METODE DE TESTARE A

IMUNITATII
Explorarea functiei imunitare permite aprecierea
raspunsului imun normal care apare in cursul
bolilor infectioase si a devierilor mecanismelor
imunitare.
Reactiile serologice permit detectarea
anticorpilor sau aprecierea titrului acestora.
Metode de testare a
imunitatii
• Sunt reactii Ag-Ac si pot fi grupate in:
• 1. Reactii de agregare- Aglutinare
• - Precipitare
• 2. Reactii in care intervine Complementul
• 3. Reactii de neutralizare
• 4. Reactii de marcare prin artificii tehnice:
• - Imunofluorescenta IF
• - Marcarea enzimatica ELISA
• - testarea radioimuna RIA
Reactia de aglutinare
• Aglutinarea bacteriana
• Este o reactie Ag-Ac de agregare, in care Ag-nul
este reprezentat de celule bacteriene sau
fragmente de celule bacteriene in suspensie.( Ag
particulat)
• Sub actiunea anticorpilor specifici, complexele
imune Ag-Ac, formeaza retele tridimensionale in
prezenta unor electroliti din mediu si in anumite
conditii de temperatura si ph, constituind agregate
vizibile. Reactia de aglutinare se foloseste pentru
identificarea unor bacterii sau a unor Ac. din serul
bolnavilor.
Reactia de aglutinare
• Tehnici de efectuare a reactiei de aglutinare
• 1. Aglutinarea pe lama
• Se foloseste in diagnosticul bacteriologic pentru
identificarea rapida a unor tulpini bacteriene izolate din
produsul patologic.
• Pe o lama microscopica degresata se pune o picatura
de ser imun si alaturi o picatura de ser fiziologic. Din
cultura bacteriana pe geloza simpla se ia cu ansa o
cantitate mica si se se suspenda omogen in serul imun,
apoi se repeta in serul fiziologic.
• In cazul unei corespondente Ag-Ac in serul imun vor
aparea grunji fini vizibili cu ochiul liber. In serul
fiziologic germenul raman in suspensie omogena. Agl
pe lama este o reactie calitativa. Pentru confirmare se
face aglutinare in tuburi.
Reactia de aglutinare
• 2. Aglutinarea in tuburi
• Se efectueaza in 6 tuburi in care se fac
dilutii crescande din serul de cercetat
sau din serul imun standard.
• Principiul reactiei
• La dilutii crescande de ser se adauga
cantitati egale de Ag. Titrul reacriei este
dat de dilutia cea mai mare in care se
mai observa aglutinare.
Reactia de aglutinare
• In aglutinarea bacteriana se observa doua tipuri de
aglutinare:
• aglutinare somatica sau O
• Aglutinare ciliara sau H
• Aglutinarea O este data de Ag-ul O somatic din
peretele bacterian ( endotoxina). Este un antigen de
natura glucidopolipeptidica, termostabil,
alcoolorezistent, distrus de formol.
• Aglutinarea O se evidentiaza sub forma de grunji fini
care nu disociaza la o agitare brusca.
• Apare lent –incubare la 52o C, 2 ore si 20 de h la
temp. camerei.
• Este o agl. polara, bacteriile se unesc cap la cap.
Reactia de aglutinare
• Aglutinarea H
• -Flagelara, este data de Ag-ul H, prezent la
bacteriile mobile.
• Ag-ul H este de natura proteica, termolabil,
distrus de alcool. Rezistent la formol.
• -Apare sub forma unor flocoane care
formeaza un sediment abundent si lax, care
dispare la agitare.
• -apare dupa o incubare de 2h la 52oC sau 20
de h la 37oC. In cursul ei bacteriile se unesc
prin flageli.
Aplicatii
• -identificarea unor bacterii izolate din
produsul patologic: se identifica speciile si
tipurile de Salmonella, Shigella, Escherichia
coli, Streptococ, etc.
• - diagnosticul serologic al unor infectii prin
evidentiarea anticorpilor in serul bolnavului.
• Ex R. Widal-in febra tifoida
• R. Wright-in bruceloza
• R. Weil-Felix-in tifosul exantematic
Reactii de aglutinare pasiva
sau aglutinare pe suport
 Se utilizeaza atunci cand antigenul este
o solutie moleculara. In urma fixarii pe
un suport particulat, acesta devine
aglutinabil in prezenta serului imun.
 Prin aceste reactii se pot identifica atat
antigenle cat si anticorpii.
 Prticulele inerte folosite sunt: latexul,
polistirenul, hematiile.
Aplicatii
• Reactii de agl. pasiva in care Ag-ul este
adsorbit pe particule de latex, polistiren
• Evidentierea factorului reumatoid:
particulele de latex acoperite cu IgG
normale sunt aglutinate de serurile
pacientilor care contin FR( IgM care apar
fata de IgG proprii).Reactia este poz. in
artrita reumatoida,reactia este negativa in
RAA si in poliartrita cr.
• Evidentierea meningococului,
pneumococului si a haemophilusului in l.c.r.
Aplicatii
 Aglutinarea pasiva in care Ag-ul este
adsorbit pe hematii se aplica in
diagnosticul tiroiditei autoimune, in
poliartrita reumatoida ( testul Waaler
Rose), in evid. ac,. anti- toxoci.
Reactii de precipitare
 Precipitarea este o reactie Ag-Ac de
agregare in care Ag-ul este reprezentat
de macromolecule in sol. coloidala.
Punerea in contact a Ag-ului cu Ac-ul
corespunzator duce la formarea de
complexe Ag-Ac care precipita atunci
cand elementele aflate in reactie sunt in
proportie optima.
Tehnici
 1. Precipitarea inelara
 Antigenul si serul imun sunt puse in
contact in tuburi cu diametrul mic, astfel
ca ele sa nu se amestece ci sa formeze o
interfata de contact la nivelul careia prin
creerea unei zone de concentratie
optima de Ac-Ag, sa apara un inel de
precipitare. Reactia poate evidentia
cantitati mici de Ag si se utilizeaza in:
Precipitarea inelara
• -industria alimentara- pentru detectia originii
carnii
• In medicina legala pentru identificarea petelor de
sange
• In diagnosticul bolilor infectioase: Reactia
Ascoli- in dg. retrospectiv al infectiei cu bacilul
carbunos. Ag-ul carbunos rezista in timp si la
temperaturi crescute. Reactia consta in punerea in
contact, a serului anticarbunos cu antigenul extras
la caldura din fragmentele de organe, in tuburi
capilare astfel ca cele doua lichide sa nu se
amestece. La interfata de contact dintre ele va
aparea un inel de precipitare opalescent.
Precipitarea inelara
• Reactia Vincent-Bellot
• Se foloseste in dg. meningitei meningococice :
in l.c.r. se gaseste Ag-ul si acesta se pune in contact
cu serul antimeningococic astfel ca intere ele sa se
produca o interfata de contact, nivel la care se
observa aparitia unui inel de precipitare opalescent.
• Identificarea grupului de streptococ: se extrage
carbohidratul C din peretele celular si se pune in
contact cu serurile de grup A, B, C, D, F, G si reactia
pozitiva identifica grupul de streptococ.
Reactii de precipitare
 2. Reactii de floculare
 Flocularea este o reactie in care
precipitarea apare prin amestecul Ag-lui cu
serul imun in toata masa amestecului sub
forma de flocoane.
 Reactia se utilizeaza pentru titrarea
toxinelor bacteriene si a serurilor
antitoxicepornindu-se de la observatia ca
flocularea apare prima data in eprubeta in
care exista o proportie optima intre Ag si Ac
2. Reactii de floculare
 Reactia de precipitare Ramon este
prototipul reactiilor de floculare. Prin
aceasta reactie se poate determina titrul
anticorpilor antidifterici in serul
pacientului flosind ca Ag toxina, sau se
poate titra toxina folosind ser
antidifteric.
Reactii de precipitare
 3. Precipitarea in gel
 Este o reactie de mare sensibilitate si
specificitate
 Se foloseste gel de agar ca mediu in care
difuzeaza Ag si Ac, la locul lor de
intalnire se formeaza zone de precipitare
vizibile in gelul transparent.
3. Precipitarea in gel

 A. Difuzia simpla
 Difuzeaza doar un reactant, celalalt fiind incorporat in
gel.
 Exemple:
 Metoda difuziei radiale Mancini se foloseste la det.
cantitativa a unor fractiuni proteice cum ar fi IgG, IgM,
IgA ( imunograma)sau C3 , transferina.
 Imunoplacile se folosesc la determinarea cantitatii de
imunglobuline in ser. Ele au inglobata in gel
imunglobulina care trebuie determinata. In godeul
central se pune ser de referinta iar in godeurile
periferice se pun serurile pacientilor. Se incubeaza 4h
la 370C si se masara diametrul fiecarui inel de
precipitare. Printr-un calcul matematic se stabileste
cantitatea de Ig continuta in ser.
Imunoplaca
3. Precipitarea in gel
 B. Difuzia dubla
 Ambii reactanti difuzeaza si formeaza linii de
precipitare la locul de intalnire.
 Metoda Ouchterlony: pe o placa de sticla se toarna
geloza 1% iar dupa solidificare se fac godeuri.
 In godeul central se pune ser imun(Ac). In
godeurile periferice se pun diferite Ag. Daca exista
corespondenta Ag-Ac apar linii de precipitare dupa
incubarea placii .
 Prin aceasat metoda putem identifica bacterii,
virusuri, proteine patologice.
Testul Elek
 Este un tip particular de dubla difuzie prin care se
identifica tulpinile toxigene de bacil difteric.
 Testul se face in placi Petri in care este turnat mediu
de cultura. In centrul placii pe intreg diametrul ei se
scobeste un sant in care se introduce ser antitoxic
100UI/ml. Perpendicular pe acest sant se
insamanteaza tulpina de bacil difteric pe care o
testam, tulpina de bacil difteric toxigena ( martor
pozitiv), tulpina de bacil difteric netoxigena ( martor
negativ). Se incubeaza placa la 370C 18 h si apoi se
interpreteaza: Aparitia unei linii de precipitate in
bidectoare unghiului format de tulpina de testat si
santul cu serul antidifteric =tulpina toxigena.
Testul ELEK
 1.martor pozitiv
 2. martor negativ
 3.tulpina netoxigena
 4. tulpina toxigena