrul lor este
crescut.
Prezena pe frotiul obinut din snge recoltat pe anticoagulant a trombocitelor agregate arat o
tehnic incorect a venopunciei cu activarea trombocitelor naintea amestecului cu
anticoagulantul. Acelai aspect se ntlnete ns i in cazul existenei de aglutinine plachetare
n sngele examinat.