Sunteți pe pagina 1din 16

fenomenul de imunohemoliz utiliznd deci un complex antigen-anticorp cunoscut,

format din hematii i anticorpi antihematie (specifici). Astfel, dac n serul unui bolnav se
caut anticorpi cu ajutorul unui antigen cunoscut, n cazul unui rezultat pozitiv C se va fixa pe
complexul Ag-Ac format, fr a produce modificri vizibile n tubul de reacie. De aceea,
pentru evidenierea fixrii C se adaug n reacie complexul imun format din hematii i
hemolizin (ser antihematii) - numit i sistem indicator deoarece, dac nu s-a format primul
complex (anticorpii lipsind din serul bolnavului) C se va fixa pe acest complex i va produce
ruperea hematiilor (imunohemoliza = rezultat negativ). n cazul n care n serul cercetat exist
anticorpi fa de antigenul cunoscut introdus n reacie nu se va produce hemoliza, C fiind
fixat pe acest complex (RFC = pozitiv).
Acest principiu este reprezentat n urmtoarea schem:
Sistem
de
cerceta
t
Antigen

Compleme
nt

Sistem
indicator

Rezultat

hematii

Lipsa hemolizei

Anticorp x

RFC = pozitiv

Antigen

hemolizin

hematii

x
imunohemoliz

x
Anticorp

hemolizin

RFC =negativ

RFC poate fi lucrat n tuburi sau pe plci de material plastic cu godeuri. Exist mai
multe tehnici pentru efectuarea reaciei de fixare a complementului, din care se desprind dou
metode mai importante: metoda clasic Wassemann, practicat n diagnosticul sifilisului,
brucelozei, tusei convulsive etc. i metoda Bengston care titreaz anticorpii fixatori de
complement pentru diagnosticul tifosului exantematic, rickettsiozelor, al ornitozei i al
leptospirozei pe lng diagnosticul serologic al unor viroze).
Reacia Bordet Wassermann
Se lucreaz n trei eprubete, cu dou cantiti diferite de ser de bolnav.
Schema
Eprubeta
-ser de bolnav (ml)
-antigen B-W (ml)
-complement (ml)
-soluie sal.fiziol. (ml)

1
0,1
0,3
0,3
0,8

2
0,2
0,3
0,3
0,7

3 (martor)
0,2
-0,3
1

Incubare 45 de minute la 37C

-sistem indicator
(hemolitic) (ml)

1,0

1,0

1,0

Incubare 30 min. la 37 C

Citirea se face urmrind apariia hemolizei (rezultat negativ) sau lipsa ei (rezultat
pozitiv).
Tehnica Ida Bengston
Metoda Bengston, adoptat n ara noastr pentru diagnosticul serologic, titreaz
anticorpii fixatori de complement pentru diagnosticul leptospirozelor, rickettsiozelor, infeciilor
cu chlamydii etc.
Tehnica Bengston, n care fiecare din componentele ce intr n reacie este folosit n
volum de 0,2 ml, este aceeai pentru toate afeciunile amintite diferind doar felul antigenului i
modul de interpretare, de aceea se va descrie doar principiul reaciei pentru diagnosticul
serologic al tifosului exantematic, al crui factor etiologic l constituie bacterii din grupul
Rickettsia.
Serul de cercetat recoltat de la bolnav trebuie s fie steril, limpede, fr hematii, se va
inactiva 30 de minute n baie de ap la 560C.
Antigenul rickettsian se va dilua conform indicaiei de pe etichet, astfel nct diluia de
lucru s cuprind 4 uniti antigenice n cei 0,2 ml.
Hemolizina va fi ntotdeauna titrat pentru fiecare reacie astfel ca n 0,2 ml din
aceast diluie s se afle 2 uniti hemolitice.
Suspensia de hematii de berbec 2% proaspt splate.
Alexina (complementul) titrat n aceeai zi n prezena antigenului, este diluat astfel
nct 0,2 ml s conin 2 uniti alexice.
Pentru o prim comparaie se recomand folosirea unui set martor sigur pozitiv i altul
sigur negativ.
Regul. n toate cazurile reaciile serologice se efectueaz pe probe de ser sanguin
perechi. Astfel, de la fiecare bolnav se va recolta snge n primele zile de boal (proba nr. 1),
se va separa serul i se va ine la -20C pn n ziua prelucrrii, iar dup aproximativ 14 zile
se va recolta a doua prob de snge. Cele dou probe se vor lucra concomitent, urmrinduse creterea n dinamic a titrului de anticorpi (putnd fi utilizate reacii serologice cu mai
multe tipuri de antigene bacteriene sau virale pe probele perechi de seruri).
Interpretare: creterea titrului de anticorpi, de cel puin patru ori, n proba a doua de ser
este semnificativ pentru diagnostic. Titrul reaciei este dat de diluia cea mai mare de ser de
bolnav unde se constat absena total a hemolizei.
Particulariti ale tehnicii RFC
n diagnosticul serologic al febrei Q antigenul reprezint o suspensie purificat de
Coxiella burneti, cultivat pe sacul vitelin al embrionului de gin, suspensie din care se face
diluie de lucru conform indicaiei de pe etichet.
n diagnosticul serologic al infeciei cu Chlamydia antigenul este un extract purificat
obinut dintr-o cultur de Chlamydia pe sacul vitelin al oului embrionat.
Pentru diagnosticul leptospirozei este necesar antigenul Leptospira biflexa suspensie
concentrat preparat dintr-o tulpin nepatogen de leptospira.

Tehnica Bradstreet i Taylor, larg aplicat n ultimul timp n infeciile virale, infecii cu
Mycoplasma, febra Q etc. ca metod standard dup tehnica la rece. Aceasta utilizeaz
titrarea complementului n prezena diluiilor de hemolizin n tabl de ah. RFC este
efectuat n plci sau microplci cu godeuri.

1.6.4. Reacia de neutralizare


Acest tip de reacie se bazeaz pe proprietatea anticorpilor de a anihila (neutraliza)
efectele antigenelor toxice, litice, infectante prin combinarea Ag-Ac specific, in vitro i in vivo.
Astfel, n reaciile de neutralizare Ag este reprezentat de toxine, enzime, virusuri pe care
anticorpii specifici le pot neutraliza. n laboratorul clinic, acest tip de reacii se utilizeaz
pentru determinarea anticorpilor antistreptolizin O (reacia ASLO), dar i pentru
identificarea infeciilor bacteriene sau virale.
1.6.4.1. Reacia ASLO
Este o reacie de neutralizare pentru determinarea antistreptolizinelor O, anticorpi
fa de streptolizina O antigen de virulen al streptococilor. Este reacia serologic
frecvent folosit pentru diagnosticul retrospectiv al infeciei streptococice cu streptococ hemolitic.
Principiul reaciei. Serul de cercetat, n diluii succesive, este tratat cu o cantitate
standard de streptolizin O (antigenul) i dup o scurt incubare, necesar combinrii
specifice, se repartizeaz suspensia de eritrocite ca mijloc revelator. n tuburile n care diluiile
de ser conin o cantitate suficient de antistreptolizine O (anticorpi), efectul litic al
antigenului va fi inhibat, ceea ce se traduce prin lipsa hemolizei, iar n diluiile de ser n care
anticorpii sunt insuficieni pentru a putea neutraliza streptolizina, efectul litic al acesteia se
observ prin prezena hemolizei.
Interpretarea rezultatelor
Exist o schem de lucru standard n care se obin prin diluii succesive ale serului i
dup adugarea tuturor componentelor: 100, 125, 166, 250, 333, 500, 625, 833, 1250, 2500
uniti ASLO/ml.
Titrurile normale de antistreptolizin O ating valori pn la 166-250 U/ml. Titrurile
peste aceast limit indic, n antecedentele recente ale pacientului, existena unei afeciuni
streptococice sau poststreptococice: scarlatin, angin, glomerulonefrit, reumatism articular
acut. Aceste titruri crescute pot fi ntlnite i la purttorii de streptococ -hemolitic la nivel
amigdalian. Titrul ASLO crete semnificativ n reumatismul articular acut (RAA), ajungnd la
valori maxime ntre sptmna a 3-a i a 6-a de la debutul articular, dar rmne crescut timp
de 6-12 luni dup puseul reumatismal. Titrul ASLO poate fi la valori normale i n anginele
streptococice dac determinarea s-a fcut mai devreme de 15 zile de la debutul anginei.
1.6.4.2. Testarea strii de susceptibilitate in vivo
Susceptibilitatea fa de difterie (reacia Schick) i fa de scarlatin (reacie Dick) se
testeaz prin urmrirea neutralizrii de ctre anticorpii specifici din sngele bolnavilor

(antitoxine) a unei doze cunoscute din toxina difteric, respectiv din toxina eritrogen
streptococic, inoculate intradermic. Aceste reacii vor fi descrise la capitolele care vor trata
diagnosticul n difterie i respectiv n infeciile streptococice.

1.6.5. Teste care utilizeaz vizualizarea complexelor


antigen-anticorp prin artificii tehnice

Sensibilitatea reaciilor antigen-anticorp utilizate n diagnostic poate fi mrit legnd de


anticorp, mai rar de antigen, un marker uor de identificat, care s nu interfereze cu
proprietile imunologice ale reactanilor. Acest marker poate fi:
-

o substan fluorescent (izotiocianat de fluorescein, rhodamin etc.), n tehnica


de imunofluorescen;

izotopi radioactivi (de obicei 125I), n metoda radioimunotestrii (RIA);

o enzim (peroxidaz, fosfataz alcalin), n testele imunoenzimatice.

1.6.5.1. Imunofluorescena

Prin cuplarea unei substane fluorescente cu anticorpii se obin anticorpi fluoresceni


care, fixndu-se pe antigenul omolog, induc complexe imunofluorescente observabile prin
examinarea la microscopul cu fluorescen n lumina ultraviolet (UV).
Reacia de imunofluorescen (IF) se poate efectua prin metoda direct sau indirect.

Metoda direct
Anticorpii monospecifici sunt conjugai cu substana fluorescent. Materialul testat
pentru prezena antigenului se etaleaz pe lam, dup care se incubeaz cu anticorpii
marcai. Excesul de anticorpi se ndeprteaz prin splare, preparatul uscat fiind apoi
examinat la microscopul cu fluorescen, unde complexele Ag-Ac formate apar ca zone
fluorescente, uor vizibile (fig. 48).

Fig. 48 Imunofluorescena direct

Metoda indirect
Este frecvent utilizat i comport doi timpi (fig. 49):
-

preparatul care conine antigen se incubeaz cu anticorpul specific, nemarcat;

vizualizarea complexului imun format se face prin adugarea unui indicator


fluorescent, care este serul antiimunoglobulin (corespunztor anticorpului adugat
n reacie) marcat.

Fig. 49- Imunofluorescena indirect

Imunofluorescena indirect are o larg aplicare permind:


-

evidenierea antigenelor ntr-un produs, prin aciunea succesiv a anticorpilor


specifici nemarcai, apoi a serului globulinic marcat;

detectarea anticorpilor ntr-un ser necunoscut, utiliznd antigene cunoscute i ser


fluorescent antiglobulinic.

Imunofluorescena se aplic n bacteriologie pentru identificarea unor germeni


patogeni, de exemplu pentru E. coli serotipurile enteropatogene, Bordetella pertussis,
Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, ca i a unor virusuri implicate n infecii
respiratorii.
Probele care se testeaz prin imunofluorescen sunt de obicei exsudate sau raclate
de la nivelul unor leziuni cutanate sau din mucoase, ca i probe bioptice, amprente din
esuturi, culturi de celule infectate, sput, aspirat bronic, secreii genitale etc.
Pentru depistarea de anticorpi, metodele imunofluorescente sunt utile n infecii virale
sau n cele bacteriene cu Mycoplasma pneumoniae, Helycobacter pylori, Treponema
pallidum etc., dar i n infeciile parazitare (malarie, tripanosomiaz, toxoplasmoz,
pneumocistoz etc.).

1.6.5.2. Radioimunotestarea (RIA)

Iniial aplicat pentru testri de hormoni i enzime, RIA s-a extins i n diagnosticul
bolilor infecioase, fiind una din cele mai sensibile i precise metode de detectare i dozare a
antigenelor i anticorpilor, prin izotopi radioactivi ( 125I, 3H etc.).
Se practic fie marcarea unuia din reactani (antigenul sau anticorpul), fie marcarea
unui ser antiglobulinic care reacioneaz cu complexul imun primar. Radioactivitatea
complexului format se msoar fie n faz lichid, fie n faz solid i este utilizat n principal
pentru detectarea enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice, pentru evidenierea
polizaharidului capsular la pneumococi etc.
n infeciile virale cunoate de asemenea o larg aplicare n: diagnosticul gripei,
infeciilor hepatice i n diagnosticul hepatitelor cu virus B (AgHBs, anticorpi anti-HBs).
Succint, etapele unei dozri radioimunologice (fig.50) sunt urmtoarele:
-

peste o cantitate de anticorp de testat, fixat pe un suport se adaug o cantitate


variabil de antigen;

dup o etap de preincubare (i apoi splare) pentru formarea complexelor Ag-Ac,


se adaug o cantitate fix de anticorp marcat cu radioizotop 125 I.

Fig. 50 Principiul metodei n faz dubl

n acest sens, este ilustrat i tehnica radioimunologic pentru detectarea antigenului


de suprafa al hepatitei B, AgHBs (fig.51), pentru care se folosete principiul sandwich, o
tehnic n faz solid pentru msurarea cantitilor de AgHBs din ser sau plasm.

Fig. 51 Principiul tehnicii de detectare a AgHBs

Bile din material plastic, acoperite cu anticorp antiHBs, sunt incubate cu eantioane de
ser de testat. AgHBs, dac este prezent, se fixeaz pe anticorp. Se adaug anticorp antiHBs
marcat 125I, i n timpul celei de-a doua incubri, aceasta se fixeaz pe AgHBs, formnd

complexul anticorp-antigen-anticorp marcat radioactiv. Dup splarea bilei, se msoar


radioactivitatea, care este cu att mai ridicat, cu ct cantitatea de AgHBs este mai mare.
1.6.5.3. Teste imunoenzimatice
Principiul. Antigenul sau anticorpul se cupleaz cu o enzim care are o mare afinitate,
rezultnd att activitatea imunologic ct i cea enzimatic.
Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activitii enzimatice fa de un substrat
specific.
Testul ELISA (enzime-linked-immuno-sorbent-assay)
Se cunosc diverse tehnici imunoenzimatice, dintre care n diagnosticul bolilor
infecioase se aplic preferenial testul ELISA cu diferite variante:
-

tehnica direct pentru determinarea antigenelor (fig.52);


tehnica dublu sandwich pentru determinarea antigenelor sau anticorpilor (fig.53).

Fig. 52 ELISA direct. AB anticorpul specific antigenului din proba de cercetat; A


antigenul de determinat; AB-E conjugat anticorp specific antigenului A, cu enzima (E)

Fig. 53 ELISA dublu sandwich. AB anticorpul specific antigenului din proba de cercetat; A
antigenul din prob; AB1 anticorp specific antigenului; AB2-E conjugat antiimunoglobulin
AB1, cu enzima (E)

Succesiunea etapelor pentru efectuarea testului ELISA este:


- alegerea unui suport solid convenabil;
- imobilizarea antigenului sau anticorpului pe acest suport;
- legarea prin reacie imunospecific a anticorpului sau antigenului din proba de testat
pe antigenul i respectiv anticorpul imobilizat pe suportul solid;
- legarea prin reacie specific antigen-anticorp a reactantului marcat enzimatic, de
complexul format anterior, i fixat pe suport;
- adugarea n final, a substratului specific enzimei folosite drept marker, producnduse o reacie de culoare a enzimei cu substratul, aceasta fiind citit colorimetric.
ELISA se utilizeaz:
- pentru detectri de antigene bacteriene sau virale, pentru evidenierea toxinelor:
toxina difteric, toxinele bacteriilor din speciile E. coli toxigene, toxinele stafilococice;
detectarea brucelelor, treponemelor, rickettsiilor etc.;
- pentru detectri de anticorpi antibacterieni (n salmoneloze, bruceloze, rickettsioze
etc.) sau antivirali;
- pentru identificarea i determinarea cantitativ a anticorpilor antinucleari, antiADN,
complexelor imune circulante i urmririi tratamentului n boli cu component
autoimun.

1.7. TESTAREA REZISTENEI NATURALE


ANTIINFECIOASE
Aprarea fa de infecie se realizeaz prin:
- mecanisme nespecifice de rezisten natural ca: barierele cutanate i mucoase,
factorii umorali, tisulari i celulari, microbiocenozele, febra, fagocitoza i inflamaia;
- mecanisme imunitare specifice: umorale (prin anticorpi) i celulare (prin limfocite,
celule citotoxice i citokine).
Aria de investigaii a acestor parametri este tot mai larg, interesnd att statusul
normal, ct mai ales, definirea strilor patologice.

1.7.1. Teste de apreciere a rezistenei naturale


1.7.1.1. Determinarea cantitativ a complementului seric
Dozarea C se bazeaz pe proprietatea acestuia de a hemoliza eritrocitele sensibilizate
(eritrocite nvelite cu anticorpi specifici). n laborator, folosim eritrocite de berbec sensibilizate
cu ser hemolitic (ser antieritrocite de berbec).
Multiplele implicaii ale sistemului C i ale componentelor sale n rezistena natural a
organismului uman, ct i n reaciile biologice favorabile sau nefavorabile, au dus la

introducerea unor tehnici de laborator care s determine valoarea C total i a C3 n serul


sanguin.
Ca punct final al reaciei se ia hemoliza 50%, pentru c aceasta d o precizie mult mai
mare dozrii complexului dect hemoliza 100%.
Reacia necesit prepararea reactivilor dup reguli stricte. Acestea sunt:
- diluentul tampon la pH 7,3 diluat 1:5 cu ap distilat;
- eritrocitele de berbec recoltate pe soluie Alsever, splate cu ser fiziologic, se
suspend 1:60 n ser fiziologic;
- serul hemolitic ntr-o diluie stoc 1:50, se pregtete nainte de utilizare;
- sistemul hemolitic rezult din amestecul n pri egale a suspensiei de eritrocite i
ser hemolitic;
- serul de bolnav n care se face dozarea complementului, se va recolta proaspt.
Reacia
Pentru fiecare ser studiat, se pipeteaz n cte 6 tuburi, diluent, ser de bolnav i sistem
hemolitic, dup urmtoarea schem:
Tub nr.
Diluent (ml)
Ser bolnav dil. 1/40 (ml)
Sistem hemolitic (ml)

1
2
3
4
5
6
1,30 1,25 1,20 1,10 1,00 0,70
0,20 0,25 0,30 0,40 0,50 0,80
1
1
1
1
1
1

Volumul total de reacie = 2,5 ml


Incubarea la termostat 37C, timp de 30 de minute.
Centrifugare la 3000 ture, timp de 3 minute.
Citire la fotometru fa de un martor de hemoliz 100% (2,5 ml ap amoniacal 0,4% +
1 ml sistem hemolitic). Se msoar extincia probelor, apoi se face un calcul pentru
transformarea n procente i stabilirea hemolizei 50%.
Se poate aplica i o procedur direct, prin care se determin direct procentul de
hemoliz n tubul de reacie, prin comparare cu o scar de hemoliz, cuprins ntre 10% i
90%.
Dozarea complementului seric, aduce informaii importante n boli renale, boli hepatice,
colagenoze i boli alergice. Astfel, scade n glomerulonefrita acut, n lupusul eritematos i n
ciroza hepatic, i crete n unele infecii i boli neoplazice.
1.7.1.2. Testarea lizozimului
Lizozimul, factor umoral bactericid din snge, lichide biologice, mucus etc., acioneaz
alturi de polipeptidele bazice, proteazele lizozomale, interferoni, prin mecanisme neoxidative
asupra microorganismelor patogene.
Efectul lizozimului asupra peretelui bacterian, se poate evidenia pe culturi de
Micrococcus lysodeikticus n medii lichide sau solide.
Tehnica mai frecvent utilizat este cea pe medii solide (fig. 54), n care se face o
suspensie de Micrococcus, avnd o densitate de 10 germeni/ml, n agar bacteriologic la pH
7,2 i la o concentraie de 2,5%. Suspensia se introduce n agar cnd acesta are o
temperatur de 45C. Se toarn n plci Petri i, dup solidificare, se practic godeuri n
masa agarului. n patru din aceste godeuri se introduc urmtoarele concentraii de lizozim
(soluie martor, preparat extemporaneu): 25g; 50g; 100g i 200g. Probele martor i cele

de cercetat (ser sanguin, saliv etc.) se introduc n godeuri n cantiti identice, astfel ca
lichidele s nu se rspndeasc n afara godeurilor. Dup 24 de ore se msoar diametrele
de inhibiie a soluiilor martor i se traseaz curba standard (fig. 55) i totodat diametrele de
inhibiie ale probelor (unde se face media).

Fig. 54 Metoda de determinare cantitativ a lizozimului n placa Petri, n funcie de diametrul


de liz bacterian (din colecia autorului).
25, 50, 100, 200 = concentraiile de lizozim standard introduse n godeuri.
a i b = probele de cercetat.

Concentraiile lizozimului n lichidele biologice, se exprim conform curbei standard,


n g/ml. Alturi de reacia de fixare a complementului (vezi cap. 1.6.3.3), aceast tehnic
poate fi utilizat fie pentru identificarea antigenelor specifice de grup, fie pentru
serodiagnosticul unor infecii respiratorii acute (pneumonii, grip), a rickettsiozelor sau
leptospirozelor.
1.7.1.3. Fagocitoza
Evidenierea fagocitozei
Fagocitoza este definit ca proprietatea unor celule de a ngloba i digera particule
strine (fagein = a mnca) sau macromolecule (pinocin = a bea). Deoarece endocitoza
(nglobarea n celula fagocitar) nu este urmat obligatoriu de omorrea i digerarea
bacteriilor, n testele de laborator se urmresc separat cele dou procese.
Sunt preferate testele in vivo, deoarece: permit folosirea unor populaii omogene de
celule fagocitare (polimorfonucleare, macrofage); este eliminat intervenia n procesul
fagocitar a unor ali factori (serici) i se poate studia separat nglobarea i efectul bacteriilor
intracelular.

Fig. 55 Reprezentarea grafic a concentraiei de lizozim standard

In vitro, pentru determinarea procentului de fagocite care au nglobat bacterii, se pune


n contact suspensia de PMN cu o suspensie de cultur bacterian, n mai multe eprubete.
Dup incubarea acestui amestec la 37C, la diferite intervale de timp (15, 30, 60, 120 minute),
se fac frotiuri care se coloreaz cu coloraia Giemsa i se examineaz la microscop, notnd:
- numrul mediu de microorganisme nglobate pe fagocit;
- procentul de fagocite care au nglobat bacterii.
n vederea cunoaterii capacitii de distrugere intracelular a microorganismelor n
procesul de fagocitoz, se determin numrul de bacterii viabile intracelulare.
Pentru aceasta, dup incubarea amestecului de celule fagocitare i microorganisme
timp de 15 minute la 37C (perioad n care are loc nglobarea), se oprete fagocitoza prin
plasarea eprubetelor la ghea. Dup o uoar centrifugare timp de 4 minute, fagocitele
sedimentare se spal n soluie Hanks, i se incubeaz la 37C. Dup fiecare 15, 30, 60, 120
minute, se ia 0,5 ml din suspensie i se amestec cu 0,5 ml soluie Hanks. Dup o nou
centrifugare, se elimin supernatantul i se lizeaz fagocitele cu ap distilat steril, de la
ghea, care conine i albumin bovin. Determinarea numrului de bacterii viabile se face
prin cultivarea pe medii de cultur adecvate. Datele statistice arat c neutrofilele ucid n 60
minute 95,8% din stafilococii albi i 86% din stafilococii aurei hemolitici.
Pentru aprecierea indicelui fagocitar (numrul mediu de particule fagocitate de un
granulocit sau monocit) se pot aplica metode cantitative, mai obiective i mai rapide, cum
este utilizarea unor particule colorate, ca de exemplu, picturile de ulei O rou, acoperite cu
LPS (lipopolizaharide bacteriene), care face posibil determinarea spectrofotometric a
fagocitozei. Alte metode se bazeaz pe marcarea bacteriilor cu izotopi radioactivi sau pe
citometria n flux (cnd bacteriile sunt marcate cu fluorocromi).
Coloidopexia
Microorganismele sau diferite particule inerte inoculate intravenos la animalele de
laborator (oareci, cobai), sunt uor fagocitate de ctre fagocitele circulante sau fixe.

Experienele mai frecvent fcute au fost cele cu tu de China. Dup diferite intervale de timp
(30, 60, 120 minute), sacrificarea animalului i efectuarea de seciuni histologice, au
demonstrat care sunt organele mai bogate n macrofage (ganglionii limfatici, splina, ficatul
etc.), cuprinse n sistemul mononuclear fagocitar.
Testul NBT (Nitrobluetetrazolium)
Este un test frecvent utilizat pentru a evidenia activitatea enzimatic a fagocitelor, mai
ales a PMN, celule generatoare de peroxizi de hidrogen i radicali activi ai oxigenului.
Principiul. Proprietatea fagocitelor de a ngloba colorantul n vacuole fagocitare, unde
sub influena unor nucleotid-oxidaze are loc reducerea acestora ntr-un precipitat insolubil de
formazan (albastru-negru), evideniabil prin coloraia Giemsa.
Metoda cu snge integral, se practic recoltnd 1-2 ml snge ntr-o sticlu cu
anticoagulant (2 mg Na EDTA uscat). ntr-o eprubet se amestec:
- 0,08 ml soluie tampon Michaelis pH 7,4;
- 0,02 ml soluie NBT 1%;
- 0,1 ml snge recoltat pe anticoagulant.
Dup incubarea amestecului la 37C, timp de 30 de minute, se agit i se fac frotiuri:
uscate, fixate cu alcool metilic i colorate Giemsa.
Se examineaz cel puin 100 PMN i se difereniaz procentual celulele cu depozite de
formazan (NBT pozitive).
La o persoan sntoas, fagocitele NBT-pozitive, reprezint 7-14%. Odat cu
creterea metabolismului oxidativ al neutrofilelor stimulate prin infecii bacteriene, procentul
lor crete mult. n infeciile virale sau stri febrile de origine neinfecioas, valorile se menin
n limite normale.
Chemiluminiscena
O metod alternativ de apreciere a metabolismului oxidativ al PMN este cea prin care
se evideniaz fenomenul de chemiluminiscen cu ajutorul unor aparate (chemiluminometre).
Radiaiile luminoase (chemiluminiscena) generate n timpul fagocitozei sunt
amplificate prin utilizarea unei substane intermediare luminol i/sau lucigenin care prin
oxidare emit unde luminoase i acestea pot fi convertite de aparate, n semnale electrice,
msurate n milivoli.
Prin aceste metode de apreciere a activitii PMN i a capacitii bactericide a acestor
celule se pot evidenia deficienele funcionale ale fagocitelor, n principal deficitul activitii
bactericide, care se traduce clinic prin infecii repetate, rebele la tratament, care afecteaz
mai ales esuturile profunde, determinnd modificri cu aspect de infiltrate granulocitare (boli
cronice granulomatoase).

1.7.2. Teste de imunitate celular


Realizarea rspunsului imun celular are la baz eliberarea mai multor categorii de
factori solubili: limfokine, factori ajuttori i supresori, factori mitogeni, factori de transfer,
factorul de inhibare a migrrii macrofagelor (MIF) i muli alii.
Pentru explorarea imunitii celulare se folosesc att teste in vitro ct i in vivo.
1.7.2.1. Explorarea imunitii celulare in vitro

Exist mai multe metode experimentale care utilizeaz limfocite din snge.
Evaluarea numrului absolut al limfocitelor i monocitelor
Normal, numrul absolut al limfocitelor sanguine este de 1500-3000/mm, iar al
monocitelor (macrofage tinere) de 300-600/mm.
Cunoscnd procentul acestora n tabloul sanguin, se poate uor calcula numrul absolut,
raportat la numrul total al leucocitelor/mm.
Actual, identificarea i evaluarea subpopulaiilor limfocitare T, B i a celulelor NK din
sngele periferic i din esuturi, apeleaz la anticorpii monoclonali i la metode de citometrie
n flux care pot identifica aceste celule pe baza markerilor i a receptorilor specifici fiecrei
populaii i subpopulaii limfocitare.
Fenotipizarea sau imunofenotipizarea limfocitelor T i B se poate face pe suspensii
unicelulare din snge, cu ajutorul anticorpilor monoclonali, fa de markerii: CD 2, CD 3, CD
4, CD 19, CD 20 etc. Pentru celulele NK se testeaz markerii: CD 16 i CD 56.
Metodele de separare a limfocitelor i macrofagelor
Pentru cercetarea in vitro a unor mecanisme care intervin n cooperarea celular i
reglarea rspunsului imun este necesar obinerea claselor i subclaselor de celule. Pentru
acest scop, au fost imaginate diverse metode de separare a celulelor, dintre care se desprind:
tehnicile de separare a celulelor bazate pe diferene de sedimentare;
separarea celulelor pe baza unor atribute biologice particulare;
metode de separare pe baza unor receptori de membran i a moleculelor marker
specifice subpopulaiilor limfocitare i altor celule cu rol n rspunsul imun.
Tehnicile de separare prin centrifugare n medii cu diferite densiti (gradient de
densitate), folosesc substane care cresc rata de sedimentare a eritrocitelor: Dextran, FicollOdiston etc.
-

Separarea de Ficoll-Metrizoat (Odiston), se face prin centrifugare, n care se introduc:


o parte din sngele recoltat pe anticoagulant i dou pri Ficoll-Metrizoat (fig. 56).
Centrifugarea timp de 20 de minute la 400 turaii, duce la separarea a patru straturi principale,
precis delimitate:
abcd-

mediu de cultur i plasm sanguin;


strat de forma unui inel alb, format din limfocite i monocite;
stratul de Ficoll-Metrizoat;
sedimentul de hematii i celule moarte.

Fig. 56 Aspectul coloanei nainte i dup centrifugare: 1 nainte de centrifugare sunt dou
straturi: unul superior (S), reprezentat de sngele diluat n mediu, i altul inferior (I), format de
ctre soluia de Ficoll-Metrizoat; 2 dup centrifugare apar cel puin 4 straturi: a- stratul
superior (mediu i plasm sanguin); b- stratul sub form de inel cu limfocite i monocite; csoluia sub form de Ficoll-Metrizoat; d- sedimentul de hematii i celule moarte.

Cu ajutorul unei pipete Pasteur sau a unei pipete cu bul (prelungit cu un tub de
cauciuc pentru a se putea urmri cu uurin toate operaiunile), se elimin stratul superior,
pentru decopertarea inelului limfocitar. Celulele care formeaz inelul alb sunt aspirate cu
ajutorul pipetei bine efilate i introduse ntr-o eprubet de centrifug, care conine mediu de
cultur pentru limfocite. Se vor spla celulele de 3 ori, prin centrifugare (10 minute la 200
turaii/s), n mediu de cultur, dup ultima splare aducndu-se la concentraia dorit. Prin
aceast metod se obine o populaie celular format din aproximativ 90% limfocite i
monocite, iar restul este format din trombocite i rare hematii.
Alte metode de separare sunt utilizate n scop de cercetare i se refer la:
- separarea macrofagelor i monocitelor prin aderarea la sticl;
- separarea macrofagelor dup fagocitarea fierului coloidal, cu ajutorul unui magnet;
- separarea prin fixarea liganzilor la receptorii de pe membran ai limfocitelor, cu
formare de rozete,etc.
Pentru celulele din esuturi, mai ales cele limfatice, fenotipizarea se face cu ajutorul
anticorpilor monoclonali cuplai cu substane fluorescente, iar evidenierea celulelor astfel
marcate se realizeaz prin citometrie n flux sau cu microscopul de fluorescen.
Prin tehnicile cu anticorpi monoclonali se pot stabili att proporiile, ct i numrul de
celule din snge. Astfel au putut fi stabilite valorile normale ale unor markeri mai frecvent
cercetai, din care fac parte CD 2 i CD 3 pentru limfocitele T totale (pan T); CD 4 pentru
limfocitele T-helper; CD 8 pentru limfocitele T-citotoxice/T-supresoare i raportul CD 4:CD 8;
CD 19 i CD 20 pentru limfocitele B totale; CD 16 i CD 56 pentru celulele NK totale. Pentru
caracterizarea imunitii celulare, evaluarea acestor subpopulaii celulare majore are o
importan deosebit att pentru diagnosticul, ct i pentru prognosticul unor afeciuni virale
sau maligne.
Teste cu formare de rozete
Principiul.
Limfocitele, monocitele i macrofagele au receptori de membran capabili s lege
specific diferite structuri care se gsesc fie pe membrana unor hematii, fie a unor bacterii.

Ataarea hematiilor, prin liganzii lor, n jurul limfocitelor care posed receptori pentru acetia
iau forma unor rozete, de unde denumirea de rozetare dat procesului respectiv.
n funcie de natura liganzilor, rozetele pot fi: E, EA, EAC, ES.
Rozetele E
Limfocitele T umane au capacitatea de a lega hematiile de oaie prin receptori E
formnd rozete E totale , de mare sau mic afinitate.
n vederea obinerii unor rezultate comparabile, Comisia Naional de Imunologie a
precizat condiiile standard de rozetare a limfocitului T uman cu hematiile de oaie.
Se lucreaz pe snge venos uman recoltat pe heparin (100 UI/ml snge), urmat de
separarea limfocitelor pe amestec Ficoll-Odiston (3ml amestec i 8ml snge diluat n TFS =
tampon fosfat salin), conform tehnicii descrise la 7.2.1.2.
Tehnica rozetrii
Rozetarea se face n mediu IC, n tuburi de hemoliz cu diametrul de 10m, n duplicat.
Se introduc 50l suspensie de limfocite umane i 100l suspensie hematii de oaie. Se
adaug 100l ser fetal de viel inactivat i adsorbit cu hematii. Centrifugare 5 minute la 100
turaii, incubare 60 minute ntr-o baie de ap la 29 0C (pentru rozetele de mare afinitate) sau
16-24 ore la +40C (pentru rozetele totale).
Citirea i interpretarea rezultatelor.
Se face o resuspendare blnd a suspensiei (prin aspirri uoare cu o pipet Pasteur
cu tetin). Suspendarea se ntinde pe o lam de microscop, se usuc rapid prin nclinare,
apoi fixare cu alcool metilic i colorare cu Giemsa. Se citesc minimum 250 celule limfoide
rozetate i nerozetate i se calculeaz procentul de rozetare. Se consider rozete numai
acelea care au minimum 3 eritrocite aezate la un limfocit.
Se determin procentul de rozete totale (incubare la +4 0C), cel de mare afinitate
(incubare la 290C) i cel de mic afinitate (prin scderea din procentul de rozete totale a
procentului de rozete de mare afinitate).
La om, media valorilor normale este urmtoarea: rozete E totale (limfocite T totale) =
68 2%, din care rozete E de mare afinitate = 43 2% i de mic afinitate = 25 2%.
Rozetele EA
Limfocitele sau monocitele au receptori Fc care leag imunoglobulinele IgG i/sau IgM
(prin fragmentul lor Fc). Dac imunoglobulina are funcie de anticorp pentru hematia de oaie,
atunci se leag prin fragmentul Fab de hematie i prin fragmentul Fc de limfocit. Astfel se
formeaz rozete prin intermediul anticorpilor (rozete EA). Folosind eritrocite de bou i ser
antieritrocite de bou, se pot identifica toate limfocitele cu receptori Fc.
Rozetele EAC

Limfocitele B, n principal, au receptori pentru


complementului, mai ales pentru C3b, astfel, eritrocite

fraciunile