BIOCEL

I. Pregatire preparatului pentru MO

- Celulele și celelalte elemente prezente în țesut să fie păstrate în condiții cât
mai apropiate de condițiile lor naturale (FIXARE)
- Preparatul să fie transparent, subțire, plat
- Diferitele componente să fie colorate diferit (COLORARE)

Posibilități de preparare
- secțiuni
- „in toto” (structuri/organisme mici, suficient de subțiri pt. a fi întinse pe o
lamă)
- zdrobire (pt. studiul conținutului celulei)
- frotiuri (celule suspendate în fluid)
- culturi celulare

Preparatul microscopic permanent

Modalitatea de examinare a unor celule, fragmente de ţesut sau organ,
cărora li s-au suprimat procesele vitale prin fixare.
Permite examinarea la microscopul optic a principalelor caracteristici ale
celulelor şi a modului lor de organizare.

Un preparat microscopic este alcătuit din:

1. obiect de examinat (subţire şi transparent)
2. mediu de montare (transparent)
3. suport de montare (lamă şi lamelă/grilă)

Scopul realizării – de a conserva

- structurile celulare şi
- raporturile dintre ele pe un timp nelimitat.
Este folosit în: - clinică
- laboratorul de anatomie patologică
- medicină legală
- cercetare
- scop didactic

Etapele obţinerii preparatului microscopic permanent

1. RECOLTAREA
= Operaţia prin care fragmentul de ţesut/organ este prelevat de la om, animal viu
sau de la cadavru
1. dimensiunea pieselor să nu depăşească 5 mm
2. instrumentele bine ascuţite pentru a evita zdrenţuirea şi pierderea
paralelismului dintre planuri
3. adecvată în funcţie de tipul organului; se vor evita modificările de volum,
formă şi relief

RECOLTAREA BIOPSICĂ
• Se recoltează de la om sau animal viu şi se practică în scop diagnostic.
• Se realizează prin :
1. raclare
2. puncţie-biopsie
3. aspiraţie cu ac fin
4. intervenţie chirurgicală

RECOLTAREA NECROPSICĂ
• recoltarea de la cadavrele umane se practică în laboratoarele de anatomie
patologică şi medicină legală cu scopul de a confrunta datele de anatomie clinică
şi tanatogenetice
• după sacrificarea animalului, în scop de cercetare sau didactic

2. FIXAREA
Celulele și celelalte elemente prezente în țesut să fie păstrate în condiții cât mai
apropiate de condițiile lor naturale

• etapă critică pentru un bun preparat

• proces fizic/ chimic prin care: sunt oprite rapid procesele vitale (celulare)
se pastreaza cu alterări minime - volumul,
forma, relieful şi raporturile moleculare (înstructuri/ultrastructuri) și spaţiale
(întrestructuri/ ultrastructuri)

Prin fixare urmărim:

1. Conservarea ţesuturilor
2. Prevenirea pierderii de constituenţi celulari
3. Creşterea diferenţierii optice a structurilor celulare
4. Mărirea consistenţei ţesuturilor în scopul de a facilita trecerea lor prin
celelalte etape şi mai ales pentru secţionare
Fixare pt MO:
Fizică: criofixare
Chimică: alcool metilic, acetonă, formol
3. INCLUDEREA
- etapa care asigură condiţii optime pentru secţionarea pieselor
- precedată de deshidratare în soluţii de alcool de concentraţii crescânde
PARAFINA pt MO

4. SECTIONARE: cu microtomul (5microm)

5. COLORARE sau impregnare/contrastare

- creşterea contrastului între elementele -sulare sau celulare cu ajutorul
coloranţilor
- Prin metode compatibile cu metoda de fixare
- Pot fi metode universale (HE) sau specifice ţesutului studiat (Nissl)

6. MONTARE (între lamă şi lamelă/pe grilă)

- permite conservarea specimenelor pentru cât mai mult timp între lamă şi
lamelă, în diferite medii de montare, iniţial fluide
- Protejarea secţiunilor fragile de eventualele deteriorări
- Conservarea coloraţiei şi asigurarea unui mediu optic omogen şi transparent
necesar
examinării microscopice

7. ETICHETAREA
Pe fiecare lamă se notează:
– tipul celular/tisular
– sursa de recoltare – fixatorul
– metoda de colorare
– data realizării preparatului

II. Pregatire preparatului pentru ME de baleiaj / scanning (SEM)

Pentru o imagine convențională de SEM, suprafața probelor de analizat
trebuie să fie conductivă electric și să fie asigurată împământarea pentru a
împiedica acumularea încărcării electrosta-ce a acestei suprafețe
- Probele biologice sunt acoperite cu un strat foarte subțire de materiale
conductive (Au, Au/Pd, Pt, Os, Ir, Tu, Cr). Există tehnici de SEM care permit
examinarea probelor fără acoperire – ESEM (Environmental SEM).

1. Recoltare
2. Fixare: fizica - Q sau inghetare / chimica - dubla, cu glutaraldehida
(stabilizeaza proteinele) si postfixare cu tetraoxide de osmiu ( stabilizeaza
proteinele si lipidele)
3. Deshidratare (soluții de alcool de % diferite)
4. Includere: epon
5. Sectionare: cu ultramicrotomul 40-100nm
6. Colorare: Contrastare în soluții de metale grele (acetat de uranil și citrat de
plumb)
7. Montare: pe grile de cupru
8. Acoperire (învelire) cu metale înalt conductive
9. Examinare
10. Etichetare: Pe fiecare lamă se notează: – tipul celular/tisular
– sursa de recoltare
– fixatorul
– metoda de colorare
– data realizării preparatului

Coloratii TOPOGRAFICE = utilizate pentru evidentierea celulelor in

ansamblul tesutului.

Coloratia MASSON = permanenta, trichrome

- Hematoxilina ferica Nuclei: negru
- Albastru de anilina Citoplasma: rosu-violet
- Fuxina acida Fb.colagen: albastru intens

Coloratia AZAN = tricromatica, simultana (la trahee)

- Nucleu: rosu viu
- Citoplasma: rosu
- Fb.colagen: albastru deschis
- Fb.musculare striate: rosu, orange, galben.

- azocarmin C
- albastru Heidenhein

Coloratia HE = cea mai utilizata; progresiva

- nucleu (acizi bazici): violet-albastru
- citoplasma (proteine): roz-rosu + descris ineract.gr.auzocrome-substrat
Coloratia Van Gieson = tricroma; ortocromatica = substratul se coloreaza in
aceeasi culoare cu a colorantului; folosita in anatomie patologica
- Nucleu: negru
- Citoplasma: galben
- Fb.colagen: rosu intens

-hematoxilina ferica
- ac.picric
- fuxina acida

METACROMAZIA = capacitatea unui substrat de a se colora in alta culoare

decat cea a substratului
- exista niste grupari functionale situate regulat, la o distanta mica una de
cealalta
- dispunere colorant ordonat, f aproape, molecula de molecula
- permite reasezari ale e pe alte nivele energetice si absorbtia de alte
lungimi de unda din spectrul vizibil.

Albastru de TOLUIDINA: granulatiile din mastocite se coloreaza rosu-

violet

Coloratii CITOLOGICE = utilizatie pt evidentierea structurilor/ organitelor

din celule

Metoda CAJAL DA FANO

- Nucleii: necolorati
- Aparatul Golgi: retea perinucleara neagra
- Citoplasma: aurie

Metoda REGAUD (hematoxilina ferica)

Evidentiaza mitocondriile
- Nuclei: incolor
- Nucleol: gri
- Mitocondrii: graulatii negre
Metoda FROTIURILOR
Se realizeaza prin intinderea celulelor in monostrat, pe lama. Se pot
examina: celule sangvine, cel.epiteliale descuamate/exfoliate, sedimente
celulare, amprente de tesuturi/organe parenchimatoase.
Calitati frotiu bun:
1. subtire in monostrat celular (intr-un singur strat de celule)
2. intins uniform
3. ambele margini pe lama
4. se termina prin franjuri pe lama (=2/3 din L acestuia)
5. la marginea lamei se trece numele pacientului/ NO

Pentru colorare frotiu:

1. coloratia May-Grunwald: contine eozinat de albastru de metilen, solubilizat in
idem jos
2. coloratie Giemsa: contine eozinat de azur de metilen solubilizat in am.alcool
metilic si glicerina neutra

Executare (pasi)
1. recoltare
2. intindere folosind 2 lame de sticla: portobiect - cea pe care se efectueaza
frotiul si executoare - cea cu care se intinde frotiul prin glisare la unghi de 45
grade.
3. uscare fizica

Frotiu sangvin - coloratie M.G.G.

- granulocite: nucleu - violet; citoplasma - roz
- agranulocite: nucleu - violet; citoplasma - albastru

HISTOCHIMIA = modalitate de evidentiere a unor bimolecule in tesuturi

Histochimia GLUCIDELOR perminte evidentierea:

- struct.glucidice de pe P (glicopropteine, proteoglicani) si L (glicolipide)
- polizaharidelor (glicogen)
(mono/di-zaharidele nu se pot evidentia pt ca sunt solubile si se pierd in timpul
pregatirii probelor)
Metode:
- Metoda PAS - evidentiere glicoproteine
- Metoda Carmin-amoniacal best - evidentiere glicogen
- Bazofilia
- Metacromazia
Histochimia LIPIDELOR
Colorantul este mai solubil in lipide decat in propriul solvent = acumulare in
incluziuni lipidice
Metode:
SUDANOFILIA - coloranti Sudan: III rosu-portocaliu
IV rosu
B negru
BB albastru

HISTOENZIMOLOGIE
- evidentiaza localizarea enzimelor pe baza activitatii lor
Metoda PEARSE: evidentiaza dehidrogenazele (SDH - enzima marker a
mitocondriilor)
Metoda GOMORY: captura fosfat de plumb (incolor) si se transforma in sulfura
de plumb (neagra) - evidentiaza activitatatea fosfatazelor
Etape obtinere preparat citoenzimologic
1. recoltare
2. fixare prin congelare rapida la temp.joase
3. sectionare
4. incubare cu substratul (ofera enzimei conditii cat mai apropiate de cele in
vivo)
5. montarea - cu glicerina/ sirop Apathy

Alte enzime pt organite:

Mb.mitocondriala interna: SDH
Mb.mitocrondriala externa: MAO
Lizozomi: fosfataza acida
RE: gl 6-Paza
Aparat Golgi: cis: gl 6P-aza
trans: fosfataza acida
dinucleozid fosfataza?

IMUNOMARCARE = Reprezintă totalitatea tehnicilor care folosesc anticorpi

pentru localizarea antigenelor corespunzătoare.
Imunomarcare pt MO: imunohistochimie, imunofluorescenta
ME: imuno-electrono-microscopia
Principiul: Recunoașterea specifică a unui antigen (Ag) de către un un anticorp
(Ac). Ac vor fi purificati din serul animalelor si vor fi cuplati cu un sistem de
detectie:
  Enzima careia i se furnizeaza un substrat care va fi transformat intr-un
compus colorat (Imunohistochimie) - vizualizare in MO cu lumina directa
 Molecule fluorescente - viz.in microsop de fluorescenta
Exista imunomarcare prin metoda:
- directa: folosire anticorp primar marcat
- indirecta: folosire anticorp primar nativ si anticorp secundar marcat

IMUNOHISTOCHIMIA = cand Ac se va cupla cu o enzima, care va actiona

asupra unui S, pe care il va transforma intr-un compus colorat. Se poate
vizualiza cu MO la lumina directa
Proxidaza de hrean  DAB (3,3 diaminobenzidina)  culoare brun-negru
Fosfataza alcalina  BCIP  negru-violet
Pot fi marcate organite celulare, componente nucleare, structuri
membranare.

FLUORESCENTA = o varianta de luminescenta

O molecula capabila de fluorescenta (fluorocrom/fluorofor) excitata de o
lumina cu o lungime de unda, va emite o radiatie cu o lungime de unda
superioara, in spectrul vizibil.
Se pot vizualiza: ADN, microtubuli, ribozomi, filamente actina, kinetocori.
Imunofluorescenta DIRECTA
- folosire anticorp primar marcat
Principiul: Recunoașterea specifică a unui antigen (Ag) de către un un
anticorp (Ac). Ac vor fi purificati din serul animalelor si vor fi cuplati cu un
sistem de detectie:
- Molecule fluorescente - viz.in microsop de fluorescenta
O molecula capabila de fluorescenta (fluorocrom/fluorofor) excitata de o
lumina cu o lungime de unda, va emite o radiatie cu o lungime de unda
superioara, in spectrul vizibil.
Se pot vizualiza: ADN, microtubuli, ribozomi, filamente actina, kinetocori.

Imunofluorescenta INDIRECTA
- folosire anticorp primar nativ si anticorp secundar marcat
Principiul: Recunoașterea specifică a unui antigen (Ag) de către un un
anticorp (Ac). Ac vor fi purificati din serul animalelor si vor fi cuplati cu un
sistem de detectie:
- Molecule fluorescente - viz.in microsop de fluorescenta
 O molecula capabila de fluorescenta (fluorocrom/fluorofor) excitata de o
lumina cu o lungime de unda, va emite o radiatie cu o lungime de unda
superioara, in spectrul vizibil.
Se pot vizualiza: ADN, microtubuli, ribozomi, filamente actina, kinetocori.

IMUNO-ELECTRONO-MICROSCOPIA
Este cea mai buna metoda pentru detectarea si localizarea proteinelor in
diferite compartimente celulare datorita puterilor de marire si rezolutie
superioare.
Foloseste anticorpi care sunt absorbiti de particule de aur. Se poate realiza
pre-/post-includere.

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARA

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

E o metoda folosita pentru obtinerea unui nr mare de copii ale unei
secvente de ADN. Etape:
1. denaturarea ADN si separarea catenelor complementare prin incalzire (95°C)
2. adaugare primeri (secvente nucleotide complementare catenei matrita) dupa
ce scade putin temp
3. sinteza de noi secvente ADN sub influenta enzimei Taq-polimerazei (crestere
putin temp)
& repeat

Aplicatii practice: determinarea încărcăturii virale pentru virusuri ADN, ori RT-
PCR pentru virusuri ARN

RT–PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE–PCR)

= Metodă foarte sensibilă de detectare şi cuantificare a ARNm
- se porneste de la ARNm
- foloseste o reverse transcriptaza ce copiaza ARNm in cADN
- apoi urmează etapele PCR
Utilizată în diagnosticul unor boli genetice, cuantificarea expresiei
diverselor gene prin determinarea cantităţii de ARNm.

SECVENTIEREA GENICA
Permite descifrarea unei secvente de nucleotide care intra in structura unei
gene. Initial s-a folosit metoda Sanger, in prezent se lucreaza prin metode de
noua generatie (NGS - Next Generation Sequencing) in care se folosesc
nucleotide cuplate cu florocromi.

ELECTROFOREZA
Metoda prin care se studiaza proteinele si acizii nucleici. Se foloseste
pentru vizualizarea rezultatelor de PCR, pt controlul si validarea unor rezultate
de biologie moleculara. Se folosesc geluri de agaroza/ poliacrilamida.
Particulele incarcate electric vor migra intr-un mediu vascos sub influenta
unui camp electric.
a. unidimensională, când migrarea se realizează în gel într-o singură direcţie
b. bidimensională, când migrarea se realizează succesiv în două direcţii
Tipuri de ELECTROFOREZA UNIDIMENSIONALA:
1. SDS-PAGE
2. Focalizare izoelectrica = separarea electroforetica a proteinelor dintr-un
amestec pe baza punctului lor izoelectric

ELECTROFOREZA SDS-PAGE
Realizează separarea proteinelor dintr-un amestec pe baza greutăţii moleculare
(singurul paramentru care influeneţază migrarea)

ELECTROFOREZA BIDIMENSIONALA
- migrarea proteinelor în două direcţii:
1. prima direcţie – FOCALIZARE IZOELECTRICĂ = separarea electroforetica
a proteinelor dintr-un amestec pe baza punctului lor izoelectric
2. a doua direcţie – SDS-PAGE
Rezultatele se prezintă sub forma unei hărţi cu proteinele separate în planul
gelului.

MICROARRAYS (array - insiruire ordonata)

= tehnica de biologie moleculara ce analizeaza transcriptele genice dintr-
un produs biologic/cultura celulara. Determina simultan intr-o proba prezenta a
sute de gene transcrise / ARNm.

Principiu: hibridizare specifica intre un fragment de ADN monocatenar

(oligonucleotid) si fragmentul complementar (ADNc).
Se utilizeaza in:
- detectare modif.in expresia genica
- detectarea deletiilor/duplicatiilor genice
- detectarea mutatiilor (necesită plăci speciale, pe care oligonucleotidele matrice
sunt de fapt variaţii cu diferite mutaţii ale aceleaşi gene)

WESTERN BLOT = metoda de biologie moleculara

Utilizări:
- determinare semicantitativă de proteine
- oferă informaţii legate de modificarea de exprimare a proteinelor/ starea
lor de activare în decursul diferitelor procese celulare

ELISA = enzyme-linked imunosorbent assay

Este o reactie de tip antigen-anticorp prin care se urmareste
cuantificarea unei anumite proteine. Se foloeseste:
- frecvent pentru markeri tumorali pt urmarirea evolutiei bolii
- pt detectarea prezentei unui anumit anticorp, care sa indice o infectie de regula
virala.
Aplicatii practice: evaluarea existentei unui raspuns imun la un anumit virus

MULTIPLEXAREA
Se identifica simultan mai multe proteine într-o singură probă (de ex – serul
unui pacient). Multiplexare Luminex:
1. adaugare microsfere cu anticorpi primari atasati
2. adaugare proba
3. adaugare al doilea tip de anticorpi
4. adaugare fluorocromi
5. sortare microsfere din amestec in fc de culoare - fiecarei proteine ii
corespunde o culoare

TRANSFECTIILE
= metoda biologie moleculara de introducere a unor acizi nucleici in celula
Tranzitorii - cu plasmide bacteriene care nu se integreaza in genomul celulei
- de lunga durata - cu virusuri care se integreaza in genomul celulei
- Dupa transfectie, celula va exprima proteina codificata de materialul genetic
respectiv.
Aplicatii practice: productia de insulina
STUDIUL CELULELOR VII

IN VIVO = cand vrem sa studiem o celula/organ in organismul intact

Avantaj: rezultatele sunt edificatoare pentru procesul studiat la nivel de
organism
Dezavantaj: rezultatele sunt dificil de interpretat din cauza influentelor celorlalte
componente ale organismului.

IN SITU = cand organul de interes este mentinut la locul sau + controlam unele
influente (nervoase/endocrine)
Avantaje: se pot studia variatii ale procesului in mediu controlat
Dezavantaje: nu putem compara rezultatul cu cel in vivo

IN VITRO = cand celula/organul/tesutul este izolat din organism

Avantaje: permite control riguros
Dezavantaje: nu se garanteaza obtinerea acelorasi rezultate ca in vivo

Tehnici in vitro: baia de organ, cultura de celule.

BAIA DE ORGAN
• permite menţinerea viabilităţii unor fragmente de organ sau ţesuturi
• variante în funcţie de organul supus experimentului121212
• asigură o temperatură constantă
oxigenarea materialului biologic
posibilitatea controlării compoziţiei mediului din baie
culegerea de date funcţionale şi eşantioane de material biologic

CULTURA DE CELULE
Tehnică prin care populaţii omogene de celule sunt menţinute în viaţă
în incubatoare special destinate, cu atmosferă controlată (temperatură, amestec
de gaze, umiditate), în medii de cultură propice.
Etape de obţinere a unei culturi celulare
1. Digestia enzimatică a ţesutului, cu obţinerea unei suspensii de celule
2. Izolarea unei populaţii celulare pure
3. Însămânţarea în flacoane de cultură / plăci Petri (cultură primară)
4. Pasarea – resuspendarea celulelor din cultura primară urmată de
reînsămânţarea, la densităţi mai mici, în noi flacoane de cultură sau plăci Petri
(culturi secundare).
Evoluţie
1. Faza de lag sau de inducţie – celulele îşi refac componentele suprafeţei
(componentele membranare) şi se acomodează cu mediul de cultură
2. Faza exponenţială – celulele se divid rapid, exponenţial
3. Faza staţionară – nr de celule rămâne constant; în această fază se efectuează
pasarea
4. Faza de declin – scăderea nr. de celule din cauza îmbătrânirii şi morţii

Medii de cultură – Componente

1. Aminoacizi şi vitamine
2. Săruri – necesare menţinerii echilibrului ionic şi pH-ului mediului de cultură
3. Glucoză pentru necesarul energetic
4. Ser fetal (factori de creştere)
5. Antibiotice
6. Roşu fenol, ca indicator de pH

CITOMETRIA in flux
Principiul: celulele dintr-o suspensie trec una câte una prin faţa unui fascicul
luminos. Modul în care lumina este dispersată va furniza informaţii despre
proprietăţile celulei respective.

Permite analiza şi separarea celulelor (vii sau fixate) pe baza unor caractere
morfologice şi biochimice.

Utilitate:
1. măsurarea caracteristicilor fizice ale celulei
2. identificarea şi separarea populaţiilor de celule sangvine (granulocite,
monocite, limfocite T sau B)
3. măsurarea cantităţii de ADN din celulă
4. măsurarea cantităţii intracelulare de Ca2+
5. măsurarea pH-ului intracelular

Oferă informaţii asupra:

1. mărimii celulelor
2. granularităţii interne relative (neomogenitatea internă, citoplasmatică)
3. intensităţii relative a fluorescenţei