Bioseparari analitice

Curs 3
Dezagregare celulara

Produsele biologice sintetizate prin fermentare sau cultur celular sunt situate
intracelular sau extracelular.
Produsele intracelulare, sunt la randul lor fie in form solubil n citoplasm sau se
prezinta ca organisme de incluziune.
Exemple de produse intracelulare sunt: insulin recombinant i factori de cretere
recombinanti.
Pentru a obtine produsele intracelulare celulele trebuie mai nti s fie dezagregate
pentru a se elibera acestea ntr-un mediu lichid.
O etapa premergatoare este separarea celulelor din mediul de cultura.
Acest lucru se face n scopul de a reduce cantitatea de impuriti: metaboliti
extracelulari secretati de celule si componente ale mediului de cultura.
In multe cazuri celula suspensiile sunt ngroate sau concentrate prin microfiltrare sau
centrifugare pentru a reduce volumul de proces.
Diferite tipuri de celul necesita dezagregare
1. Celulele bacteriene Gram pozitive
2. Celule bacteriene Gram negative
3. Celule de drojdii
4. Celulele de mucegai
5. Celulele animale cultivate
6. Celule vegetale cultivate
7. Tesuturi
SUSCEPTIBILITATEA LA RUPERE A CELULELOR
Forma i rezistena celulelor si natura lor
Celulele prezinta o mare varietate de
morfologii,
structuri,
mrimi,
EXEMPLE:
Bacteriile: sfere, baghete, elici, filamente.
Fungiile: de tip micelar, pseudomicelar,
unicelular.
Rezistena, rigiditatea i forma celulelor
este data de PERETII CELULARI.
Bacterii gram positive Bacterii gram negative

Membrana celulara
Celule animale
caracterizate de lipsa pereilor celulari
prezint o membran celular alctuit
dintr-un strat dublu de lipide
Lipsa peretelui celular rigid:
permite dezvoltarea unei mari diversiti de
celule, esuturi i organe;
permite dezintegrare uoar a unor astfel de
celule.
Celulele animale fiind relativ mari (1 100
m), sunt foarte vulnerabile la forfecare.
Celule vegetale
Au pereii constituii din carbohidrai
compleci
insolubili (celuloz i hemiceluloze),
lignin i
cear care nconjoar membrana
plasmatic:
Procedeul utilizat pentru
dezagregare depinde de:
usurinta de rupere a peretelui
celulelor,
caracteristicile de stabilitate ale
produsului,
uurina extraciei produsului
din resturile celulare,
viteza metodei,
costurile asociate.
 Dezagregare celular folosind moara cu bile

Acest echipament const dintr-un vas tubular

din metal sau sticl groas n care suspensia de
celule este plasat mpreun cu mici sfere de
metal sau de sticl.
Vasul tubular este apoi rotit n jurul axei sale i
ca rezultat se produce rostogolirea sferelor in
direcia rotatiei. La viteze de rotaie mai mari,
unele sfere se deplaseaza n partea superioara
a cilindrului dupa care acestea cad peste
amestecul de celule provocand un impact
mecanic care conduce la ruperea peretelui
celular.
Dezagregare celular folosind Dezagregare celular folosind
moara de tip rotor -stator moara de tip presa franceza
Dezagregare celulara celular folosind detergeni
Detergenii perturba structura membranelor celulare prin solubilizarea
fosfolipidelor.
Aceste substane chimice sunt folosite n principal la ruperea celulelor de
mamifere.
Triton-X
Pentru a afecta celulele bacteriene, detergeni trebuie s fie utilizati n
conjuncie cu lizozimul.
In cazul celulelor fungice (de exemplu, drojdii i mucegai) pereii celulelor
trebuie s fie slbiti n mod similar, nainte ca detergenii sa poate aciona.
Detergeni sunt clasificati n trei categorii: cationici, anionici i neionici.
Detergeni neionici sunt preferai n bioprocesare deoarece acestia provoac
cel mai mic grad de deteriorare a moleculelor biologice sensibile cum ar fi
proteinele i ADN.
detergenii neionici utilizati n mod obinuit includ seria Triton-X i seria
Tween.
Cu toate acestea, trebuie remarcat c un numr mare de proteine
sunt denaturate sau precipita n prezena unor detergeni.
De asemenea, detergentul trebuie ndeprtat ulterior din produsu i acest
lucru implic, de obicei, o etapa suplimentare. Prin urmare, utilizarea
lizozimul
detergenilor este evitat n cazul n care posibil.
Distrugere celular folosind enzime
Lizozimul (o enzim extrasa din ou) distruge peretii celulelor bacteriene, n special
cele de tip gram pozitiv. Lisozimul singur nu poate perturba celulele bacteriene
deoarece nu poate penetra membrana celular. De aceea se prefera combinarea
lizozimului cu detergenti.
Lizozimul este, de asemenea, utilizat n asociere cu ocul osmotic sau metode
mecanice de distrugere celular.
Limitarea principal a utilizrii lizozimului este costul ridicat.
Distrugere celular utiliznd solveni organici
Acetona acioneaz n principal pe membrana celular prin solubilizarea
fosfolipidelor i prin denaturarea proteinelor sale.
Toluenul este cunoscut ca perturba peretii celulelor fungice.
Limitrile utilizrii solvenilor organici sunt similare cu cele ale detergenilor i
anume necesitatea de a elimina aceste produse in etapa finala.
Dezagregarea celular prin oc osmotic
Membranele celulare sunt semi permeabile i transferarea brusca a unei celule dintr-un
mediu izotonic in ap distilat (care este hipoton) are ca rezultat un flux rapid al apei
n celul.
Acest lucru ar avea ca rezultat expansiunea rapid a volumului celulei, urmat de
ruptura membranelor acestora. Daca celulele sangelui sunt brusc introduse n ap
acestea sufera hemoliza adic se dezagrega elibernd hemoglobina.
Socul osmotic este folosit n principal pentru celulele animale.
In cazul celulelor bacteriene i fungice, pereii celulelor au nevoie s fie partial degadati
nainte de aplicarea unui oc osmotic. Socul osmotic este utilizat pentru a elimina
substanele periplasmice (n principal proteine) din celule, fara degradari totale ale
acestora.
Precipitarea
Precipitarea este o metod tradiional, important, utilizata pentru purificarea
proteinelor i a acizilor nucleici.
Cel mai comun exemplu de precipitare este metoda fracionarii Cohn pentru
purificarea proteinelor din plasma.
Folosind aceast metod, care const dintr-o serie de trepte de precipitare, diversele
componente ale proteinelor din plasm uman sunt obinute n forme pura.
Biosepararea pe baz de precipitare implic n mod esenial conversia selectiv a
unei anumite componente a unui amestec complex dizolvat ntr-o form insolubil,
folosind procese fizice sau mijloace fizico-chimice.

Procesul de precipitare
Factorii care actioneaza in procesul de precipitare
Macromoleculele biologice pot fi precipitate prin:
1. Rcire
2. Ajustarea pH-ului
3. Adugarea de solveni cum ar fi aceton i etanol
4. Adugarea de sruri cum ar fi sulfatul de amoniu, sulfat de sodiu, uree i clorhidrat de
guanidina
5. Adugarea de reactivi biospecifici ca n imunoprecipitare
Un proces de precipitare prezinta urmtoarele
etape:
1. amestecarea
2. formarea germenilor
3. creterea germenilor prin difuzie
4. creterea germenilor prin convecie
Efectul temperaturii asupra solubilitii proteinelor Efectul pH-ului asupra solubilitii proteinelor
Sruri cum ar fi sulfatul de amoniu i
sulfatul sodiu expun zonele
hidrofobe ale proteinelor prin
ndeprtarea stratului de ap care
acoper, de obicei, aceste zone. Ca
rezultat gruparile hidrofobe de pe
moleculele de protein pot
interaciona cu alte grupari de
acelasi tip ceea ce duce n cele din
urm la agregarea proteinelor si
formarea de precipitat. Srurile pot
reduce, de asemenea, solubilitatea
proteinelor prin ecranare ale
gruprilor ncrcate care menin n
mod normal, proteinele n soluie.
Precipitarea proteinei folosind saruri de tip sulfat de amoniu
Centrifugarea

O centrifug este un dispozitiv care separ particulele sau macromoleculele din suspensii n funcie de
dimensiunea, forma i densitate prin supunerea acestor sisteme dispersate la campuri gravitaionale
induse artificial. Centrifugarea poate fi utilizata numai n cazul n care materialul dispersat este mai
dens dect mediul n care este dispersat.

Densitile unor materiale biologice

 Centrifugarea

Centrifugile de laborator sunt folosite pentru separarea la scar

Centrifugile sunt clasificate n dou categorii:
1. centrifugi de laborator
2. centrifugi preparative
mic. Volumele de lichid uzuale vehiculate de astfel de
dispozitive sunt n intervalul 1 - 5000 ml. Materialul care
urmeaza a fi centrifugat este distribuit ntr-un numr
corespunztor de tuburi care sunt la rndul lor, ataate ntr-un
mod simetric la un bloc rotativ numit rotor.
Magnitudinea cmpului gravitaional indus este msurat n multiplii ai valorii
acceleratiei gravitationale G. Valoarea G este numita: fora centrifug relativ.
Valoarea FCR depinde de viteza de rotaie, precum i de modul n care tuburile de
centrifug sunt plasate in rotor:
Unde
r = distana de la axa de rotaie (m)
w = viteza unghiular (radiani / s)
g = acceleraia gravitaional (m / s2)
n = viteza de rotaie
Extracia
Extracia presupune partiionarea unui solut ntre dou faze nemiscibile sau
parial miscibile. De exemplu, penicilina este mai solubila n solvent organic
metilizobutilceton (MIBK) dect n mediul su de fermentaie apos la pH acid.
Aceasta proprietate este utilizata pentru purificarea penicilinei. Cnd are loc
extractia dintr-un mediu lichid n altul, procesul se numete extracie lichid-
lichid. Atunci cnd un lichid este folosit pentru a extrage substanele dizolvate
dintr-un material solid, procesul este denumit extracie ca solid-lichid. Cnd un
fluid supercritic este utilizat ca solvent de extracie, procedeul se refer la
extracia cu fluide supercritice (SFE).
Aplicaiile tipice ale extraciei n bioseparari includ:
1. Purificarea antibioticelor
2. Purificarea alcaloizilor
3. Purificarea proteinelor folosind sisteme apoase bifazice
4. Purificarea peptidelor i proteinelor cu masa moleculara mica
5. Purificarea lipidelor
6. Purificarea ADN-ului
Sistemele de solveni utilizate in procesele de
extractive:
1. Sisteme apoase / neapoase
2. Sisteme de extractie apoase bifazice
3. Extracie fluide supercritice
Aspecte generale privind extracia L L
Se consider o soluie binar, omogen, format dintr-un dizolvant iniial A i un
solut B.
Din aceast soluie, solutul B se poate separa cu ajutorului unui alt solvent S
dac:
(i) S i A sunt total nemiscibili (cazul ideal) sau parial miscibili;
(ii) B este solubil n S;
(iii) la echilibru, concentraia solutului B n solventul S (YB) este mai mare dect
concentraia aceluiai solut B n solventul iniial A (XB): YB > XB

Solutul B, solubil att n A ct i n S se repartizeaz ntre cei doi solveni dup un coeficient de
distribuie (de partiie, de repartiie):
Pentru sistemele ideale, coeficientul de distributie KN respect legea de repartiie
a lui Nernst.
KN > 1: solutul trece preponderent n extract,
KN < 1: solutul rmne preponderent n rafinat,
KN = 1, solutul B se repartizeaz n mod egal
ntre cei doi solveni A i S, separarea prin extracie nefiind posibil.
Pentru scopuri practice, extracia L L este posibil dac KN > 3.
Pentru realizarea extraciei L L este necesar parcurgerea
urmtoarelor etape:
(1) contactarea soluiei iniiale (A + B) cu solventul S (amestecarea),
(2) solubilizarea i difuzia solutului B n solventul S (transferul de mas
al solutului),
(3) separarea celor dou faze: extractul (E) i rafinatul (R),
(4) recuperarea solventului din extract (uzual prin distilare);
(5) desolventarea rafinatului (prin distilare sau stripare).
Ca operaie unitar, extracia L L este preferat distilrii atunci cnd:
(1) volatilitatea relativ a componenilor amesteculuide separat este apropiat de
unitate;
(2) componentul volatil este n concentraie mare sau are cldur de vaporizare mare
(apa, de ex.);
(3) temperatura la care s-ar face rectificarea este mare;
(4) substanele de separat sunt termolabile.
Pe acest din urm considerent s-a impus extracia L L n separarea antibioticelor,
nc din perioada n care procesul nc nu era bine fundamentat din punct de vedere
teoretic.
Aspecte particulare ale extraciei
lichid lichid n bioprocese
Printre metodele de separare i purificare utilizate n biotehnologii,
metodele de
extracie L L sunt utilizate frecvent, datorit faptului c aceste metode:
(1) sunt bine cunoscute i testate industrial cu succes n alte aplicaii,
(2) sunt adesea ieftine
Aplicaii ale extraciei lichid lichid
n bioprocese
separarea din mediul de cultur a unor metabolii (alcooli, acizi carboxilici, aminoacizi,
antibiotice),
prepararea unor produse farmaceutice isolate din compui naturali sau obinute prin
sintez parial (sulfamide, fenobarbital, antihistaminice, cortizon, estrogeni, alcaloizi),
rafinarea grsimilor vegetale i animale (procedeul Solexol de extracie cu propan,
extracia cu furfural),
extracia proteinelor din pete,
extracia vitaminelor A i D din uleiul de ficat de pete,
extracia vitaminei E din uleiurile vegetale.
Solveni de extracie
Solventul ideal:
selectiv,
nemiscibil cu materia prim,
ieftin i uor de recuperat,
netoxic, neinflamabil i necoroziv,
nu trebuie s reacioneze ireversibil cu solutul.

Solveni de extracie
Viscozitatea = sczut:
consumurile energetice pentru vehiculare sunt mai reduse
valoarea mic a viscozitii influeneaz favorabil coeficienii de transfer de cldur i de mas.
Diferena de densitate ntre solvent i materia prim = ct mai mare:
mbuntete dispersia
mrete viteza de deplasare a picturilor, favoriznd transferul de mas.
Tensiunea interfacial = valoare optim:
la valori prea mari, dei se uureaz separarea fazelor se ngreuneaz dispersia,
la valori prea mici exist pericolul formrii unor emulsii stabile ntre materia prim i solvent,
emulsii greu de separat.
Solveni de extracie
Solvenii utilizai n bioprocese trebuie n
plus s nu denatureze biomoleculele
extrase (peptide, proteine etc.).
Regul general:
cu ct biomoleculele sunt mai mari:
cu att mai complex este structura lor
spaial
cu att mai mare este riscul de denaturare.
peptidele mari i proteinele nu se
preteaz la extracia clasic cu solveni
organici, ele separndu-se prin extracie n
sisteme apoase bifazice.
Solveni de extracie
Pentru extracia produselor de biosintez polare:
alcooli,
esteri,
cetone,
Pentru extracia produselor nepolare:
eter de petrol,
diclormetan,
dicloretan etc.
n cazul solvenilor din prima categorie, principala
problem: solubilitatea relativ ridicat n mediul apos.
Creterea masei moleculare a acestor compui:
reduce solubilitatea lor n ap,
mrete tendina de formare a unor emulsii stabile cu aceasta
 EXTRACIA N SISTEME APOASE BIFAZICE

Extracia cu solveni organici - limitat la extracia unor componente

biologice cu
structur simpl i stabilitate relative ridicat.
Moleculele de natur proteic:
polare,
solubilitate n solveni organici nepolari redus.
Solvenii organici pot provoca denaturri ale substanelor proteice n
timpul extraciei.
Pentru separarea din faza apoas a proteinelor prin extracie lichid lichid,
este necesar un
solvent care:
s aib capacitate mare de solubilizare pentru proteine,
s nu denatureze proteinele,
s produc o tensiune interfacial sczut.
Extractia in sisteme apoase bifazice este un caz special de
extractie lichid-lichid care implica transferul substanei
dizolvate dintr-o faz apoas in alta. Cele dou faze apoase
nemiscibile sunt generate in situ prin adugarea unor
substane, cum ar fi polimerii i/sau sruri intr-o soluie
apoas. Dou tipuri de sisteme apoase bifazice sunt utilizate
n mod obinuit: K = coeficientul de partiie (-)
aA = constant de asociere pentru macromolecula i
1. sistem bifazic polimer-polimer
polimerul A
2. sistem bifazic polimer-sare
aB = constant de asociere pentru macromolecula i
Un sistem bifazic de tip polimer-polimer poate fi obinut, de polimerul B
exemplu, prin introducerea unor cantitati bine determinate b = constanta sistemului
de dextran i PEG intr-o solutie apoasa (care conine solutul
de interes) cand se formeaza astfel dou faze apoase, una CA1 = concentraia polimerului A n extract (kg/m3)
bogat n PEG i cealalta bogata n dextran. Sistemele cu CA2 = concentraia polimerului A n rafinat (kg/m3)
dou faze apoase pot fi, de asemenea, generate folosind un CBI = concentraia polimerului B n extract (kg/m3)
polimer (de exemplu, PEG sau dextran) i o sare cum ar fi
CB2 = concentraia polimerului B n rafinat (kg/m3)
fosfat de sodiu sau potasiu. Pentru determinarea
compozitiilor la care se formeaza cele doua faze se traseaza
diagrame binare de faza. Coeficientul de partiie al unui
compus biologic macromolecular intr-un sistem apos bifazic
format cu ajutorul a doi polimeri A si B se poate determina
folosind ecuaia:
 PEG

dextran
Obtinerea sistemele apoase bifazice (SAB) se bazeaz pe:
incompatibilitatea a doi polimeri hidrofili diferii la dizolvarea lor ntr-un
solvent usual cum este apa,
incompatibilitatea dintre un polimer hidrofil i o sare anorganic,
termoseparare.

In extractia apoasa bifazica a proteinelor utilizand combinatia PEG / dextran

comportamentul partiiei depinde n mare msur de compoziia relativa a
polimerului, de pH-ul soluiei i greutatea moleculara a proteinei. In general
vorbind proteina de interes migreaza in zona cu PEG in sistemul cu doi polimeri si
in zona cu polimer cand se utilizeaza sistemul polimer-sare.
In extractia apoasa bifazica a
proteinelor utilizand
combinatia PEG / dextran
comportamentul partiiei
depinde n mare msur de
compoziia relativa a
polimerului, de pH-ul soluiei
i greutatea moleculara a
proteinei. In general vorbind
proteina de interes migreaza
in zona cu PEG in sistemul cu
doi polimeri si in zona cu
polimer cand se utilizeaza
sistemul polimer-sare.
Schema general a procesului de extracie selective a moleculelor proteice din
lichidul intracelular
Extracia cu fluide supercritice
Un fluid supercritic (SF) reprezinta o forma speciala a materiei care are proprieti asimilabile lichidelor si gazelor. Orice
substan poate exista ca fluid supercritic peste temperatura critic i presiunea critica iar peste aceste valori substanta nu se
poate lichefia indiferent de valoarea presiunii aplicate. Un fluid supercritic combin proprietatea gazelor de a putea ptrunde
cu uurin substanele cu proprietatea lichidelor de a putea se dizolva diverse substante. n plus, densitatea poate fi schimbat
continuu prin modificarea presiunii. Utilizarea unui fluid supercritic (de ex dioxid de carbon) ofer o alternativ la solveni
organici care sunt mai puin prietenosi cu mediul. Puterea de dizolvare a unui fluid supercritic ofer un solvent sigur pentru
prelucrarea i extragerea de produse farmaceutice i produse alimentare. Extracia cu fluide supercritice are un potenial mare
pentru aplicatii analitice. Unele dintre principalele aplicaii ale extraciei de fluid supercritic sunt:
1. Separarea i purificarea uleiurilor eseniale i medicinale
2. ndeprtarea grsimii i a altor materiale care adera la echipamentele de process
3. obtinerea de produse alimentare (ex producia de "cafea decofeinizat i bere fr alcool)
Diagrama presiune temperatur cu evidentierea zonei supercritice
Un fluid supercritic poate fi utilizat att pentru extracia lichid-lichid precum si pentru extracia solid-lichid.

Posibili solventi utilizati in procesul de extractie cu fluide supercritice

Efectul presiunii in procesul de extractie cu fluide supercritice
Instalatie utilizata in procesul de extractie cu fluide supercritice
Utilizarea unei membrane ca o barier poroas intre alimentare si solventul de extracie ofer mai
multe avantaje. Unele dintre acestea sunt:
1. segregarea eficient a rafinatului i a extractului
2. Instalatie compacta
3. zona interfacial mare

Instalatie prevazuta cu membrane utilizata in procesul de extractie cu fluide supercritice

Solventi utilizati in procesul de extractie cu fluide supercritice