ETAPELE EXAMENULUI

CITOLOGIC

IN MICROSCOPIA

ELECTRONICA
Mirela-Camelia Zgura

Master I

Biofizica si Fizica Medicala

 Cuprins
• 1. Tipuri de informatii care se pot obtine prin microscopie electronica

• 2. Prelucrarea electronomicroscopica a probelor

• 3. Fixarea

• 4. Spalarea pieselor

• 5. Deshidratarea preparatelor

• 6. Includerea in Epon 812

• 7. Sectionarea probelor

• 8. Aplicarea sectiunilor ultrafine pe grile

• 9.Contrastarea preparatelor biologice prin colorare

• 10.Vizualizarea probelor la microscopul electronic

 Biologia celulara si moleculara ca
stiinta de sine statatoare, a luat
nastere in urma cu aproximativ 50 de
ani ca urmare a utilizarii complexe a
trei metologii:
* microscopie electornica;
* fractionarea celulara;
* culturile de celule;
 MICROSCOPIA ELECTRONICA
domina perioada contemporana a microscopiei
deoarece este singura metodolgie care poate
furniza informatii directe asupra organizarii lumii vii
in domeniul dimensiunilor de 1,2 Å – 2000 Å, care
scapa posibilitatii de studiu cu microscopul fotonic.
 1.TIPURI DE INFORMATII CARE SE POT
OBTINE PRIN MICROSCOPIE
ELECTRONICA
- gradul de inrudire genetica dintre organisme;
- biosinteza de proteine si structurile implicate
in acest proces;
- structura si configuratia macromoleculelor proteice;
- configuratia moleculara a acizilor nucleici si stabilirea
greutatii lor moleculare;
- procese de filtrare prin membrana;
- transportul ionic in celule; etc.
 2.PRELUCRAREA
ELECTRONOMICROSCOPICA
A PROBELOR

- Conditia esentiala obtinerii unor rezultate corecte este ca

probele de material biologic sa fie prelevate numai din
organisme vii care nu au suferit actiunea unor factori
stresanti sau din culturi celulare proaspete si direct din
mediul in care au crescut.
- Bune rezultate se obtin cand concomitent cu prelevarea
pieselor de tesut se realizeaza si o prefixare a
materialului respectiv.
- Cu ajutorul a 2 lame de ras noi,
bine degresate, se
confectioneaza cubulete de tesut
cu latura de 1mm.

- Fragmentele se intorduc intr-un

flacon cu fixator racit la +4°C.
 3. FIXAREA

- Reprezinta conservarea structurilor biologice cat mai

aproape de starea lor functionala vie.
- Prin fixare, celulele capata un oarecare grad de
rezistenta impotriva aventualelor distrugeri ce pot surveni
in cursul operatiunilor ulterioare.
- Tipul de fixator, procedeul folosit la fixare si durata
diferitelor etape ale procesului de fixare depind nu numai
de materialul biologic ci si de scopul urmarit in cadrul
studiului intreprins.
 Pentru fixare se folosesc:
a. Metode fizice: deshidratarea inerta cu alcool;
b. Metode chimice: folosesc proprietatile unor
reactivi care blocheaza rapid metabolismul
celular, inclusiv activitatile enzimatice.
Se folosesc:
* solutii tampon
- tampon cacodilat ;
- tampon fosfat.
 * agenti fixatori

- anorganici : oxizi –OsO4, saruri-permanganat de

potasiu si bicromatul de potasiu;

- organici : aldehidele-formaldehidele, glutaraldehida,

acroleina, acidul tanic.

In practica curenta se foloseste o dubla fixare:

- prefixare - cu glutaraldehida tamponata;
- postfixare - cu tetraoxid de osmiu tamponat.
 4. SPALAREA PROBELOR
- Opreste procesul de fixare si indeparteaza
excesul de fixator
- Se spala tesuturile timp de 5-20 min cu aceeasi
solutie tampon care a fost folosita la prepararea
fixatorului.
 5. DESHIDRATAREA
PREPARATELOR
- reprezinta eliminarea apei din tesuturile fixate pe
cale chimica sau fizica fara a produce modificari
in structura moleculara nativa a celulelor din
tesuturi.
- probele se deshidrateaza in bai
de alcool de 30º, 40º, 70º, 90º, 100º,
timp de 15 min, in fiecare gradatie
de alcool.
- pentru o deshidratare completa toate
probele s-au spalat cate 5 min in
2 bai de propilen oxid.
 6. INCLUDEREA IN EPON 812

- este etapa in care piesele

deshidratate corect se
introduc intr-un mediu lichid
care, prin polimerizare,trece in
stare solida.
- acest mediu lichid este
EPON 812.
- EPON 812 este o rasina epoxidica.
- Includerea se face in capsule de
gelatina sau poiletilena,cea mai
folosita fiind polietilena.
- Impregnarea specimenelor se
realizeaza la temperatura camerei
timp de 24h intr-un preparat
final format din:
- EPON 50% si
- Propilen oxid 50 %.
- Specimenele se
transfera in capsulele de
incluzionare,
individualizate si plasate
in termostatul de
incluzionare,timp de 4-
5h la 37ºC.
- Probele biologice se lasa
pana cad la fundul
capsulelor, apoi se trece
la polimerizarea rasinii
expoxidice la + 67ºC,
timp de 3 zile.
 7. SECTIONAREA PROBELOR

Sectionarea probelor se realizeaza la un ultramicrotom

Leica-Ultracut R.
 Sectionarea probelor se
face cu cutite de sticla
speciale.

• Înaintea
sectionării
propriu-zise,
port-preparatul se
fixează in partea
terminală a tijei
de avans iar cutitul
se montează in
suportul său .
- Se urmăreşte ca fata cutitului care
"priveşte" spre preparat să fie
alipită de ghidajul perpendicular al
cutitului.
- Cutitul se orientează astfel încât
tăişul lui să fie paralel cu suprafata
preparatului iar suportul cu
preparatul se roteşte încât laturile
care delimitează pătratul sau
trapezul sa fie perpendiculare pe
gura cutitului iar baza mare a
trapezului sa fie paralelă cutăişul
acestuia.
- Toate aceste reglaje se execută
privind prin microscopul
stereoscopic.
- Cu ajutorul unei seringi se introduce
in băia cutitului apa distilata.
- Se urmăreşte sub microscop pânâ
când lichidul atinge tăişul cutitului.
- Prin mişcarea Iămpii fluorescente
inainte şi înapoi se urmăreşte
reflexia luminii pe suprafata apei
din bâită.
- Se aduce cutitul cu ajutorul vizei
macrometrice, foarte aproape de
preparat şi apoi se trece pe
controlul automat.
- După o serie de mişcări in gol,
preparatul va atinge cutitul şi va
începe sectionarea.
- Grosimea sectiunilor poate fi reglată
electronic de la pupitrul de control in
limitele dorite.
- Vizual, grosimea sectiunilor se poate
aprecia prin reflexia in baita pe suprafata
apei, culoarea sectiunilor in lumină
reflectata fiind in functie de grosimea
acestora.
Culoare Grosime (Å)
cenuşie sub 600
!!! argintie 600-900
aurie 900-1500
purpurie 1500-1900
albastra 1900-2400
verde 2400-2800
galbena 2800-3200
 8. APLICAREA SECTIUNILOR PE GRILE
- Se folosesc grile din
cupru, nichel, argint, aur,
platina.
- Acestea sunt niste discuri
de 200-300 mesh (criteriul
international de
identificare care
indica numarul de ochiuri
pe “inch”- 2,54cm).
- Sectiunile se culeg de pe suprafata apei
din bac prin simplul contact al grilei.
- Se indeparteaza de pe grila apa in exces
cu hartie de filtru.
- Grilele cu preparatul in sus se plaseaza
intr-o cutie Petri pe fundul careia se afla
hartie de filtru.
9.CONTRASTAREA PREPARATELOR
BIOLOGICE PRIN COLORARE
Colorarea este dubla:
1) Cu acetat de uranil 13%, 10 min la intuneric.
Apoi grilele se trec prin bai cu alcool etilic 50%.
2) Cu acetat de plumb (solutia Reynolds = nitrat de
Pb + citrat de Na + apa distilata), tot 10 min.
Apoi grilele se spala cu apa distilata.
- Dupa aceste colorari si indepartarea excesului de apa
distilata, sectiunile pot fi examinate la microscopul
electronic.
10. VIZUALIZAREA SPECIMENELOR LA
MICROSCOPUL ELECTRONIC
Se face la microscopul electronic
Phylips – 301, un microscop
performant cu marire directa de
x1.000.000 si o rezolutie de 1,2 Å.
- Vizualizarea se face de catre
fizician
- Imaginile obtinute sunt stocate
in calculator.
 Alcatuirea microscopului electronic cu
transmisie
- Constructiv microscopul electronic
are o structura mult mai complexa
decat microscopul optic.

- Partile principale ale microscopului

electronic indeplinesc aceleasi
functii ca si lentilele microscopului
optic.

- Ele sunt magnetice sau electrice,

dupa cum devierea fasciculului de
electroni are loc intr-un camp
magnetic sau intr-un camp electric.
-Electronii pe toata - Planul imaginii finale se afla
traiectoria lor se pe un ecran fluorescent
deplaseaza in vid.
APLICATII
TOFU MIGDALA PRAJITA

MOZZARELA
 VA MULTUMESC
PENTRU ATENTIA
ACORDATA!