Alexandra Tofan

Seria A, Grupa 4

Prelucrarea tesuturilor
- Sectiuni fine in parafina -

Prelucrarea esuturilor pentru obinerea seciunilor fine la parafin (folosite n microscopia

fotonic) se realizeaz n 5 etape, i anume: recoltarea, fixarea, splarea, includerea n parafin i
secionarea la microtom.

Recoltarea probelor tisulare presupune metode fie invazive (biopsia), fie minim invazive.

Biopsia reprezint decuparea unui fragment de esut viu i poate fi clasificat n biopsie
exciziional (pentru leziuni care sunt ndeprtate complet n cadrul unor intervenii chirurgicale),
incizional (pentru leziuni care nu sunt ndeprtate complet, ci numai explorate chirurgical) sau
de raclare (mai ales pentru leziuni cutanate).

Avantajul biopsiei const n sigurana diagnosticului, ns sunt necesare incizii ce pot lsa
cicatrice, recuperarea este mai ndelungat, iar riscul de complicaii (hemoragii, supuraii, etc.)
este mai mare.

Metodele minim-invazive sunt utilizate n cazul esuturilor care nu sunt n mod direct i
convenabil accesibile unei biopsii, cum ar fi zonele accesibile prin: explorare datorat orificiilor
naturale (endoscopii asociate cu recoltare prin biopsie, puncie, citologie exfoliativ), explorare
laparoscopic sau puncionare/explorare percutanat (recoltare prin aspiraie sau puncie-biopsie).

Puncia-biopsie (percutan) poate fi biopsie aspirativ cu ac fin (FNAB - metoda cea mai puin
invaziv) sau biopsie cu ac gros (core needle).

FNAB se aplic pentru extracia unui fragment mic dintr-o leziune i este indicat pentru
formaiuni solide sau pentru cele tumorale cu aspect chistic, ns nu solide (formaiunile trebuie
s fie mai mici de 1cm). Avantajele FNAB sunt rapiditatea i facilitatea, nefiind necesar
anestezia, ns metoda nu permite diferenierea ntre o leziune malign i una invaziv.

Metoda core-needle utilizeaz un ac mai gros, prevzut cu un sistem de tiere, dar fr aspiraie.
Se obine un cilindru de esut, fiind posibil diferenierea ntre o leziune malign i una invaziv,

Page 1 of 6
 Alexandra Tofan
Seria A, Grupa 4

ns exist riscul de apariie a unor hematoame locale. Biopsia cu ac gros este indicat pentru
leziunile solide, dar nu chistice, ns sigurana rezultatului negativ al probei nu este complet.

Fixarea are drept scop esenial att conservarea constituienilor celulari ntr-o stare ct mai
apropiat de cea vie, ct i includerea i colorarea acestora. Fixatorii histologici determin o
coagulare i un anumit grad de polimerizare a proteinelor. Acest lucru duce la blocarea reaciilor
enzimatice catalizate de elemente proteice, mpiedicnd distrugerea autolitic a esuturilor.

Fixarea difer n funcie de gradul conservrii morfologice, de natura constituienilor chimici ce

trebuie conservai, de volumul fragmentelor tisulare (vizeaz viteza de ptrundere a fizatorului)
i de tipul reaciilor de culoare sau histochimice care urmeaz a fi efectuate.

Prin urmare, un bun fixator citologic trebuie s ptrund rapid n esut fr a modifica forma
probei i s permit colorarea i includerea eficient. Important este faptul c fixatorii acioneaz
nu numai asupra unor componente celulare, ci i asupra macromoleculelor plasmalemei sau din
spaiile extracelulare (glicoproteine i proteoglicani). n cazul membranei, fixatorii creeaz o
reea poroas prin distrugerea bistatului fosfolipidic, reea prin care pot trece i molecule mai
mari, precum cele ale parafinei sau ale coloranilor. Agenii fixatori coagulani (clorura de Hg,
acidul picric, sulfatul de Zn) determin apariia unor pori mai mari comparativ cu cei
necoagulani (formaldehida, glioxalul, glutaraldehida).

Pentru fixare se folosesc ageni fizici sau chimici.

Agenii fizici sunt reprezentai de metode ce utilizeaz cldura, desicare la temperatura

laboratorului, criodesicare, precum i metode de congelare-substituie (rcirea este numai o
metod de prevenire a autolizei, nu i de fixare).

Fixarea prin desicare la temperatura laboratorului se aplic att n cazul frotiului de snge
destinat colorrii, ct i pentru frotiurile de mduv osoas i pentru amprentele de organe.
Aceast metod trebuie completat cu un alt fixator n momentul colorrii.

Criodesicarea nu este o metod de fixare propriu-zis deoarece nu determin denaturarea

proteinelor. Acesta se bazeaz pe eliminarea apei din probe prin sublimare, rcire la t < 0C i
plasare ntr-o incint cu p < 4,6mmHg. Se descriu trei etape, i anume: congelarea piesei (pentru

Page 2 of 6
 Alexandra Tofan
Seria A, Grupa 4

oprirea tuturor reaciilor vitale de la nivel tisular), desicarea sub vid i tratamentul ulterior al
piesei (impregnarea i includerea).

Fixarea prin congelare-substituie are un principiu similar criodesicrii, ns esuturile congelate

sunt transferate n etanol, eter sau glicol rcit (la -20/-50C), ceea ce permite stabilirea unui
echilibru ntre faza solid (ghea) i cea lichid (ap i solvent organic n proporii variabile cu
tC). Cnd excesul de solvent este mare, toat apa poate fi extras din pies printr-o deshidratare
progresiv.

Agenii chimici pot fi fixatori coagulani sau necoagulani.

Cei coagulani (alcooli, HCl, acid cromic) denatureaz i precipit proteinele care nu sunt n mod
normal vizibile la microscopul fotonic i de aceea sunt folosii n special n microscopia fotonic
i nu n cea electronic. Metanolul i etanolul sunt utilizai n cazul frotiurilor, ns nu i pentru
fixarea tisular deoarece determin friabilitatea pieselor.

Fixatorii necoagulani formeaz puni intra i intermoleculare, determinnd o tranziie a

citoplasmei de la stare lichid la stare de gel (formaldehida, formalina, glutaraldehida). Soluiile
de formaldehid 4% sau formalin 10% se neutralizeaz cu sruri anorganice. Glutaraldehida
altereaz -helixul proteinelor i se utilizeaz n soluie tamponat 2%, n special n microscopia
electronic (piesele sunt ultrafine, ceea ce permite penetrarea facil a fixatorului). Agenii
oxidani (4 , 2 2 7 i tetraoxidul de osmiu) realizeaz legarea ncruciat i denaturarea
proteinelor. Tetraoxidul de osmiu este cel mai bun fixator chimic i se folosete n microscopia
electronic, ns prezint toxicitate crescut.

Factorii care pot afecta fixarea sunt pH-ul (trebuie meninut ntre limite fiziologice 4-9, iar
soluiile fixatoare trebuie tamponate la 7,2-7,4), osmolaritatea (soluiile hipertone produc
ratatinarea celular, iar cele hipotone pot determina edem celular i o slab fixare) , dimensiunea
piesei (optim 1-4mm), volumul fixatorului (min. de 15-20 ori mai mare dect volumul tisular)
temperatura (tC viteza de fixare) i durata fixrii (viteza de fixare1mm/h).

Splarea nu se aplic pentru probele desicate sau pentru frotiuri.

Includerea n parafin asigur ndeprtarea apei din esutul splat i fixat i nlocuirea acesteia
cu un mediu care se solidific i permite realizarea unor seciuni fine (3-15m). Parafina

Page 3 of 6
 Alexandra Tofan
Seria A, Grupa 4

(amestec de hidrocarburi alifatice) este intens utilizat n combinaie cu ceara de albine i

deoarece este nemiscibil cu apa, dup deshidratarea piesei, aceasta este transferat prin bi
succesive de alcool etilic, de solvent organic i n final de parafin topit.

Prin urmare, includerea n parafin cuprinde patru etape, i anume: deshidratarea (6 bi de cte
15min n alcool), ndeprtarea alcoolului (3 bi de cte 5min n aceton), clarificarea (3 bi de
cte 15min n xilol), impregnarea (3 bi de cte 5min n parafin topit) i includerea propriu-
zis (piese conservate n blocuri pe termen nedefinit).

Secionarea la microtom se aplic blocurilor de parafin. Seciunile trebuie aplicate pe lama de

sticl bine degresat, etalarea fcndu-se pe un mediu lichid, slab nclzit.

Etalarea pe lam presupune acoperirea acesteia cu o pictur de soluie apoas de gelatin sau
albumin Mayer, aplicarea seciunilor, picurarea de ap distilat pentru ca seciunile s pluteasc
i aezarea pe o plac nclzit la tC< t top parafina .

Dup ntinderea complet a seciunilor, apa n exces se ndeprteaz iar lamele se introduc n
termostat la 37C pentru 24h.

- probe congelate -

Tehnica secionrii pieselor congelate se realizeaz n dou etape, recoltarea i fixarea &
includerea, i permite analiza microscopic rapid a unui preparat (~10min), comparativ cu
tehnica seciunilor fine n parafin (~16h).

De aceea, aceast metod este utilizat n cadrul examenelor anatomopatologice rapide (tehnica
chirurgical Mohr/chemiochirurgie sau examinarea n timpul operator a unei tumori cu
presupus metastaz), n evidenierea unor componente tisulare (lipide, enzime,
mucopolizaharide) care se pierd la prelucrarea prin alte tehnici i n efectuarea unor preparate
ce permit aplicarea altor tehnici (imunofluorescena) pentru detectarea de antigene. Grosimea
seciunilor este de 5-60m.

Page 4 of 6
 Alexandra Tofan
Seria A, Grupa 4

Recoltarea decurge similar, prin biopsie, puncie bioptic, etc. Fixarea i includerea constau n
congelarea probei, descriindu-se urmtoarele etape: acoperirea piesei cu o soluie crioprotectoare
i sigilarea cu o membran PET, amplasarea piesei n incinta criotomului (-58C) i congelarea.
Se folosesc gelul crioprotector OCT (optimal cutting temperature) i metoda de pre-rcire a
piesei pentru a menine starea optim a probei i pentru a accelera fixarea i includerea.

- Sectiuni ultrafine pentru t.e.m. -

Microscopia electronic ofer informaii cu privire la ultrastructura celulelor i componentelor

lor, att n condiii normale, ct i n stare patologic. Principiul preparrii seciunilor pentru
TEM este similar cu cel al metodelor anterioare, cuprinznd ca etape recoltarea, fixarea, splarea,
deshidratarea, includerea, secionarea i amplasarea probelor pe grile de examinare.

Recoltarea trebuie s fie realizat ct mai rapid pentru a preveni eventualele schimbri care pot
aprea la nivel tisular. Aceast etap decurge fie sub o lup binocular, fragmentele fiind
preluate cu o pens i introduse n fixator la rcit (4C), fie, n cazul pieselor obinute prin biopsii
sau puncii, cu amplasarea fragmentelor pe hrtie fotografic (fr emulsie de 3 ) i
adugarea de fixator.

Fixarea se poate face prin metode fizice (congelarea, deshidratarea inert, substituia prin
congelare) sau chimice, cu soluii fixatoare, care sunt compuse din soluii tampon i agentul
fixator propriu-zis.

Soluiile tampon difer n funcie de compatibilitatea cu agenii fixatori (tampon cacodilat -

compatibil cu toi agenii fixatori; tampon fosfat - incompatibil cu ionii de calciu i uranil;
tampon veronal - incompatibil cu aldehidele fixatoare).

Agenii fixatori pot fi organici (formaldehida, glutaraldehida, acroleina, acidul tanic) sau
anorganici (4 , 2 2 7 i tetraoxidul de osmiu). De obicei se folosete o dubl fixare
(prefixare cu glutaraldehida tamponat i postfixare cu tetraoxid de osmiu tamponat).

Page 5 of 6
 Alexandra Tofan
Seria A, Grupa 4

Splarea se face timp de 5-20min sau peste noapte, cu aceeai soluie tampon din compoziia
fixatorului.

Deshidratarea necesit utilizarea unor ageni de deshidratare miscibili cu materialul de

includere (acetona - vestopal, etanol i propilenoxid - epon).

Includerea se realizeaz n rini poliesterice (vestopal) i epoxidice (epon) sau n medii

hidrofile (durcopan, hidroxipropilmetacrilat), care conserv lichidele i enzimele intracelulare.

Secionarea presupune utilizarea unor ultramicrotoame (cu cuite de sticl sau de diamant)
pentru realizarea de seciuni ultrafine (~1000) ce pot fi traversate de fasciculul de electroni.
nainte de secionarea propriu-zis, blocurile cu preparate biologice trebuie fasonate (conferirea
unei forme piramidale) manual, sub o lup binocular, pn ce vrful atinge 0,1-0,2mm.

Amplasarea probelor se face pe grile sau discuri de examinare (confecionate din Cu, Ni, Ag,
Pt, oel inoxidabil, molibden sau tungsten) acoperite cu pelicule organice sau anorganice fine i
transparente la fasciculul de electroni.

Page 6 of 6