__________________

Aatomie-Patologica
PROCEDURA OPERAIONAL
IMUNOHISTOCHIMIE
Ediia: 1
Nr.de ex.: 3
Revizia: -
Nr.de ex. : -
COD PO
Pagina _1___ din
13
Exemplar nr.: 1
SCOP
Diagnostic histopatologic de nalt performan
DESCRIEREA PROCEDURII
1. Generalitati:
Principiu: Tehnicile de imunohistochimie au la baz reacia antigen-
anticorp, antigenul urmrit afndu-se n materialul bioptic, iar anticorpii
utilizai n scopul evidenierii acestora sunt comercializai sub diverse forme
mono- sau policlonali, concentrai sau diluai (gata de a f utilizai ready-to-
use). Situsul legrii cu anticorpul poate f identifcat fe prin legarea direct a
antigenului de un anticorp marcat, deci vizibil (de exemplu fuorescent), fe
printr-o metod indirect de legare, prin intermediul unui lan de alte reacii,
cu anticorpi secundari marcai prin reacie indirect n 2 sau mai multe faze.
Ultima metod este folosit n laboratorul nostru i folosete un substrat
cromogen care este ataat la anticorpul secundar. Anticorpul primar este
nemarcat, de acesta se leag un anticorp secundar marcat cu peroxidaz, de
care este legat un sistem de relevare. Aceast tehnic este mai sensibil
deoarece permite vizualizarea antigenelor existente n concentraii mici.
2. Continutul procedurii operationale:
Medicul anatomo-patolog solicit aceast tehnic special n cazurile
difcil de soluionat, pe lame selecionate, pentru completarea diagnosticului
histopatologic din coloraia uzual (HE) i/sau histochimice fnaliznd astfel
diagnosticul.
Condiia primordial pentru reuita reaciilor imunohistochimice este
fxarea corect a preparatului bioptic, astfel nct epitopii (situsurile antigenice)
1

__________________
Aatomie-Patologica
PROCEDURA OPERAIONAL
IMUNOHISTOCHIMIE
Ediia: 1
Nr.de ex.: 3
Revizia: -
Nr.de ex. : -
COD PO
Pagina _2___ din
13
Exemplar nr.: 1
s nu fe distrui sau inactivai. Fixarea optim dureaz 24 de ore; fxarea care
depete 48 de ore inactiveaz majoritatea epitopilor, determinnd reacii fals
negative. Fixatorul optim este formolul tamponat 10%.
n continuare, paii de prelucrare histopatologic sunt cei obinuii:
includerea se face n parafna histologic, secionarea la microtom n seciuni
subiri de 4 , urmate de deparafnare complet i rehidratare.
3. Protocolul de imunohitochimie
Asistentul de laborator prelucreaz materialul bioptic, secioneaz blocul
de parafn selecionat pentru investigaiile imunohistochimice i realizeaz
corect tehnica de colorarea imunohistochimic. Medicul anatomo-patolog
examineaz lamele la microscop i stabilete diagnosticul histopatologic fnal n
coroborare cu coloraia uzual (i/sau coloraii speciale histochimice), respectiv
furnizeaz informaii eseniale oncologului (chimioterapeut) privind statusul
hormonal al diverselor tumori sau supraexpresia unor oncoproteine, cu impact
decisiv n strategia terapeutic adjuvant din domeniul oncopatologiei.
Seciunile la parafn se aplic pe lame special tratate (ncrcate
electrostatic sau silanate), cu o mare adezivitate, n majoritatea cazurilor
tehnica impunnd metode de relevare termic a epitopilor.
Lamele se pun la deparafnat in toluen 1 h la termostat;
Se trec prin bi de alcooli de concentraie descrescnd (100%, 96%,
80%) cte 5 min;
Se aduc lamele la ap;
n funcie de tipul anticorpului i specifcaiile tehnice ale productorului
este necesar sau nu (se trece la punctul 8) pretratarea enzimatic
(tripsin 5 min, apoi se trece la punctul 8) sau termic a seciunilor;
Pretratarea termic presupune imersionarea seciunilor n solutie Target
Retrieval (pH = 6 sau 9) prealabil nclzit n cuptorul cu microunde la
95 grade (se controleaza cu termometrul de laborator) 20 minute la 600
W;
2

__________________
Aatomie-Patologica
PROCEDURA OPERAIONAL
IMUNOHISTOCHIMIE
Ediia: 1
Nr.de ex.: 3
Revizia: -
Nr.de ex. : -
COD PO
Pagina _3___ din
13
Exemplar nr.: 1
Se las la rcit pn la temperatura camerei;
Se scot i se spal n ap distilat;
Se trec n tampon TRIS 10 minute;
Se terg lamele de excesul de tampon, se marcheaza seciunea cu un
creion special;
Se pun ntr-un mediu umed si se acoper fecare seciune cu o picatura
de peroxid pentru blocarea peroxidazei endogene 5 min;
Se scurg de peroxid i se introduc din nou n tampon TRIS ca s se spele
i apoi se las ntr-un recipient cu tampon curat TRIS (5 min);
Incubarea lamelor cu anticorpul primar ntre 10 min i 30 min, n
functie de instruciunile productorului;
Se scurg de anticorp i se spal ntr-un recipient cu tampon TRIS i se
las n tampon curat 5 min;
se pune Link (picatura galben) peste seciunile ncercuite cu marker
special, lamele se menin n mediu umed 10 min;
Se spal n tampon TRIS i apoi se las 5 min n tampon curat;
Se terg de tampon i se pune Streptavidin (picatura roie) peste
seciunile ncercuite cu marker special, lamele se menin n mediu umed
10 min;
Se spal cu tampon TRIS i se las 5 min n tampon curat;
Se aplic DAB (cromogenul) peste seciunile ncercuite cu marker special,
lamele se menin n mediu umed 10 min;
Se spal n ap distilat i apoi se contracoloreaz cu hematolixin 1-2
min;
Seciunile se deshidrateaz obinuit (acooli de concentraie cresctoare
80%, 96%. 100% - 5 min in fecare;
Se monteaz i se examineaz la microscop
- materialului biopsic (Anexa 3) din incaperea unda s-a efectuat examenul
extemporaneu si le duce in sala unde medicul anatomopatolog examineaza la
microscop;
- medicul anatomopatolog examineaz la microscop seciunile efectuate, noteaz
pe buletinul de nsoire al piesei diagnosticul istopatologic, semneaz !i
parafeaz;
3

__________________
Aatomie-Patologica
PROCEDURA OPERAIONAL
IMUNOHISTOCHIMIE
Ediia: 1
Nr.de ex.: 3
Revizia: -
Nr.de ex. : -
COD PO
Pagina _4___ din
13
Exemplar nr.: 1
- registratorul medical noteaz rezultatul istopatologic de pe fisa de insotire a
materialului biopsic n registrul unic de e"iden a biopsiilor;
- prin intermediul cadrului medical delegat de sectia care a adus piesa n
#er"iciul de Anatomie $atologic, diagnosticul istopatologic al examenului
extemporaneu este comunicat cirurgului in cel mai scurt timp%
4