IMUNOLOGIE II

Reactiile de precipitare
Reactiile de precipitare se folosesc pentru a masura concentratii de Ac sau Ag. Precipitarea
implica interactiunea antigenelor solubile cu anticorpii in proportie corecta, rezultatul fiind
obtinerea unui precipitat vizibil. Antigenele solubile utilizate in reactiile de precipitare sunt
solutii de molecule de natura proteica sau carbohidrati.Anticorpii care agrega Ag solubile se
numesc precipitine, pot sa fie monoclonali sau policlonali. Cea mai simpla reactie de precipitare
consta in adaugarea unei solutii de antigen intr-un volum mic de antiser, la interfata dintre cei doi
reactivi se formeaza un inel.
Fenomenul are la baza faptul ca anticorpii au mai mult de o valenta si ca atare se pot lega in retea
la antigenele prezente.
Reactiile de precipitare se pot desfasura in mediu lichid (turbidimetrie, nefelometrie) sau solid
(imunodifuzie radiala, imunoelectroforeza).
Tehnici calitative:
Dubla difuzie Ouchterlony
Electroforeza proteica in gel
Contraimunoelectroforeza
Imunoelectroforeza
Imunofixarea
Teste cantitative:
Imunodifuzia radiala
Electroimunodifuzia Laurell
Reactii de precipitare in solutie

Mixarea Ac si Ag in forma solubila in eprubeta poate evolua in doua directii:

Raman in forma solubila
Formeaza precipitat
Prin adaugarea de cantitati crescande de Ag la o cantitate fixa de Ac se construieste curba de
precipitare Heidelberger care poate fi impartita in trei zone:

1. Zona de exces Ac - dupa centrifugare complexe Ag-Ac raman Ac in solutie; aici se

formeaza complexe solubile Ac-Ag, raportul Ag/Ac este scazut.
2. Zona de echivalenta formare eficienta complexe Ac-Ag, nu raman in solutie Ag sau Ac,
se formeaza complexe insolubile Ag-Ac care se vad sub forma de precipitat
3. Zona de exces Ag Ag liber in solutie dupa centrifugare complexe Ag-Ac; in aceasta
zona se formeaza din nou incomplexe solubile de Ac-Ag si mimeaza zona de concentratie
scazuta de Ag. Pentru verificarea titrului de Ag se fac dilutii ce aduc in proportie optima
concentratia de Ac si Ag si permite formarea de complexe insolubile (precipitat).

In cadrul reactiilor de precipitare complexele Ag-Ac sunt rezultatul interactiunii unui Ac cu un

Ag molecular, Ag difuzeaza intr-o proba cu concentratie cunoscuta de Ac si se formeaza
precipitate in zona de echivalenta.
Testul inelului metoda simpla de evidentiere a reactiei Ag-Ac intr-un tub, prin punerea in
contact a unei solutii de Ag cu imunoserul corespunzator. La interfata apare in cateva minute un
inel sau un disc albicios ce corespunde precipitatului Ag-Ac.

Reactia Heidelberger si Kendall posibilitate de cuantificare a reactiei Ag-Ac prin

interactiunea in mai multe tuburi de reactie a unei cantitati constante de Ac cu concentratii
crescute de Ag intr-un volum dat. Apare precipitat, posibil inca din primele tuburi, creste
cantitatea de precipitat in tuburile urmatoare pt ca apoi sa se reduca in conditiile excesului de Ag
(zone Ag-Ac).
Turbidimetria- Un Ag este plasat intr-o cuva si interactioneaza cu Ac corespunzator aflat in
exces. Se formeaza complexe solubile ce tulbura proba de cercetat. Se masoara fotometric
formarea de complexe
Nefelometria are acelasi principiu ca si turbidimetria, ca metoda de cuantificare a rezultatului
se foloseste insa o lumina laser ce va fi reflectata de complexele Ag-Ac si preluata/ focusata de
niste lentile speciale intr-un fotometru . Concentratia de Ag din proba studiata este determinate
cu ajutorul unor curbe standard. Necesita aparatura mai complicate, este insa de folos in
determinarea in medii biologice a moleculelor de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgE), fractiuni
de complement C1q, C3, C4, etc.
Precipitarea in faza solida
1.

Imunodifuzia radiala Mancini o cantitate constanta de Ac este incorporata omogen in

gel de agar inainte de solidificarea gelului si in godeuri facute in gel se plaseaza dilutii de
Ag. Pe masura ce Ag difuzeaza in gel, reactioneaza cu Ac si cand se atinge punctul de
echivalenta apare un inel de precipitare (vezi figura alaturata).

Diametrul inelului este proportional cu logaritmul concentratiei de Ag din moment ce

concentratia de Ac este constanta. Astfel daca se lucreaza cu un Ag standard se poate genera o
curba standard pe seama careia se poate masura exact cantitatea de Ag dintr-o proba necunoscuta
deci acesta este un test cantitativ. Daca apare mai mult de un inel inseamna ca au aparut mai
multe reactii Ag-Ac. Acest lucru se intampla cand se lucreaza cu o mixtura de Ac si de Ag. Se
foloseste de obicei in laboratorul clinic pt a determina nivelul de imunoglobuline in serul
pacientilor.
Este de folos in determinarea IgG, IgA, IgM, fractiuni de complement C3, alfa-1-antitripsina,
etc.

2.

Imunodifuzia radiala dubla Ouchterlony in cadrul acestei metode Ag este plasat intrun godeu, Ac monospecific in alt godeu, difuzeaza unul catre celalalt in gel de agar si
apar arce de precipitare vizibile la locul de intalnire. Aceasta metoda calitativa permite
analizarea sistemului Ag-Ac gratie reactiei de identitate.

Pot fi observate mai multe aspecte ale precipitarii:

a. Reactia de identitate daca doua Ag sunt identice sau au epitopi asemanatori, liniile lro
de precipitare cu Ac vor avea continuitate.
b. Reactia de nonidentitate 2 Ag diferite ce se combina cu 2 Ac, arcele de precipitare se
intersecteaza
c. Reactia de identitate partiala daca cele doua Ag au un epitop comun si un epitop
specific doar uneia dintre antigene, se va forma un arc de cerc continuu si va aparea
atasat un brat secundar epitopului diferit.

Se foloseste pentru evidentierea proteinei C reactive, proteinelor Bence-Jones, beta-2microglobulina, alfa-fetoproteina, produsi de degradare a fibrinogenului, rezultatele sunt
exprimate semicantitativ: +, ++, +++.
d. Imunoelectroforeza o mixtura complexa de Ag este plasata in godeuri in gel de agar si
prin electroforeza Ag sunt separate pe seama incarcaturii lor electrice. Dupa electroforeza
sunt efectuate santuri in gel si se adauga Ac (imunoelectroforeza sau imunofixare). Pe
masura ce Ac difuzeaza in gel, apar arce de precipitare la zona de echivalenta.
Acest test este folosit pentru analiza cantitativa a mixturilor complexe de Ag, pentru analiza
componentelor din serul pacientului. Comparand serul pacientului cu serul normal, se poate
identifica deficienta uneia sau mai multor componente serice in proba de cercetat. Se folosesc
imunoseruri de origine animala specifice pentru proteine din serul uman. Aceeasi tehnica permite
analizarea proteinelor urinare sau a lichidului cefalorahidian. Este o metoda calitativa, se poate
constata aparitia sau nu a precipitarii in raport cu un martor.

e. Electroforeza contracurent (elctroimunodifuzia) Ag este plasat in godeuri de agar,

sunt supuse electroforezei atat Ag cat si Ac si apare linie de precipitare ca in figura de
mai jos. Acest test poate fi utilizat numai daca Ac si Ag au incarcatura electrica opusa.
Este un test calitativ desi se poate aprecia si cantitatea prin aprecierea grosimii benzii de
precipitare. Avantajul sau major este rapiditatea testului.

f. Imunoelectroforeza in racheta electroforeza in gel ce contine anticorpi Ag migreaza

electroforetic catre anod prin gelul continator de Ac si apare precipitare sub forma de
racheta ce poate fi vizualizata prin colorare. Aceasta metoda permite cuantificarea unui
Ag prin comparatia cu o proba standard.

g. Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) RIA

sunt metode bazate pe masurarea radioactivitatii generate de complexele Ag-Ac. Pentru
ca RIA necesita molecule radiomarcate, dificil de efectuat, a fost inlocuita cu metodele de
investigare in faza solida (ELISA). Marcarea se face fie la nivelul Ag fie la Ac. Testele
ELISA sunt cele bazate pe masurarea unei reactii enzimatice asociate cu formarea
complexelor Ag-Ac. O reactie pozitiva duce la aparitia unui produs colorat ce poate fi
masurat spectrofotometric. Se folosesc doua alternative de reactie: directa si indirecta. In
metoda directa, proba de cercetat este adaugata peste placa in care sunt fixati Ac
monoclonali in faza solida, se spala dupa incubare si este inlaturat materialul nelegat. In
metoda directa un Ac secundar marcat reactioneaza cu Ag-ul legat de primul Ac. In
metoda indirecta se adauga un Ac anti-Ag de cercetat si un al treilea Ac marcat enzimatic
interactioneaza cu Ac secundar (Sandwich ELISA). La final se adauga substratul enzimei,
atat in metoda directa cat si in cazul celei indirecte. Cantitatea de produs colorat final
reprezinta echivalentul cantitatii de Ag prezent in proba clinica.

RIA/ELISA competitive pt depistarea Ag:

Prin utilizarea unei cantitati cunoscute de Ag standard

se construiesc curbele standar de radioactivitate pe seama carora poate fi analoizata
ulterior cantitatea de Ag din probele de cercetat. Etapa cheie in desfasurarea metodei o
reprezinta separarea complexelor Ag-Ac de restul componentelor. Aceasta se poate
realize in mai multe feluri:

o Precipitare cu sulfat de amoniu precipita imunoglobulinele dar nu si Ag astfel

ca metoda poate fi folosita pt separarea complexelor immune de Ag liber - este
cunoscuta sub numele de tehnica Farr
o Ac anti imunoglobulina adaugarea unui al doilea Ac directionat impotriva
primului Ac poate duce la precipitarea complexelor immune si astfel la separarea
acestora de Ag liber.
o Imobilizarea anticorpilor Ac pot fi imobilizati pe suprafete de plastic si astfel
complexele imune pot fi usor separate de alte componente prin simpla spalare.
Aceasta este cea mai frecvent folosita metoda astazi si este cunoscuta ca ELISA
sau RIA in faza solida. Se olosesc pt dozarea cantitativa a unor protein serice,
hormoni, metaboliti de medicamente.

RIA /ELISA necompetitive pt antigene sau anticorpi RIA si ELISA necompetitive

sunt de asemenea folosite pt masurarea de Ag sau Ac. Ag fixat in faza solida este folosit
pentru determinarea prezentei de Ac in serul de cercetat. Cantitatea de Ac secundar
marcat enzimatic sau radioactiv este concordant cu cantitatea de Ac din proba cercetata.
Aceasta metoda este de obicei folosita pentru depistarea Ac de tip IgE anti-alergene
cunoscute si este cunoscuta sub numele de metoda RAST (radioallergosorbent test).

Desfasurarea testului prin fixarea Ac in faza solida permite masurarea cantitatii de Ag din
serul de cercetat. Cantitatea de Ac secundar marcat enzimatic sau radioactive este
proportional cu cantitatea de Ag.
h. Immunoblotting Western Blot separare fractiuni proteice conform greutatii lor
moleculare prin electroforeza in sistem sodium dodecil sulfat gel poliacrilamida (SDPAGE). Proteinele sunt apoi transferate si imobilizate pe o membrana de nitroceluloza
unde pot sa fie identificate prin folosirea unui Ac specific. Unul din avantajele metodei
este acela de a identifica cu foarte mare sensibiliate un Ac specific dupa separarea
proteinelor.

FIXAREA COMPLEMENTULUI
Reacia de fixare a complementului- test serologic bazat pe epuizarea unei cantitati fixe de
complement n prezena unei reacii antigen-anticorp.
Bun pentru detectarea unor cantiti foarte mici de anticorpi, atunci cnd valoarea de anticorp
este prea mic pentru a provoca o reacie de aglutinare sau de precipitaii.
Initial testul a fost pus la punct pentru diagnosticul sifilisului (reactia Wasserman) si inca se mai
foloseste pt diagnosticul unor infectii virale sau fungice.
Metoda cuprinde 2 etape:
1. Fixarea complementului se adauga Ag si complement la serul de cercetat. Daca serul
contine Ac impotriva Ag adaugat, acestia se vor lega la Ag si vor fixa complementul
astfel ca nu mai ramane complement pt urmatorul pas, etapa martor.
2. Etapa indicator se adauga eritrocite de oaie si Ac anti-Er in ser. Complexul Er-Ac antiEr
pot lega complement daca a mai ramas disponibil si celulele Er vor fi lizate. Hemoliza va
indica ca in serul de cercetat nu exista Ac cautati. Daca nu mai exista complement
disponibil, Er vor fi hemolizate.

Imunofluorescenta directa
Este folosita pt a identifica direct microorganisme. Ac directionati impotriva unui Ag de
suprafata sun marcati fluorescent si dupa incubare cu proba de cercetat este vizualizata reactia cu
microscop de fluorescenta sau prin flow-citometrie.

Imunofluorescenta indirecta
Metoda folosita pt identificarea Ac in ser. Ag sau microorganismul in sine este incubat cu serul
pacientului in care se presupune ca exista Ac. Dupa incubare cu Ac anti-imunogloblina umana
marcati fluorescent, recatia pozitiva este vizualizata prin fluorescenta.