TEHNICI DE IMUNOHISTOCHIMIE

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE CRAIOVA

I. PRELUCRAREA MATERIALULUI BIOLOGIC PENTRU
STUDII DE IMUNOHISTOCHIMIE

A. Fixarea
B. Prezervarea şi pregătirea pentru secţionare
C. Secţionarea şi arhivarea
A. Fixarea ţesutului

• Previne autoliza şi atacul bacterian

– Modificările anoxice, leziunile mitocondriale apar în 10
minute de la moartea ţesutului
– Enzimele ciclului fosforilării oxidative dispar în prima oră
• Menţine structura ţesuturillor aproape de statusul “in vivo”
• Prin acţiunile lor, fixatorii “maschează” situsurile antigenice
(epitopii) recunoscute de anticorpi
– Există anticorpi sintetizaţi pentru epitopii fixaţi, dar au
utilizare limitată
A. Tipuri de fixatiori (în funcţie de acţiune):

• Coagulanţi (denaturanţi): metanol, etanol, acid acetic

• Cu funcţie aditivă: aldehide, carbodiamide
• Cu funcţie mixtă: cloruri mercurice
• Agenţi oxidanţi: ioni metalici, tetraoxid osmic
• Factori fizici: căldură, microunde
• Alte structuri: fixatorul HOPE
• Aldehide: formaldehidă, paraformaldehidă, glutaraldehida
A. Avantajele şi dezavantajele fixării
• Formaldehida şi paraformaldehida sunt cei mai utilizaţi fixativi pentru
imunohistochimie, ADN-ul putând fi recuperat pentru analize genetice.
• HOPE (Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect)
este un alternativ nou al formalinei ce nu necesită recuperare antigenică şi
permite şi efectuarea de analize genetice pe ţesutul de studiat.
• Soluţia Bouin (formalină şi acid picric) este un fixativ cu penetranţă rapidă.
Lipidele sunt afectate.
• Glutaraldehida are o penetranţă redusă fiind folosită pentru piesele de
dimensiuni mici. Se foloseşte în special pentru ME.
• Tetraoxidul osmic denaturează complet proteinele, se foloseşte pentru
histochimie.
• Clorurile mercurice sunt indicate pentru prezervarea antigenelor citoplasmatice.
• Alcoolurile permit şi ele o bună prezervare a antigenicităţii, şi de obicei, nu
necesită recuperare antigenică.
• Acetona menţine bine epitopii, pătrunde însă greu în ţesut; se foloseşte în
special pentru secţiunile îngheţate sau frotiuri.
A. Mecanismul fixării

• Unul din cei mai cunoscuţi fixatori, formalina, fixează prin

formarea de punţi metilenice între reziduurile peptidice
Utilizarea largă a formaldehidei pentru fixare are o serie de
avantaje:
• cost redus;
• nu întăreşte excesiv piesele;
• deformează (contractă) puţin piesele;
• penetrează şi conservă bine sângele şi ţesutul adipos;
• culorile normale sunt mai bine conservate decât cu alţi fixatori;
• fixează bine proteinele, inhibând astfel pierderea glicogenului
din ţesut în soluţii apoase;
• se utilizează şi pentru secţiunile la gheaţă şi evidenţierea
lipidelor; (secţiunile la gheaţă se taie mai bine).
• Printre dezavantajele fixării în formaldehidă menţionăm:
• reduce cantitatea de ADN/ARN în celule ;
• vaporii de formaldehidă sunt supărători şi iritanţi, în special
pentru ochi şi căile respiratorii;
• poate provoca reacţii alergice pe piele (mâini);
• fiind un fixator blând, uneori nu fixează adecvat structurile
citoplasmatice pentru includerea la parafină; postfixarea şi
deshidratarea în alcool 80% completează procesul de fixare;
• este inferior alcoolului în fixarea fierului şi a altor pigmenţi;
• poate produce în ţesuturi precipitate neplăcute negre-brun
prin descompunerea (lăcuirea) hemoglobinei; pigmentul
poate fi confundat cu cel din malarie sau cu hemosiderina.
A. Alternativele fixării clasice

• Crioprotecţia şi îngheţarea ţesutului

– Nu denaturează acizii nucleici. Se pretează şi pentru analize
genetice (ADN, ARN) în paralel cu IHC
– Nu este necesară recuperarea antigenică
– Ultrastructura ţesutului este inferioară fixării în formalină şi
HOPE
• Fixarea în HOPE
– Formula cuprinde un tampon de protecţie organic şi acetona
ca solvent
– Nu este cunoscut mecanismul exact de fixare, însă nu
formează punţi aditive între aminoacizi.
– Nu denaturează acizii nucleici. Se pretează şi pentru analize
genetice (ADN, ARN) în paralel cu IHC
– Menţine ultrastructura ţesutului
– Nu este necesară recuperarea antigenică
B. Demascarea antigenică

• Este procesul de “recuperare” a structurii situsurilor antigenice

blocate în timpul fixării
• Metode de demascare antigenică:
– Fierbere simplă în soluţii tampon (citrat pH6, EDTA pH9)
– Fierbere în vase sub presiune în soluţii tampon;
– Alternativ pentru fierberea simplă, se poate face o incubare la
80°C peste noapte în aceleaşi soluţii tampon ca mai sus
– Digestie enzimatică (proteinază K, tripsină) se face 5 minute la
37°C
– Digestie chimică (acid formic). Specifică pentru Ab (amiloid),
se incubează secţiunile în acid formic 90% timp de 5 minute
C. Prezervarea şi secţionarea ţesutului

• Clasic, biopsiile sau fragmentele de țesut sunt fixate în

formalină neutră tamponată, apoi fixativul este îndepărtat
prin spălare în apă, deshidratat (în alcool etilic), clarificat în
xilen sau cloroform), după care este inclus în parafină.
• Secţionarea se face cu ajutorul microtomului, la grosimi
variabile, de cel puţin 1 μm (cu elemente Peltier de răcire
montate sub ţesut).
• Tehnica este ideală pentru procedeele clasice de
microscopie în care secţionarea subţire duce la o bună
vizualizare cu obiective mari
• Ţesutul se poate post-fixa în glutaraldehidă pentru
microscopie electronică.
C. Prezervarea şi secţionarea ţesutului

• Alternativ, biopsiile pot fi fixate, spălate de formalină şi tăiate

direct, fără includere la parafină.
• Secţionarea se face cu vibratomul, putându-se realiza
secţiuni între 20 -150 μm sau chiar mai groase.
• Procedeul este util pentru microscopia confocală şi pentru
urmărirea activităţii metabolice pe celule integre (în acest
caz ţesutul este nefixat).
• Principalul dezavantaj al tehnicii constă în necesitatea
prelucrării rapide a ţesutului şi limitarea arhivării.
C. Prezervarea şi secţionarea ţesutului

• Crioprotecţia şi îngheţarea ţesutului constituie o metodă cu

aceeaşi scară de utilizare ca fixarea clasică şi includerea în
parafină
• Principalul avantaj al tehnicii este păstrarea integrităţii
situsurilor antigenice
• Secţiunile se realizează cu ajutorul criotomului, grosimile
fiind de ordinul zecilor de microni
• Principalul dezavantaj al tehnicii este alterarea morfologiei
în timpul îngheţării
Procesarea clasică pentru imunohistochimie

• Secţionare a blocului de parafină şi ataşarea pe lame

• Deparafinarea (solvenţi organici: xilen, benzen)

• Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

• Blocarea enzimelor endogene

• Blocarea situsurilor antigenice nespecifice (inclusiv reziduurile Fc)

• Blocarea biotinei endogene

• Incubare cu primul anticorp (anticorpu primar)

• Incubare cu anticorpul secundar şi sistemul de detecţie

Blocarea potenţialelor surse de semnal fals

• Blocarea enzimelor endogene

– Peroxidaza se inhibă prin saturare cu apă oxigenată 3%
– Fosfataza alcalină este inactivată prin demascare cu fierbere
sau adăugarea de levamisol
• Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
– Se face prin incubare cu ser heterolog faţă de primul anticorp
sau lapte degresat în concentraţie de 1-5%
– Pentru blocarea situsurilor Fc se pot utiliza seruri cu fragmente
Fab
• Blocarea biotinei endogene
– În organe bogate în biotină endogenă (ficat, rinichi, ţesut
limfoid)
– Se face prin incubare succesivă cu streptavidină şi apoi
saturare cu biotină (biotina are un singur situs de legare)
– Biotina endogenă se demască şi ea în cazul fierberii cu EDTA
Antigene

• Un antigen este un element străin “self-ului” fiecărui

organism, având proprietatea de a stimula formarea de
anticorpi, şi apoi de a se lega la acei anticorpi.

• De obicei, antigenele sunt proteine sau glicoproteine cu

masă moleculară mare.

• Un antigen ce determină un răspuns imun puternic se

numeşte puternic imunogen.
Antigene

• Epitopul reprezintă un situs de pe suprafaţa antigenului

faţă de care un anticorp complementar poate prezenta o
reactivitate specifică.
Anticorpii

• Anticorpul este o imunoglobulină capabilă de o

reactivitate specifică faţă de antigenul care a declanşat
sinteza sa.

• Anticorpii sunt produşi de limfocitele B ca răspuns la

invazia elementelor străine în organism (bacterii,
virusuri, etc.)

• Specia de limfocite B responsabile de producerea

anticorpilor se numesc plasmocite, iar fiecare plasmocit
produce un anticorp cu o specificitate unică.
Anticorpii

• Fiecare anticorp tipic este alcătuit din patru lanțuri

polipeptide unite într-o moleculă în formă de Y:
– Două lanţuri “grele”
– Două lanţuri “uşoare”
Structura anticorpilor

• Funcţional, anticorpul tipic în formă de Y este compus din 2

regiuni variabile de legare a antigenului (Fab) şi porţiunea de
activare a complementului (Fc).
• Porţiunea din fragmentul Fab direct implicată în legarea epitopului
se numeşte paratop.
Structura anticorpilor

• Pe baza structurii fragmentului Fc, se deosebesc 5 clase majore

de anticorpi: IgG, IgM, IgA, IgD şi IgE.

• Lanţurile grele ale imunoglobulinelor sunt de mai multe tipuri: γ

(gama), μ (miu), α (alfa), δ (delta) şi ε (epsilon).
• Lanţurile uşoare pot fi clasificate ca lanţuri κ (kapa) sau λ
(lambda).
• Datorită prezenţei sale majoritare în ser şi a perioadei
crescute de înjumătăţire, în IHC, IgG este cea mai frecvent
folosită clasă de imunoglobuline.
Reacţia antigen-anticorp

• Anticorpii leagă antigenele prin intermediul regiunilor variabile.

Aceste legături sunt asigurate de cele 4 forţe non-covalente
(hidrofobice, ionice, Van der Waals sau punţi de hidrogen).

• Afinitatea este un indice al forţei de legătură dintre un anticorp

monovalent şi un epitop.

• Aviditatea este cea care descrie afinitatea funcţională, şi este de

fapt o măsură a afinităţii totale de legare dintre un anticorp şi un
antigen.
Reacţia antigen-anticorp

• Rata de reacţie antigen-anticorp variază în funcţie de temperatura

şi pH-ul soluţiilor tampon şi diluenţii folosiţi.
• Creşterea temperaturilor de incubare duce la creşterea vitezei de
legare.
• pH-ul tamponului şi conţinutul său ionic poate afecta încărcarea
aminoacizilor aflaţi în constituţia anticorpilor şi antigenelor.
Producerea anticorpilor

• În mod clasic, anticorpii sunt produşi prin imunizarea unor

animale (iepure, şoarece) faţă de antigenul purificat.
Animalele răspund prin producerea de anticorpi ce recunosc
specific aceste antigene.

• Anticorpii pot fi policlonali sau monoclonali.

Producerea anticorpilor policlonali

• Anticorpii policlonali se prezintă ca diferite tipuri de Ig

produse de către mai multe clone de plasmocite şi recunosc
epitopi variaţi ai antigenului.
• Deoarece recunosc o clasă de epitopi, au o toleranţă
crescută la variaţii mici de structură a antigenului.
• Iepurele este cel mai folosit animale pentru producerea
serurilor imune.
Producerea anticorpilor policlonali

antigen

Iepurele este injectat intradermic sau subcutanat cu

antigenul purificat.
Producerea anticorpilor policlonali

anticorpi

Y
Y
Y

Sistemul imun al iepurelui produce anticorpi specifici

antigenului injectat.
Producerea anticorpilor policlonali

Când se înregistrază producerea maximală de Ig,

sângele este recoltat de la nivelul urechii.
Producerea anticorpilor policlonali

Y
Y Y
Y Y
Y

Hematiile şi fibrinogenul sunt eliminate, antiserul se

purifică.
Producerea anticorpilor policlonali

• Anticorpii policlonali sunt purificaţi fie prin purificare proteică

sau prin cromatografie cu afinitate antigenică.
• Purificarea proteică elimină restul proteinelor serice dar nu
elimină fracţiunea de imunoglobuline non-specifice.
• Cromatografia prin afinitate antigenică elimină fracţiunile de
Ig non-specifice prin capturarea lor pe antigene imobilizate.
Producerea anticorpilor monoclonali

• Anticorpii monoclonali sunt derivaţi dintr-o singură clonă de

limfocite B şi sunt produşi sub forma unei singure clase de
imunoglobuline.
• Limfocitele B specifice sunt fuzionate cu celule imortalizate
(mielom) şi formează un hibridom.
• Celulele hibride se multiplică indefinit şi produc în mod continuu
anticorpul monoclonal specific.
• Anticorpii monoclonali recţionează cu un anumit epitop al
antigenului (fond redus).
• Acest fapt îi face însă vulnerabili la prelucrarea chimică a
ţesutului (fixare).
• Pentru imunohistochimie, anticorpii monoclonali au
o serie de avantaje importante faţă de anticorpii
policlonali:
• înalta omogenitate,
• absenţa fracţiunilor de imunoglobuline nespecifice,
• uşurinţa de caracterizare antigenică
• lipsa variabilităţii între diferite loturi de producţie.
Producerea anticorpilor monoclonali

antigen

Şoarecele este injectat intradermic sau subcutanat cu

antigenul purificat.
Producerea anticorpilor monoclonali

anticorpi

Y Y
Y

Sistemul său imun produce anticorpi specifici antigenului

injectat.
Producerea anticorpilor monoclonali

splină

Limfocite B

Limfocite B producătoare de anticorpi sunt recoltate din

splină.
Producerea anticorpilor monoclonali

Celule mielomatoase Limfocite B

Limfocite B sunt fuzionate in vitro cu celulele mielomatoase

rezultând celule hibride imortalizate sau hibridoame.
Producerea anticorpilor monoclonali

Hibridoamele produc la infinit copii identice ale unui

anticorp.
Producerea anticorpilor monoclonali

A. Hibridoamele sunt transplantate în cavitatea peritoneală a

unor şoareci, iar anticorpii produşi sunt recoltaţi ca lichid de
ascită.
Producerea anticorpilor monoclonali

B. Hibridoamele sunt cultivate pe medii de cultură, iar

anticorpii produşi sunt preluaţi sub formă de supernatant.
 ANTICORPII PRIMARI

• Sunt anticorpii folosiţi la detecţia antigenelor de interes.

• Sunt disponibili în formă concentrată sau prediluată.

• Fişa tehnică a anticorpului detaliază de obicei diluţiile

recomandate pentru diferite procedee. De multe ori însă este
necesară optimizarea în fiecare laborator.

• Titrul anticorpului este cea mai mare diluţie ce duce la o

marcare specifică a structurilor de interes cu o marcare de fond
minimă.
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

1. Tehnica directă

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp legat de enzimă

•Detecţia chimică
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

2. Tehnica indirectă în doi paşi

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp

•Incubare cu anticorpul secundar legat cu enzima

•Detecţia chimică
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

3. Tehnica indirectă în trei paşi

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp

•Incubare cu primul anticorp secundar legat cu enzima

•Incubare cu al doilea anticorp secundar legat cu enzima

•Detecţia chimică
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

4. Tehnica enzimă / anti-enzimă

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp

•Incubare cu primul anticorp secundar de legătură

•Incubare cu un complex anticorp enzimă / anti-enzimă

•Detecţia chimică
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

5. Tehnica marcării cu particule de aur

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp

•Incubare cu primul anticorp secundar marcat cu particule de aur

•Preparare pentru EM
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

6. Tehnica complexului avidină - biotină

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp

•Incubare cu anticorpul secundar biotinilat

•Prepararea complexului AB-enzimă

•Incubarea cu complexul avidină-biotină-enzimă

•Detecţie chimică
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

7. Tehnica avidinei etichetate (LAB şi LSAB)

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp

•Incubare cu anticorpul secundar biotinilat

•Incubarea cu complexul avidină-biotină-enzimă

•Detecţie chimică
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

8. Tehnica prin amplificare polimerică (En Vision)

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)

•Blocarea enzimelor endogene

•Incubare cu primul anticorp

•Incubare cu anticorpul secundar complexat cu polimer-

enzimă

•Detecţie chimică
DETECŢIA CHIMICĂ A SEMNALULUI ÎN IHC

9. Amplificarea catalizată a semnalului (CSA)

•Clarificare (solvenţi organici)

•Hidratare (alcool în concentraţie descrescătoare)
•Blocarea enzimelor endogene
•Incubare cu primul anticorp
•Incubare cu anticorpul secundar biotinilat
•Incubarea cu complexul avidină-biotină-enzimă
•Precipitarea tiramidei biotinilate în prezenţa H2O2
•Incubarea cu complexul avidină-biotină-enzimă
•Detecţie chimică
DETECŢIA FLUORESCENTĂ A SEMNALULUI ÎN
IHC

1. Tehnici directe sau indirecte

2. Tehnica ABC

3. Amplificarea catalizată a semnalului (CSA)

4. Marcarea cu nano-particule fluorescente

(Quantum-dots Invitrogen)
DETECŢIA CHIMICĂ – ENZIME ŞI SUBSTRATURI
 PRACTICA OPTIMIZĂRII ÎN IHC

• Alegerea anticorpilor primari:

– clonalitate
– puritate,
– reactivitate încrucişată
– specificitate în funcţie de fixatorul folosit
– diluţii optime

• Alegerea metodei de demascare antigenică

• Stabilirea sistemului de detecţie optim
• Stabilirea secvenţei de lucru (pentru detecţiile
multiple)
 I: Optimizarea diluţiei unui anticorp

• Se caută în literatură metodele de demascare

antigenică folosite
• Se realizează diluţii (de obicei în scară logaritmică)
în cadrul unui sistem standardizat de detecţie
secundară şi vizualizare (DAB)
• Este esenţial ca toate variantele de reacţie
(recuperare antigenică şi diluţii) să se desfăşoare în
acelaşi timp.
• Interpretarea obiectivă a rezultatelor (semnal –
fond)
 I: Optimizarea diluţiei unui anticorp

VEGF, 1/100 VEGF, 1/400 VEGF, 1/800

 II: Problema unui singur situs de detectat

• F VIII este un marker antigenic endotelial sensibil (fixare,

pierderea endoteliului în patologie, etc.)

DAB
 II: Problema unui singur situs de detectat

• O metodă de detecţie cu precipitare accentuată poate fi

de ajutor.

•IHC pentru F VIII.

NBT
 II: Problema unui singur situs de detectat

• Un sistem de detecţie sensibil este o variantă elegantă

dar costisitoare.

•IHC pentru F VIII.

Tiramidă - DAB
 II: Problema unui singur situs de detectat

• O soluţie practică în cazul în care există anticorpi pentru

epitopi localizaţi pe aceeaşi structră de identificat –
cocktail de anticorpi primari.
FVIII + CD31+ CD34

DAB
 III: Problema unui epitop dificil de vizualizat

• Optimizarea în cazul unui epitop cu expresie

scăzută (Ex: Limfocitele CD4+)

CD4, diluţie recomandată. CD4, diluţie recomandată. Tiramidă / AEC

ABC / DAB
 IV: Problema detecţiei multiple simultane

• Alegerea anticorpilor primari

– Speciile în care au fost dezvoltaţi să fie diferite
– Fixarea în funcţie de afinitatea pentru materialul prelucrat
(formalină, crioprotecţie)

• Optimizarea individuală a diluţiei anticorpilor (DAB)

• Alegerea sistemelor de detecţie şi a secvenţei de
reacţie:
– Abundenţa epitopilor
– Necesitatea amplificării semnalului (ABC, TSA)
– Blocarea biotinei (endo- şi exogene)
– Blocarea enzimelor (endo- şi exogene)
– Alegerea enzimelor şi a substraturilor
 IV: Problema detecţiei multiple simultane

• Optimizarea individuală a anticorpilor (DAB).

• Alegerea sistemelor de detecţie multiplă.

Limf. B Limf. T
IV: Problema detecţiei multiple simultane

Limf. T/B