Procedee de dezintegrare a țesuturilor.

Medii de extracție a proteinelor și

obținerea unui extract proteic total
LP1
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

A. Consideraţii generale

În celulele animale şi vegetale, proteinele pot exista libere în citoplasmă, incluse în membranele plasmatice
sau cele ale organitelor sau în interiorul unor organite intracelulare (nuclei, mitocondrii, lizozomi, etc.).
În vederea preparării unui extract proteic total, prima etapă constă în ruperea membranelor celulare
şi eliberarea în mediu a componentelor citoplasmatice, a organitelor celulare şi a resturilor membranare.
În cazul ţesuturilor vegetale, este preferabil ca înaintea extracţiei proteinelor să fie îndepărtaţi pigmenţii care
pot interfera cu metodele de dozare a proteinelor. Dezintegrarea ţesuturilor vegetale tari precum seminţele se
poate realiza prin îmuierea lor în soluţii apoase peste noapte sau prin măcinarea lor în prezenţa sau absenţa
acetonei.
În cazul țesuturilor animale, metodele de dezintegrare utilizate trebuie să aibă în vedere duritatea țesutului,
compartimentul celular unde sunt localizate proteinele de interes, precum și analizele ulterioare ce urmează sa
fie efectuate pornind de la extractul obținut.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

B. Procedee de dezintegrare a ţesuturilor

Metode mecanice/fizice
1. Dezintegrarea ţesuturilor prin mojarare.
După cum sugerează denumirea metodei, ţesutul este dezintegrat într-un mojar de porţelan în
prezenţa nisipului de cuarț sau a unei pulberi de sticlă, prin frecarea circulară a pistilului de pereţii
mojarului până la obţinerea unei paste.
Prin aceasta metodă sunt dezintegrate nu numai celulele ce constituie un țesut dar sunt distruse și
organitele celulare, în consecință, extractul obținut va conține proteine din toate
compartimentele celulare.
Dezintegrarea tesuturilor prin mojarare are dezavantajul contaminării probei cu
nisipul de cuarț, și necesitatea unor timpi de lucru mai mari în cazul prelucrării mai multor
probe.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

2. Dezintegrarea ţesuturilor cu omogenizatoare de tip Potter-Elvehjem

Acest tip de omogenizator este prevăzut cu un pistil de inox la capătul căruia se află
un bulb cilindric din porţelan ai cărui pereţi exteriori sunt şlefuiti sau metal învelit in
teflon, sau alcatuit dintr-un plastic special şi care pătrunde într-un tub de sticlă a cărui
capacitate poate varia între 5 – 50 ml.
Jocul liber al celor două piese este de circa 0,2 mm. Aparatul este prevăzut cu un
motor care roteşte pistilul cu viteze variabile de până la 4000 r.p.m. În tub este
suspendat ţesutul care urmează a fi dezintegrat împreună cu mediul de extracţie într-o
proporţie de 1g la 10 ml.
Dezintegrarea ţesutului care poate fi proaspăt sau îngheţat are loc în momentul
trecerii repetate a piesei de țesut prin spaţiul mic dintre pistilul rotator şi pereţii tubului,
realizând o mişcare repetitivă de sus în jos a tubului.
Pentru a evita denaturarea proteinelor tisulare, este de preferat ca tubul să fie răcit
pe o baie de gheaţă la intervale scurte de timp (30 s). Avantajul acestui dispozitiv este
că lasă în cea mai mare măsură organitele celulare intacte iar ţesutul nu mai este
impurificat cu nisip de cuarţ.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

3. Dezintegrarea ţesuturilor cu omogenizatoare cu cuţite tip blender

Dispozitivul este prevăzut cu o cuvă cu capacitate relativ mare (până la 2 L) la
baza căreia sunt prevăzute lame tăietoare antrenate de motorul electric al aparatului.
Țesuturile, inclusiv cele dure precum semințele și cartilagiile, sau cele fibroase și
rezistente precum tegumentul sunt dezintegrate rapid, lamele fiind antrenate într-o
miscare circulară cu o frecvență de până la 10000 r.p.m. (rotații pe minut), ceea ce
conduce la apariția unor forțe de forfecare şi tăiere puternice și la obţinerea unui
omogenat fin.
Metoda nu poate fi folosită în scopul fracţionării subcelulare, organitele fiind
distruse. Utilizarea aparatelor de tip blender pentru omogenizare este pretabilă
cazurilor în care este necesară / posibilă analiza unor cantități mari de țesut.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

4. Omogenizarea cu ultrasunete (sonicarea)

Sonicatorul transformă energia electrică în ultrasunete cu frecvenţă variabilă, emise prin intermediul
unei tije de inox care se imersează în lichidul ce conţine o suspensie celulară.
Sunetele de înaltă frecvenţă (18 kHz – 1 MHz) sau ultrasunetele, induc în lichidul în care este
imersat ţesutul un fenomen de cavitaţie, care se traduce prin formarea unei multitudini de microbule care
cresc şi colapsează.
În momentul colapsului, energia sonică este transformată în energie mecanică sub forma unei unde de
şoc echivalentă cu o presiune de aproximativ 300 MPa, care induce formarea unor pori în membrana
celulară, care produc liza celulară.
Pe scurt, liza celulară are loc prin alternarea presiunilor înalte cu cele joase.
În același timp, se eliberează cantități importante de căldură. Din acest motiv,
sonicarea trebuie realizată pe o baie de gheaţă, și numai pe perioade scurte de timp.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total
5. Omogenizarea prin presiune
Această metodă este utilizată în special pentru deintegrarea unor fragmente tisulare mici sau celule animale ( ex.
cultivate in vitro) sau a celulelor vegetale, a fungilor și a bacteriilor care prezintă pereţi celulari şi care îngreunează
procesul de dezintegrare.
Probele biologice sunt forţate să treacă, prin aplicarea unor presiuni înalte, prin orificiile unei site cu porii mai
mici decât diametrul celular, către o zonă cu presiune scăzută. În momentul trecerii forțate prin aceste orificii are loc
liza celulară.
6. Dezintegrarea cu ajutorul omogenizatoarelor automate cu sfere depinde de asocierea mecanică dintre sferele
dense și tuburile securizate. Proba de omogenizat este cântărită și introdusă într-un tub cu capac cu filet, în care există de
asemenea mediul de extracție și un număr de sfere cu densitate apreciabilă. Tuburile bine închise sunt introduse în
caruselul omogenizatorului, după care acesta este închis și securizat.
Aceste omogenizatoare pot avea opțiunea de a menține temperatura probelor la anumite valori (de exemplu, Bioprep
24R de la Hangzhou Allsheng Instruments Co. dispune de funcție de răcire), în timp ce caruselul va executa mișcări
foarte rapide în plan vertical, antrenând sferele din microtuburi, care lovesc cu forță proba biologică, dezintegrând-o.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

6. Dezintegrarea cu ajutorul omogenizatoarelor automate cu sfere

Dat fiind faptul că sferele utilizate exercită forță asupra probei, o caracteristică esențială este
materialul utilizat pentru construcția acestora. Sferele pot fi ceramice/zirconiu, din granat, oțel
inoxidabil, sticlă sau teflon.
În timp ce sferele ceramice sunt perfecte pentru pregătirea specimenelor delicate (de exemplu, țesut
hepatic), cele din oțel inoxidabil sunt potrivite pentru prepararea probelor uscate și dure, în timp ce cele
din sticlă sunt perfecte pentru manipularea specimenelor microbiene.
După dezintegrare, microtuburile sunt centrifugate pentru a separa proteinele solubile de resturile
celulare și de sfere, fiind păstrat numai supernatantul.
Metoda de dezintegrare cu ajutorul omogenizatoarelor automate cu sfere are avantajul că permite
dezintegrarea rapidă a multor probe, posibilitatea de termostatare pentru a preveni denaturarea, și
eliminarea riscului de contaminare, fiecare microtub cu sfere fiind de unică folosință.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

6. Dezintegrarea cu ajutorul omogenizatoarelor automate cu sfere

Fluxul de lucru pentru dezintegrarea țesuturilor cu ajutorul omogenizatorului cu sfere:
a) microtub cu sfere ceramice – mediul de extracție se adaugă ulterior, în funcție de obiectivele experimentale
și tipul probei biologice;
b) microtub cu capac cu filet pregătit pentru dezintegrare – se observă piesa de țesut intactă și sferele ceramice,
imersate în mediul de extracție;
c) caruselul omogenizatorului, încărcat cu microtuburi pline cu probe pregătite de omogenizare;
d) omogenizatorul Bioprep 24R cu răcire va dezintegra probele biologice din tuburile din carusel, efectuând
ample vibrații în plan orizontal, cu anumite frecvențe, alese de utilizator;
e) aspectul probelor din microtuburi după omogenizare – nu se mai observă piesa de țesut, aceasta fiind
disperastă în mediul de extracție. Pentru obținerea extractului proteic, microtuburile sunt centrifugate și
supernatantul este prelevat.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total
METODE TERMICE
8. Dezintegrarea termică
Această metodă constă în îngheţul şi dezgheţul repetat al celulelor, aplicându-se în mod frecvent
eritrocitelor şi bacteriilor. Astfel, formarea cristalelor de gheaţă, în care moleculele de apă realizează asociaţii
prin legături de hidrogen într-un procent maxim, destabilizează legăturile van der Waals preponderente de la
nivelul membranei celulare.
METODE CHIMICE/BIOCHIMICE

9. Dezintegrarea chimică
Constă în tratarea celulelor în special cu detergenţi care interacţionează fizic cu lipidele şi proteinele
membranare, destabilizând interacţiile lipid-lipid, proteină-lipide şi proteină-proteină, care sunt preponderent
de tip wan der Waals şi electrostatice, formând cu acestea micele de asociaţie, eliberând materialul
citoplasmatic.
Datorită caracterului lor amfifil, detergenţii interacţionează prin capătul lor polar cu proteinele membranare
iar prin coada hidrofobă cu lipidele.
De obicei, pentru o liză eficientă a celulelor se combină dezintegrarea mecanică cu cea chimică şi în
funcţie de scopul urmărit şi a analizelor ulterioare pe lizat, pot fi utilizaţi diferite tipuri de detergenţi.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor.
Medii de extracție a proteinelor și obținerea
unui extract proteic total

10. Dezintegrarea enzimatică

Reprezintă una dintre cele mai vechi metode de

obţinere a lizatelor celulare şi constă în tratarea ţesuturilor
animale sau vegetale, a bacteriilor şi drojdiilor cu enzime
proteolitice şi lipolitice care digeră fie peretele celular
fie componente ale membranei celulare. Astfel, ţesutul
muscular poate fi dezintegrat cu ajutorul enzimelor
proteolitice izolate din Bacillus subtilis.

Obţinerea lizatului celular/tisular prin diferite

metode de dezintegrare tisulară
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

C. Tipuri de medii de extracţie a proteinelor

1. Apa distilată este un mediu foarte hipotonic eficace de

extracţie pentru componentele polare având capacitatea de a liza
celulele și organitele celulare.
Efectul presiunii osmotice asupra
volumului unei hematii

a) dacă concentrația în soluți a mediului este superioară celei a plasmei celulare, mediul este hipertonic și apa tinde să
iasă, prin osmoză, din celulă, aceasta diminuându-și volumul;
b) dacă concentrația în soluți a mediului este egală celei a plasmei celulare, mediul este isotonic, iar celula are volum
și formă specifice;
c) dacă concentrația în soluți a mediului este inferioară celei a plasmei celulare, mediul este hipotonic, iar apa
pătrunde prin osmoză în celulă, al cărei volum crește și duce la modificarea formei specifice;
d) dacă concentrația în soluți a mediului este mult mai mică decât cea a citoplasmei, mediul este foarte hipotonic, iar
apa pătrunde prin osmoză în celulă, al cărei volum crește foarte mult, până când membrana plasmatică nu îl mai poate
conține, moment în care are loc liza celulară.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

2. Soluţiile saline izotonice de NaCl 0,15 M, KCl 0,15 M şi zaharoză 0,25 M sunt cele mai eficace
medii de extracţie pentru proteine.
Astfel, ionii sărurilor neutre la tării ionice mici, participă la formarea dublului strat electric al
proteinelor, măreşte distanţa dintre particule prin repulsii electrostatice şi cresc solubilitatea acestora, proces
numit „ salting – in”.
La tării ionice mari, are loc fenomenul invers de „salting – out”, deoarece are loc neutalizarea unei părţi
din sarcinile electrice ale proteinei, inducându-i o sarcină netă egală cu zero, dublul strat electric se
distruge, dispar forţele de repulsie iar cele de atacţie devin predominante, iar proteinele precipită
(coagulează). Mai mult, apare şi un fenomen de deshidratare a proteinelor, deoarece la concentrații mari
sărurile atrag moleculele de apă polare în jurul lor pentru a se solvata.

3. Soluţii tampon de tipul fosfat monopotasic-fosfat dipotasic 0,01-0,05M, pH 7,4 – 7,8, Tris-HCl pH
7,4 – 7,8 sunt des utilizaţi în special pentru extracţia enzimelor care au domeniul optim de pH în jur de 7,4
(pH fiziologic) şi datorită faptului că la majoritatea proteinelor punctul izoelectric (pH la care suma
sarcinilor pozitive ale aminoacizilor constituenți este egală cu cea cea a sarcinilor negative, sarcina electrică
globală fiind negativă) este în domeniul de pH acid, majoritatea proteinelor sunt solubile la valori de pH
neutru şi alcalin.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și obținerea unui extract
proteic total

4. Detergenţii naturali sau sintetici (ionici, neionici sau amfoterici). În funcţie de analizele ulterioare,
se utilizează un anumit tip de detergent, ei având capacitatea de a solubiliza proteine care se află în
complexe lipoproteice sau din membranele celulare sau a organitelor celulare prin formarea unor micele
de asociaţie.
Detergenţii neionici şi cei amfoterici au un efect mai mic denaturant (ruperea legăturilor de hidrogen,
electrostatice şi van der Waals cu pierderea structurii cuaternare, terţiare şi secundare) asupra proteinelor
decât cei ionici.
Detergenţii ionici sunt agenţi de solubilizare mult mai puternici, încărcând proteinele cu sarcini
negative sau pozitive. Cei mai utilizaţi detergenţi sunt: CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamino]-1-
propansulfonat, detergent amfoteric; Triton X-100 (C14H22O(C2H4O)n), detergent neionic polietoxilat,
Tween (polioxietilen sorbitan monolaureat), detergent neionic iar cel mai cunoscut detergent ionic este
dodecilsulfat de sodiu (SDS), utilizat în special la separarea proteinelor prin electroforeză.

5. Ureea şi guanidina hidroclorică, sunt agenţi denaturanţi deoarece rup legăturile de hydrogen, fiind
utililizaţi în disocierea complexelor proteice.
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

Extracţia proteinelor din țesutul hepatic în diferite medii de extracție

Principiul metodei:
Probele de țesut vor fi dezintegrate mecanic prin mojarare iar proteinele totale vor fi extrase într-un
mediu foarte hipotonic (apă distilată), într-un mediu izotonic (ser fizologic) și într-un mediu izotonic
tamponat (tampon fosfat salin). Mediul optim de extracţie al proteinelor totale din țesut hepatic va fi selectat
ulterior, după determinarea concentrației proteice totale a extractelor obținute.

Reactivi și materiale necesare:

• mojare
• tuburi de centrifugă
• centrifugă
• apă distilată
• ser fiziologic (150 mM NaCl)
• tampon fosfat salin (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4)
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

Modul de lucru:
- se cântăresc aproximativ 1,2 g de ţesut heptic, care se va plasa apoi într-un mojar împreună cu un vârf
de spatulă de nisip de cuarţ
- se mojarează țesutul câteva minute, până la obţinerea unei paste, apoi se adaugă treptat, câte 12 mL
mediul de extracţie atribuit (cele trei medii de extracție sunt apă distilată, ser fiziologic și tampon
fosfat) şi se lasă în repaus 30 de minute la 4˚C, pentru extracția proteinelor
- în funcție de cantitate de probă cântărită se modifică și volumul de mediu de extracție, astfel că raportul
dintre masa de probă și volumul de mediu să fie 1 la 10
- după terminarea timpului, omogenatele se centrifughează 15 minute la 6000 rpm
- se poate distribui omogenatul tisular în două tuburi de centrifugă echilibrate, în cazul în care este
necesar
- supernatantele care reprezintă extractele proteice totale se păstrează iar sedimentele care reprezintă
resturi celulare și nisipul de cuarț insolubil se aruncă
LP1 - Procedee de dezintegrare a țesuturilor. Medii de extracție a proteinelor și
obținerea unui extract proteic total

- extractele proteice totale se alicotează, fiind împărțite în câte două flacoane, unul într-un tub de
centrifugă de 50 mL (volum aproximativ 10 mL) și altul într-un tub de 14 mL (volum
aproximativ de 2 mL)
- ambele alicoturi se congelează la -20 ˚C, primul fiind utilizat pentru purificarea unor fracții
proteice prin precipitare cu sulfat de amoniu, respectiv pentru determinarea concentraţiilor
proteice din extractul total (alicotul de 2 mL) printr-o metodă spectrofotometrică (exemplu
metoda Biuretului, metoda Bradford)
- concentraţiile proteice totale obţinute în cele trei medii diferite de extracţie se compară între ele
pentru a se determina mediul optim de extracţie, apoi se normalizează la cantitatea de țesut luat
în lucru (în condițiile unei prelucrări în etape identice, putem considera că eventualele diferențe
de concentrație proteică obținute se datorează mediului de extracție utilizat).