IZOLAREA ŞI CULTIVAREA PROTOPLASTILOR LA

PAPAVER SOMNIFERUM

•Manipularea genetică a plantelor - tehnici care permit izolarea şi cultivarea protoplaştilor.

Protoplaştii sunt celule nude, obţinute prin îndepărtarea pereţilor celulari rigizi.
Utilitatea culturilor de protoplaşti pentru ameliorarea plantelor, nu se rezumă numai la
calitatea lor de sisteme apte pentru ingineria genetică, ci s-au dovedit a avea un enorm
potenţial în creşterea variabilităţii genetice a plantelor. Studiile de regenerare a
plantelor din culturi de protoplaşti au condus la decelarea de mutaţii spontane şi în
special a variaţiilor somaclonale, care cuprind totalitatea schimbărilor genomice,
cromozomiale sau genice, induse în timpul dezvoltării in vitro a celulelor.
•Tehnica obţinerii protoplaştilor a devenit de mare interes, mai ales prin aceea că oferă
posibilitatea hibridării somatice si, pe calea regenerării, obţinerea unor genotipuri
valoroase.
•Tehnicile destinate transferului de nuclei, organite, fragmente mici de ADN în protoplaşti
sporesc şansele de transformare mai rapidă a plantelor în sensul obţinerii unor genotipuri
valoroase.
 Material si metoda

•Plantule de 5-7 zile, obţinute prin germinarea seminţelor de Papaver somniferum, în condiţii aseptice.

Tehnica izolării protoplaştilor cuprinde 3 etape:

1.Plasmoliza materialului vegetal;

2. Tratamentul enzimatic;
3.Purificarea protoplaştilor.

Compoziţia chimică a soluţiilor utilizate pentru izolarea protoplaştilor:

Soluţia de plasmoliză Soluţia enzimatică Soluţia de spălare

KH2PO4 27,2 mg/l Celulază 0,75g/100ml CaCl2 1,3g/l

KNO3 101 mg/l Macerozim 0,2g/100 ml NaCl 0,905g/l

CaCL2.H2O 1480 mg/l KCl 0,037g/l

MgSO4,7H2O 246 mg/l Glucoză 0,099g/l

KI 0,16 mg/l

CuSO4.5H2O 0,025 mg/l

Manitol 130 g/l pH-5,8 pH-5,8 pH-5,6

• 1. Plasmoliza materialului vegetal este prima etapă în izolarea protoplaştilor.
Plasmoliza cu soluţia 13% manitol este efectuată în scopul ruperii plasmodesmelor şi
pregătirii pereţilor celulari pentru tratamentul enzimatic. Durata plasmolizei este de 30
minute.

• 2. După îndepărtarea soluţiei de plasmoliză, materialul vegetal este tratat cu soluţia

enzimatică. Durata incubării în soluţia enzimatică variază în funcţie de tipul explantului
şi concentraţia amestecului enzimatic. Se poate utiliza o soluţie enzimatică conţinând
0,75 % celulază şi 0,2 % macerozim. Celulaza este un amestec de hidrolaze, care
desfac celuloza până la glucoză, iar macerozimul, al cărui component principal este
pectinaza, hidrolizează legăturile 1,4 galacturonice ale pectinei, eliberând acizii
galacturonici. Pectinliaza este o altă componentă a macerozimului, care catalizează
eliminarea acizilor nesaturaţi 4,5 galacturonici din pectină.
Incubarea materialului vegetal în soluţia enzimatică se realizeaza în condiţii de agitare,
timp de 16 ore, la întuneric.

3. Purificarea protoplaştilor reprezintă următoarea etapă în izolarea lor.

Se pot utiliza două metode:

• 1.Filtrarea prin sita de nylon cu diametrul porilor de 80 µm:

• Protoplaştii eliberaţi în urma tratamentului enzimatic sunt separaţi de resturile

tisulare nedigerate, la inceput printr-o sită metalică, apoi prin sita de nylon.
Filtratul este centrifugat timp de 5-7 minute (1000 rot/min). Supernatantul este
îndepartat, iar sedimentul format din protoplaşti este resuspendat în soluţia de
spălare. Operaţia de spălare a protoplaştilor se repetă de două ori, în scopul
eliminării totale a soluţiei enzimatice.

• 2.Flotarea protoplaştilor:

• Purificarea protoplaştilor prin metoda filtrării şi centrifugării prezintă dezavantajul

distrugerii protoplaştilor într-o proporţie destul de mare. De aceea putem recurge
la o altă metodă, care să inlăture acest neajuns.

• Sedimentul de protoplaşti obţinut după prima spălare, este resuspendat într-o

soluţie concentrată de sucroză (40 %). Se centrifughează timp de 5 minute,
protoplaştii se adună la suprafaţa într-o bandă verde, care va fi colectată şi
resuspendată în mediul de cultivare al protoplaştilor.
 Mediul de cultivare al protoplastilor
Mediul Gamborg (săruri minerale + vitamine)
• manitol 54,6 g/l
• glucoză 20,0 g/l
• hidrolizat de cazeină 1,0 g/l
• 2,4 D 1 mg/l
• kinetina 2 mg/l
• pH 5,8

•Protoplaştii purificaţi prin cele două metode mai sus amintite, sunt
resuspendaţi în mediul nutritiv pentru protoplaşti. Cultivarea lor se
face la întuneric şi la temperatură constantă (23-24°C).

• Protoplaştii proaspăt izolaţi îşi refac peretele celular în decursul a

48 ore, iar după trei zile se pot observa primele diviziuni.

•Pentru cultivarea protoplaştilor pot fi utilizate atât medii lichide cât

şi medii agarizate.
•Cultivarea protoplaştilor pe mediul solid prezintă avantajul unei mai
bune vizualizări a diviziunilor celulare şi a agragatelor celulare, care
premerg formării calusului.
• Imediat după izolare - determinarea viabilitatii
protoplaştilor la microscopul optic în contrast
de fază. Pe o lamă se pune o picatură din
suspensia de protoplaşti şi se acoperă cu o
lamelă. Forma sferică şi existenţa unui perete
continuu la periferia protoplastului indică faptul
că protoplaştii sunt viabili. Protoplaştii neviabili
au o formă neregulată şi cloroplaştii sunt
aglomeraţi în grămezi dezordonate.

• La 7 zile de la izolarea protoplaştilor putem

determina "capacitatea de regenerare" a
celulelor prin numărarea stadiilor de diviziune.
Capacitatea regenerativă a fost stabilită ca
raport între numărul celulelor divizate (după 7
zile) şi numărul total al protoplaştilor (după
izolare).
• Pentru numărarea protoplaştilor se poate utiliza
o cameră de numărare a celulelor de tip Fuchs-
Rosenthal 0,2 mm. Densitatea optimă a
protoplaştilor pentru diviziune şi implicit pentru
regenerare este de 5.104-1.105 protoplaşti/ml.
 METODA HIBRIDĂRII CELULARE LA PLANTE PRIN FUZIUNI DE
PROTOPLAŞTI

•Hibridarea somatică este o tehnică de mare actualitate pentru aplicaţiile sale în genetică,
biologie celulară. Prin intermediul înmulţirii parasexuate se pot realiza genotipuri noi, care
sunt imposibil de realizat prin metodele convenţionale de ameliorare.

•Inducerea fuziunii protoplaştilor se poate realiza utilizând o gamă foarte largă de

agenţi de fuziune cum ar fi: nitratul de sodiu, proteine de agregare dar cel mai
eficient este polietilenglicolul (PEG) - introdus relativ recent în tehnicile de hibridare
somatică la plante, polietilenglicolul este un polimer solubil în apă şi eficienţa sa în
aglutinare şi fuzionare este datorată capacităţii de a forma legături ionice între
constituienţii de suprafaţă ai celulei.
Inducerea fuziunii protoplaştilor la Papaver somniferum şi Papaver pseudo-orientale
cu ajutorul polietilenglicolului

•Izolarea protoplaştilor a fost realizată prin metoda enzimatică descrisă utilizând două surse
de protoplaşti: cotiledoanele plantulelor de Papaver somniferum şi suspensii celulare de
Papaver pseudo-orientale.

•Pentru inducerea fuziunii celor două tipuri de protoplaşti s-a utilizat tehnica culturii "în
picătură".
• Protoplaştii izolaţi de la cele două surse sunt amestecaţi în raport de 1:1 (aproximativ
100µl fiecare) într-un vas Petri şi se lasă 10 minute la temperatura camerei.
•Se adaugă apoi 2-3 picături din soluţia de PEG (polietilenglicol) la periferia suspensiei
mixte de protoplaşti, după care amestecul se incubeaza 30 minute, timp în care are loc
aderarea şi aglutinarea reciprocă a protoplaştilor.
•După tratamentul cu soluţia PEG, aceasta este înlocuită treptat cu mediul de cultivare al
protoplaştilor.

•Atât procesul adeziv, cât şi cel de fuziune necesită o anumită compoziţie a soluţiei de
fuziune.
 Compoziţia soluţiei PEG

•-polietilenglicol 50 g
•-CaCl2 2H2O 120 mg
•-KH2PO4 10 mg
•-glucoza 1 g
•- pH 5,8

•In timpul fuziunii, marginile externe ale protoplaştilor se unesc.

•Organitele celulare migrează către periferia celulelor fuzionate. In general, amestecul
complet al citoplasmelor are loc după aproximativ 12 ore. Natura hibridă a produşilor de
fuziune este evidentă numai după fuziunea nucleilor mitotici şi parcurgerea mai multor
cicluri celulare.

Selecţia hibrizilor somatici vegetali poate avea loc în diferite faze:

•-imediat după fuziune, înaintea apariţiei diviziunii;

•-după apariţia calusului;
•-după regenerarea de hibrizi somatici.