Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
format din hematii i anticorpi antihematie (specifici). Astfel, dac n serul unui bolnav se
caut anticorpi cu ajutorul unui antigen cunoscut, n cazul unui rezultat pozitiv C se va fixa pe
complexul Ag-Ac format, fr a produce modificri vizibile n tubul de reacie. De aceea,
pentru evidenierea fixrii C se adaug n reacie complexul imun format din hematii i
hemolizin (ser antihematii) - numit i sistem indicator deoarece, dac nu s-a format primul
complex (anticorpii lipsind din serul bolnavului) C se va fixa pe acest complex i va produce
ruperea hematiilor (imunohemoliza = rezultat negativ). n cazul n care n serul cercetat exist
anticorpi fa de antigenul cunoscut introdus n reacie nu se va produce hemoliza, C fiind
fixat pe acest complex (RFC = pozitiv).
Acest principiu este reprezentat n urmtoarea schem:
Sistem
de
cerceta
t
Antigen
Compleme
nt
Sistem
indicator
Rezultat
hematii
Lipsa hemolizei
Anticorp x
RFC = pozitiv
Antigen
hemolizin
hematii
x
imunohemoliz
x
Anticorp
hemolizin
RFC =negativ
RFC poate fi lucrat n tuburi sau pe plci de material plastic cu godeuri. Exist mai
multe tehnici pentru efectuarea reaciei de fixare a complementului, din care se desprind dou
metode mai importante: metoda clasic Wassemann, practicat n diagnosticul sifilisului,
brucelozei, tusei convulsive etc. i metoda Bengston care titreaz anticorpii fixatori de
complement pentru diagnosticul tifosului exantematic, rickettsiozelor, al ornitozei i al
leptospirozei pe lng diagnosticul serologic al unor viroze).
Reacia Bordet Wassermann
Se lucreaz n trei eprubete, cu dou cantiti diferite de ser de bolnav.
Schema
Eprubeta
-ser de bolnav (ml)
-antigen B-W (ml)
-complement (ml)
-soluie sal.fiziol. (ml)
1
0,1
0,3
0,3
0,8
2
0,2
0,3
0,3
0,7
3 (martor)
0,2
-0,3
1
-sistem indicator
(hemolitic) (ml)
1,0
1,0
1,0
Incubare 30 min. la 37 C
Citirea se face urmrind apariia hemolizei (rezultat negativ) sau lipsa ei (rezultat
pozitiv).
Tehnica Ida Bengston
Metoda Bengston, adoptat n ara noastr pentru diagnosticul serologic, titreaz
anticorpii fixatori de complement pentru diagnosticul leptospirozelor, rickettsiozelor, infeciilor
cu chlamydii etc.
Tehnica Bengston, n care fiecare din componentele ce intr n reacie este folosit n
volum de 0,2 ml, este aceeai pentru toate afeciunile amintite diferind doar felul antigenului i
modul de interpretare, de aceea se va descrie doar principiul reaciei pentru diagnosticul
serologic al tifosului exantematic, al crui factor etiologic l constituie bacterii din grupul
Rickettsia.
Serul de cercetat recoltat de la bolnav trebuie s fie steril, limpede, fr hematii, se va
inactiva 30 de minute n baie de ap la 560C.
Antigenul rickettsian se va dilua conform indicaiei de pe etichet, astfel nct diluia de
lucru s cuprind 4 uniti antigenice n cei 0,2 ml.
Hemolizina va fi ntotdeauna titrat pentru fiecare reacie astfel ca n 0,2 ml din
aceast diluie s se afle 2 uniti hemolitice.
Suspensia de hematii de berbec 2% proaspt splate.
Alexina (complementul) titrat n aceeai zi n prezena antigenului, este diluat astfel
nct 0,2 ml s conin 2 uniti alexice.
Pentru o prim comparaie se recomand folosirea unui set martor sigur pozitiv i altul
sigur negativ.
Regul. n toate cazurile reaciile serologice se efectueaz pe probe de ser sanguin
perechi. Astfel, de la fiecare bolnav se va recolta snge n primele zile de boal (proba nr. 1),
se va separa serul i se va ine la -20C pn n ziua prelucrrii, iar dup aproximativ 14 zile
se va recolta a doua prob de snge. Cele dou probe se vor lucra concomitent, urmrinduse creterea n dinamic a titrului de anticorpi (putnd fi utilizate reacii serologice cu mai
multe tipuri de antigene bacteriene sau virale pe probele perechi de seruri).
Interpretare: creterea titrului de anticorpi, de cel puin patru ori, n proba a doua de ser
este semnificativ pentru diagnostic. Titrul reaciei este dat de diluia cea mai mare de ser de
bolnav unde se constat absena total a hemolizei.
Particulariti ale tehnicii RFC
n diagnosticul serologic al febrei Q antigenul reprezint o suspensie purificat de
Coxiella burneti, cultivat pe sacul vitelin al embrionului de gin, suspensie din care se face
diluie de lucru conform indicaiei de pe etichet.
n diagnosticul serologic al infeciei cu Chlamydia antigenul este un extract purificat
obinut dintr-o cultur de Chlamydia pe sacul vitelin al oului embrionat.
Pentru diagnosticul leptospirozei este necesar antigenul Leptospira biflexa suspensie
concentrat preparat dintr-o tulpin nepatogen de leptospira.
Tehnica Bradstreet i Taylor, larg aplicat n ultimul timp n infeciile virale, infecii cu
Mycoplasma, febra Q etc. ca metod standard dup tehnica la rece. Aceasta utilizeaz
titrarea complementului n prezena diluiilor de hemolizin n tabl de ah. RFC este
efectuat n plci sau microplci cu godeuri.
(antitoxine) a unei doze cunoscute din toxina difteric, respectiv din toxina eritrogen
streptococic, inoculate intradermic. Aceste reacii vor fi descrise la capitolele care vor trata
diagnosticul n difterie i respectiv n infeciile streptococice.
1.6.5.1. Imunofluorescena
Metoda direct
Anticorpii monospecifici sunt conjugai cu substana fluorescent. Materialul testat
pentru prezena antigenului se etaleaz pe lam, dup care se incubeaz cu anticorpii
marcai. Excesul de anticorpi se ndeprteaz prin splare, preparatul uscat fiind apoi
examinat la microscopul cu fluorescen, unde complexele Ag-Ac formate apar ca zone
fluorescente, uor vizibile (fig. 48).
Metoda indirect
Este frecvent utilizat i comport doi timpi (fig. 49):
-
Iniial aplicat pentru testri de hormoni i enzime, RIA s-a extins i n diagnosticul
bolilor infecioase, fiind una din cele mai sensibile i precise metode de detectare i dozare a
antigenelor i anticorpilor, prin izotopi radioactivi ( 125I, 3H etc.).
Se practic fie marcarea unuia din reactani (antigenul sau anticorpul), fie marcarea
unui ser antiglobulinic care reacioneaz cu complexul imun primar. Radioactivitatea
complexului format se msoar fie n faz lichid, fie n faz solid i este utilizat n principal
pentru detectarea enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice, pentru evidenierea
polizaharidului capsular la pneumococi etc.
n infeciile virale cunoate de asemenea o larg aplicare n: diagnosticul gripei,
infeciilor hepatice i n diagnosticul hepatitelor cu virus B (AgHBs, anticorpi anti-HBs).
Succint, etapele unei dozri radioimunologice (fig.50) sunt urmtoarele:
-
Bile din material plastic, acoperite cu anticorp antiHBs, sunt incubate cu eantioane de
ser de testat. AgHBs, dac este prezent, se fixeaz pe anticorp. Se adaug anticorp antiHBs
marcat 125I, i n timpul celei de-a doua incubri, aceasta se fixeaz pe AgHBs, formnd
Fig. 53 ELISA dublu sandwich. AB anticorpul specific antigenului din proba de cercetat; A
antigenul din prob; AB1 anticorp specific antigenului; AB2-E conjugat antiimunoglobulin
AB1, cu enzima (E)
1
2
3
4
5
6
1,30 1,25 1,20 1,10 1,00 0,70
0,20 0,25 0,30 0,40 0,50 0,80
1
1
1
1
1
1
de cercetat (ser sanguin, saliv etc.) se introduc n godeuri n cantiti identice, astfel ca
lichidele s nu se rspndeasc n afara godeurilor. Dup 24 de ore se msoar diametrele
de inhibiie a soluiilor martor i se traseaz curba standard (fig. 55) i totodat diametrele de
inhibiie ale probelor (unde se face media).
Experienele mai frecvent fcute au fost cele cu tu de China. Dup diferite intervale de timp
(30, 60, 120 minute), sacrificarea animalului i efectuarea de seciuni histologice, au
demonstrat care sunt organele mai bogate n macrofage (ganglionii limfatici, splina, ficatul
etc.), cuprinse n sistemul mononuclear fagocitar.
Testul NBT (Nitrobluetetrazolium)
Este un test frecvent utilizat pentru a evidenia activitatea enzimatic a fagocitelor, mai
ales a PMN, celule generatoare de peroxizi de hidrogen i radicali activi ai oxigenului.
Principiul. Proprietatea fagocitelor de a ngloba colorantul n vacuole fagocitare, unde
sub influena unor nucleotid-oxidaze are loc reducerea acestora ntr-un precipitat insolubil de
formazan (albastru-negru), evideniabil prin coloraia Giemsa.
Metoda cu snge integral, se practic recoltnd 1-2 ml snge ntr-o sticlu cu
anticoagulant (2 mg Na EDTA uscat). ntr-o eprubet se amestec:
- 0,08 ml soluie tampon Michaelis pH 7,4;
- 0,02 ml soluie NBT 1%;
- 0,1 ml snge recoltat pe anticoagulant.
Dup incubarea amestecului la 37C, timp de 30 de minute, se agit i se fac frotiuri:
uscate, fixate cu alcool metilic i colorate Giemsa.
Se examineaz cel puin 100 PMN i se difereniaz procentual celulele cu depozite de
formazan (NBT pozitive).
La o persoan sntoas, fagocitele NBT-pozitive, reprezint 7-14%. Odat cu
creterea metabolismului oxidativ al neutrofilelor stimulate prin infecii bacteriene, procentul
lor crete mult. n infeciile virale sau stri febrile de origine neinfecioas, valorile se menin
n limite normale.
Chemiluminiscena
O metod alternativ de apreciere a metabolismului oxidativ al PMN este cea prin care
se evideniaz fenomenul de chemiluminiscen cu ajutorul unor aparate (chemiluminometre).
Radiaiile luminoase (chemiluminiscena) generate n timpul fagocitozei sunt
amplificate prin utilizarea unei substane intermediare luminol i/sau lucigenin care prin
oxidare emit unde luminoase i acestea pot fi convertite de aparate, n semnale electrice,
msurate n milivoli.
Prin aceste metode de apreciere a activitii PMN i a capacitii bactericide a acestor
celule se pot evidenia deficienele funcionale ale fagocitelor, n principal deficitul activitii
bactericide, care se traduce clinic prin infecii repetate, rebele la tratament, care afecteaz
mai ales esuturile profunde, determinnd modificri cu aspect de infiltrate granulocitare (boli
cronice granulomatoase).
Exist mai multe metode experimentale care utilizeaz limfocite din snge.
Evaluarea numrului absolut al limfocitelor i monocitelor
Normal, numrul absolut al limfocitelor sanguine este de 1500-3000/mm, iar al
monocitelor (macrofage tinere) de 300-600/mm.
Cunoscnd procentul acestora n tabloul sanguin, se poate uor calcula numrul absolut,
raportat la numrul total al leucocitelor/mm.
Actual, identificarea i evaluarea subpopulaiilor limfocitare T, B i a celulelor NK din
sngele periferic i din esuturi, apeleaz la anticorpii monoclonali i la metode de citometrie
n flux care pot identifica aceste celule pe baza markerilor i a receptorilor specifici fiecrei
populaii i subpopulaii limfocitare.
Fenotipizarea sau imunofenotipizarea limfocitelor T i B se poate face pe suspensii
unicelulare din snge, cu ajutorul anticorpilor monoclonali, fa de markerii: CD 2, CD 3, CD
4, CD 19, CD 20 etc. Pentru celulele NK se testeaz markerii: CD 16 i CD 56.
Metodele de separare a limfocitelor i macrofagelor
Pentru cercetarea in vitro a unor mecanisme care intervin n cooperarea celular i
reglarea rspunsului imun este necesar obinerea claselor i subclaselor de celule. Pentru
acest scop, au fost imaginate diverse metode de separare a celulelor, dintre care se desprind:
tehnicile de separare a celulelor bazate pe diferene de sedimentare;
separarea celulelor pe baza unor atribute biologice particulare;
metode de separare pe baza unor receptori de membran i a moleculelor marker
specifice subpopulaiilor limfocitare i altor celule cu rol n rspunsul imun.
Tehnicile de separare prin centrifugare n medii cu diferite densiti (gradient de
densitate), folosesc substane care cresc rata de sedimentare a eritrocitelor: Dextran, FicollOdiston etc.
-
Fig. 56 Aspectul coloanei nainte i dup centrifugare: 1 nainte de centrifugare sunt dou
straturi: unul superior (S), reprezentat de sngele diluat n mediu, i altul inferior (I), format de
ctre soluia de Ficoll-Metrizoat; 2 dup centrifugare apar cel puin 4 straturi: a- stratul
superior (mediu i plasm sanguin); b- stratul sub form de inel cu limfocite i monocite; csoluia sub form de Ficoll-Metrizoat; d- sedimentul de hematii i celule moarte.
Cu ajutorul unei pipete Pasteur sau a unei pipete cu bul (prelungit cu un tub de
cauciuc pentru a se putea urmri cu uurin toate operaiunile), se elimin stratul superior,
pentru decopertarea inelului limfocitar. Celulele care formeaz inelul alb sunt aspirate cu
ajutorul pipetei bine efilate i introduse ntr-o eprubet de centrifug, care conine mediu de
cultur pentru limfocite. Se vor spla celulele de 3 ori, prin centrifugare (10 minute la 200
turaii/s), n mediu de cultur, dup ultima splare aducndu-se la concentraia dorit. Prin
aceast metod se obine o populaie celular format din aproximativ 90% limfocite i
monocite, iar restul este format din trombocite i rare hematii.
Alte metode de separare sunt utilizate n scop de cercetare i se refer la:
- separarea macrofagelor i monocitelor prin aderarea la sticl;
- separarea macrofagelor dup fagocitarea fierului coloidal, cu ajutorul unui magnet;
- separarea prin fixarea liganzilor la receptorii de pe membran ai limfocitelor, cu
formare de rozete,etc.
Pentru celulele din esuturi, mai ales cele limfatice, fenotipizarea se face cu ajutorul
anticorpilor monoclonali cuplai cu substane fluorescente, iar evidenierea celulelor astfel
marcate se realizeaz prin citometrie n flux sau cu microscopul de fluorescen.
Prin tehnicile cu anticorpi monoclonali se pot stabili att proporiile, ct i numrul de
celule din snge. Astfel au putut fi stabilite valorile normale ale unor markeri mai frecvent
cercetai, din care fac parte CD 2 i CD 3 pentru limfocitele T totale (pan T); CD 4 pentru
limfocitele T-helper; CD 8 pentru limfocitele T-citotoxice/T-supresoare i raportul CD 4:CD 8;
CD 19 i CD 20 pentru limfocitele B totale; CD 16 i CD 56 pentru celulele NK totale. Pentru
caracterizarea imunitii celulare, evaluarea acestor subpopulaii celulare majore are o
importan deosebit att pentru diagnosticul, ct i pentru prognosticul unor afeciuni virale
sau maligne.
Teste cu formare de rozete
Principiul.
Limfocitele, monocitele i macrofagele au receptori de membran capabili s lege
specific diferite structuri care se gsesc fie pe membrana unor hematii, fie a unor bacterii.
Ataarea hematiilor, prin liganzii lor, n jurul limfocitelor care posed receptori pentru acetia
iau forma unor rozete, de unde denumirea de rozetare dat procesului respectiv.
n funcie de natura liganzilor, rozetele pot fi: E, EA, EAC, ES.
Rozetele E
Limfocitele T umane au capacitatea de a lega hematiile de oaie prin receptori E
formnd rozete E totale , de mare sau mic afinitate.
n vederea obinerii unor rezultate comparabile, Comisia Naional de Imunologie a
precizat condiiile standard de rozetare a limfocitului T uman cu hematiile de oaie.
Se lucreaz pe snge venos uman recoltat pe heparin (100 UI/ml snge), urmat de
separarea limfocitelor pe amestec Ficoll-Odiston (3ml amestec i 8ml snge diluat n TFS =
tampon fosfat salin), conform tehnicii descrise la 7.2.1.2.
Tehnica rozetrii
Rozetarea se face n mediu IC, n tuburi de hemoliz cu diametrul de 10m, n duplicat.
Se introduc 50l suspensie de limfocite umane i 100l suspensie hematii de oaie. Se
adaug 100l ser fetal de viel inactivat i adsorbit cu hematii. Centrifugare 5 minute la 100
turaii, incubare 60 minute ntr-o baie de ap la 29 0C (pentru rozetele de mare afinitate) sau
16-24 ore la +40C (pentru rozetele totale).
Citirea i interpretarea rezultatelor.
Se face o resuspendare blnd a suspensiei (prin aspirri uoare cu o pipet Pasteur
cu tetin). Suspendarea se ntinde pe o lam de microscop, se usuc rapid prin nclinare,
apoi fixare cu alcool metilic i colorare cu Giemsa. Se citesc minimum 250 celule limfoide
rozetate i nerozetate i se calculeaz procentul de rozetare. Se consider rozete numai
acelea care au minimum 3 eritrocite aezate la un limfocit.
Se determin procentul de rozete totale (incubare la +4 0C), cel de mare afinitate
(incubare la 290C) i cel de mic afinitate (prin scderea din procentul de rozete totale a
procentului de rozete de mare afinitate).
La om, media valorilor normale este urmtoarea: rozete E totale (limfocite T totale) =
68 2%, din care rozete E de mare afinitate = 43 2% i de mic afinitate = 25 2%.
Rozetele EA
Limfocitele sau monocitele au receptori Fc care leag imunoglobulinele IgG i/sau IgM
(prin fragmentul lor Fc). Dac imunoglobulina are funcie de anticorp pentru hematia de oaie,
atunci se leag prin fragmentul Fab de hematie i prin fragmentul Fc de limfocit. Astfel se
formeaz rozete prin intermediul anticorpilor (rozete EA). Folosind eritrocite de bou i ser
antieritrocite de bou, se pot identifica toate limfocitele cu receptori Fc.
Rozetele EAC
fraciunile