LUCRARE PRACTICA 2

TEHNICA OBȚINERII
PREPARATELOR
MICROSCOPICE

COLORAREA. COLORANȚI
UTILIZAȚI ÎN HISTOLOGIE
Metode de studiere a celulelor şi ţesuturilor

I. Metode utilizate în practica clinică

II. Metode utilizate în cercetare

 I. Metode utilizate în practica clinică

Coloraţia uzuală – Hematoxilină-eozină

Coloraţiile speciale
Examenul microscopic extemporaneu
Coloraţiile imunohistochimice
 Preparatul microscopic

Totalitatea obiectelor pregătite pentru a fi examinate la aparate

optice măritoare în vederea studierii structurii lor.
Componentele:
• Obiectul
• Suportul: lama
• Lamela

Sunt de 2 tipuri: extemporanee şi permanente

 Preparatul microscopic
I. Recoltarea
• Biopsie
• Necropsie
• De la animale
 Preparatul microscopic
I. Recoltarea
• Excizia
• Incizia
• Rezecţia
• Puncţia biopsie
 Preparatul microscopic
II. Fixarea

Piesa e introdusă în fixatori care previn degradarea

enzimatică (autoliza) şi păstrează intactă structura
tridimensională a ţesutului.

Formaldehida
Fixatorii acţionează asupra proteinelor din ţesuturi prin 3
mecanisme: denaturare, coagulare şi precipitare
 Preparatul microscopic
II. Fixarea
Aspectul unui fragment de ţesut după fixare
 Preparatul microscopic
III. Spălarea

• Îndepărtează excesul de fixator

• Se face cu apă sau alcool (deshidratarea)

Decalcificarea
– Preparatele de os sau dinte
– Se face cu acizi şi răşini schimbătoare de ioni sau prin
electroliză
 Preparatul microscopic
IV. Includerea în parafină

Piesa e îmbibată şi înglobată într-o substanţă solidificabilă,

denumită masă de includere.
Piesa devine rigidă şi poate fi secţionată în felii de ordinul
µm (5μm).

Această secţionare este necesară pentru a permite luminii să

treacă prin preparatul microscopic şi apoi să ajungă la ochiul
obsevatorului, care va examina imaginea microscopică a
ţesutului
 Preparatul microscopic
IV. Includerea în parafină

Etape:
1. Deshidratarea- introducerea în băi de alcool de concentraţii
crescânde → alcoolul va înlocui apa din ţesut;
2. Clarificarea cu solvenţi organici (xilen, toluen) miscibili atât
în alcool cât şi în parafină, vor scoate alcoolul din ţesut
3. Îmbibarea cu parafină: parafina topită intră în celule →
ţesutul va fi complet inclus în parafina care se va întări şi va
forma un bloc solid ce conţine ţesutul;
4. Includerea propriu-zisă
 Preparatul microscopic
IV. Includerea în parafină

Ţesuturi incluse în blocuri de parafină

Preparatul microscopic
V. Secţionarea
 Preparatul microscopic
V. Secţionarea

 
 Preparatul microscopic
VI. Colorarea

Evidenţiază elementele structurale

Coloranţii histologici se fixează pe anumite componente structurale
Coloranţi artificiali: derivaţi din hidrocarburi aromatice şi, în funcţie de
natura cromoforului, pot fi:
Bazici: albastrul de metilen, albastrul de toluidină, fuxina bazică
Acizi: eozina, fuxina acidă, eritrozina, orange G
Neutri: eozinatul de azur de metilen
Indiferenţi: Sudan III, Scharlach Roth
Coloranţi naturali: carminul, hematoxilina, orceina
 Preparatul microscopic
VI. Colorarea

• Bazofilie
• Acidofilie
• Neutrofilie

Termeni care se referă la afinitatea tinctorială (de coloraţie) a

diferitelor elemente faţă de baze, acizi sau substanţe neutre.
 Preparatul microscopic
VI. Colorarea

Clasificarea coloraţiilor
1. După electivitate: difuze şi elective
2. După modul de acţiune: directe şi indirecte
3. După procedeul de executare: progresive şi regresive
4. După numărul de coloranţi folosiţi: simple şi combinate:
succesive sau simultane

Coloraţia ortocromatică
Coloraţia metacromatică
Preparatul microscopic

VII. Montarea

VIII. Etichetarea
 Preparatul microscopic
Examenul extemporaneu (la gheaţă)

Permite un diagnostic rapid (15-20 min), care orientează decizia

terapeutică chirurgicală
Frecvent utilizat în chirurgia oncologică
Nu are precizia examenului histologic clasic
 Preparatul microscopic
Examenul extemporaneu
DE RETINUT!

→ acidofilia: afinitatea pentru coloranţi acizi (caracteristică

substraturilor bazice– proteine citoplasmatice, colagen)
→ bazofilia: afinitatea pentru coloranţi bazici (caracteristică
substraturilor acide –acizi nucleici – nucleu şi reticul endoplasmic
rugos)
→ metacromazia: proprietate mixtă a substratului şi a colorantului:
virarea culorii colorantului în contact cu anumite substraturi (cea
mai frecventă: albastru–violet)
Asadar, coloratiile sunt clasificate in:

1. Coloraţii morfologice
2. Coloraţii histochimice
3. Coloraţii imunohistochimice
4. Coloraţii citologice
1. Morfologice:

Generale:
- bicrome (un colorant nuclear bazic şi unul acid, pentru citoplasmă)
- cea mai frecvent utilizată: Hematoxilină – Eozină (HE)
- tricrome (un colorant nuclear, 2 coloranţi acizi, din care de regulă
unul pentru colagen)
- cele mai frecvente: Masson

Speciale
- Masson: colagenul este colorat în albastru
- Goldner Szekelly - colagen verde,
- Van Gieson – colagen rosu
- impregnările argentice: 4 tipuri pentru fibre de reticulină şi membrane
bazale
- orceină – pentru fibre elastice
2. Coloraţii histochimice:
- permit identificarea cu relativă specificitate a unui substrat prin
reacţii de culoare sau de precipitare datorate unor grupări ale acestuia

De exemplu:
- reacţia PAS: identificarea polizaharidelor prin colorarea în violet-
roşu a grupărilor aldehidice libere create în structura lor (glicogen,
membrane bazale)
- coloraţia cu albastru de toluidină: identificarea glicozaminoglicanilor
din granulaţiile mastocitelor şi mucinelor prin metacromazie (violet),
utilizate pentru organele nervoase
- coloraţia albastru alcian: mucine (glicozaminoglicani)
- pentru componente ale neuronilor şi celulelor gliale
- saruri de argint pentru celule neuroendocrine (APUD)
- pentru germeni (H. pylori)
- mucicarmin (pentru mucus)
- coloraţii histoenzimologice: identificarea prezenţei şi activităţii unor
enzime
- se mai folosesc:
- ATP – aza (intens pozitivă la polul biliar al hepatocitelor,identificarea
canaliculilor biliari)
- mieloperoxidaza (identificarea unor subtipuri de leucocite)
3. Coloraţii imunohistochimice:
- bazate pe reacţia antigen – anticorp
- anticorp primar – anticorp secundar
- anticorpul secundar este marcat, de regulă enzimatic
- vizualizare prin reacţie de culoare catalizată de enzima care marchează
anticorpul secundar
- identifică tipuri de celule şi molecule ale acestora, inclusiv când
celulele sunt transformate malign
- utile în embriologie moleculară, histologie şi patologie
- exemple de markeri: citokeratine, vimentină, actină de tip muşchi
neted, cromogranină A, enolază neuronal specifică, proteină glială
fibrilară acidă, colagen IV
4. Coloraţii citologice:
- APT - Drăgan: - simplă, nu dă foarte multe detalii celulare
Papanicolaou:
- mai complicată
- dă detalii celulare mai multe (ex. acumularea de keratină în
citoplasmă utilă în diagnosticul cervico – vaginal, pleural, lavaj
bronşic)
May – Grünwald – Giemsa:
- utilă pentru frotiuri de sânge periferic şi măduvă osoasă hematogenă
- dă detalii citoplasmatice mai multe (granulaţii)
 Preparatul microscopic
Coloraţia HE

Coloraţie uzuală (95% din lame); e o metodă directă, progresivă,

combinată, succesivă, ortocromatică.
Hematoxilina-colorant bazic- colorează în ALBASTRU
structurile bazofile: acizii nucleici- ADN-nucleu; ARN- ribozomi
Eozina –colorant acid- colorează în ROŞU structurile acidofile
sau eozinofile: proteinele – în citoplasmă şi în matricea
extracelulară
Structurile cu conţinut ridicat de substanţe lipidice (celule
adipoase, mielina) rămân optic vide;
 Preparatul microscopic
Coloraţia HE

Celulele: funcţia biochimică şi distribuţia elementelor

componente.

Nucleii
•Celulele tinere sau/şi active metabolic, prezintă nucleii
eucromi sau hipocromi (eucromatina este palidă).
•Celulele adulte sau îmbătrânite, cu activitate metabolică
redusă, au nuclei hipercromi (heterocromatina inactivă se
colorează intens bazofil)
 Preparatul microscopic
Coloraţia HE

Citoplasma
•Celulele care sintetizează proteine conţin numeroşi ribozomi
liberi şi RER bine dezvoltat şi prezintă un aspect bazofil al
citoplasmei (H colorează ARN din ribozomi în albastru)
•Celulele implicate în transportul de ioni conţin numeroase
mitocondrii şi prezintă un aspect eozinofil al citoplasmei (E
colorează proteinele cationice: citocromii în roşu).
•Fibrele musculare au aspect intens eozinofil datorită fixării
eozinei pe proteinele contractile din miofibrile.
Preparatul microscopic
Coloraţia HE
Preparatul microscopic
Coloraţia HE
 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Tricrom Masson, tricrom Mallory
• pune în evidenţă ţesutul conjunctiv
• fibrele de colagen se colorează în verde,
respectiv albastru
 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Rezorcină Fuxină Weigert: fibrele elastice sunt colorate în violet
închis
Orceină: fibrele elastice sunt colorate în maro închis

RFW Orceina
 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Impregnarea argentică: pune în evidenţă fibrele de reticulină,
neurofibrilele din neuroni (maro/negru) şi cimentul intercelular în
epitelii

Ficat-impregnare argentică Ţesut nervos- impregnare argentică

 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Sudan III, Sudan negru, Scharlach Roth- folosite pentru a pune în
evidenţă lipidele în ţesuturi, pe care le colorează în galben, negru şi
respectiv roşu.
!!! Fragmentele de ţesut
nu sunt preparate cu
solvenţi organici,
pentru a nu dizolva
subst. lipidice
 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Coloraţia PAS (Periodic Acid Schiff)
Colorează carbohidraţii
în roz intens. Evidenţiază
membrana bazală a epiteliilor.
 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Acidul osmic- colorează în brun/negru substanţele lipidice
Evidenţiază teaca de mielină
 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Hematoxilina Ferică Heidenheim- colorează în negru
miofibrilele şi evidenţiază aspectul striat al fibrelor musculare.
 Preparatul microscopic
Coloraţii speciale
Ţesutul osos compact şlefuit, montat în balsam de Canada !!!
Preparat necolorat
 Imunohistochimia

Utilizează principiul antigen-anticorp (Ag-Ac) pentru a

identifica prezenţa/absenţa unor proteine specifice la nivelul
ţesuturilor.
 Imunohistochimia

Imunoperoxidază Imunofluorescenţă
 II. Metode utilizate în cercetare

Visualization of biconcave
erythrocytes and polyhedral
erythrocytes (polyhedrocytes) in
uncontracted and contracted blood
clots, respectively.
(A,B) Stained histological section
(C,D) transmission electron
microscopy (TEM),
(E,F) scanning electron
microscopy (SEM)
(G,H) confocal microscopy were
used to image biconcave
erythrocytes and polyhedrocytes.
Scale bar is 25 µm. for histology,
1 µm for TEM, 10 µm for SEM,
and 10 µm for confocal.
 Fibrele de colagen, cu orientarea lor particulară în interiorul
lamelei osoase(paralele în fiecare lamelă si perpendicular de la o
lamelă la alta), permit ca la microscopul cu lumină polarizată să
apară o imagine caracteristică (zone clare și zone întunecate) dată de
birefringența acestora.