METODE PENTRU EXAMENUL CITOLOGIC N MICROSCOPIA ELECTRONIC.

1.TIPURI DE INFORMAII CARE SE POT OBINE PRIN MICROSCOPIE ELECTRONIC

ultrastructura diferitelor tipuri de celule i a componentelor acestora n stare normal i
patologic
2.PRELEVAREA PROBELOR
Pentru a preveni schimbrile de orice natur care pot aparea la nivel tisular sau celular chiar din
momentul prelevrii, recoltarea trebuie s se fac rapid. Deoarece piesele trebuie s fie de mici
dimensiuni 0,5x0,5x0,5 mm, tierea acestora se realizeaz sub o lup binocular. Fragmentele sunt
preluate cu o pens i introduse n fixator rcit la 4C.

Alternativ, fragmentele de material biologic obinute prin puncii sau biopsii, sau fragmentele mici din
esuturile i organele recoltate imediat dup sacrificarea animalului de experien, sunt puse pe o hrtie
fotografica, pe faa cea fr emulsie de azotat de argint(AgNO3). Peste aceste fragmente se pun 2-3
picturi din lichidul fixator
(4C) pentru a opri pe ct posibil aciunea distructiv a enzimelor celulare.

Cu ajutorul a dou lame de ras noi, bine degresate, prin micri de translaie se confecioneaz cubulee
cu latura de maxim 1mm.

Cu o scobitoare se ridic fragmentele i se introduc ntr-un flacon cu fixator rcit la +4C. Singele se
recolteaza pe anticoagulant(acid citric si dextroza).

FIXAREA
1. Metode fizice - au la baz folosirea temperaturilor foarte sczute, deshidratarea inert i metoda de
substituie prin ngheare.
2. Metode chimice O soluie fixatoare este format din:
a) soluia tampon;
b) agentul fixator
a)Soluia tampon se alege n funcie de compatibilitatea cu agenii fixatori
tampon cacodilat (compatibil cu toi agenii fixatori)
tampon fosfat (compatibil cu toi agenii fixatori, exceptie cu ionii de calciu i uranil)
tampon veronal (compatibil cu toi agenii fixatori, exceptie aldehide fixatoare)
b) agenii fixatori:
- anorganici (oxizi - OsO4,
sruri- permanganat de potasiu(KMnO4)
bicromatul de potasiu(K2Cr2O7));

- organici (aldehidele- formaldehidele,

glutaraldehida,
acroleina,
aciziacidul tanic
unele catechine).
n practica curent se folosete o dubl fixare:
- prefixare cu glutaraldehida tamponat;
- postfixare cu tetraoxid de osmiu tamponat;

Tehnica de lucru.
Fragmentele prelevate i fasonate sunt introduse cu ajutorul unei scobitori ntr-un flacona n care se
gsete glutaraldehid tamponat (+4C) n care vor sta 1 or la frigider; flaconul se acoper cu un dop
(glutaraldehida este toxic) pe care se noteaz numrul de ordine.

Fixatorul se vars ntr-o sticl cu dop rodat iar fragmentele rmase pe pereii flaconului se spal de trei
ori a cte 1 or cu tampon fosfat 0,15 M la temperatura de 4C.
Dup a treia splare fragmentele sunt post-fixate n acelai flacon cu fixatorul Milloning timp de 1 or
i la +4C.
Fixatorul Milloning conine:
-...............................................................................tetraoxidul de osmiu 1g
-................................................................................tampon fosfat, 0,15 M

100ml

SPLAREA PIESELOR
Dup fixare, urmeaz obligatoriu splarea pieselor. Piesele se spal timp de 5-20 min sau chiar peste
noapte cu aceeai soluie tampon care a intrat n compoziia fixatorului.
DESHIDRATAREA PREPARATELOR
Prin deshidratarea preparatelor se urmrete eliminarea apei din esuturile fixate pe cale chimic sau
fizic fr a produce modificri in structura molecular nativ a celulelor din esuturi.
Alegerea solventului pentru deshidratare este n funcie de materialul de includere, acesta trebuie s fie
miscibil cu agentul de deshidratare. n cazul folosirii vestopalului ca material de includere se folosete
acetona iar n cazul eponului, alcoolul etilic i propilenoxidul.
INCLUDEREA
Cele mai utilizate medii de includere fac parte din grupa rinilor poliesterice (vestopal) a rinilor
epoxidice (epon 812, epon 562, araldita) i mediile de includere hidrofile (durcopanul,
hidroxipropilmetacrilatul) care prezint avantajul c evit deshidratarea i conserv lichidele i
enzimele din celul.
Includerea se face n capsule de gelatin sau polietilen (BEEM).
Tehnica includerii n Epon 812
n compoziia mediului de includere intr urmtoarele substane:
Amestecul A
+
Amestecul B
+
Accelerator DMP - 2
Epon 812 +DDSA
Epon 812+MNA
5 ml
5 ml
0,15 ml
unde DDSA = anhidrida dodecilsuccinic; MNA = anhidrida metilanadic
Piesele din materialul biologic se introduc n capsule de gelatin, n eponul de lucru, n ni, la
temperatura laboratorului.

Capsule de gelatin pregtite n suport de

polistiren

Epon de lucru

Adugarea eponului de lucru, pentru includere, n capsulele de gelatin

Se adaug iniial numai 1 picatur de epon

Piesele sunt preluate din mediul de impregnare, tot cu o scobitoare, apoi sunt trecute n capsulele de gelatin care con in
deja 1 pictur epon.

n fiecare capsul de gelatin se introduce un numr de identificare scris numai cu creion negru

Se completeaz cu epon pn la umplerea capsulelor

SECIONAREA
Preparatele biologice fixate i incluse n diferite medii de includere sunt supuse unor operaii de
secionare prin tehnici speciale, cu ajutorul unor aparate speciale numite ultramicrotoame, pentru a
realiza seciuni ultrafine, a cror grosime nu depete 1000 i care vor fi uor traversate de
fasciculul de electroni.
Fasonarea blocurilor
nainte de a le supune procesului de secionare, blocurile cu preparate biologice trebuie fasonate.
Prin acesta operaie o anumit zon din preparat capt aspect de piramid. Dac la includere s-au
folosit capsule de polietilen, atunci blocul apare aproape gata fasonat n aceast form.
Operaia de fasonare a blocurilor se face manual dup ndeprtarea capsulei de gelatin, sub o lup
binocular, cu ajutorul unei lame de ras noi, dup fixarea blocului ntr-un portbloc.

Se confecioneaz un trunchi de piramid, al crui vrf trunchiat ce conine piesa, trebuie s aib forma
unui ptrat cu latura de 0,1-0,2 mm.

Fasonarea blocului se poate face cu ajutorul ultramicrotomului i cu cuite de sticl.

Secionarea propriu-zis i colectarea seciunilor
Secionarea se face cu ajutorul unui ultramicrotom

Ultramicrotomul folosete cuite de sticl sau de diamant

Vizual, grosimea seciunilor se poate aprecia prin reflexia n bi pe suprafaa apei, culoarea
seciunilor n lumin reflectat fiind n funcie de grosimea acestora (Peachey 1958, Zelander i
Ekholm 1960).
Culoare
Grosime ()
cenuie
sub 600
argintie
600 - 900
aurie
900 - 1500
purpurie
1500 - 1900

albastr
verde
galben

1900 - 2400
2400 - 2800
2800 - 3200

Seciunile semifine se fac cu ajutorul ultramicrotomului prin folosirea avansului manual (cu o grosime
de 1500-3200 ) cu scopul de a verifica dac blocul respectiv conine elementele pe care ni le-am
propus s le examinm.
Dup colorare se analizeaz la microscopul fotonic. Pentru colorarea seciunilor semifine exist mai
multe metode: colorarea cu albastru de toluidin. Colorarea se face aplicnd pe lam 2-3 picturi din
soluia de albastru de toluidin; lamele se pun n termostat la 60 grade C timp de 10-30 min. apoi se
spal n ap curgtoare apoi n aceton 100%, se trec rapid prin xilol, se sugativeaz, se monteaz i se
examineaz la microscopul fotonic.
Seciunile ultrafine rezultate n urma secionrii urmeaz s fie depuse pe un portobiect care n
microscopia electronic este o gril metalic.
APLICAREA SECIUNILOR ULTRAFINE PE GRILE
n prezent exist o gam variat de suporturi pentru preparate (grile i discuri), confecionate pe cale
electrolitic din cupru, nichel, oel inox, argint, aur, platin, molibden sau tungsten. Grilele electrolitice
sunt de mai multe feluri: a) standard; b) de identificare; c) duble.
Pentru ca grilele s devin un bun suport pentru preparat, se acoper cu pelicule organice sau
anorganice fine, transparente la fasciculul de electroni a cror grosime nu trebuie s depeasc 200 .
Grilele cu preparatul n sus se plaseaz ntr-o cutie Petri pe fundul creia se afl hrtie de filtru i pe
care se noteaz numrul preparatului din registrul de eviden.
Contrastarea preparatelor biologice
Pentru mrirea contrastului biomoleculelor, al virusurilor, al diferitelor microorganisme i al seciunilor
de esuturi, se recurge n practic la o serie de metode de contrastare, cele mai utilizate fiind: colorarea
pozitiv, colorarea negativ i umbrirea sau metalizarea.
Colorarea pozitiv are la baz interaciunea chimic dintre structurile biologice i un colorant format
din sruri ale unor metale grele(acetat de uranil, citrat de plumb).
Contrastarea cu acetat de uranil.
Un numr de godeuri fcute pe o plac de plexiglas se umplu cu o soluie de acetat de uranil 13%,
utiliznd o pipet cu par de cauciuc.
Faa cu seciuni ale grilelor se aplic pe suprafaa soluiei din godeuri lsndu-le n contact 10 min, la
ntuneric.
Cu ajutorul unei pense foarte fine se iau grilele de pe suprafaa picturilor de acetat de uranil pe care
plutesc i se spal trecndu-le prin 3 bi cu alcool etilic 50%.
Contrastarea cu citrat de plumb (soluia Reynolds) se execut n al doilea timp.
Pe o plac de parafin curat se pune un numr de picturi din soluia Reynolds (nitrat de plumb +
citrat de sodiu + ap distilat), corespunztor numrului de probe de colorat.
Peste aceste picturi se aplic grilele cu preparatul n jos i se in 3 min dup care se spal cu ap
distilat.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

7.
8.
9.

Procedeu complet:
Recoltare
Fixarea n glutaraldehida tamponat
Splarea n tampon fosfat
Postfixare n OSO3 tamponat
Splare n tampon fosfat
Deshidratare cu:
alcool 30%....................................................................10 min.
alcool 50%....................................................................10 min.
alcool 70%....................................................................10 min.
alcool 90%....................................................................10 min.
alcool 100% (2 bi)..........................................20min. fiecare
aceton 100% (2 bi)..........................................20min. fiecare
(acesta ultim etap nu este obligatorie, dar se recomand pentru o mai bun impregnare)
Impregnare
aceton 100% + epon de lucru 1/1 ..................................1 or
epon de lucru.....................................................................1 or
Includere: piesele din materialul biologic se introduc n capsule
gelatin n eponul de lucru, n ni, la temperatura laboratorului.
Polimerizarea eponului la termostat, la 60C.
esuturile se pun n capsule de gelatin cu amestec de Epon proaspt preparat. Se las pn cnd
piesele cad la fundul capsulelor i apoi polimerizarea are loc la 60C peste noapte.