ANTONELLA CHEŞCĂ

BIOLOGIE CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ

Aplicaţii
Referenţi ştiinţifici:
Profesor Doctor Doc. Doina Onicescu
Conferenţiar Universitar Doctor Chim. Mihaela Badea

2
Studiul practic al biologiei celulare şi moleculare a adus permanent noi tehnici şi metode, odată cu
cele mai recente descoperiri în domeniu. Din acest punct de vedere se poate aprecia că biologia
celulară şi moleculară este permanent într-un proces de reînnoire şi actualizare a datelor.
Baza aplicaţiilor în domeniul acestei discipline complexe o constituie informaţiile fundamentale
care au permis introducerea biologiei celulare şi moleculare în rândul ştiinţelor moderne din
învăţământul medical.
Se ştie faptul că noţiunile fundamentale de biologie celulară şi moleculară, tehnicile de laborator şi
aparatura folosită în domeniu, se regăsesc pe parcursul studiului altor discipline medicale. Astfel se
poate aprecia că biologia celulară şi moleculară stă la baza unei diversităţi de domenii medicale,
potrivit studiilor din ce în ce mai noi.
Consider ca informaţiile prezentate în lucrarea de faţă, să ofere studenţilor la medicină care învaţă
noţiuni de biologie celulară şi moleculară, datele elementare, în domeniu, privind aplicabilitatea
ştiinţifică la lucrările practice de laborator.

Autoarea

3
 CUPRINS

1. METODE PENTRU STUDIUL MORFOLOGIC AL CELULEI

2. MICROSCOPIE OPTICĂ
3. MICROSCOAPE OPTICE SPECIALE
4. MICROSCOPIE ELECTRONICĂ
5. METODE UZUALE PENTRU EXAMINAREA CELULELOR PRIN MICROSCOPIE
OPTICĂ

6. METODE DE COLORARE ŞI COLORANŢI ÎN BIOLOGIA CELULARĂ

7. TEHNICI SPECIALE UTILIZATE ÎN BIOLOGIA CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ

8. STUDIUL COMPONENTELOR MACROMOLECULARE ALE CELULEI

9. TEHNICI DE CITOCHIMIE, CITOENZIMOLOGIE ŞI IMUNOCITOCHIMIE

10. TEHNICI DE INGINERIE GENETICĂ FOLOSITE ÎN DIAGNOSTICUL
MOLECULAR

11. MORFOMETRIE CELULARĂ ŞI SUBCELULARĂ

12. FORME CELULARE

13. MEMBRANA CELULARĂ

14. JONCŢIUNI INTERCELULARE

15. ORGANITE GENERATOARE DE ENERGIE

4
16. ORGANITELE SINTEZEI ŞI SECREŢIEI CELULARE

17. ORGANITELE DIGESTIEI CELULARE

18. INCLUZIUNI CELULARE

19. CITOSCHELET CELULAR

20. NUCLEUL ÎN INTERFAZĂ

21. DIVIZIUNEA CELULARĂ

22. DIFERENŢIEREA CELULARĂ

23. APOPTOZA

5
 1. METODE PENTRU STUDIUL MORFOLOGIC AL CELULEI

Metodele de investigare privind studiul celulei au avansat în ultimii ani datorită tehnicilor noi
descoperite şi implicit a perfecţionării metodelor de investigare.
La baza înţelegerii noţiunilor de biologie celulară şi moleculară stau în principal metode de studiu
biochimice, biofizice, morfologice şi funcţionale.
Acestora li se adaugă în timp noţiuni de cromatografie,electroforeză, spectrofotometrie, difracţie cu
raze X.
Mai recent au fost elaborate tehnologii complexe în domeniu, ce au la bază tehnica culturilor de
celule, fuziuni celulare, purificări de gene. Astfel date privind ingineria genetică vin să completeze
şi totodată să extindă sfera ştiinţifică a cunoştinţelor de biologie moleculară.
Pentru a se înţelege organizarea ansamblurilor de molecule în structuri, a biosintezei şi funcţiilor
acestora şi nu în ultimul rând a implicaţiilor în patologie, este necesară investigarea
ultrastructurală. Aceasta permite pătrunderea de la nivel celular, la nivel molecular şi atomic.(Fig.
1)

6
7
Figură 1

Fig.1 Scala mărimilor celulelor (după I. Diculescu şi col., 1983)

Unităţi de măsură folosite în microscopie:

1 milimetru ( mm ) = 10-3 m = 1000 micrometri

1 micrometru ( m) = 10-6 m = 1000 nanometri

1 nanometru ( nm ) = 10-9 m = 10 Ångstromi

1 Angstrom ( Å ) = 10-10 = 0,1 nanometri

8
 2.MICROSCOPIE OPTICĂ

MICROSCOPUL FOTONIC

Microscopul fotonic sau optic obişnuit, este un aparat de mărit care foloseşte fotonul ca sursă de radiaţie şi
are ca putere de rezoluţie maximă 0,2μm (micrometri). Termeni sinonimi pentru acest tip de microscop
sunt: convenţional, cu lumină vizibilă, cu fond clar.[10]

Microscopul fotonic este alcătuit din:

9
Partea mecanică sau stativul, care se compune din:
> Talpa sau piciorul microscopului, ce asigură stabilitatea aparatului şi care conţine sursa de lumină,
oglinda proiectoare şi diafragmul.
> Coloana, care este ataşată la picior şi care conţine:
-platina sau măsuţa microscopului, ce reprezintă dispozitivul pe care se fixează preparatul de examinat,
cu ajutorul a altor două componente numite cavaleri sau valeţi.
-tubul microscopului,, care are montate la extremitatea superioară sistemul ocular şi la extremitatea
inferioară sistemul obiectiv.
-revolverul, format din discul mobil, pe care se montează obiectivele cu puteri măritoare crescătoare şi
discul fix, ataşat în partea inferioară a tubului.
-dispozitivul de punere la punct a imaginii, care este format din viza macrometrică sau macroviza, ce
realizează mişcări grosiere şi rapide şi viza micrometrică sau microviza, ce realizează mişcări reduse şi
lente.[9]

Partea optică formată din:

-sistemul ocular, compus din două lentile montate într-un tub, ce se introduce în partea superioară a
acestuia şi care au puteri măritoare cu valori crescătoare de 5x, 7x, 10x, 15x.
-sistemul obiectiv, ce reprezintă o asociaţie de lentile montate într-un tub ce se ataşează la capul
revolverului şi care au puteri măritoare de ( 6x, 10x, 20x, 40x şi 90x).[9]

Sursa de fotoni şi dispozitivul de transmisie cuprind:

- sursa de lumină care este un bec de 6V, alimentat de la transformator.
- dispozitivul de transmisie, care cuprinde o oglindă plană cu rolul de a orienta razele luminoase în axul
optic.
- condensorul de lumină sau condensatorul, care este dat de un sistem de lentile, montat sub platină, cu rolul
de a focalize lumina pe preparat.(Fig. 2)

10
 Fig. 2 Părţile componente ale microscopului optic( după site-ul www.aas-
tech.ro/microscoape/produse/22)

Tehnica de lucru cuprinde următoarele etape:

> se pune în funcţiune sursa de lumină;

> se aduce în axul optic obiectivul cu puterea măritoare de 10x şi se ţine cont de faptul că examinarea
microscopică se începe întotdeauna cu obiectivul cel mai mic ( cel de 10x, deoarece punerea la
punct a imaginii se face mai uşor).
! Obiectivul de 10x se consideră de orientare
! Obiectivul de 20x se consideră de diagnostic
! Obiectivul de 40x; 90x se consideră citologice
! Cu cât puterea măritoare a unui obiectiv este mai mare, cu atât distanţa la care se obţine
punerea la punct, dintre lentila frontală a obiectivului şi preparat, respectiv lamela, este mai
mică.[10]

> se coboară condensorul până la obţinerea unei lumini uniforme şi de intensitate mare;

11
> se fixează lama portobiect pe platină, cu ajutorul valeţilor, întotdeauna cu lamela în sus, precizând faptul
că dacă lama se aşează cu lamela în jos, nu este posibilă punerea la punct a imaginii când se
folosesc obiective cu putere măritoare mare, ca de exemplu obiectivul de 40x.

> cu ajutorul vizei macrometrice, se coboară tubul până la o distanţă mai mică de 16mm, respectiv distanţa
focală a obiectivului cu puterea măritoare de 10x.
> se fixează distanţa interpupilară prin apropierea sau îndepărtarea celor două oculare.
> privind prin ocular, se ridică tubul cu ajutorul vizei macrometrice până când apare imaginea. Prin
mişcarea vizei micrometrice se obţine o imagine clară şi luminoasă. Se face precizarea că imaginea se caută
prin urcarea tubului deoarece prin coborâre se poate sparge lama sau se poate deteriora lentila frontală a
obiectivului.
> în timpul examinării se va ţine în permanenţă mâna pe viza micrometrică, în vederea menţinerii unei
imagini clare în timpul deplasării câmpului. De asemenea, pe toată durata examinării microscopice, se
manevrează microviza, prin mişcări înainte-înapoi. Se consideră că manevrarea microvizei
reprezintă un stereotip dinamic, specific examinatorului la microscop.
> cu ajutorul celor două vize de pe partea laterală a platinei, se va mişca lama cu preparatul, pentru a se
realiza o examinare completă a preparatului.
> se roteşte revolverul pentru a aduce în axul optic celelalte obiective (20x, 40x, 90x).
> la utilizarea obiectivului cu puterea măritoare de 90x, respectiv cu imersie, se ridică la maxim
condensatorul şi se deschide complet diafragmul iris. Pe preparatul aflat pe lama microscopică cum ar fi de
exemplu frotiul de sânge colorat, se pune o picătură de ulei de cedru şi se coboară tubul până când lentila
frontală a obiectivului a făcut contact cu picătura de ulei de cedru.
> se ridică tubul microscopului 1 – 2 cm, se dă jos lama şi se îndepărtează uleiul de cedru de pe lentila
frontală, prin ştergere cu vată îmbibată în solvenţi ca de exemplu xilol şi se deconectează de la reţea,
acoperindu-se cu husa protectoare.
> manevrarea microscopului optic se face cu atenţie şi delicateţe, deoarece orice defecţiune la
nivelul părţilor componente ale acestuia, poate crea dificultăţi în examinarea preparatelor sau poate
face chiar imposibilă examinarea microscopică.[9]

Pentru evitarea aşa-numitor incidente ce pot să apară în examinarea microscopică, trebuie ţinut
cont de:
-buna funcţionare a becului electric, respectiv a sursei de lumină
-poziţia în axul optic a obiectivului
-aspectul curat al lentilei frontale a obiectivului

12
-evitarea confundării bulelor de aer ce pot să apară între lamă şi lamelă din timpul montării
preparatului microscopic, numite artefacte, cu diferite structuri celulare.[10]

Lentilele simple prezintă anumite defecte datorate proprietăţilor sticlei utilizate pentru construcţia
lor. Aceste defecţiuni se numesc aberaţii.[10]
După gradul de corectare a aberaţiilor se disting câteva tipuri de obiective care vor fi descrise.
Obiective acromatice, alcătuite din numeroase lentile convexe şi concave, confecţionate din sticlă
specială şi dispuse astfel încât să realizeze corecţia aberaţiei cromatice pentru culorile roşu şi verde
şi a aberaţiei sferice în domeniul verde.
Aberaţia cromatică este determinată de faptul că razele de lumină, refractate de lentilă, se
descompun în culorile lor componente, formând un spectru, lentilele respective oferind imagini
neclare şi colorate.
Aberaţia sferică este cauzată de o refracţie mai puternică a razelor de lumină periferice, comparativ
cu refracţia, pe care o suferă lumina din zona centrală a lentilei, fapt ce duce la apariţia de imagini
deformate.
Obiective apocromatice, alcătuite dintr-un număr mai mare de lentile, care dau o corecţie aproape
completă a aberaţiei cromatice, pentru trei culori şi anume roşu, verde, albastru-violet şi a aberaţiei
sferice în domeniul a două culori.
Pe lentilele obiective sunt gravate: puterea de mărire (6x, 10x, 20x,40x,90x) şi apertura numerică
(0,1; 0,3; 0,4; 0,6; 1,25).[9]
Apertura numerică este dată de formula:
AN = n sin α,
n = indicele de refracţie al mediului dintre lentila frontală şi lamelă
sin α = semiunghiul format de razele extreme care pătrund în obiectiv[10]
Orice microscop indiferent de tipul lui, se apreciază după:
- puterea de mărire
- puterea de rezoluţie

13
Puterea de mărire (grosismentul), indică de câte ori a fost mărit obiectul examinat. Se apreciază că
aceasta este, la microscoapele fotonice, de aproximativ 1500 ori iar la microscoapele electronice
poate să ajungă la sute de mii sau chiar un milion de ori.[10]
Puterea de rezoluţie, reprezintă capacitatea unui microscop de a distinge clar două puncte cât mai
apropiate. La microscopul fotonic este de până la 0,2 micrometri iar la microscoapele electronice
ajunge la aproximativ 2 Å.[10]
Un microscop este utilizat pentru mărirea imaginii preparatului studiat, cu scopul de a se putea
observa detaliile care nu se văd cu ochiul liber.
Funcţionarea oricărui microscop depinde de rezoluţia acestuia.
Datorită posibilităţii de mărire mai sus amintite, rezoluţia este deseori confundată cu magnitudinea,
care se referă la mărimea imaginii.
Magnitudinea totală este calculată prin înmulţirea măririi lentilelor oculare cu cea a lentilelor
obiective. Dacă imaginea unei celule este mărită de la10x la 40x, imaginea este mai mare dar nu
neapărat şi mai clară. Concluzionând, fără rezoluţie, imaginea este mărită, dar detaliile nu pot fi
observate, fapt ce implică necesitatea calculării limitei puterii de rezoluţie.
Puterea de rezoluţie sau de separare se defineşte ca fiind distanţa cea mai mică la care două puncte
sau linii separate sau alăturate, se pot vedea de către examinatorul la microscop, individualizate şi
clare.[10]
Calcularea puterii de rezoluţie a microscopului optic obişnuit se face separat pentru fiecare sistem
optic, conform formulei lui Abbé:

d = λ / n sin α
λ = 0,55 micrometri şi reprezintă lungimea de undă a luminii fotonice
n = indicele de refracţie a mediului interpus între preparat şi lentila frontală a obiectivului
α = jumătatea unghiului de deschidere, format din razele laterale care, pornind dintr-un punct al
preparatului, pătrund în sistemul obiectiv şi participă la formarea imaginii.[13]
Deoarece apertura unghiulară maximă este, teoretic, de 180˚, limita maximă a unghiului λ este 90˚,
având sinusul de 0,95˚.[10]
Indiferent de firmă sau marcă, microscoapele fotonice nu pot depăşi limita separatoare maximă,
care coboară la 0,2 micrometri şi care este, de fapt, limita puterii de rezoluţie.(Fig. 3)

14
 Fig. 3 Apertura unghiulară a unui obiectiv(2 α) (după I. Diculescu, 1980)

lf = lentila frontală a obiectivului

b = bisectoarea unghiului de apertură

Puterea de mărire a microscopului este determinată de distanţa focală a obiectivului, de puterea de

mărire a ocularului şi de lungimea optică a tubului microscopului. Practic, mărirea totală este
produsul dintre mărirea obiectivului şi cea a ocularului.
Modul de formare a imaginii la microscopul fotonic arată că, obiectivul formează în partea
superioară a tubului microscopului, o imagine reală, răsturnată şi mărită, a preparatului
microscopic. Ocularul, acţionând ca o lupă, preia imaginea formată de obiectiv şi oferă
examinatorului la microscop, o imagine finală, care este virtuală, răsturnată şi mult mărită, a
preparatului microscopic.[10]

15
 3. MICROSCOAPE OPTICE SPECIALE

Microscopul cu fluorescenţă

Este un tip de microscop optic obişnuit care prezintă anumite particularităţi:

16
- sursa de lumină, este reprezentată de o lampă cu vapori de mercur, ce emite radiaţii UV ( H.B.O.
– 200W; 3,3 – 3,9A )
- filtrele de lumină, care opresc radiaţiile vizibile şi calorice. Se poate preciza faptul că anumite
filtre de lumină, au rol de a opri toate radiaţiile în afara celor UV şi că se montează în talpa
microscopului. Filtrele de lumină au rol de a proteja retina, prin montarea între obiectiv şi ocular.
- condensatorii, care sunt diferiţi după modalitatea de examinare.
Microscopul cu fluorescenţă, folosind radiaţii UV, evidenţiază proprietatea unor substanţe de a
transforma radiaţiile UV în radiaţii vizibile, proprietate numită fluorescenţă.
Fluorescenţa reprezintă fenomenul fizic prin care unele substanţe iradiate cu un fascicul de lumină
cu lungime de undă mică şi cu frecvenşă înaltă, emit alte radiaţii cu o lungime de undă mai mare şi
cu o frecvenţă mai joasă, de culoare diferită, numindu-se fluorescente.
Fluorescenţa vizibilă într-un preparat se clasifică în naturală, respectiv autofluorescenţă, care este
produsă de substanţe ce se găsesc în mod natural în celule şi ţesuturi şi secundară care este indusă
prin tratarea celulelor cu fluorocromi sau substanţe colorante, cum sunt de exemplu acridin-oranj,
rodamina B, tioflavina S.[10]
Principiul fizic al fluorescenţei se bazează pe capacitatea moleculelor substanţelor capabile să
determine acest fenomen, absorbind energia luminii care cade asupra lor. În acest mod, devin
capabile ulterior de a provoca fluorescnţa, prin atingerea unei stări de excitaţie moleculară, odată
cu trecerea electronilor din atomii lor la un nivel energetic superior. Acest fapt se produce datorită
migrării electronilor pe orbite situate mai departe de nucleu.[10]
Aplicaţiile practice ale acestui tip de microscop în biologia celulară sunt multiple şi cuprind
identificare prin fluorescenţă primară a:
- pigmenţilor, ca lipofuscina – fluorescenţă roşu-brun; lipocromii sau pigmenţii carotenoizi -
fluorescenţă verde, cromolipidele-fluorescenţă galben-verde, porfirinele-fluorescenţă roşie.
- aminelor biogene – adrenalina, noradrenalina, serotonina-fluorescenţă galben-verde.
- acizilor aminaţi, ca tirozina, fenilalanina, triptofanul-fluorescenţă albastră.
Cu fluorocromi, ca acridin orange, se pot identifica:
acizi nucleic- ARN-fluorescenţă roşie, ADN-fluorescenţă galben-verde
mucine-fluorescenţă verde
fibre elastice, de colagen, de reticulină-fluorescenţă verde
Acridin orange se foloseşte şi în studiul acizilor nucleici, în diagnosticarea precoce a cancerului.[9]

17
Microscopul cu lumină ultravioletă

Este un tip special de microscop optic la care s-a adăugat o optică de cuarţ precum şi o sursă de
lumină specială, reprezentată de vapori de mercur. Pentru că radiaţiile ultraviolete au efect nociv
asupra ochiului uman, imaginea care se obţine cu acest tip de microscop, se proiectează pe o placă
fotografică sau pe un ecran.
Aplicaţiile practice ale acestui tip de microscop sunt în studiul acizilor nucleici datorită proprietăţii
acestora d a absorbi radiaţiile ultraviolete. Există şi microscoape cu lumină ultravioletă folosite în
studiul citospectrofotometriei, permiţând detectarea absorbţiei razelor ultraviolete prin tehnică
fotometrică.

Microscopul cu contrast de fază

Este un tip special de microscop optic care realizează contrastul unor obiecte de examinat, făcând
posibil studiul celulelor în stare vie, nefixate şi necolorate.
Prezintă ca particularităţi:
- condensorul, care are un diafragm inelar
- placa de defazare, la nivelul obiectivului
Principiul fizic al acestui tip de microscop constă în convertirea diferenţelor de fază ale luminii
transmise, prin diferite structuri celulare în diferenţe de intensitate luminoasă, utilizând fenomenul
de interferenţă.[10]
Aplicaţiile practice ale microscopului cu contrast de fază permit, pe lângă studiul celulelor în stare
vie, nefixate şi necolorate, evidenţierea unor detalii de structură, care nu se pot observa la
microscopul fotonic obişnuit. În context, se aminteşte studiul reacţiilor celulare la diferiţi agenţi
fizici sau chimici sau studiul benzilor cromozomilor.[9]
Din microscopia cu contrast de fază au derivat:
Microscopia cu interferenţă, care permite aprecierea cantitativă a masei unor componente tisulare şi
microscopia cu interferenţă diferenţială, utilă în evaluarea proprietăţilor suprafeţei celulare sau a
altor structuri biologice.[13]

18
Microscopul cu lumină polarizată

Este un tip special de microscop care prezintă moficări faţă de microscopul optic obişnuit.
Microscopul cu lumină polarizată prezintă două dispozitive speciale, polarizor şi analizor,
constituite dintr-o peliculă de film polaroid sau o prismă Nicol. Polarizorul se situează sub
condensator iar analizorul se găseşte deasupra obiectivului. Prin modul de alcătuire, se obţine o
lumină polarizată ce permite studiul structurilor interne ale celulei, din punct de vedere a
refringenţei.
Lumina polarizată trece prin preparat şi polarizorul este folosit pentru a roti planul acesteia. În
acest mod se poate detecta orientarea unei specii de molecule dintr-un ţesut. S-a observat că
substanţele cristaline şi moleculele bine ordonate, schimbă planul luminii polarizate care le
străbate, permiţând detectarea lor printr-un sistem de lentile.
Rotaţia planului luminii polarizate, este o proprietate numită birefringenţă.[13]
Birefringenţa se clasifică în :
> pozitivă, când indicele de refracţie este mai ridicat în lungime decât în plan perpendicular, în
structurile fibrilare:colagen, mielină, fibre musculare striate şi negativă, în fibrele nucleoproteice,
opusă precedentei.
> negativă, cu caracteristici opuse precedentei.
> cristalină sau intrinsecă, la nivelul sistemelor sau moleculelor, în care ionii prezintă un
aranjament asimetric regulat, fiind independentă de indicii de refracţie ai mediului de montare şi
observabilă în structuri formate din lipide şi proteine.
> de tensiune, observabilă la structuri izotrope supuse constrângerii mecanice şi întâlnită la nivelul
muşchilor şi ţesuturilor embrionare.
> structurală sau de formă, care apare când particulele submicroscopice sunt orientate în mediu cu
indice de refracţie diferit.[9]
Dicroismul apare când absorbţia unei lungimi de undă dată de lumina polarizată variază în funcţie
de orientarea obiectului de examinat. Variaţiile amintite apar datorită orientării obiectului examinat
şi datorită diferenţelor de intensitate ale luminii transmise de obiect.[9]
Birefringenţa sau monorefringenţa sunt date de dispunerea moleculelor din alcătuirea obiectelor
studiate. Birefringenţa apare la corpurile cu molecule dispuse ordonat iar monorefringenţa, la cele
cu molecule neordonate. Când planul de polarizare al analizorului este perpendicular pe cel al
polarizorului, lumina nu se transmite. Dacă se aşează pe platina microscopului un preparat

19
birefringent, planul de polarizare va devia datorită întârzierii determinate de întreruperea probei de
examinat. Se învârte preparatul până când în câmpul microscopului apar puncte cu luminozitate
maximă şi minimă.
Aplicaţiile acestui tip de microscop vizează studiul structurilor cu o compoziţie chimică
macromoleculară cu aspect liniar: fibre de colagen, fibre musculare striate,mielina osteonul;
strudiul unor structuri ca membrane biologice; evidenţierea unor structuri cu simetrie radială cum
ar fi granulele proteice, lipide sau colesterol.

Microscopul cu fond întunecat

Acest tip de microscop este reprezentat prin utilizarea unui efect de tip Tyndal. Cu ajutorul acestui
instrument optic, obiectul examinat apare strălucitor într-un câmp întunecat, datorită iluminării
laterale.
Principiul de funcţionare al acestui tip de microscop optic, se bazează pe formarea imaginii prin
difracţia luminii de către obiect şi prin utilizarea unui condensator special numit cardioic, ce
dirijează razele marginale în jurul preparatului.[7]
Aplicaţiile practice ale acestui tip de microscop sunt atât în histologie cât şi în dermatologie, în
ultimul caz permiţând identificarea spirochetei.

Ultramicroscopul

Reprezintă o variantă a microscopului cu câmp întunecat. Acest tip de microscop optic prezintă
anumite particularităţi. Sursa de lumină este forte puternică şi anume arcul voltaic iar proiecţia
razelor laterale spre preparatul microscopic, se face sub un unghi de aproximativ 90˚.[22]
Aplicaţiile practice ale acestui microscop permit identificarea unor particule ultramicroscopice, cu
dimensiuni până la 0,03 micrometri. De asemenea ultramicroscopul se foloseşte şi în studiul
stărilor coloidale.

4. MICROSCOPIE ELECTRONICĂ

20
Invenţia microscopului electronic a fost posibilă în urma unor studii experimentale şi teoretice în
fizică şi inginerie.

Principalul concept care a stat la baza apariţiei microscopei electronice şi a microsopului electronic
ca şi instrument de examine ultrastructurală, este reprezentat de faptul că “electronii au unda
asociată”. Aceasta a fost ipoteza fizicianul francez Luis Victor de Broglie în 1924. În 1927, ipoteza
lui de Brooglie a fost verificată experimental de către fizicienii americani Clinton J. Davisson şi
Lester H. Germer şi independent, de către fizicianul englez George Paget Thomson. În 1932,
inginerii germani Max Knoll şi Ernst Ruska construiesc primul microscop electronic de transmisie.
În 1938 Ruska şi inginerul german Bodo von Borries construiesc primul model al microscopului
electronic de transmisie pentru firma Siemens-Halske Company din Berlin,Germania. Inginerul
englez Sir Charles Oatley a inventat microscopul electronic de baleiaj iar fizicianul german Ernst
Ruska a realizat primele experimente cu ajutorul microscopului electronic construit de el însuşi,
primul de acest fel din lume, în care rolul razelor de lumină era îndeplinit de un fascicul de
electroni ce traversau mai multe lentile electronice.

Primul microscop electronic putea mări imaginea obiectelor doar de 400 de ori.

Se ştie că puterea separatoare a intrumentelor optice este invers proporţională cu lungimea de undă
a radiaţiei utilizate.

Microscoapele optice nu vor putea da imagini clare ale unor obiecte cu dimensiuni mai mici de
circa 0,15 µm.

Puterea separatoare a fost sensibil mărită cu ajutorul microscopului electronic, deoarece lungimea
de undă a undei asociate electronului este mult mai mică decât a radiaţiilor vizibile sau ultraviolete
utilizate de microscopul optic. Microscoapele pot doar să mărească structuri care sunt mai mari
decât lungimea undelor, respectiv unda luminoasă. Acestea pot obţine mult mai multă putere de

21
mărire decât microscoapele standard, ce folosesc lumina solară, pentru că electronii au lungime de
undă asociată mai mica decât lungimea de undă a luminii. Conform anumitor studii în domeniu, se
apreciază că cea mai mare mărire posibilă, este de 2 000 x. În cazul microscopului electronic,
electronii pe toată traiectoria lor, se deplasează în vid, de la sursă până la imaginea finală.[7]

Pentru ca imaginea electronică să fie vizibilă, este necesar ca aceasta să fie transformată în una
luminoasă. În acest scop, în planul imaginii finale se află un ecran fluorescent.

Microscopul electronic este folosit în diferite domenii de cercetare, dar una dintre utilizările
curente este cea din domeniul cercetărilor medicale şi biologice.[22]

Substanţele biologice, în general, nu pot fi studiate sub formă vie, deoarece la o tensiune curentă de
30-50 000 V, timpul de expunere a probelor biologice în vid este destul de lung, ceea ce conduce la
distrugerea ţesuturilor vii.

În anul 1962 a fost pus la punct un microscop electronic pentru cercetările biologice pe viu. La
acest microscop se foloseşte o tensiune de 2 000 000 V, care conduce la micşorarea sensibilă a
timpului de expunere şi deci şi la o absorbţie mult mai mică a fasciculului de electroni în proba
biologică.

Ulterior s-au construit şi alte microscoape protonice şi ionice care au condus la măriri de 10 -15
ori mai mari decât cele obţinute cu microscopul electronic. Cu ajutorul microscopului ionic s-au
obţinut fotografii clare ale poziţiilor atomilor în reţeaua cristalină.
Microscopul electronic foloseşte electronii în loc de lumina zilei pentru a produce imagini
mărite ale unor obiecte. Utilizarea microscopiei electronice este largă, cuprinzând diferite domenii
de cercertare, ca medicina, biologia, chimia, metalurgia, entomologi şi fizica. Încă din 1930 când a
fost folosit pentru prima dată microscopul electronic, a revoluţionat studiul structurilor
microscopice şi al suprafeţelor.
Microscoapele electronice s-au dovedit a fi instrumente puternice de cercetare pentru investigarea
structurii principale a materiei. Microscopul electronic a dat ştiinţei, mediului fotografic şi video,
remarcabile imagini, cum ar fi formele organismelor microscopice şi suprafaţa structurii
moleculelor.[15]
După tipul de construcţie şi destinaţia lor, microscoapele electronice se împart astfel:
-de tramsmisie (TEM), utilizate pentru cercetări ultrastructurale
-de scanning sau de baleiaj (SEM), utilizate în studiul ultramorfologiei suprafeţelor (Fig. 4)

22
-de tansmisie şi scanning (STEM), utilizate în studiul ultrastructural prin transmisie de electroni şi
în studiul suprafeţelor prin electroni secundari sau reflectaţi, pe principiul SEM
-analitice de transmisie (TEAM), utilizate în studii ultrastructurale şi simultan analitice
-sistemice, utilizate în cercetări multiple simultan pe acelaşi aparat
cu fotoemisie (PEM), având utilizări la fel ca SEM
-tip EPI (Electron Probe Instrument), utilizate în studiul suprafeţelor şi în analize elementare
-tip FIM (Field Ion Microscope), utilizate în vizualizarea directă a orientării atomilor într-un
material.[9]

Fig. 4 Comparaţie între microscopul optic şi microscopul electronic (după I. Diculescu, 1980)

23
Microscopul electronic de transmisie (TEM)
Părţi componente: coloana microscopului, în interiorul căreia trebuie creat şi menţinut vid şi care
are ataşate dispozitive ca:
-sursa de electroni, catodul, la extremitatea superioară, constituită dintr-un filament de tungsten
încălzit
-anodul, care creează o diferenţă de potenţial între el şi catod de la 60 000 la 100 000 volţi,
permiţând deplasarea electronilor în tubul microscopului
-ecranul fluorescent, la extremitatea inferioară, cu rol în observarea imaginii
-sistemul de lentile electronice, aflat între sursa de electroni şi ecran
-port-obiectul, între lentilele electronice, utilizat pentru preparatul de examinat. [13]
În TEM nu se priveşte direct obiectul de examinat, respectiv preparatul, imaginea acestuia fiind
proiectată pe un ecran fluorescent. Aceasta este formată dintr-un ansamblu de puncte întunecate şi
luminoase. Pentru a fi păstrate, imaginile se înregistrează pe film sau placă fotografică. TEM oferă
o imagine plană a ultrastructurii cercetate.(Fig. 5)
Imaginea la microscopul electronic este întotdeauna alb-negru, vizualizându-se ultrastructuri.
În TEM, calea electronilor este influenţată de lentilele electronice (electromagnetice). Electronii
sunt emişi din catodul încălzit electric şi atraşi spre anod. Acesta este prevăzut cu un
orificiu(apertură) iar electronii care îl traversează sunt focalizaţi de lentila condensor şi direcţionaţi
spre preparat, focalizaţi de lentila obiectiv, care formează o primă imagine mărită care apoi este
mult mărită de lentila proiector, ce proiectează imaginea finală pe ecranul fluorescent sau pe placa
fotografică.[13]
Se apreciză că o imagine de microscopie electronică utilă, se poate obţine doar dacă preparatul este
suficient de subţire pentru a lăsa să transmită prin el aproximativ 50%, până la 90% din electronii
incidenţi.

24
Fig. 5 Microscop electronic de transmisie (după site-ul
http://www2.uakron.edu/cpspe/images/micro_tem.jpg)

Microscopul electronic de baleiaj (scanning, SEM)

Acest tip de microscop dă imagini tridimensionale, cu dimensiuni centrimetrice, ale suprafeţelor
probelor cercetate.
Formarea imaginii se bazează pe principiul emisiei electronilor secundari, reflectaţi în urma
bombardării probei de către fasciculul primar de radiaţii X.[13]
Constructiv, SEM are suplimentar un detector al electronilor secundari emişi în urma interacţiunii
cu suprafaţa probei.[13]
Curentul produs de acesta este modulat şi trimis la final spre blocul de baleiere al unui tub
cinescopic dintr-un monitor.(Fig. 6)
Pregătirea probei nu necesită secţiuni ultrafine. Rezoluţia este de 10 ori mai mică decât la TEM.
Microscopul de înalt voltaj
Reprezintă un instrument mai puternic decât TEM.

25
Este un microscop electronic de transmisie, cu un tub accelerator de dimensiuni mari, având
lungime totală de aproximativ 10m. Acest lucru face posibilă accelerarea electronilor de 10ori mai
mult decât în cazul TEM.
Imaginea rezultată se consideră practic a fi o “radioscopie cu electroni”.[13]
Acest tip de microscop permite vizualizarea în profunzime şă dă o imagine tridimensională a
organizării ultrastructurale a celulei.

Fig.6 Microscop electronic de baleiaj (după site-ul

http://www2.uakron.edu/cpspe/images/micro_sem.jpg)

26
Pentru examinarea la TEM a preparatelor biologice, tehnologia de prelucrare în laborator urmăreşte
succesiunea etapelor:
-Recoltarea materialului biologic
-Fixarea dublă, cu glutaraldehidă pentru prefixare şi tetraoxid de osmium pentru postfixare
-Spălarea în soluţie tampon
-Deshidratarea în alcooluri de concentraţie crescândă
-Includere în Epon
-Secţionare la ultramicrotom cu etalarea secţiunilor pe grile
-Contrastarea secţiunilor cu acetate de uranil şi citrate de plumb
-Observarea la microscop
-Fotografierea pe film sau plăci fotografice [10] (Fig. 7)

27
Fig. 7 Etapele obţinerii preparatului electronomicroscopic (după I. Diculescu, 1980)

28
 5. METODE UZUALE PENTRU EXAMINAREA CELULELOR PRIN MICROSCOPIE
OPTICĂ

Preparatele microscopice se clasifică în:

-proaspete
-permanente
Preparatul proaspăt se numeşte şi temporar sau extemporaneu.
Acesta se examinează numai în momentul realizării sau imediat după aceasta, pentru a împiedica
apariţia artefactelor, ca urmare a alterării necrobiotice.
Se realizează din ţesut sau organ viu, prin biopsie sau piesă operatorie, din timpul intervenţiilor
chirurgicale.
Examinarea se poate face fie între lamă şi lamelă, fie în cameră umedă.
În cazul examenului între lamă şi lamelă, se recoltează un fragment, din care se disociază o
porţiune foarte mică, care se plasează într-un mediu de montare natural sau artificial. Aceste medii
permit menţinerea în viaţă a celulelor.[10]
Medii naturale: ser sangvin, plasmă, limfă, lichid amniotic, umoare apoasă.
Medii artificiale: ex. ser fiziologic.
Examinarea prin camere umede prezintă avantajul prelungirii viabilităţii elementelor de examinat.
„De obicei se foloseşte o cameră umedă confecţionată în laborator care este o lamă histologică pe
care se lipeşte cu balsam de Canada un inel de sticlă sau plastic, cu grosime de 1-2mm”.[10]
Preparatele permanente se clasifică în frotiuri, amprente, secţiuni.[10]

Frotiul
Metoda frotiurilor permite întinderea celulelor în monostrat, pe lame de sticlă.[10]
Cu ajutorul ei se pot examina: celule sangvine periferice şi medulare; celule epiteliale descuamate
sau exfoliate din piele, cavitatea bucală, vagin, col uterin, endometru, prostată, uretră, căi
respiratorii etc.; sedimente celulare din lichid cefalorahidian, lichid pleural, lichid de ascită, suc
gastric, urină etc.; amprente de ţesuturi sau organe parenchimatoase.[9]
Realizarea frotiului necesită o lamă port-obiect şi o lamă executoare.
Acestea sunt lame histologice, prima având pe ea materialul de examinat, de exemplu sânge
periferic iar cea de-a doua este înclinată la aproximativ 45˚, cu colţurile rupte, căreia i se imprimă o
mişcare de înaintare continuă şi rectilinie, pentru ca frotiul să nu iasă discontinuu sau ondulat.

29
„Un frotiu bine realizat trebuie să fie subţire, cu celulele dispuse în monostrat, să aibă ambele
margini pe lamă, porţiunea terminală să fie mai îngustă, rotunjită, franjurată, întinderea lui să fie
uniformă şi să prezinte date de identificare la unul din capete. După fixare şi colorare ulterioară,
frotiul poate fi examinat la microscopul optic”.[10]
Frotiul sangvin se colorează prin tehnica panoptică Pappenheim, folosind coloraţia May Grünwald
Giemsa. Aceasta este o coloraţie formată din doi coloranţi, soluţia May Grünwald şi soluţia
Giemsa.
Soluţia May Grünwald conţine eozinat de albastru de metilen solubilizat în amestec de alcool
metilic şi glicerină neutră.
Soluţia Giemsa conţine eozinat de azur de metilen solubilizat în amestec de alcool metilic şi
glicerină neutră.[9]

Amprenta
Se realizează prin aplicarea şi apăsarea uşoară a unei structuri tisulare. Aceasta poate fi
reprezentată printr-un fragment biopsic dintr-un organ, respectiv fragment de splină, de măduvă
osoasă, limfoganglion şi nu numai acestea, pe lamă de sticlă, care apoi se fixează şi se
colorează.[16]
Secţiunea
Reprezintă o felie, o cupă sau tăietură, dintr-un ţesut sau organ, realizată la grosime foarte redusă,
prelucrată apoi prin tehnica histologică ce permite examinarea microscopică.[16]
Preparatul microscopic permanent
Reprezintă un fragment de ţesut sau organ, secţionat la grosime de ordinul a câtorva micrometri,
lipit pe o lamă de sticlă, acoperit cu lamelă subţire din material plastic, care poate fi examinat la
microscopul optic.[10]
Tehnica histologică constituie totalitatea operaţiunilor prin care se realizează preparatul histologic
şi cuprinde următoarele etape:
-recoltarea
-fixarea
-includerea
-secţionarea
-colorarea

30
-montarea şi etichetarea

Recoltarea reprezintă prelevarea ţesutului sau a organului care va fi prelucrat, numit piesă. Se face
prin biopsie, respectiv piesă operatorie sau recoltare necroptică, când se obţine un eşantion cu
grosime de aproximativ un centrimetru, ce urmează a fi prelucrat prin tehnica histologică.[10]
Fixarea este operaţiunea prin care piesa este conservată într-o substanţă numită fixator, care are
drept rezultat menţinerea formei structurilor şi păstrarea raporturilor dintre celulele ţesuturilor sau
organelor în timpul vieţii. Fixatorii sunt fie soluţii simple fie amestecuri fixatoare.[10] “Printre
calităţile unui bun fixator se numără următoarele: să pătrundă în ţesuturi pentru oprirea bruscă a
proceselor vitale; să stabilizeze structurile cu păstrarea nealterată a caracterului şi distribuţiei
constituenţilor celulari; să nu provoace artefacte (structuri ce nu au corespondent în celula vie); să
nu îşi modifice compoziţia în timpul fixării; să favorizeze secţionarea printr-o bună
consistenţă”.[10]
Fixatori simpli: formol 10% , respectiv soluţia 10% din formaldehida comercială, timp de fixare
24-48 ore; alcool etilic 96˚-100˚, timp de fixare 24 ore-câteva zile; alcool metilic pur; bicromat de
potasiu soluţie 2-4%; acetonă anhidră; acid osmic soluţie 1-2% etc.[10]
Amestecurile fixatoare sunt date de diferiţi fixatori simpli care se pot amesteca în anumite
concentraţii. Uzual se folosesc următoarele amestecuri fixatoare, respectiv fixatori compuşi:
- lichidul Bouin sau picroformolul acetic, considerat fixator universal cu utilizare curentă pentru
toate structurile.
- fixatorul Carnoy, foarte bun fixator nuclear
- fixatorul Regaud, de elecţie pentru evidenţierea mitocondriilor
- fixatorul Zenker, datorită pătrunderii rapide este convenabil pentru orice tip de ţesut
- Fixatorul Helly, util în observarea structurilor hemolimfopoietice
- fixatorul Susa, ce permite coloraţii elective pentru diferite substraturi
Mordansarea este un procedeu post-fixare, cu substanţe ce contribuie la ameliorarea fixării şi a
colorării ulterioare.[10] În acest context, postcromizarea se utilizează pentru evidenţierea
mitocondriilor şi a fosfolipidelor.[10]
Includerea este etapa prin care ţesuturile fixate şi spălate sunt pătrunse cu şi în substanţe
solidificabile, la temperature camerei. Are ca scop conferirea unei consistenţe apreciabile piesei,
pentru a fi secţionată la dimensiuni cât mai subţiri. Substanţele folosite pentru includere se numesc

31
mase de incluziune. Dintre acestea, cele mai utilizate sunt: parafina, celoidina, amestecul
parafină-celoidină, substanţe sintetice.[10]
Includerea la parafină se foloseşte cel mai frecvent şi are următoarele etape intermediare:
-deshidratarea
-clarificarea
-impregnarea cu parafină
-includerea în bloc

Deshidratarea este operaţiunea de îndepărtare a apei din piesă, prin trecera acesteia prin trei băi
succesive de alcool în concentraţii crescânde, de la 70˚, la alcool absolut. Astfel, alcoolul
înlocuieşte apa din ţesuturi. Fiecare baie de alcool are durata de aproximativ 3 ore.
Clarificarea permite înlocuirea alcoolului din piesă cu o substanţă miscibilă cu apa şi care este
totodată şi dizolvant al parafinei care urmează să impregneze piesa. Se folosesc 3 băi succesive cu
una din următoarele substanţe: xilen, benzen, toluen, alcool amilic, salicilat de metil. Fiecare baie
de clarificare are durata de aproximativ 3 ore. La finalul etapei, piesa arată translucidă. [10]
Impregnarea cu parafină, foloseşte parafina histologică, cu punct de topire 56˚, ţinută într-un
termostat cu această temperatură. Piesele sunt trecute prin trei băi de parafină topită, a câte 3-6 ore
fiecare. La final, parafina înlocuieşte clarificatorul şi impregnează piesa. [10]
Includerea în bloc implică realizarea propriu-zisă a blocului de parafină. Aceasta se face între două
bare metalice în forma literei L, numite bare Leuckardt, unde se toarnă parafina topită la 56˚ şi
unde se pune piesa scoasă de la termostat. După răcirea completă a blocului, parafina se întăreşte,
urmând a fi secţionat la microtom.[9]
Secţionarea blocurilor de parafină, ce include piesa, se face prin tăierea acestora în felii subţiri, cu
aparatul numit microtom.[9] Uzual se foloseşte microtomul rotator tip Minot.[10] (Fig.8)

32
Fig. 8 Microtom rotator (după site-ul http://www.micros.at/Englisch/microtom.html)

Acesta este alcătuit dintr-un suport metallic greu şi patru elemente funcţionale şi anume un cuţit
fixat într-un suport, un mecanism de fixare a portobiectului, un dispozitiv mobil ce permite trecerea
piesei prin cuţit şi un mecanism gradat de înaintare a portobiectului pe distanţe foarte mici şi precis
stabilite, numit micrometru, cu ajutorul căruia se reglează grosimea secţiunii.[10]
Se pot obţine secţiuni de 1-2 micrometri până la 5-7 micrometri. Secţiunile obţinute, se lipesc pe
lama de sticlă portobiect, care a fost pregătită prin ungere cu albumina Mayer, ce reprezintă un
amestec în părţi egale de albuş de ou proaspăt, glicerină şi câteva cristale de timol ca şi conservant.
Uscarea preparatelor se face la termostatul de 37˚, unde se lasă 24 ore lamele portobiect cu
secţiunile lipite pe ele.

33
Colorarea secţiunilor se face după deparafinarea lor, urmând apoi rehidratarea care să permită
colorarea.
Deparafinarea are ca scop scoaterea parafinei din secţiuni prin trecerea acestora prin trei băi
successive fiecare cu durata de 1-3 minute, folosind solvenţi ai parafinei, ca benzen, toluen, xilol.
Ulterior, solventul parafinei este scos prin 3 băi successive de alcool etilic absolut, 96˚, 90˚, fiecare
baie având durata de circa 2 minute.
Hidratarea secţiunilor se face prin trecerea lamei într-un vas cu apă, timp de 10 minute.
Coloraţia uzuală în histologie se numeşte hematoxilină-eozină (HE).[10]
Etapele acestei coloraţii sunt:
-deparafinare cu toluen, trei băi successive, a câte circa 3 minute fiecare
-hidratare, prin trei băi succesive de alcool, de la alcool absolut, la alcool 96˚, 90˚, apă
-colorare cu hematoxilină Mayer, timp de 6-7 minute
-spălare cu apă de robinet
-diferenţiere în alcool clorhidric 2% la suta, circa 3 secunde
-spălare în apă de robinet
-virare ăn carbonat de litiu, soluţie saturată, circa 3 secunde
-spălare în apă de robinet
-colorare cu eozină 3-5 secunde
-spălare în apă de robinet
-deshidratare , cu alcool în concentraţii crescătoare, trei băi, 90˚, 96˚, alcool absolut
-clarificare în trei băi de xilen, xilol, a câte 15 minute fiecare
-montarea lamelei cu balsam de Canada
- etichetarea şi păstrarea în histotecă[10]

Rezultatele coloraţiei HE:

-nucleii se colorează în albastru-violet, cu hematoxilină
-citoplasma se colorează în roz-roşu, cu eozină [10]

34
6. METODE DE COLORARE ŞI COLORANŢI ÎN BIOLOGIA CELULARĂ

Colorarea structurilor celulare şi tisulare reprezintă un fenomen complex în care sunt implicaţi atât
factori fizici cât şi mecanisme chimice.
Coloranţii sunt compuşi organici care pot colora durabil o substanţă sau un ansamblu de substanţe.
Pentru aceasta, necesită grupări cromofore sau purtătoare de culoare şi una sau mai multe grupări
auxocrome, ce îi conferă calitatea de colorant.[9]
Termenul de cromofor, desemnează o grupare de atomi, cu caracter nesaturat, care, prezentă în
molecula unei substanţe organice, îi conferă calitatea de cromogen, respectiv de substanţă
colorată.[10] Prin urmare, o substanţă colorantă nu este implicit un colorant, respectiv nu poate
colora diferite materiale, fie acestea biologice sau nu.
Termenul de auxocrom, desemnează o grupare funcţională care, prezentă în molecula unui
cromogen, îi conferă afinitatea pentru substratul pe care se aplică, deci calitatea de colorant.
Concluzionînd, auxocromii determină calitatea de colorant şi chiar caracterul acid sau bazic al
colorantului respective.[10]
Colorarea substratului în aceeaşi culoare ca şi culoarea colorantului se numeşte ortocromazie.
Colorarea substratului altfel decât culoarea colorantului se numeşte metacromazie şi reprezintă
fenomenul prin care unii coloranţi, ca de exemplu albastru de toluidină, îşi schimbă culoarea după
ce au reacţionat cu un component tisular.[13]
Nomenclatura coloranţilor citologici, implică definirea acestora prin denumiri scurte, descriptive
şi nu prin denumiri chimice complete.[9]

Clasificarea coloranţilor citologici se face după criterii diferite:

35
1. după origine:
- naturali, de origine vegetală, ca hematoxilina, şafranina sau de origine animală, carmin
- sintetici, de exemplu albastru de metil

2. după natura auxocromilor ce determină şi comportamentul lor în soluţie, coloranţii se împart în:
- acizi sau anionici
- bazici sau cationici
- neutri

Substratul molecular la nivelul căruia se ataşează coloranţii, este reprezentat de proteine. Coloranţii
se ataşează pe substrat, în principal, prin mecanism chimic, realizând cu substratul, legături
electrochimice. Se pot forma, de asemenea, legături de hidrogen. [10]

Metodele de colorare se clasifică:

A. după starea materialului:

-coloraţii vitale, care se efectuează prin folosirea unor coloranţi vitali pe un preparat proaspăt şi
care persistă numai atât timp cât celulele supravieţuiesc in vitro, ca de exemplu Verde Janus B;
roşu neutru
-coloraţii permanente, care se efectuează prin colorarea preparatelor permanente

B. după numărul coloranţilor utilizaţi:

-coloraţii simple, ce folosesc un singur colorant, fie nuclear, hematoxilina, fie citoplasmatic, eozina
-coloraţii combinate, ce folosesc doi sau mai mulţi coloranţi, ca de exemplu coloraţia dublă
hematoxilină-eozină; coloraţia tricromică van Gieson, folosite pentru colorarea în mod diferit a
diferitelor elemente tisulare şi facilitarea analizării structurilor acestora.[9]

C. după utilizarea unor adjuvanţi:

36
-coloraţii directe, când colorantul se fixează prin simplul contact cu secţiunea, ca în colorarea cu
hematoxilină-eozină
-coloraţii indirecte sau prin mordansare, ce necesită prezenţa unui mediator sau mordant, respectiv
iod, săruri de fier, alaunuri, care fixează colorantul de componentele celulare
Combinaţia colorant-mordant se numeşte lac.[10]

Mecanismele fixării coloranţilor pe structuri celulare sau tisulare sunt complexe, realizându-se prin
intermediul unor factori fizici şi a unor mecanisme chimice în proporţii variabile. Anumite coloraţii
nu par să evidenţieze decât parţial mecanisme chimice, de aceea s-au luat în consideraţie şi unii
factori fizici, printre care se amintesc:

-penetrarea pur mecanică a colorantului în interiorul anumitor structuri tisulare prin osmoză sau
prin capilaritate
-adsorbţia, cu rol important în coloraţiile diferenţiale ale unor elemente tisulare dar şi în fenomene
de mordansare
-absorbţia legată de structura fizică a constituenţilor tisulari

Coloraţia hematoxilină-eozină este cea mai răspândită în laboratoarele de histologie normală şi

patologică. Este o coloraţie topografică, utilizată pentru studiul aspectului general al ţesuturilor şi
organelor şi nu o coloraţie citologică, deoarece nu permite studiul componentelor citoplasmatice.
“Hematoxilina este o substanţă naturală, de origine vegetală, incoloră, ce trebuie oxidată sub formă
de hemateină, pentru a deveni colorată. Oxidarea ei, denumită curent maturare, se face natural, prin
expunere prelungită la aer sau artificial, prin tratare cu agenţi oxidanţi. Hemateina are culoare
galben-roşiatică dar nu are capacitatea de colorant, fapt pentru care necesită mordansarea ce se
realizează cu alaun de potasiu. Deci, colorantul este hemalaunul, format din hemateină şi alaun.
Rezultatele coloraţiei sunt: nucleul, bazofil, albastru-violet, cu hemalaun, colorant bazic iar
citoplasma, acidofilă, roz-roşu, cu eozină, colorant acid”.[10]
Evidenţierea mitocondriilor, organite intracitoplasmatice cu rol în producerea de energie, se
realizează prin coloraţia hematoxilină ferică Regaud. Rezultatele coloraţiei identifică mitocondriile
ca formaţiuni punctiforme, răspândite în toată citoplasma, colorate în negru, pe fondul
citoplasmatic necolorat. Mitocondriile se pot evidenţia şi prin tehnica Benoît, când apar colorate în
roşu, citoplasma în verde, lipidele osmiofile în negru. Tehnica Benoît evidenţiază de asemenea

37
microvilii şi cilii vibratili din trahee, intestine, rinichi. Alte tehnici pentru evidenţierea
mitocondriilor sunt metodele Benda, Nassonow, impregnările argentice.[9]
Evidenţierea complexului Golgi, organit intracitoplasmatic, se face prin tehnica Cajal-Da-Fano.
Rezultatele coloraţiei sunt evidenţierea complexului Golgi ca filamente în reţea colorate în negru,
citoplasma, fără supracolorare, fiind cu tentă aurie. Alte metode pentru evidenţierea complexului
Golgi sunt Mann-Kopsch,cu tetraoxid de osmiu 1% şi Elftman, cu azotat de argint.[9]
Evidenţierea reticulului endoplasmic rugos, organit intracitoplasmatic, cuprinde tehnici care se
bazează pe bazofilia acidului ribonucleic, constituentul caracteristic organitului. Rezultate bune
pentru evidenţierea RER se obţin prin detectare histochimică. Prin această tehnică se evidenţiază
corpusculii Nissl coloraţi în albastru închis iar citoplasma în albastru deschis.[9]
Centrozomul se evidenţiază prin coloraţia Flemming, varianta Matthey, rezultatele arătând
citoplasma cu tentă galben-brună iar centrozomul şi diferenţele fibrilare, brun închis. Se mai
foloseşte, metoda Hortega, respectiv impregnare cu argint amoniacal.[9]

„Etapele de preparare şi colorare a unei secţiuni, pot să determine apariţia unor imperfecţiuni la
final. Acestea constituie structuri artificiale, efect a unor alterări, manipulări neadecvate sau
modificări celulare, rezultate în cursul efectuării preparatului microscopic, numite artefacte”.[9]
Se utilizează diferite tehnici histologice, pentru evidenţierea diferitelor tipuri de ţesuturi.
Tehnici speciale pentru examinarea ţesutului epitelial – impregnarea argentică Ranvier. Rezultate:
limite intercelulare negre.
Tehnici speciale pentru examinarea ţesutului conjunctiv – coloraţia cu albastru de toluidină,
evidenţiază granulaţiile din mastocite, fiind un exemplu de metacromazie.
Metodă pentru evidenţierea fibrelor conjunctive – fibre de reticulină, prin impregnare argentică;
fibre elastice – cu rezorcin-fuxină sau cu orceină.
Tehnici speciale pentru ţesutul nervos:
>metoda Nissl, ce are ca rezultate imaginea de ansamblu, albastru deschis, cu nucleii albastru palid
şi periferia intens colorată iar nucleolul, albastru-violet
>Impregnare argentică pentru componente ale ţesutului nervos
- neurofibrile, metoda Ramon y Cajal
-prelungirile nervoase, metoda Golgi
-microglie, tehnica Rio Hortega
-metoda cu acid osmic pentru evidenţierea mielinei

38
-metoda cu hematoxilină cromică-floxină, pentru evidenţierea granulelor de neurosecreţie.[10]

7. TEHNICI SPECIALE UTILIZATE ÎN BIOLOGIA CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ

Sortarea celulelor prin citometrie de flux

Citometria de flux permite determinarea simultană a mai multor parametri fizici şi chimici
caracteristici unei singure celule aflate în mişcare într-un curent lichid.[21]
Funcţionarea unui citometru de flux implică, în general, succesiunea etapelor:
-suspensia de celule este pusă în contact cu un set de anticorpi monoclonali marcaţi cu anumite
substanţe fluorescente
-suspensia trece printr-un dispozitiv de reglare a fluxului, respectiv camera de curgere, care
determină o aliniere a celulelor într-un curent unicelular pe secţiune
-inserţia celulelor cu un fascicul laser, ce se soldează cu dispersia luminii şi emisia de fluorescenţă
-folosirea unui sistem de detecţie ce analizează semnalele rezultate, obţinându-se date despre
dimensiunile şi complexitatea structurală a celulei şi respectiv despre prezenţa unor structuri
antigenice corespondente anticorpilor marcaţi
-curentul fluid este fragmentat în picături, ce conţin celule, prin aplicarea energiei sonice la nivelul
camerei de curgere
-îndeplinirea de către celulă a unor condiţii predefinite, prin programare, determinând plasarea unei
sarcini electrice, pe picătura pe care o conţine
-picăturile încărcate electric sunt deflectate într-un câmp electrostatic şi apoi colectate
corespunzător.(Fig. 9)

39
Funcţionarea unui citometru de flux şi informaţiile pe care acesta le oferă, se înţeleg prin
perceperea acestui sistem sub forma unui microscop cu lumină fluorescentă.

Un citometru de flux oferă posibilitatea de a sorta din totalul celulelor din probă, o populaţie de
interes. Procedura presupune instalarea unor eprubete pentru colectarea celulelor dorite; activarea
unui meniu de sortare din cadrul etapei de achiziţie a programului; alegerea modului de sortare, a
numărului de celule dorite şi identificarea populaţiei prin intermediul unei aşa-numite “porţi
logice”. [21]
Principiul sortării implică antrenarea celulelor din probă printr-un curent de lichid şi forţate apoi să
treacă una câte una prin camera de curgere, unde sunt interceptate de raza laser. Superior se află un
tub cu diametrul interior comparabil cu dimensiunile unei celule, numite tub colector. El este
poziţionat în afara traiectului de curgere a celulelor dar se poate deplasa astfel încât să îl
intercepteze şi să colecteze celule ţintă. Celulele sortate sunt dirijate către eprubete situate pe un
panou frontal al aparatului.(Fig. 10) În momentul în care o celulă trece prin faţa razei laser,
calculatorul decide, pe baza caracteristicilor porţii de sortare, dacă este o celulă ţintă sau nu. După
stabilirea acestui lucru, decizia de a captura celule ţintă este luată în funcţie de modul de sortare,
cunoscute fiind în principal trei moduri de sortare.(Fig. 11)
Aplicaţiile metodei sunt în imunodiagnostic şi în monitorizarea unor afecţiuni, ca boli de
autoagresiune sau imunodeficienţe (HIV/SIDA, neoplazii); în imunologia experimentală(cercetări
cu celule sortate); studierea gestaţiei fiziologice.[21]

40
Fig. 9 Principiul general al unui flux-citometru (după C. Voiculescu, 1996)

41
10.Principiul sortării celulelor(după C. Voiculescu, 1996)

Fig 11. Moduri de sortare celulară prin citometria de flux (după C. Voiculescu, 1996)

42
Culturi celulare

Tehnicile de culturi de celule şi ţesuturi reprezintă un instrument important şi necesar în studiul a

numeroase probleme fundamentale din domeniul biologiei celulare normale şi patologice, a
geneticii şi a altor domenii medicale.
Prin cultura de celule se obţine o multiplicare ‚in vitro” a celulelor provenite dintr-un fragment de
ţesut. Astfel, se poate studia comportamentul celulelor în condiţii strict definite, fiind posibilă
determinarea efectelor asupra comportamentului celular prin adăugarea sau extragerea de molecule
specifice, ca factori de creştere sau hormoni şi obţinerea de populaţii omogene de celule pentru
studiul interacţiunilor între un tip celular sau altul.[9]
“Metoda permite studiul caracterelor morfologice şi proprietăţile biologice ale celulelor din diferite
ţesuturi, separate de organism dar şi studiul unor probleme de biologie tisulară ca de exemplu
afinitatea sau antagonismul între suşe tisulare diferite”. [9]
Recent s-au putut realiza culturi prin suspensii de celule disociate din ţesuturi, existând
posibilitatea purificării tipurilor celulare individuale din amestecul de tipuri de celule diferite.(Fig.
12)
Tipurile de culturi celulare se pot clasifica după cum urmează:[9]
>După felul substratului:

-culturi pe suport organic nutritiv

-culturi pe suport organic nenutritiv
-culturi în suspensie în mediu lichid
-culturi pe suport anorganic

>După modul de iniţiere a culturii:[9]

43
1.culturi iniţiate cu fragmente de ţesut:

- pe suport nutritiv: culturi în picătură suspendată; culturi în flacoane; culturi în tuburi rotate
-culturi pe suport nenutritiv
-culturi în suspensie în mediu lichid , când se obţine numai supravieţuirea celulelor

2.culturi iniţiate cu celule dispersate:

>culturi de celule libere în mod natural, respectiv culturi de leucocite din sângele periferic
>culturi de celule obţinute prin dispersarea celulelor din fragmente de ţesut

>După tipul de material biologic cultivat:[9]

>culturi de organe sau organocultura, ca “metodă ce reprezintă scoaterea din organism a unui
fragment de organ, de exemplu intestin, trahee, rinichi şi introducerea acestuia într-un mediu
nutritiv”, cu menţinerea acestora “in vitro”, un timp limitat. Caracteristica culturilor de celule
obţinute din fragmente de ţesut este formarea în jurul explantului, respectiv a fragmentului extras
dintr-un ţesut, a unei “coroane de celule”.[9]
>cultura celulară propriu-zisă, este obţinută prin cultivarea într-un mediu nutritiv a unei suspensii
de celule, şi se realizează prin dispersare prin metode fizice şi chimice, fiind reprezentată prin
asocierea factorilor chimici, cu factori mecanici.[9]

Materialele de lucru cuprind prepararea culturilor de celule într-un spaţiu steril, special amenajat.
Laboratorul de lucru trebuie să cuprindă obligatoriu: camera de curăţire şi sterilizare a
instrumentelor şi sticlăriei de laborator, camera de creştere a celulelor şi ţesuturilor sau camera de
incubare, camera de inoculare şi transfer şi camera de prelucrare a materialului biologic.
Mediile nutritive se prepară într-un mod specific. Mediul de cultură trebuie să asigure celulelor
cultivate “in vitro” condiţii apropiate de acelea pe care le oferă organismul viu; trebuie să asigure:
echilibrul ionic obţinut cu soluţii izotonice, pH-optim 7,2-7,4 care să se menţină cu substanţe
tampon; temperatura optimă, conţinutul de oxigen şi dioxid de carbon favorabil; elemente nutritive
indispensabile metabolismului: hidraţi de carbon, respectiv glucoza, zaharoza, fructoza, proteine
animale, respectiv ser sangvin, aminoacizi esenţiali, grăsimi, colesterol, vitamine, hormoni,

44
substanţe stimulatoare ale creşterii. Se impune evitarea contaminării cu germeni patogeni prin
adăugarea de antibiotice: penicilină, streptomicină şi antifungice ca micostatin, dar şi stimularea
multiplicării şi creşterii celulelor.[9]
Clasificarea mediilor de cultură se poate face şi astfel:

-după consistenţă: lichide, semilichide respectiv mediu nutritiv şi agar sau coagulant plasmatic
sangvin
-după compoziţie: naturale, semisintetice şi sintetice
-după valoarea nutritivă şi după scopul urmărit: medii de creştere, ce permit o proliferare
abundentă a celulelor de cultură; medii de menţinere ce păstrează activitatea celulelor fără a le
favoriza proliferarea, utilizate pentru întreţinerea culturilor ajunse la dezvoltarea maximă.
Desfăşurarea ciclului vital al celulelor cultivate” in vitro” este diferită de cea care se petrece în
organism pentru că factorii de cultivare sunt diferiţi. Studiul celulelor normale adulte sau
embrionare cultivate pe substanţe solide, cum ar fi sticlă sau plastic, au arătat că dinamica
dezvoltării este fazică, cuprinzând: [10]
-stadiul staţionar, care începe imediat după prelucrarea celulelor în vederea cultivării. Faza are
durata de aproximativ 30 minute. Celulele se găsesc suspendate în mediu şi au forma globulară. În
această fază se produc adaptări la noile condiţii fizico-chimice de mediu precum şi procese
reparatorii ale microleziunilor, cauzate de tehnicile de dispersare chimică, enzimatică sau
mecanică.
-stadiul de ataşare, are durata de 1-2 ore. Acest fenomen este rezultatul unui proces de echilibrare a
forţelor ionice între substratul solid şi suprafaţa celulelor puse în cultură. Procesul este condiţionat
de prezenţa micromoleculelor proteice conţinute în adaosul de ser sangvin la mediul nutritiv, ce
împiedică schimbarea potenţialului electrostatic al membranei celulare.
-stadiul de etalare sau aplatizare, favorizat de proteinele serice în echilibru cu formaţiunile
glicoproteice de pe suprafaţa celulară; celulele iau formă aplatizată în plan paralel cu suportul solid
de cultivare, îşi măresc suprafaţa prin procesul de expansiune citoplasmatică, amintind dinamica
pseudopodelor.
-stadiul de multiplicare, în care la fiecare 18-20 ore are loc câte un ciclu celular datorită declanşării
unui proces mitotic intens care va determina acoperirea suportului solid de cultivare cu celule,
numit monostrat.

45
-stadiul staţionar, care, în momentul în care toată suprafaţa recipientului în care s-a iniţiat cultura
este acoperit de monostratul celular, determină stoparea sintezelor de ADN, ciclul celular oprindu-
se în faza G2. Fenomenul este cunoscut şi drept inhibiţie de contact.[10]
De menţionat este faptul că, anumite culturi, care s-au iniţiat din materiale cu origine tumorală sau
cele inoculate cu factori malignizanţi sau care se malignizează prin factori neidentificaţi, parcurg
primele stadii în aceeaşi ordine, mai rapid uneori, dar nu respectă faza staţionară şi inhibiţia de
contact, continuând să se multiplice multistratificat, în microtumorete.[9]

Fig. 12 Tehnica culturii de celule pentru ţesuturi embrionare ( după I. Diculescu şi col., 1980)

Criofracturarea

46
„Analiza şi vizualizarea preparatelor microscopice implică prevenirea artefactelor”.[9]

În acest context, se consideră că structurile observate la microscopul electronic nu sunt identice cu

starea lor nativă din organismul viu iar starea lor biostructurală ar putea fi modificată. [9]

În urmă cu câteva decenii s-a dezvoltat o tehnică numită replicarea prin criofracturare; „freeze-
fracture replication”.[9]

Experienţele efectuate în acest domeniu, prin introducerea unor compuşi ca glicerolul, urmate de
răciri la temperaturi joase de -150˚C, au arătat că celulele ar putea fi îngheţate fără formarea
cristalelor de gheaţă. „Procesul de cristalizare intracelulară la viteze mici, atunci când celulele sunt
îngheţate în apă, produce moartea celulelor”.[9] În cazul unor viteze de îngheţare ridicate, apa
conţinută, capătă o structură solid-amorfă, ţesuturile devenind astfel vitroase, cu păstrarea
fiabilităţii lor.(Fig. 13)

47
Fig. 13 Schema obţinerii unei criofracturi (după C.Cotrutz şi col., 1994)

Se consideră că fenomenul de îngheţare rapidă la nivel celular este limitat de conductivitatea

termică relativă a apei conţinute, care micşorează rata îngheţării rapide a probei.

În tehnicile de îngheţare, dezvoltate recent, proba este aşezată pe suprafaţa unei piese metalice din
cupru pur, răcită în prealabil la temperatura heliului lichid, -270˚C.[9]

În acest caz, conductivitatea termică este suficient de rapidă pentru a realiza îngheţarea straturilor
de celule, stopând cele mai rapide activităţi celulare.(Fig. 14)

„Prepararea unui ţesut în vederea examinării prin microscopie electronică presupune ca odată
făcută îngheţarea celulelor, să se facă secţionarea şi apoi realizarea unei replici de platină-carbon,
care va evidenţia, în urma iluminării cu un fascicul de raze X, detaliile morfostructurale
analizate”.[9] Cu ajutorul crioultramicrotomului, ţesuturile îngheţate instantaneu sunt secţionate cu
un cuţit răcit la temperaturi de -190˚C, cu azot lichid. Ulterior, gheaţa din probă este îndepărtată
printr-un proces de sublimare în vid. În acest mod, va fi pregătit ţesutul astfel fracturat, pentru
realizarea replicii de platină-carbon.[9] În urma fracturării, suprafaţa probei prezintă neuniformităţi,
care se datorează particulelor şi formelor diferite ale organitelor prezente în celule şi care sunt
acoperite apoi, în procesul de replicare a probei. Replicile obţinute permit înţelegerea modului de
asamblare a structurilor, pe baza imaginilor tridimensionale date de explorările
electronomicroscopice. În urma criofracturării şi sublimării în vid, replica materialului biologic
astfel obţinut, are avantajul evitării etapelor obişnuite, de fixare şi includere, păstrând fidelitatea
biostructurii native.(Fig. 15)

Metoda criofracturării materialului, are avantajul vizualizării unor structuri, cum ar fi partea
internă a membranelor unitare, care în mod normal nu sunt accesibile prin tehnici de
ultramicrotomie clasică.

Se cunosc tehnici de crioultramicrotomie care folosesc o impregnare a ţesuturilor cu crioprotectori,

ca de exemplu glicerina 20-30%, agenţii crioprotectori, aplicându-se ţesuturilor a căror structuri
depăşesc un conţinut de apă de 70%. [9]

48
Fig. 14 Schema instalaţiei de sublimare şi metalizare a criofracturii (după C.Cotrutz şi col., 1994)

49
Fig.15 Obţinerea replicii de platină –carbon a probei criofracturate (după C.Cotrutz şi col., 1994)

50
Fracţionarea. Centrifugarea

Fracţionarea celulară reprezintă modalitatea de studiu a componentelor subcelulare izolate,

permiţând descrierea cantitativă a diferitelor componente subcelulare, din punct de vedere a
compoziţiei chimice, activităţii enzimatice, comportamentului funcţional.[10]

Etapele fracţionării celulare sunt reprezentate de omogenizare, separarea sau fracţionarea propriu-
zisă şi analiza fracţiunilor, toate în succesiune obligatorie.

Omogenizarea reprezintă operaţiunea de obţinere a omogenatului celular, care este reprezentat de

componentele celulare obţinute prin liza membranei plasmatice, suspendate într-un mediu
corespunzător.[10]

Precauţiile acestei tehnici au ca scop păstrarea cât mai aproape de condiţiile in vitro, a structurii
organitelor celulare şi a activităţii funcţionale a componentelor lor. Procedurile de omogenizare
sunt în funcţie de tipul celular şi depind de următorii factori: timpul şi modul de omogenizare;
timpul de extracţie; mediul de suspendare; temperatura de lucru, pH-ul mediului.[9]

Tehnica de obţinere a omogenatului se desfăşoară în mai multe etape. Acestea includ recoltarea
probei; spălarea; fragmentarea; omogenizarea propriu-zisă. Ruperea membranei plasmatice în
vederea fracţionării celulare cunoaşte diferite metode.[10]

Omogenizarea propriu-zisă, reprezintă ruperea membranelor celulare prin îngheţare-dezgheţare;

ruperea membranelor celulare prin ultrasonicare; ruperea membranelor celulare cu ajutorul
detergenţilor. Compoziţia ionică a mediului de extracţie este foarte importantă, medii de
suspendare deseori folosite, fiind: soluţiile saline; soluţiile de acid citric, soluţia de zaharoză; medii
neapoase folosite pentru solubilizarea unor substanţe din celule; medii complexe, folosite cu
scopul păstrării integrităţii morfologice şi funcţionale a unui tip de structură, determinat. [10]

Trecerea de la omogenat la fracţiuni subcelulare se face prin metode variate, mai importantă fiind
centrifugarea.

51
Separarea prin centrifugare se bazează pe deosebirea componentelor celulare ca densitate şi
coeficient de sedimentare, factori în funcţie de care diferitele particule celulare vor sedimenta cu
viteze diferite.(Fig. 16)

Fig. 16 Separarea organitelor celulare prin centrifugare în gradient de densitate (după C.Cotrutz şi
col., 1994)

Practica centrifugării implică o suscesiune de etape:(Fig. 17)

52
-realizarea centrifugării omogenatului obţinut în prima etapă a fracţionării la viteză mică, cu
obţinerea unui sediment şi a unui supernatant, sedimentul reprezentând o fracţiune ce conţine
organite celulare de acelaşi fel

-continuarea centrifugării, care se face până ce supernatantul devine aparticulat

O fracţiune celulară obţinută prin centrifugare , trebuie să întrunească anumite caracteristici. Prin
urmare trebuie să fie omogenă, fără contaminare, cu organite celulare nealterate.[10]

Metodele morfologice şi biochimice, se utilizează pentru controlul riguros şi pentru aprecierea

caltăţii fiecărei fracţiuni celulare. Dezavantajul metodelor de centrifugare constă în faptul că nu se
obţin fracţiuni pure.[10]

O metodă modernă de separare a fracţiunilor celulare este reprezentată de ultracentrifugare, care se

clasifică în două categorii: ultracentrifugări analitice şi ultracentrifugări preparative.

Ultracentrifugarea analitică necesită rotoare analitice speciale, având celule analitice cu ferestre,
foarte deosebite ca tip de construcţie, după scopul urmărit. Ultracentrifugele analitice sunt
echipate cu trei sisteme optice de înregistrare: strioscopică Philpot-Swensson, interferenţială
Reylight şi de absorbţie în UV. [10]

Ultracentrfugarea preparativă necesită tuburi din material plastic, în care se introduce

omogenatul, folosind medii suspendate adecvate. Aceată categorie de metode dezvoltă o forţă
centrifugă superioară ca valoare, prin care se pot realiza trei categorii de măsurători
fundamentale: viteza de sedimentare, gradientul de densitate, echilibrul de sedimentare.[10]

53
Fig. 17 Fracţionarea celulară-etape (după C.Cotrutz şi col., 1994)

54
8. STUDIUL COMPONENTELOR MACROMOLECULARE ALE CELULEI

Cromatografia

Metoda cromatografică a fost introdusă pentru prima dată în anul 1903 de către botanistul rus
Mihail Ţvet, în studiul compoziţiei unor coloranţi vegetali.[9]

Reunind o serie de tehnici de analiză, cromatografia reprezintă o metodă de separare de mare

performanţă, ce se bazează pe separarea componentelor unei probe. Acest lucru se realizează prin
mecanism de migrare diferenţiată între două faze, dintre care una este staţionară iar cealaltă
mobilă.[9]

Migrarea diferenţiată este o consecinţă a vitezelor diferite cu care componenţii amestecului

antrenaţi de faza mobilă se deplasează de-a lungul fazei staţionate în coloana cromatografică, hârtie
cromatografică sau strat subţire depus pe o placă.

Caracteristicile metodei constau în capacitatea de rezoluţie foarte mare, concretizată în posibilitatea

separării unor amestecuri speciale de componenţi asemănători, cu sensibilitate remarcabilă. Se
urmăreşte universalitatea domeniilor de aplicare, simplitatea, aceesibilitatea, rapiditatea obţinerii
rezultatului.[9]

În funcţie de mecanismul ce stă la baza procesului elementar de separare şi după natura celor două
faze, metodele cromatografice se împart:[9]

-cromatografia de adsorbţie: cromatografie lichid-solid, gaz-solid.

-cromatografie de repartiţie: lichid-lichid, gaz-lichid.

-cromatografie prin schimb ionic.

55
-cromatografie de excludere-difuzie.

După natura fazei staţionare şi a fazei mobile, se clasifică:[9]

-A. Fază staţionară solidă:

-fază mobilă solid-lichid: -cromatografia de adsorbţie pe coloană; cromatografia pe strat subţire;

cromatografia prin schimb ionic.

-faza mobilă gazoasă solid-gaz.

B. faza staţionară lichidă:

-faza mobilă lichidă lichid-lichid cu tipurile de cromatografie: de repartiţie pe coloană; pe hârtie; de

excudere-difuzie; pe strat subţire.

-faza mobilă gazoasă lichid-gaz cu tipurile de cromatografie: de repartiţie pe coloană; pe coloane

capilare.

Fracţionarea proteinelor, reprezintă o metodă cu mare utilizare, ce implică cromatografia. Aceasta

este o tehnică folosită iniţial pentru fracţionarea compuşilor cu greutate moleculară mică, precum
zaharidele şi aminoacizii.[9]

Cromatografia de partiţie este metoda cea mai folosită pentru separarea moleculelor mici.[9]
Aceasta implică aplicarea unei picături de probă pe un suport, cum ar fi o bucată de hârtie
absorbantă, în cromatografia pe hârtie, sau o bucată de plastic sau sticlă acoperită cu un strat
subţire de material absorbant inert, cum ar fi celuloza sau silicagel, în cromatografia în strat subţire.
Prin această tehnică, se permite unui amestec de solvenţi, să pătrundă în bandă, începând de la un
capăt. Odată cu deplasarea solvenţilor de-a lungul benzii, aceştia antrenează moleculele probei în
solvenţii respectivi. Aceştia din urmă, sunt selectaţi astfel încât unul din ei să fie absorbit mai
puternic decât celălalt, pe materialul absorbant. În acest timp, moleculele care sunt mai solubile în
solventul absorbit sunt relativ întârziate, în timp ce acelea care sunt mai solubile în celălalt solvent
se mişcă mai rapid. Pentru a detecta localizarea diferitelor molecule, cromatograma este uscată şi
apoi colorată.[9]

56
Tipurile de cromatografie pe hârtie şi în strat subţire, sunt folosite frecvent, pentru analiza
moleculelor mici. După ce proba a fost aplicată la bază şi uscată, o soluţie ce conţine un amestec
de doi solvenţi, s-a trecut încet prin hârtie, prin acţiune capilară.Componente din probă se
deplasează cu viteze diferite, conform solubilităţii lor relative, în solventul absorbit preferenţial pe
hârtie, la rate diferite. [9] (Fig. 18)

Fig. 18 Separarea moleculelor mici prin cromatografie pe hârtie (după C.Cotrutz şi col., 1994)

57
Prin cromatografia pe coloană, deseori sunt fracţionate proteinele. Tehnica implică trecerea
acestora peste o coloană ce conţine un material poros, solid, proteinele sunt migrate cu viteze
diferite prin interacţiunea lor cu matricea. În acest mod, anumite proteine pot fi colectate separat pe
măsură ce se scurg pe la baza coloanei. Proba se aplică la capătul unei coloane cilindrice din sticlă
sau plastic, conţinând o matrice solidă permeabilă imersată în solvent. La nivelul coloanei se
pompează lent o cantitate mare de solvent, care se colectează în tuburi separate pe măsură ce iese
prin baza coloanei.[9](Fig. 19)

Fig. 19 Separarea moleculelor prin cromatografie pe coloană (după C.Cotrutz şi col., 1994)

58
Diferiţi componenţi ai probei traversează prin coloană cu viteze diferite şi astfel sunt fracţionaţi. S-
au dezvoltat multe tipuri de matrici care permit proteinelor să fie separate fără alterarea structurii
lor native. Aceste matrici fac diferenţă între tipurile de proteine, pe baza sarcinii electrice, mărime
sau capacitate de a se lega de grupări chimice particulare pe matrice. În acest scop, sunt disponibile
mai multe tipuri de matrici. Matricile care se utilizează frecvent pentru separarea proteinelor sunt
dietilaminoceluloza, respectivDETAE-celuloză, încărcate pozitiv şi carboximetilceluloza sau Cm-
celuloza, încărcate negativ.[9]

Coloanele cu schimbători de ioni, conţin suporturi de săruri negative sau pozitive. Proteinele sunt
fracţionate conform cu aranjamentele sarcinilor electrice pe suprafaţa lor. Capacitatea asocierii
între moleculele dizolvate şi matricea schimbătoare de ioni, depinde de gradul ionic şi de pH-ul
soluţiei de eluţie, ce pate fi variat pentru a obţine o separare efectivă. În cromatografia pe
schimbători de ioni, matricea insolubilă poartă sarcini ionice care întârzie moleculele de sarcină
opusă. „Cromatografia prin schimbare de ioni separă proteine ce diferă prin încărcarea lor”.[9]

Coloanele de filtrare pe gel separă proteinele după mărimea lor şi conţin pături poroase minuscule.
Astfel, moleculele mari rămân între straturi iar moleculele mici, ce se mişcă mai rapid prin coloană,
se extrag primele. Cromatografia de filtrare pe gel este un mod accesibil de a determina mărimea
moleculelor de separat. „Cromatografia prin gel-filtrare separă proteinele ce diferă prin mărime.
Proteinele mici trec prin coloană mai încet decât cele mari, datorită drumului lor mai sinuos prin
ochiurile coloanei”.[9]

59
Cromatografia de afinitate pentru anticorpi, permite unui anticorp specific să fie legat covalent în
coloană, astfel încăt doar proteinele cu afinitate mare pentru anticorpi să fie reţinute de coloană.
Pentru proteinele celulare totale, se impune folosirea diferitelor tipuri de coloane succesive pentru
a le purifica. În acest context există suporturi de polizaharide ca dextran, agaroză, cu diferite
mărimi de pori, potrivite pentru fracţionarea moleculelor cu greutăţi moleculare specifice.
Procedeul cromatografiei de afinitate, are implicaţii asupra interacţiunilor biologice de legare ce
apar la suprafaţa proteinelor. Astfel, dacă un substrat enzimatic este legat covalent de o matrice
inertă, respectiv un suport polizaharidic, enzimele pot fi adesea reţinute de matrice, împreună cu
extrem de puţine alte proteine. Datorită marii specificităţi a unor asemenea coloane de afinitate, pot
fi obţinute purificări de 1000-10000 ori.

În cromatografia de afinitate, se foloseşte o matrice insolubilă care este legată covalent de un

ligand specific. Acesta poate fi o moleculă de anticorp sau un substrat enzimatic care va lega o
proteină specifică. Printr-o asemenea coloană de afinitate, sunt realizate „purificări într-un singur
pas”.[9] (Fig. 20)

Fig. 20 Matricea cromatografică în cromatografia de afinitate (după C.Cotrutz şi col., 1994)

60
Electroforeza

Este o tehnică mult utilizată în biologia celulară şi moleculară. A adus date noi referitoare la baza
informaţională ce priveşte nivele macromoleculare mari cum sunt cele proteice şi acizii nucleici
dar şi pentru cele de dimensiuni mai reduse.

„Electroforeza este o metodă de separare care se bazează pe migrarea diferenţiată a unor particule
sau ansambluri de particule încărcate electric, sub acţiunea unui câmp electrostatic uniform
extern”.[9]

Prin tehnicile de electroforeză se realizează purificarea şi fracţionarea macromoleculară, în funcţie

de abilitatea moleculelor cu sarcină electrică, de a migra către un câmp electric continuu.[9]

În funcţie de natura sarcinii, pozitive sau negative, ele migrează către catod sau anod.

Lungimea deplasării, în timpul migrării proteinei, este în funcţie de anumiţi parametri: masa
moleculară, sarcina ei electrică, temperatură, pH-ul mediului, câmpul electric, timpul de migrare
şi tipul suportului. În aceste condiţii, este realizabilă separarea diverselor tipuri de molecule ce pot
fi inerte: hărtie de filtru, silicagel, celuloză microcristalină sau dimpotrivă pot participa activ în
separare, interacţionând cu particulele care migrează: geluri de agar sau agaroză, poliacrilamidă.

Cele mai folosite tehnici de electroforeză, sunt acelea care utilizează gelul poliacrilamidic sau din
agaroză. Acestea reprezintă medii propice separărilor de proteine şi acizi nucleici, datorită abilităţii
moleculelor de a migra în prezenţa unui gradient de câmp electric.[9]

Printre avantajele folosirii gelului sunt: reproductibilitatea lui, puterea de rezoluţie, posibilitatea de
control a mărimii porilor pe un larg domeniu de dimensiuni, inerţia şi stabilitatea chimică la variaţii
mari de pH, temperatură şi concentraţie ionică, transparenţă perfectă, rezistenţă mecanică şi
flexibilitate.[9]

61
Gelul de poliacrilamidă(PA), care se consideră a fi cel mai eficient mediu stabilizat, se obţine prin
copolimerizarea acrilamidei şi a N,N’-metilenbisacrilamidei. În cazul proteinelor, gelurile
poliacrilamidice pot fi preparate sub formă fie de straturi sau plăci netede, fie sub forma unor
coloane cilindrice. Sistemele tampon pot conţine unul sau mai mulţi agenţi de disociere ca
detergenţii ionici (dodecilsulfat, uree).[9]

“Starea moleculelor în procesul de separare trebuie să întrunească condiţiile: înaintea polarizării,

diversele tipuri de molecule să se găsească întru-un amestec; odată cu aplicarea câmpului electric
toate proteinele să treacă rapid prin porii gelului; în cazul procesului de separare ele se vor distanţa
datorită sarcinii electrice şi masei moleculare specifice”.[9]

În cazul plăcilor se folosesc două tipuri de gel: unul de concentrare, ce are un pH acid şi porozitate
mare şi altul de separare cu pH alcalin şi porozitate mică, care se introduce în plăci ulterior, în
partea superioară. Soluţia poliacrilamidică, care se introduce în tubul de sticlă, polimerizează într-
un gel semisolid. La iluminarea sa cu o sursă ultraviolet, conferă o anumită porozitate gelului.
“Concentraţia soluţiei din tuburi sau plăci, determină mărimea porilor în gel, respectiv mărimea
efectivă a porilor scade pe măsură ce concentraţia de acrilamidă creşte, facilind astfel traversarea
moleculelor prin mediul poliacrilamidic. Gelului i se aplică o diferenţă de potenţial, care face
posibilă migrarea moleculară”.[9] Prin localizarea în mod diferit pe gel, se permite observarea
diferitelor tipuri de proteine sau acizi nucleici, care migrează în benzi diferite. Moleculele
specifice sunt colorate în prealabil sau marcate radioactiv. Prin plasarea unui film radiografic pe
gelul uscat şi expunere la radiaţii X, se obţine un film în care apar benzi colorate în nuanţe de gri,
care reprezintă diverse tipuri de molecule. Filmul astfel obţinut este cunoscut ca film
autoradiografic.[9]

Un alt mediu, la fel de răspândit pentru realizarea gelului, este agaroza. Acest mediu furnizează
rezoluţii superioare, se prepară uşor şi datorită faptului că rezultatele nu sunt întotdeauna
reproductibile, este necesară purificarea lui pentru eliminarea impurităţilor interferente. “Practic,
concentraţia de agaroză are valori cuprinse între 0,6%-1,5%. Gelul este turnat orizontal în aparatele
care sunt transparente la radiaţii UV, pentru a face posibilă migrarea. În cazul utilizării
electroforezei pe gel de agaroză la separarea acizilor nucleici, între bazele acizilor nucleici se
introduce bromura de etidiu, care nu prezintă fluorescenţă în mod spontan dar care, în cazul
intercalării între bazele acizilor, prezintă o fluorescenţă oranj”.[9] ADN-ul se poate vizualiza în gel
sub formă de benzi, după migrare, folosind iluminare ultravioletă.

62
Electroforeza capilară (EC) reprezintă o tehnică de separare care constă într-un tub capilar ce
conţine o soluţie tampon şi care se întinde între două rezervoare ce conţin electrozi de platină.
Aplicarea unei tensiuni înalte la capetele capilarei, care este umplută cu o soluţie tampon, cu o forţă
ionică mare şi constantă, permite separarea diverselor tipuri de molecule aflate în soluţie.
„Separarea depinde de viteza cu care moleculele migrează în câmp electric continuu. Aceată
modernă tehnică de electroforeză este rapidă şi separă cu o rezoluţie mare volume mici de probă,
0,1-10nl. Tehnica EC a fost utilizată pentru separarea cationilor şi anionilor anorganici, a
aminoacizilor sau a medicamentelor şi în special la determinarea secvenţei complete a ADN-ului
uman. De asemenea prezintă câteva avantaje comparativ cu electrforeza pe gel: viteză mare de
analiză; cantităţi mici de probă; control foarte bun al temperaturii; rezoluţie mare şi
reproductibilitate”.[9]

Difracţia cu raze X

Folosirea razelor X în studiul biologiei celulare şi moleculare, s-a dovedit utilă odată cu abordarea
structurii moleculare. În acest caz, imaginea analizată, era una de difracţie a cristalului substanţei
urmărite.

„Difracţia cu raze X oferă rezoluţii bune comparativ cu cele mai particulare tehnici de
microscopie electronică. Utilizând radiaţii X cu lungime de undă de circa 0,1nm pentru a genera
imaginea difractată a unui cristal, este posibil să se deducă poziţiile individuale ale atomilor unei
molecule, ca unitate de structură cristalină”.[9]

Cu ajutorul difracţiei cu raze X, imaginea obţinută poate impresiona uşor emulsia unui film,
permiţând stocarea informaţiei. Deoarece razele X au o putere de penetrare mult mai mare decât
electronii, permit analiza unei probe stratificate. Se obţine în acest fel, o imagine care nu mai este
distorsionată ca în alte tehnici ce necesită prelucrarea materialului biologic.[9]

Natura structurii unui cristal şi poziţiile pe care le ocupă în planurile regulate ale reţelei,
determină imaginea de difracţie produsă de cristal. Astfel, dacă un fascicul de raze X cu lungimi de
undă distribuite uniform cade pe un cristal, de exemplu clorură de sodiu, apar fascicule care

63
corespund interferenţei produse de centri difractanţi, din care este format cristalul, după direcţii
bine definite. „Dacă aceste fascicule ar întâlni în calea lor o placă fotografică, ar forma pete mai
luminoase, din a căror poziţie şi intensitate s-ar putea determina poziţiile atomilor în cristal în
acelaşi mod în care am putea deduce structura unei reţele optice, printr-un studiu al poziţiilor şi
intensităţilor liniilor de interferenţă”. [9]

La scară microscopică, structura unui cristal se prezintă ca o reţea cu simetrie cubică, ce are drept
cel mai mic element al constituţiei sale, laticea sau celula unitate. Aceasta are plasaţi în vârfuri
atomii corespunzători moleculei. Natura legăturilor dintre atomi determină configuraţia
arhitecturală. “Laticea reprezintă unitatea periodică fundamentală de difracţie”. Razele X sunt
difractate mai ales de electroni, difracţia pe nuclee fiind neglijabilă.[9]

Studiile referitoare la direcţiile fasciculelor de raze X difractate, fac posibilă găsirea simetriei de
bază a unui cristal. Totodată, studiul intensităţilor permite aflarea modului de distribuţie al
electronilor în celula unitate. Comparativ cu microscopia electronică în care lentilele obiectiv
colectează razele difractate şi le recombină spre a forma imaginea probei, în cristalografia cu raze
X, recombinarea făcută de cristalograf, se bazează pe informaţia dintre poziţia spoturilor, respectiv
reflexia. În această situaţie se are în vedere intensitatea de la nivelul plăcilor fotografice şi fazele
undelor, care sunt obţinute pe baza comparării imaginilor produse cu şi fără metalele grele ataşate
proteinei. Studiile au demonstrat că atomii mai grei sunt mai repede detectaţi comparativ cu atomii
de hidrogen. Astfel, atomii de metal, ca de exemplu atomul de fier din molecula de hemoglobină,
creează o lumină intensă a razelor X împrăştiate.[9]

Datele dintr-o imagine cristalografică se prelucrează cu anumite computere, dotate cu programe

soft specializate. În acest mod se poate face prelucrarea tridimensională a macromoleculelor,
proteinelor şi acizilor nucleici, permiţând analiza în detaliu a elementelor spaţiale existente la nivel
subcelular. Difracţia cu raze X tinde să devină o tehnică din ce în ce mai utilizată prin faptul că este
singura cale cunoscută până în prezent, pentru a determina în totalitate aranjamentul atomilor în
cele mai multe molecule. Se impune menţionarea aportului cristalografiei cu raze X în studiile
ADN-ului, ca în cazul modelului lui Crick şi Watson, 1953, când s-a propus modelul structurii
ADN, pe baza interpretării datelor provenite în special din cristalografia cu raze X.[9] (Fig. 21)

64
 Fig. 21 Difracţia cristalului de mioglobină (după C.Cotrutz şi col., 1994)

Spectrofotometria

Spectrofotometria este o ramură a opticii care se ocupă cu determinarea intensităţii radiaţiilor

monocromatice ce constituie spectrul unei radiaţii compuse.

Spectrofometrul este un instrument optic, care serveşte la obţinerea spectrelor de emisie sau de
absorbţie ale substanţelor, ce permite determinarea atât a lungimilor de undă ale liniilor spectrale
cât şi a intensităţilor acestor linii, prin comparare cu liniile unui spectru cunoscut.

În fenomenele de propagare, lumina prezintă un aspect ondulatoriu, de undă electromagnetică.

În fenomenele de emisie respectiv absorbţie, lumina prezintă un aspect corpuscular: se comportă ca fiind
formată din cantităţi bine determinate de energie, indivizibile, numite cuante sau fotoni. Energia fotonilor
este direct proporţională cu frecvenţa. E=hν unde h=6,62x10-27 (constanta lui Planck).

Existenţa cuantelor a fost demonstrată pentru prima dată în studiul efectului fotoelectric.[18]

Cel mai simplu tip de spectrofotometru este format dintr-o sursă de lumină albă, respectiv un bec
cu filament, un monocromator şi un detector cu citire directă.

Cu ajutorul unor oglinzi mobile din monocromator se schimbă în salturi foarte mici frecvenţa
luminii selectate din radiaţia totală a sursei. De fiecare dată se măsoară absorbţia, transmisia sau

65
extincţia şi se calculează, în funcţie de grosimea cuvei şi de concentraţie, valoarea coeficientului de
extincţie.

Extincţia reprezintă micşorarea sau anularea intensităţii unui fascicul de lumină.

Colorimetrul este un aparat folosit pentru determinarea intensităţii culorilor.

Monocromatorulu este un dispozitiv pentru izolarea dintr-un spectru a unei radiaţii cu o singură
frecvenţă.

9. TEHNICI DE CITOCHIMIE, CITOENZIMOLOGIE ŞI IMUNOCITOCHIMIE

Citochimia

Citochimia reprezintă un domeniu de studiu care permite interpretarea chimică a celulelor respectiv
a ţesuturilor, în relaţie cu organizarea lor structurală. Proteinele, lipidele şi glucidele, sunt
macromolecule care nu pot fi observate ca atare la microscop, fapt ce determină folosirea tehnicilor
ce urmăresc vizualizarea locusurilor subcelulare unde sunt prezente aceste substanţe, prin reacţii de
culoare.[10]

Evidenţierea citochimică are ca principiul general, tratarea secţiunilor de celule cu un reactiv,

respectiv colorant citochimic, care reacţionează cu o anumită substanţă, denumită substrat, de la
nivel celular, în urma căruia rezultă un produs de reacţie colorat şi vizibil la microscopul optic.[10]

Trebuie precizat faptul că o reacţie citochimică negativă nu înseamnă obligatoriu că substanţa

cercetată nu există în celulele respective. În această situaţie substanţa poate exista dar produsul
colorat format este în cantitate foarte mică sau acest produs, odată format, nu aderă de structurile
respective, prin lipsa de afinitate a acestora faţă de grupul cromofor al colorantului sau faţă de
reactiv.[10]

66
Condiţiile minime pentru evidenţierea citochimică a unei substanţe la nivel celular şi subcelular,
implică mai multe subcategorii şi anume:[10]

-condiţii ce privesc substratul cercetat: conservarea in situ şi imobilizarea substanţei chimice

cercetate prin procedee de fixare fizice sau chimice, cum sunt congelarea, criodesicarea şi respectiv
folosirea amestecurilor fixatoare

-condiţii referitoare la reactivul sau colorantul citochimic, respectiv reactiv cât mai specific, ales
astfel încât să nu reacţioneze cu alte substanţe în afara celor avizate şi să fie cât mai sensibil, adică
să permită detectarea cantităţilor cât mai mici din substanţa cercetată

-condiţii referitoare la produsul final de reacţie, să fie colorat, să fie în cantitate suficientă şi să fie
insolubil, pentru a nu difuza, dând false reacţii pozitive sau negative

Cel mai folosit în citochimia proteinelor, lipidelor şi glucidelor este reactivul Schiff, care reprezintă
o fuxină bazică decolorată în acid sulfuros, prin mecanism de condensare a moleculelor de reactiv
cu grupări funcţionale de tip aldehidic, rezultând un produs final colorat în roşu-violaceu.[10]

Citochimia proteinelor se face prin demonstrarea proteinelor, urmărindu-se determinarea punctului

izoelectric al proteinei, respectiv extincţia cu albastru de metilen.

Citochimia lipidelor se face prin demonstrarea acestora prin sudanofilie cu coloranţi Sudan şi
reacţia plasmală.

Citochimia glucidelor se face prin demonstrarea acestora prin: bazofilie cu albastru Alcian;
metacromazie cu albastru de toluidină şi reacţia PAS, respectiv periodic acid Schiff.

Imunocitochimia este o tehnică mult mai modernă, care se bazează pe reaţie antigen-anticorp.

În mod practic, dacă se in jectează unui animal de experienţă o substană străină, sistemul imun al
acestuia produce anticorpi, ca răspuns la substanţa injectată, numită antigen, datorită capacităţii
sale de a stimula formarea anticorpilor.[13]

Pentru a descrie un tip de procedeu, se descrie izolarea proteinei de investigat, de exemplu actina,
dintr-o sursă cum ar fi muşchiul striat de şoarece şi se injectează unui animal de altă specie. Actina,
antigen, stimulează formarea de anticorpi anti-actină, care circulă prin sângele animalului.
Anticorpii sunt izolaţi, legaţi de o substanţă fluorescentă şi folosiţi pentru explorarea celulelor sau a

67
ţesuturilor în care se presupune prezenţa actinei, ca de exemplu fibroblastul-celulă conjunctivă.
Dacă actina este prezentă, anticorpii se leagă de ea, reacţia devenind vizibilă datorită substanţei
fluorescente legată de anticorpi. Pentru evidenţierea reacţiei, se foloseşte microscopul cu
fluorescenţă. Anticorpii se pot conjuga şi cu alte substanţe, ca feritina, aceasta fiind o moleculă ce
conţine fier. Acest fapt se realizează cu scopul localizării reacţiei antigen-anticorp prin studii de
microscopie electronică.[13]

Citoenzimologia

Ramura citochimiei care are ca scop evidenţierea localizării şi activităţii enzimelor în celulă, o
constituie citoenzimologia. Prin această tehnică, se poate obţine o imagine fidelă a metabolismului
anumitor ţesuturi sau organe, permiţând stabilirea diagnosticului diferitelor boli.

Fiind macromolecule proteice cu dimensiuni sub limita de rezoluţie a microscopului optic,

emzimele ca atare, nu pot fi vizualizate direct. La nivelul unei celule, vizualizarea şi localizarea
acestora, se face pe baza unor reacţii chimice, ce au ca produs final un precipitat colorat şi
insolubil. Dacă produsul final de reacţie este solubil, se poate realiza insolubilizarea lui, printr-o
reacţie numită de captură.[10]

Viteza unei anumite reacţii enzimatice, poate fi influenţată de: concentraţia substratului;
concentraţia enzimei; pH-ul optim, de acţiune al enzimei; temperatura de lucru care în mod
obişnuit trebuie să fie 37˚C; timpul de incubaţie ce s-a constatat a fi cuprins între 20-30minute,
influenţa activatorilor şi a inhibitorilor.[10]

Etapele de obţinere a unui preparat citoenzimologic urmăreşte succesiunea: recoltarea

fragmentelor de ţesut sau organ; fixarea cu scopul conservării activităţii enzimatice şi a imobilizării
în proporţie mare a enzimei; secţionarea la microtom de congelare; incubarea, cea mai importantă
etapă a tehnicii, care face posibilă vizualizarea produşilor de reacţie rezultaţi în urma activităţii

68
catalitice a enzimelor de cercetat; montarea secţiunilor, folosind medii hidrosolubile iar produşii de
reacţie fiind în majoritate solubili în alcool şi benzen, utilizând în acest scop glicerina şi siropul
Apathy.[10]

Autoradiografia

Reprezintă o metodă care foloseşte o emulsie fotografică întinsă peste o secţiune de ţesut, pentru a
localiza materialului radioactiv tisular.[13]

Realizarea practică constă în injectarea unor molecule precursoare, de care celulele au nevoie în
sinteza moleculelor mari, cum sunt ADN-ul sau colagenul. Pentru sinteza ADN-ului, celulele
folosesc, de exemplu, timidina tritiată.[13]

Pentru exemplificare, timidina tritiată, radioactivă, este injectată unui animal de experienţă.
Celulele care sintetizează ADN-ul, utilizează timidina tritiată, devenind radioactive. Ţesutul este
prelucrat în mod obişnuit, până la operaţiunea de întindere a secţiunii pe emulsia fotografică.
Aceasta este ţinută un timp, pentru ca radiaţia izotopului folosit, timidina tritiată şi mai concret
particule beta de joasă energie emise de aceasta, să impresioneze emulsia fotografică. Ulterior,
emulsia fotografică este developată şi granule negre de argint, indică localizarea componentului
tisular radioactiv. Ţesutul poate fi colorat, dacă nu a fost deja, deshidratat în alcooluri, acoperit cu
lamele şi examinat la microscopul optic.Autoradiografia se poate realiza, folosind secţiuni subţiri
de masă plastică, pentru examinarea la microscopul electronic de transmisie.[13]

Historadiografia

Historadiografia reprezintă o microradiografie cu raze X, a unui preparat întins pe lamă. Această

metodă evidenţiază diferenţele de densitate, ca şi o radografie obişnuită.

Deşi razele X pot fi folosite pentru examinarea părţilor moi, metoda se utilizează frecvent la
examinarea secţiunilor de os şlefuite sau a altor ţesuturi mineralizate.

Uzual, secţiunea şlefuită de os este pusă în contact cu o emulsie fotografică iar apoi este developată
şi privită la microscop. „Un standard de masă cunoscută, poate fi adăugat pe aceeaşi lamă sau pe o

69
lamă martor, tratată în acelaşi mod, pentru a oferi informaţii semicantitative despre cantitatea de
mineral din os, în diferite regiuni ale secţiunii şlefuite”.[13]

10. TEHNICI DE INGINERIE GENETICĂ FOLOSITE ÎN DIAGNOSTICUL

MOLECULAR

Enzimele de restricţie

Acestea sunt endonucleaze bacteriene, care scindează moleculele de ADN, la nivelul unor zone
strict specifice, generând fragmente de lungimi variabile, numite fragmente de restricţie(FR)
Enzimelor de restricţie(ER) au drept caracteristică esenţială specificitatea acţiunii lor. Acest fapt
poate explica că o ER îşi exercită activitatea endonucleazică doar în prezenţa unei anumite
secvenţe nucleotidice, cu lungime între 4-8 perechi de baze, denumită situs de recunoaştere sau de
restricţie(SR). Se poate preciza că pentru fiecare ER există în genom numeroase SR. S-a
demonstrat că distanţa care separă situsurile este diferită, asfel încât în urma acţiunii unei anumite
ER vor rezulta o multitudine de FR, de lungimi variate.[20]

70
Studiile au arătat că secţiunile efectuate de cele mai multe ER nu sunt situate la acelaşi nivel pe cele
două catene ale moleculei de ADN. Prin urmare, pe o porţiune de câteva nucleotide, capetele
fragmentelor vor fi monocatenare, şi anume la unul din capete, vor fi desperecheate nucleotidele unei
catene iar la celălalt capăt, nucleotidele catenei opuse. Acest mod de acţiune este important în practică,
pentru că fragmentele ADN generate de aceeaşi ER, având capete coezive, pot fi făcute să se sudeze
între ele, chiar dacă provin din surse complet diferite. La final rezultă ADN recombinant. [20]

Reacţia polimerizării în lanţ

“Numită şi polymerase chain reaction(PCR), reacţia polimerizării în lanţ este o metodă cu un

pricipiu ce se bazează pe procesul replicării semiconservative şi care permite realizarea amplificării
selective şi rapide a ADN sau ARN.
Este o tehnică foarte simplă, economică şi total automatizată.
Eşantionul ADN, în cantitate care poate fi de ordinul a câtorva nanograme, este introdus într-un tub
ce conţine ca reactivi o ADN-polimerază termostabilă(Taq, extrasă din bacteria termofilă Thermus
aquaticus), cele patru dezoxiribonucleotide trifosfat şi două oligonucleotide sintetice numite
amorse sau primeri.[20] Punctele la nivelul cărora se iniţiază activitatea ADN-polimerazei sunt
reprezentate de amorse, a căror secvenţă nucleotidică trebuie să fie complementară cu secvenţele
ADN ce flanchează capetele segmentului care va fi amplificat. „Proba este denaturată termic,
amorsele hibridizează cu secvenţele complementare şi, pornind de la amorse, ADN-polimeraza
începe să adauge dezoxiribonucleotide în sensul 5’-3’, pe matriţele reprezentate de monocatenele
segmentului ţintă. Răcirea, în prezenţa excesului de amorse, duce la hibridizarea acestora cu
secvenţele nou sintetizate iar reîncălzirea mediului, deremină iniţierea unei noi reacţii de
polimerizare. Procesul se desfăşoară ciclic, astfel că la sfârşitul a ”n” cicluri, în mediulde reacţie
vor exista 2n molecule ADN dublu catenar, copii ale secţiuniiADN aflată între amorse”.[20]
Se impune, pentru înţelegerea caracterului selectiv al amplificării, precizarea că în moleculele
duplexurilor ADN, cele două catene complementare sunt orientate antiparalel, 5’-3’ şi respectiv
3’ – 5’. Polimeraza Taq se ataşează la capetele 3’ ale amorselor şi operează, adăugând nucleotide
numai în sensul 5’-3’. Astfel vor fi copiate exclusiv secvenţele cuprinse între cele două amorse.
După mai multe cicluri de amplificare, aceste secvenţe vor depăşi cu mult numărul celorlalte
secvenţe din eşantionul iniţial.
Cantitatea optimă este obţinută după mai puţin de 30 cicluri de reacţie, când în tub vor exista câte 109
copii ale ţintei pentru fiecare din secvenţele rămase neamplificate.

71
Dacă durata unui ciclu este de 5 minute, rezultă că această cantitate va fi obţinută în circa 3 ore.
„Metoda acceptă ADN ce provine din surse variate, cum ar fi de exemplu celule obţinute prin lavaj
sau aspiraţie, cele din frotiuri, pete de sânge, foliculi piloşi, spermă”.[20]
PCR este o metodă preparativă nu numai pentru analiza secvenţei nucleotidice ci şi pentru toate
celelalte proceduri utilizate în analiza ADN, datorită purităţii şi cantităţii materialului pe care îl
produce (Fig. 22)

Fig. 22 Reacţia de polimerizare în lanţ a unei secvenţe specifice ADN (după D. Ştefănescu, 1998)

72
Tehnicile Southern Blotting, Northern Blotting, Western Blotting

Metoda marcării radioactive a ADN, numită Southern blotting(blotting=pătare, amprentare)

permite analiza structurii şi conţinutului genic al fragmentelor rezultate prin digestia cu enzime de
restricţie.

Tehnica conduce la denaturarea chimică a fragmentelor ADN incluse în gel, după care
monocatenele sunt transferate prin capilaritate pe o membrană de naylon sau de nitroceluloză. Se
obţine o replică a modelului de benzi din gelul de agaroză. Moleculele ADN de pe membrană sunt
expuse unor probe ADN sau ARN, marcate radioactiv, complementare cu secvenţa urmărită.
Probele vor forma complexe dublu catenare stabile în zonele membranei în care se află secvenţele
omoloage.

Sediul hibridizării este detectat autoradiografic.

Importanţa medicală a tehnicii constă în capacitatea ei de a detecta polimorfismele lungimii

fragmentelor de restricţie şi, prin aceasta, de a funcţiona ca metodă de diagnostic ADN
indirect.(Fig. 23)

Procedura se poate aplica în aceeaşi manieră pentru ARN, purtând numele de Norhern Blotting iar
pentru proteine, Western Blotting.” [20]

73
 Fig. 23 Etapele tehnicii de marcare radioactivă -Southern blotting (după D. Ştefănescu, 1998)

Hibridizarea in situ

Această tehnică permite ca, după hibridizare cu secvenţe specifice din moleculele ADN sau ARN,
probele marcate izotopic sau chimic să poată fi vizualizate direct pe preparatele celulare sau
cromozomiale.

Tehnicile care folosesc probe marcate radioactiv tind să fie abandonate, datorită rezoluţiei insuficiente
şi perioadei lungi de timp necesară obţinerii rezultatelor.Locul acestora este luat de tehnica numită
fluorescence in situ hibridization (FISH), care este relativ simplă şi nu foarte costisitoare.[20]

74
11. MORFOMETRIE CELULARĂ ŞI SUBCELULARĂ

Morfometria implică descrierea prin date cantitative, a unor structuri.

Prin numeroase procedee de măsurare dimensională, ce includ şi determinări stereologice, se pot

obţine datele morfometrice.

Analiza geometrică a structurilor, respectiv obţinerea informaţiilor tridimensionale dintr-o imagine

virtual bidimensională, este realizată prin stereologie.

Morfometria este un termen cu utilizare frecventă în biologia celulară, prin care se subânţelege de
fapt stereologia şi nu simple măsurători dimensionale.[10]

Informaţii cantitative privind structura şi ultrastructura diferitelor tipuri de celule, ţesuturi şi

organe, se pot obţine cu ajutorul morfometriei celulare şi subcelulare. În acest mod se realizează o
corelaţie cantitativă a datelor morfologice cu date de biochimie şi biofizică.

Stereologia foloseşte un sistem de notaţii privind: [10]

- dimensiuni individuale: volumul structurii x; suprafaţa structurii x; aria structurii x pe

transsecţiune

- dimensiuni colective ale unui grup de structuri: volumul colectiv al structurilor x; suprafaţa
colectivă a structurilor x; aria colectivă a transsecţiunilor prin x; numărul colectiv al punctelor
test situate pe transsecţiunile prin x

- dimensiuni relative: fracţiunea de volum ocupată de x.

75
„Analiza stereologică celulară şi subcelulară se bazează pe faptul că structurile care se studiază pe
secţiuni sunt: prezentate într-un număr adecvat; identificabile neechivoc; relativ similare ca
dimensiuni şi formă”.[10]

Pentru o estimare stereologică ideală, secţiunile trebuie să fie alese la întâmplare şi de grosime
neglijabilă în raport cu structurile de studiat.

În practică, grosimea secţiunilor este deseori mai mare decât ar fi cerută în determinări ideale şi va
influenţa acurateţea rezultatelor, conform efectului Holmes.[10]

Pentru determinări morfometrice se utilizează grile universale Weibel de diverse modele, de

exemplu 42, pentru determinarea volumului relativ(Vv) extracelular, intracelular, nuclear şi
citoplasmic în miocard şi ficat şi model 42 sau 100, pentru determinarea Vv mitocondrial în
celulele musculare cardiace şi hepatocite.(Fig. 24, 25)

Practic sunt necesare imagini de microscopie electronică, alb/negru, peste care se suprapune grila
universală Weibel şi se determină: numărul de intersecţii ale liniilor din grilă cu conturul structurii
a cărei suprafaţă o determină şi numărul punctelor test care cad pe aria de secţiune a structurii a
cărui volum îl determină.[10]

76
Fig. 24 Grila Weibel universală 42 şi volumul relativ ocupat de structuri (după I. Diculescu şi col.,
1980)

Fig. 25 Grila Weibel universală 100 (după I. Diculescu şi col., 1980)

Efectul Holmes constă în faptul că structurile opace vor fi supraestimate în dauna matricei mai
puţin opace, dacă secţiunea este mai groasă de curbatura lor şi care depinde natural de raza lor de
curbură. În mod teoretic, ar fi necesare corecţii matematice ale determinărilor, dacă grosimea
secţiunilor ar fi mai mare decât diametrul de 1/10 al structurii de estimat volumetric în
secţiune.[10]

Cu toate acestea însă, în practică, corecţiile menţionate nu sunt importante iar efectul Holmes poate
fi minimalizat iar acurateţea rezultatelor acceptabilă, dacă: secţiunea este cât mai subţire posibilă şi
dacă se iau în consideraţie la numărătoare numai acele puncte care cad neechivoc pe structura de
interes perfect focalizată, ignorându-se orice alte puncte care cad la limita sau pe structurile de
interes ce nu sunt clar focalizate.[10](Fig. 26)

77
Fig. 26 Efectul Holmes (după I. Diculescu şi col., 1980)

78
12. FORME CELULARE

Odată cu perfecţionarea tehnicilor de microscopie, a devenit posibil studiul componentelor

celulare, atât din punct de vedere structural cât şi ultrastructural.
În concepţia actuală, celula este unitatea biologică structurală şi funcţională a materiei vii. Ea
intră în componenţa tuturor organismelor, fiind cea mai mică unitate vie capabilă să se
multiplice.[1]
Structura celulei este complexă iar componentele de bază sunt reprezentate de membrană,
citoplasmă şi nucleu.(Fig. 27)
Membrana celulară se găseşte la exteriorul citoplasmei şi are rolul de a proteja şi de a media
schimburile de substanţe.
Citoplasma este substanţa fundamentală a celulei care ocupă spaţiul dintre membrana celulară şi
membrana nucleului.
Reticulul endoplasmatic este o reţea de canalicule ramificate, care face legătura dintre membrana
celulară şi membrana nucleului. El are aspect neted sau rugos.
Mitocondriile sunt aşezate, de regulă, în jurul nucleului, fiind mai numeroase în celule cu activitate
intensă. Ele au rol în respiraţia celulară.
Aparatul Golgi este aşezat tot în apropierea nucleului şi i se atribuie un rol secretor. Selectează
unele proteine sintetizate la nivelul R.E. şi este implicat şi în formarea membranei celulare.
Ribozomii sunt sferici, liberi sau ataşaţi de reticulul endoplasmatic. Conţin ARN, proteine şi au rol
în sintetizarea proteinelor.
Lizozomii sunt corpusculi foarte mici care stochează peste 40 de enzime digestive. Au rol în
digestia celulară.

79
Nucleul este unic, de obicei sferic, situat central. Este înconjurat de o membrană nucleară dublă,
străbătută de pori, prin care se face schimbul între nucleu şi citoplasmă. Nucleul este coordonatorul
întregii activităţi celulare.
Centrozomul se întâlneşte la majoritatea celulelor şi are rol în diviziunea celulară.
Incluziunile sunt produşi rezultaţi din activitatea metabolică a celulei.
Constituenţii celulari sunt în strânsă legătură unii cu alţii. Fiecare constituent are o structură
specifică şi un anumit rol în viaţa celulei.
Funcţiile celulei sunt multiple.
Totalitatea transformărilor care au loc în celulă, în urma schimbului de materie şi energie cu
mediul, constituie metabolismul celular.[1]
Excitabilitatea este răspunsul specific dat de celulă la acţiunea diferiţilor factori de mediu.
Mişcarea presupune deplasarea activă a unor constituienţi celulari precum şi curenţii citoplasmatici
care antrenează conţinutul celular.
Semipermeabilitatea este însuşirea membranei plasmatice de a fi permeabilă pentru apă şi anumite
substanţe şi impermeabilă pentru substanţe care au dimensiuni mari.
Semipermeabilitatea membranelor plasmatice este controlată de forţe pasive şi active. Astfel avem
forţele pasive, ca difuziunea, osmoza şi turgescenţa şi forţele active ca polarizarea electrică,
fagocitoza, pinocitoza.

Celulele ajunse la maturitate dau naştere la noi celule asemănătoare cu celula-mamă printr-un
proces numit diviziune.[14]
La maturitate, masa citoplasmei creşte foarte mult în raport cu cea a nucleului. Are loc mai întâi
diviziunea nucleului urmată de diviziunea citoplasmei.
Datorită diviziunii celulare, organismele cresc, se înmulţesc, formează celulele reproducătoare şi
sunt înlocuite celulele moarte sau uzate.
În diviziunea celulară rolul principal îl are nucleul. Celulele somatice iau naştere prin mitoză, iar
cele reproducătoare prin meioză.

80
Fig. 27 Componentele ultrastructurale ale celulei (după C.Cotrutz şi col., 1994)

Ţesuturile sunt formate din celule şi matrice intercelulară iar în fiecare tip de ţesut atât celulele cât
şi matricea intercelulară prezintă aspecte morfofuncţionale specifice.

Celulele reprezintă unităţi morfofuncţionale ale oricărui ţesut, matricea sau substanţa intercelulară,
fiind elaborată de fapt de către celule.

În microscopia fotonică, membranele celulelor din ţesuturi nu pot fi, de obicei, evidenţiate decât
prin metode speciale.

81
Forma, dimensiunile şi alte caracteristici morfologice generale ale celulelor, se pot examina la
microscopul optic obişnuit.

În general, în ţesuturi se întâlnesc variate forme celulare: sferică-ovul, leucocit, adipocit, condrocit;
turtită sau pavimentoasă- celulele endoteliale sau mezoteliale; cubică-celulele epiteliului tiroidian,
ale plexurilor choroide, din epiteliul canalicului biliar din spaţiul Kiernann, cilindrică- celulele
spinoase din epiteliul malpighian al epidermului, epiteliul bucal; caliciformă-celule mucoase din
epiteliul intestinal şi din epiteliul mucoasei respiratorii; piramidală- neuronii piramidali din scoarţa
cerebrală, celula secretorie din acinii seroşi; stelată-neuronul; fuziformă-celula Purkinje;
discoidală-hematia, flagelată-spermatozoidul, celula pigmentară, cu prelungiri mult ramificate ce-i
conferă un aspect neregulat.[9] (Fig. 28)

Corespunzător fiecărui tip celular, există anumite dimensiuni: 4-5 micrometri pentru celulele
granulare din cerebel, 7-8 micrometri pentru limfocite şi hematii, 30-40 micrometri pentru celulele
epiteliului tip malpighian epidermal, 80-120 micrometri pentru neuronii din coarnele anterioare ale
măduvei spinării şi 180-200 micrometri pentru ovul.[10]

Organismul deţine şi aspecte celulare deosebite, sub formă de mase citoplasmatice multinucleate
provenite fie prin contopirea mai multor celule –sinciţii, la osteoclaste, fie dintr-o singură celulă,
prin creşterea citoplasmei şi înmulţirea nucleilor – plasmodii, la fibra musculară striată. În practică,
unele dintre aceste mase citoplasmatice multinucleate, poartă numele de celule gigante şi apar în
situaţii patologice.[9]

82
Fig. 28 Forme celulare (după Cotrutz şi col., 1994)

83
 13. MEMBRANA CELULARĂ

Bazându-se pe studiile altor cercetători, Singer S.J. şi Nicolson G.L., în anul 1972, aduc argumente
în sprijinul a ceea ce se va numi modelul mozaicului fluid lipoproteic, al structurii membranei
plasmatice, definindu-l ca pe „o mare lipidică fluidă în care plutesc la întâmplare iceberguri
proteice”.[12]
Modelul mozaicului fluid, acceptat unanim pentru definirea membranei celulare, este fluid, adică
constituenţii lipidici şi protidici nu sunt ficşi deoarece interacţiunile dintre lipide sau proteine şi
lipide, nu sunt covalente, respectiv glucidele se găsesc ataşate fie proteinelor, respectiv
glicoproteine fie unor lipide, respectiv glicolipide.(Fig. 29)
Matricea membranei celulare poate fi comparată cu un film subţire de ulei mineral cu vâscozitate
redusă, lipidele din constituţia sa având ca proprietate comună structura lor amfifilă sau amfipată,
cu un cap hidrofil şi o coadă hidrofobă. Acest aranjament le obligă ca, prin autoasamblare, să se
dispună într-un strat dublu lipidic, determinând o conformaţie stabilă.(Fig. 30, 31)
Cele trei componente ale membranei celulare sunt de la exterior spre interior, glicolema,
plasmalema şi citoscheletul membranei.
Plasmalema, prima identificată la microscopul electronic, are grosime de 7,5nm şi are structură
lipoproteică, trilaminată formată dintr-o foiţă clară la flux de electroni flancată de două foiţe dense
la flux de electroni.[11]
Lipidele cel mai bine reprezentate cantitativ sunt fosfolipidele, mai abundente în componenţa
endomembranelor şi colesterolul.[10]
Conţinutul în proteine este mai mare în cazul membranelor cu o activitate metabolică complexă.
Moleculele proteice, dispersate în bistratul lipidic, singulare sau în grup, au forme diverse, unele
fiind mai mult sau mai puţin incluse în matricea lipidică, pe faţa externă sau internă iar altele, o
traversează dintr-o parte în alta.[2]
Proteinele intrinseci sau integrale, nu pot fi îndepărtate din membrană fără a se dezmembra
bistratul lipidic, fie prin modificarea pH-ului fie prin modificarea tăriei ionice a soluţiei apoase
folosite. În acest mod are loc disocierea interacţiunilor ionice ale acestor proteine cu capetele
polare ale fosfolipidelor sau cu alte proteine membranare.[10](Fig. 32)

84
Toate membranele din celulă sunt structuri asimetrice, glucidele fiind legate de proteine şi lipide
numai pe suprafaţa externă. Majoritatea proteinelor integrale sunt glicoproteine şi circa 1/10 din
moleculele lipidice ale matricei sunt glicolipide.[1]
Asimetria bistratului lipidic nu este absolută, deoarece de o parte şi de alta a membranei nu diferă
tipurile de lipide ci numai cantităţile în care se află fiecare dintre acestea.
Fluiditatea membranei permite lipidelor mişcări de translaţie, respectiv difuziune laterală, în acelaşi
monostrat lipidic şi mişcări de rotaţie, în jurul unui ax perpendicular pe planul membranei.
Acestea, într-un timp mai lung pot trece chiar dintr-un monostrat lipidic în celălalt, prin difuziune
transversală; flip-flop, echivalentul în engleză pentru “salt mortal”.[10]
Proteinele pot executa doar mişcări de translaţie şi de rotaţie. Proteinele sunt fie intrinseci fie
extrinseci. Primele se extrg greu din continuumul lipidic al plasmalemei iar celelate sunt fie pe o
faţă fie pe alta, a continuumului lipidic al plasmalemei.[12]
La suparfaţa celulei, lanţurile oligozahaidice ancorate de versantul extern al plasmalemei formează
un înveliş cu aspect pufos numit glicolemă, glicocalix sau înveliş dulce. Aceasta are grosime totală
de 50nm şi este formată din lamina externa, de 20nm, situată la exterior şi învelişul de suprafaţă,
30nm, la interiorul glicolemei. S-a demonstrat că nu se poate trasa o limită de demarcaţie distinctă,
între glicocalix şi substanţa din spaţiul extracelular, respectiv matricea extracelulară.[12]
Glicolema este formată predominant de molecule de glucide asociate cu proteine sub forma
proteoglicanilor şi a glicoproteinelor. Acidul sialic formează fragmentul terminal al lanţurilor
oligozaharidice de pe trama proteică a glicolemei, conferind încărcătură electrică negativă
suprafeţei celulare.
Proteinele sunt dispuse interconectat, pe suprafaţa internă a statului bilipidic, în majoritate având
caracter contractil. Dintre acestea se pot menţiona actina şi spectrina, constituind o zonă de
ancorare atât pentru unele proteine intrinseci cât şi pentru sistemele contractile celulare. Acestea
constituie reţele fibrilare, de ochiuri şi noduri, cu grosime între 5-9nm, funcţia lor părând a fi cea
de a stabiliza infrastructurile membranei. Acest fapt a permis denumirea de citoschelet al
membranei, care este de fapt zona periferică a citoscheletului celulei.[12]

85
86
Fig.29 Membrana celulara ( după site-ul
http://www.fairfield.k12.ct.us/tomlinson/ctomlinson03/CellProject04/Per7/7HP/cell_membrane.gif)

Fig. 30 Orientarea moleculelor bimodale în monostrat (după I. Diculescu şi col., 1983)

Fig. 31 Formarea miceliilor (după I. Diculescu şi col., 1983)

87
Fig. 32 Proteinele membranei celulare ( după site-ul
http://www.weizmann.ac.il/chemphys/gov/images/membrane.jpg)

88
 14. JONCŢIUNI INTERCELULARE

Contactul dintre celule, la nivelul ţesuturilor, se realizează prin structuri specializate denumite
joncţiuni intercelulare.

Joncţiunile celulare se pot sistematiza în joncţiuni simple şi joncţiuni speciale.

Joncţiunile simple cuprind spaţiile intercelulare, legăturile intercelulare denticulate şi legăturile

intercelulare digitiforme.[12]

Joncţiunile simple sunt alcătuite de membranele celulare, care se află la o distanţă de cel puţin
30nm, fapt ce permite ca prin spaţiile delimitate de acest tip de joncţiuni, să treacă liber toate
tipurile de molecule din mediul interstiţial.[12]

Joncţiunile speciale includ joncţiunile strânse sau de închidere, joncţiunile de aderenţă sau
desmozomii, joncţiunile comunicante sau gap, complexele joncţionale şi legăturile celulare cu
membranele bazale.[11]

Joncţiunile strânse se denumesc şi zonulae occludens, joncţiuni pentalaminate, joncţiuni

heptalaminate.(Fig. 33)

Joncţiunile strânse, separând net compartimentele tisulare cu compoziţii chimice diferite, reprezintă
dispozitive de adezivitate impermeabile pentru componenţi intercelulari.[12]

În organizarea joncţiunilor strânse, membranele adiacente se apropie complet una de cealaltă,

formând structuri pentalaminate sau heptalaminate şi astfel, obliterând spaţiul intercelular. În acest
mod, scurgerea moleculelor printre membranele din organizarea joncţiunii poate fi împiedicată.
[11]

Proteinele integrale, care traversează membranele adiacente şi se dispun în şiruri gemene, participă
la edificarea acestui tip de joncţiuni, organizând dispozitive tipice, ce se conectează la nivelul
frontului extracelular. Pe frontul plasmatic, proteinele integrale sunt ancorate prin microfilamente,

89
de citoscheletul matricei. Şirurile de proteine integrale conferă aspect de reţea ansamblului şi au un
traiect neregulat prezentând segmente de legături între ele.[12]

Acest tip de joncţiuni are două funcţii importante.Ele previn pasajul moleculelor şi ionilor prin
spaţiul dintre două celule epiteliale adiacente şi blochează deplasarea proteinelor membranare
integrale între suprafeţele apicale şi bazolaterale ale celulelor.”De asemenea sunt considerate
dispozitive de adezivitate intercelulară, flexibile şi sigure, bariere fizice şi chimice intercelulare, ce
conferă polaritate celulelor angajate în această categorie”.[11]

Fig. 33 Joncţiune strânsă (după B.Alberts, 2002)

90
Desmozomii sau joncţiunile de aderenţă, sunt dispozitive de adezivitate intercelulară foarte
puternice. Nu sunt implicate în schimburile intercelulare şi nu împiedică deplasarea moleculelor
printre spaţiile pe care le delimitează. (Fig. 34)

Sunt cunoscute şi ca zonulae adherens, maculae adherens, lamina desmosomica.

Apar sub trei tipuri, în formă de pată, în formă de bandă şi hemidesmozomi.[1]

Desmozomii în pată sau în spot, maculae adherens, sunt alcătuiţi din membrane plasmatice
adiacente aşezate paralel la 25-30nm, material intercelular dens la flux de electroni proteic,
filamentos, bisectat de o densificare centrală, bogat în glucide şi în calciu, densificări în formă de
disc pe frontul citoplasmatic, linkeri de legătură reprezentaţi din microfilamente ce se detaşează din
materialul dens intercelular care străbat membranele plasmatice, traversează , pentru a se ancora de
microfilamentele tramei matriceale şi elemente citoscheletale, precum tonofibrilele sau
microfilamentele de actină.[12]

Desmozomii în bandă, zonulae sau fascia adherens, se găsesc la nivelul segmentelor transversale
ale discurilor intercalare cardiace şi sub joncţiunile strânse de la polul apical al celulelor epiteliale.
Se deosebesc de desmozomii în pată prin faptul că spaţiul intercelular este la 15-25nm, fiind mai
sărac în material dens iar densificările de pe faţa internă a plasmalemei nu au formă de disc ci se
extind nedefinit.[12]

Rolurile joncţiunilor de aderenţă sunt multiple. Ele realizează o ataşare mecanică puternică, între
celulele adiacente. Acest fapt se poate ilustra la nivelul celulelor musculare cardiace care sunt
menţinute împreună în timpul sistolei şi diastolei dar pe de altă parte şi la nivelul celulelor
epiteliale.[11]

Se poate aminti inhibiţia de contact, care se manifestă în timpul dezvoltării culturilor celulare
primare, în care par a fi responsabile joncţiunile de adeziune.

O variantă a desmozomilor în pată ce realizează joncţiuni cu membranele bazale, este reprezentată

de hemidesmozomi. Aceştia se pot găsi la nivelul celulelor care sunt supuse unor frecări mecanice
puternice. Astfel de structuri sunt reprezentate de celulele epiteliale din cervixul uterin unde apar
împreună cu desmozomii în spot.[12]

91
Fig. 34 Schema desmozomilor (după B.Alberts, 2002)

Joncţiunile gap, nexus sau maculae communicans sunt zone specializate ale membranei
plasmatice, care conectează celule învecinate. În organizarea acestui tip de joncţiuni participă
membranele plasmatice adiacente ce se găsesc la 2-3nm distanţă. Ele constituie grupări organizate
de canale proteice, ce permit ionilor şi moleculelor mici cu greutate moleculară sub 1000 daltoni,
să treacă în mod pasiv între celule conectate.[12](Fig. 35)

Acest tip de joncţiuni sunt constituite din proteine canal, care sunt formate din conexoni. Se poate
aprecia că fiecare joncţiune gap poate să conţină chiar şi câteva sute de conexoni.[8]

Conexonii sunt alcătuiţi din 6 subunităţi proteice, conexine, în formă de bastonaşe. Subunităţile au
un diametru de 2,5nm şi lungime de 7,5nm şi sunt dispuse în inel pentru a delimita un canal
hidrofil cu diametrul reglabil cuprins între 0,4-2nm. Joncţiunile gap, nefiind deschise permanent,
oscilează între deschis şi închis.[12]

Aceste joncţiuni sunt permeabile pentru numeroase tipuri de molecule hidrofile, dintre care
amintim hormonii steroizi, vitaminele, amonoacizii, glucidele. De menţionat este faptul că
joncţiunile gap nu sunt permeabile pentru proteine, ADN şi ARN.[4]

92
 Fig. 35 Joncţiune gap (după B.Alberts, 2002)

S-a dovedit existenţa complexelor joncţionale, care sunt reprezentate prin elemente joncţionale
întâlnite la nivelul celulelor epiteliale secretorii sau a celulelor din epiteliile intestinal şi renal, fiind
solidare la acest nivel, la polul apical.[2]

„Complexele joncţionale cuprind joncţiuni strânse spre frontul luminal şi elemente desmozomale
spre extremitatea bazală. Deseori sunt plasate în poziţii intermediare, joncţiuni gap, zonula
adherens”.[12]

Dispozitivele joncţionale incluse în complexele joncţionale realizează toate tipurile de legături

intercelulare, necesare îndeplinirii funcţiilor caracteristice elementelor tisulare respective.[3]

93
 15. ORGANITE GENERATOARE DE ENERGIE

Mitocondriile sunt organite prezente în toate tipurile de celule, cu excepţia hematiei adulte.
„Se evidenţiază în celula proaspătă, nefixată şi necolorată, cu verde Janus B iar în celula fixată, cu
hematoxilină ferică Regaud”.[12] (Fig. 36)
Numărul mitocondriilor este în concordanţă cu gradul de activitate al celulelor, fiind diferit de la o
celulă la alta.
Poziţia acestor organite în celulă este diferită. La celulele cu poli activi, se concentrează în jurul
acestora. Astfel la nefrocite, se găsesc la polul bazal celular iar la enterocite, la polul apical sau
luminal.[12]
Poziţia mitocondriilor în celule se poate modifica în funcţie de intensitatea activităţii celulare.
Dimensiunile acestor organite celulare sunt variabile, ajungând până la 7 micrometri iar grosimea
de aproximativ 0,5 micrometri. Se apreciază că mărimea mitocondriilor este proporţională cu
activitate celulară.
La microscopul optic, mitocondriile apar ca granule izolate în citosol, granule înşirate sau
filamente.
La microscopul electronic, mitocondriile prezintă membrana externă, membrana internă cu criste
mitocondriale, spaţiul mitocondrial extern,situat între cele două membrane şi spaţiul mitocondrial
intern sau matrice mitocondrială.[11](Fig. 37)

Membrana externă mitocondrială are grosime de aproximativ 6nm, având organizare în mozaic şi
compoziţie lipoproteică.
Proteinele reprezintă aproximativ 60%, respectiv 4% din totalul proteinelor mitocondriale.
Lipidele sunt în procent de 40%, cu cantitate mai mare de colesterol şi mai puţină cardiolipină,
fosfolipidele fiind în proporţie mai mare la acest nivel, comparativ cu procentul acestora în
membrana mitocondrială internă.
Această compoziţie, determină permeabilitatea membranei mitocondriale externe, prin care se fac
schimburile între citosol şi organit.
Activitatea enzimatică la nivelul membranei mitocondriale externe este intensă.[12]

Membrana internă mitocondrială, are grosime de aproximativ 6nm şi structură lipoproteică.

94
Proteinele sunt în procent de aproximativ 80%, respectiv 1/5 din totalul proteinelor mitocondriale.
Lipidele, 20%, cu colesterol puţin şi cardiolipină multă, comparativ cu membrana externă.[11]
Compoziţia chimică a mitocondriilor, determină o permeabilitate scăzută la acest nivel, comparativ
cu membrana mitocondrială externă, constituind o barieră între matricea mitocondrială şi restul
organitului.
Totodată, la acest nivel, prin trecere în soluţie hipotonă şi colorare cu fosfotungstat, se evidenţiază
subunităţi de membrane, denumite particule elementare, F1, cu bază, gât şi cap.
Fiecare particulă F1, conţine lanţul enzimatic respirator, din enzimele căruia, citocromoxidaza,
fiind considerată enzimă marker a membranei interne mitocondriale.[12]
Membrana mitocondrială internă este permeabilă pentru unii ioni, spre spaţiul intern, ca de
exemplu Ca2+, Mg2+ necesari desfăşurării activităţii enzimelor din matricea mitocondrială.
Pe de altă parte, este permeabilă pentru ATP, ADP, necesari desfăşurării fosforilării active.[12]
Cristele mitocondriale sunt structuri ce aparţin membranei interne mitocondriale.
Numărul lor creşte cu activitatea enzimatică a celulei, cu starea fiziologică a celulei, cu condiţiile
metabolice ale celulei.
După formă se clasifică în lamelate, tubulare, veziculoase.[11]
Ca poziţie, sunt paralele sau perpendiculare cu axul mare al mitocondriei.
Spaţiul mitocondrial extern are grosime de aproximativ 7-8nm şi aspect în general omogen.
S-a demonstrat că la acest nivel au loc schimburi permanente între mitocondrie şi citosol, care se
realizează prin membrana mitocondrială externă.[17]
Patologic, aici se depun materiale anorganice, ca de exemplu sărurile de calciu.
Această structură conţine adenilatkinaza, enzimă cu rol în menţinerea echilibrului ATP/ADP/AMP.
Pe lângă acestea se mai pot menţiona nuclezid mono- şi difosfokinaza şi sulfitoxidaza.[16]
Spaţiul intern sau matricea mitocondrială este relativ omogen, fiind format din proteine structurale,
contractile şi protein-enzime.
Enzime importante întâlnite la acest nivel sunt cele oxidoreductorii ale ciclului Krebs, ca
malatdehidrogenaza, izocitratdehidrogenaza sau fumaraza, aconitaza, citratsintetaza.
Se pot menţiona, de asemenea, alte enzime oxidoreductorii implicate în metabolismul
aminoacizilor; enzimele oxidării acizilor graşi; enzime implicate în fosforilare.[5]
Studiile de microscopie electronică au demonstrat existenţa la nivelul matricei mitocondriale, a
unor granule osmiofile, de 30-40nm, ce diferă ca formă, diametru şi conformaţie. Acestea apar în
condiţii fiziologice şi au funcţie insuficent cunoscută, fapt pentru care se presupune că participă la

95
mişcările ionilor bivalenţi, ca de exemplu transportul calciului. Acest tip de transport poate fi rapid
în unele mitocondrii, sau lent, în altele, participând la reglarea statusului energetic celular.[12]
Totodată, la acest nivel, se evidenţiază acizii nucleici mitocondriali care se prezintă ca ARN-mit
reprezentat prin ARN ribozomal, ARN mesager, ARN de transfer şi ADN-mit, cu moleculă
bicatenară, helicoidală şi circulară comparabilă cu ADN din nucleu, care este bicatenară,
helicoidală, dar liniară.[11]
„ADN mitocondrial se aseamănă cu cel al procariotelor”.[12]
Compoziţia chimică a mitocondriei este de 65-70% proteine, respectiv 30% structurale şi 70%
protein-enzime, 25%-28% lipide şi anume fosfolipide, ca de exemplu lecitine; trigliceride,
cardiolipină; ADN în cantitate mică, ARN 0,5% şi glucide.[12]
Rolul central al acestor organite în metabolismul energetic, explică funcţiile mitocondriei. Energia
se realizează prin acţiunea enzimelor oxidoreductorii din mitocondrie dar şi prin procesul de
fosforilare oxidativă de la nivelul organitului.[11]
În desfăşurarea reacţiilor enzimatice oxidative şi ale cuplării oxidării cu fosforilarea, mitocondria
suferă modificări structurale incluse în ciclul de umflare-contracţie efectuat pe seama membranei
mitocondriale interne.[12]
Mitocondria se transformă în stare condensată sau în stare de contracţie, în mod reversibil, prin
proteinele contractile conţinute.[11]
Raportul ATP/ADP influenţează starea de balonizare sau de umflare a mitocondriilor de la
suprafaţa externă a acestora.Balonizarea poate fi datorată acumulării peste normal a unor ioni în
organism dar poate fi prevenită de ionii de Mg2+, Mn.[12]

96
Fig. 36 Schema mitocondriei (după site-ul
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/mitochondria.jpg)

Fig. 37. Ultrastructura mitocondriei (după Alberts şi col., 1994)

97
Cloroplastele

Aceste organite sunt asemănătoare mitocondriilor şi se găsesc în număr variabil în citosolul

celulelor vegetale. Cloroplastele sunt implicate în procesul de fotosinteză, care este caracteristic
acestui tip de organite.[11](Fig. 38)

Aceste organite au o lungime variabilă, cuprinsă între 2-10 micrometri şi sunt delimitate de două
membrane, externă şi internă, între care se găseşte un spaţiu de dimensiuni variabile, cuprins între
5-8nm.

În matrice, respectiv spaţiul intern delimitat de membrana internă, se găsesc formaţiuni delimitate
de citomembrane cu aspect de saci, fiecare denumit tilakoid.[12]

Aceşti saci turtiţi sunt în număr variabil de la o celulă la alta şi conţin în membranele lor pigmentul
verde, clorofila. Ei sunt aşezaţi în grămezi.

Fiecare grămadă sau stivă de saci turtiţi, se numeşte granum iar totalitatea lor grana.

Între diferitele stive de lamele apar canalele de legătură, constituind sistemul intergrana.[12]

Membranele interne ale cloroplastelor precum şi cele ale tilakoizilor sunt formate din particule
granulare cu diametru de 10-20nm şi par a fi corespunzătoare particulelor F1 mitocondriale interne,
cu rol în fosforilare.

98
Din punct de vedere chimic, cloroplastele conţin în procent mare proteine, apoi lipide, clorofilă şi
alţi pigmenţi.

Fig. 38 Cloroplastul (după B. Alberts şi col., 2002)

16. ORGANITELE SINTEZEI ŞI SECREŢIEI CELULARE

Ribozomii

Aceste organite membranare, au dimensiuni submicroscopice şi sunt formate din

ribonucleoproteine;ARNr, cu rol în procesele de proteogeneză. Datorită dimensiunilor mici, sub
limita puterii de rezoluţie, nu se observă la microscopul optic ci doar prin microscopie electronică.
(fig. 41) Se găsesc în citoplasma tuturor celulelor, liberi, izolaţi sau grupaţi ca poliribozomi sau

99
 ataşaţi, fie membranelor reticulului endoplasmic, fie de faţa citoplasmatică a învelişului
nuclear.[11](Fig. 39, 40)

În celule cum ar fi cele foliculare din ovar, unde au loc procese de proteogeneză intensă, formează
zone intens bazofile în citoplasmă. Prin tehnica ce utilizează metoda verde metil pironină, Brachet,
se colorează în roşu, reacţie ce indică prezenţa ARN-ului.[12]

Ultrastructural, apar sub forma unor granule ovalare sau elipsoidale şi anume subunitatea mare cu
diametrul de 20-30nm, de formă sferică şi 60S(Svedberg), iar subunitatea mică, de aproximativ
10-20nm, alungită, cu un coeficient sau constantă de sedimentare de 40S(Svedberg), formată din
două părţi inegale.[11]

„Cele 2 subunităţi se separă, ducând la disocierea granulei ribozomale, atunci când în citoplasmă se
modifică concentraţia unor ioni, în special scăderea Mg2+ sub10-3

Creşterea Mg2+ în citoplasmă determină agregarea ribozomilor în polimeri, fără funcţie specială în
celulă. Revenirea la valori normale a concentraţiei Mg2+ în citoplasmă duce la desfacerea
polimerilor şi individualizarea ribozomilor”.[12]

În momentul sintezei de proteine, se realizează o grupare ribozomală funcţională sub formă de

poliribozomi sau polizomi. Aceştia formează lanţuri sinuoase în care ribozomii sunt uniţi printr- o
moleculă de ARNm, de forma unui filament gros de 2nm.[11]

Din punct de vedere chimic, ribozomii conţin ARN şi proteine în părţi aproximativ egale, apă în
cantităţi mici şi ioni metalici, ca Mg2+, Ca2+.[12]

Prin faptul că aceştia constituie locul de sinteză a proteinelor, ribozomii deţin o funcţie majoră.

Proteinele de structură, se sintetizează la nivelul poliribozomilor neataşaţi membranelor reticulului

endoplasmic şi se consumă în diviziune şi creştere. Totodată se sintetizează proteinele de înlocuire
ale organitelor uzate din celulă. La nivelul ribozomilor ataşaţi membranelor reticului endolasmic,
se sintetizează proteine de export, enzime, hormoni.[12]

100
Fig. 39 Schema subunităţilor ribozomale (după B. Alberts şi col., 2002)

Fig. 40 Asamblarea subunităţilor ribozomale (după B. Alberts şi col., 2002)

101
Fig. 41 Ribozomi, aspect ultrastructural (după B. Alberts şi col., 2002)

Reticulul endoplasmic

Este organit membranar comun tuturor celulelor, cu excepţia hematiei adulte. Denumirea provine
datorită faptului că iniţial a fost mai bine observat în partea internă a citoplasmei.(Fig. 42)

Este mai dezvoltat în partea mijlocie şi internă a citoplasmei, endoplasmă şi mai puţin în cea
externă, ectoplasmă.De asemenea este bine reprezentat în celule angajate în sinteza de proteine, de
glucide, de lipide, celule secretorii exocrine şi endocrine.

Se regăseşte sub forma reticului endoplasmic rugos şi a reticulului endoplasmic neted.

Reticulul endoplasmic rugos, RER sau granular REG, se poate observa la microscopul optic ca
ansamblu al structurilor canaliculare şi veziculare membranare, cu diametrul de 20nm, pe suprafaţă
având ataşaţi ribozomi, prin subunitatea mare, izolaţi sau în grupări active. La nivelul REG se
sintetizează proteinele de export.

În microscopia optică, reticulul endoplasmic rugos este vizibil datorită prezenţei ribozomilor. [12]

Se poate evidenţia prin coloraţiile Hemalaun picro-indigo-carmin în brun; Ramon-Cajal, în nuanţă

de roşu; metoda Mann-Doninici, în albastru deschis.[4]

REG apare sub forma corpilor Berg, în celulele glandulare, hepatocite şi corpii lui Nissl, ca
ergastoplasmă, în neuroni.[11]

102
La microscopul electronic de transmisie, TEM, se observă ca saci aplatizaţi sau vezicule cu
membrane trilaminate groase de 5-6nm, ce delimitează un lumen de 5-60nm.

În funcţie de starea funcţională surprinsă, conţinutul lumenului poate fi omogen şi puţin dens la
flux de electroni sau heterogen, cu aspect granular. (Fig. 43)

Pe unele preparate se observă continuitatea membranelor REG cu membrana externă a învelişului

nuclear şi a lumenului cu cisterna perinucleară.

Reticulul endoplasmic neted sau agranular, nu este vizibil la microscopul optic.

La microscopul electronic, membranele REN au aceeaşi structură ca şi a membranelor REG dar din
loc în loc prezintă fenestrări asemănătoare porilor nucleari, pe care nu se ataşează ribozomi.(Fig.
44)

REN este bine reprezentat în celulele care sintetizeată hormoni steroizi, ca suprarenala sau cu o
mare cantitate de glicogen, ca în miocite, hepatocite dar şi în melanocite.

În celula musculară striată este cunoscut ca reticul sarcoplasmic, cu rol de rezervor de Ca2+ şi ATP,
participând la procesul de cuplare a excitaţiei cu contracţia.

Enzima marker a acestui organit este glucozo-6-fosfataza, care catalizează degradarea glicogenului
din REN.[12]

Reticulul endoplasmic deţine funcţii comune:[11]

- formează un sistem microcirculator intracitoplasmatic.

- este suport intracitoplasmatic pentru celelate organite şi pentru menţinerea formei celulei, prin
acestea având rol mecanic.

- permite schimburi active pe largi porţiuni ale citomembranelor sale, între conţinutul formaţiunilor
componente în citosol.

Există şi funcţii diferenţiate pentru cele două tipuri de reticul endoplasmic.[11]

RER:

103
 – este organit la nivelul căruia se sintetizează proteinele de export.

– are rol în sinteza unor fosfolipide ca de exemplu lecitina, sau a unor glicoproteine integrale din
membrană.

REN:

Are multiple roluri:

- în sinteza hormonilor steroizi; a unor lipoproteine

- în metabolismul glucidelor, lipidelor

- rol în detoxifiere

- rol în cuplarea excitaţiei cu contracţia, în celule musculare

- rol în fotosinteză, în celulele pigmentare din retină

Fig. 42 Schema reticului endoplasmic (după B. Alberts şi col., 2002)

104
Fig. 43 Reticul endoplasmic rugos, aspect ultrastructural (după B. Alberts şi col., 2002)

Fig. 44 Reticulul endoplasmic neted, aspect ultrastructural (după B. Alberts şi col., 2002)

105
Complexul Golgi

Este un sistem intracitoplasmatic de cavităţi limitate de citomembrane, cu suprafaţa netedă.

Se găseşte atât la organismele superioare cât şi în ţesuturile vegetale, cu excepţia, hematiei adulte.

În celulă este situat perinuclear; în neuroni, supranuclear; în celule secretorii exocrine, între nucleu
şi polul lor apical; între cei doi poli ai celulelor, în anumite celule specializate, cum ar fi
ameloblastele.[12]

Se observă sub forma unei reţele formată din canalicule anastomozate, vacuole de diferite mărimi,
bastonaşe sau dictiozomi, prin studii de microscopie optică.[11]

Pe preparate permanente ce conţin celule specializate în sinteză şi secreţie, ca celulele glandulare,

obţinute după prelucrare cu tetraoxid de osmiu sau nitrat de argint prin metodele Da Fano, Elftman,
Bowen, apare colorat în negru , sub forma unei reţele de filamente neregulate situate în imediata
vecinătate a nucleului.[12]

Microscopia electronică permite observarea acestui organit sub forma unor pachete de saci turtiţi
sau cisterne aşezate în stivă, microvezicule şi macrovezicule. Formaţiunile complexului Golgi,
respectiv aparatului Golgi sunt delimitate de citomembrane cu grosime de aproximativ 6-8nm, de
aspect neted.

Sacii turtiţi, dilataţi la extremităţi, se asociază câte 4-8, fiind separaţi prin spaţii de 20nm, având o
dispoziţie paralelă. Fiecare ansamblu de saci golgieni, este o structură polarizată ce prezintă 2 feţe:

faţa proximală, sau formatoare, convexă,imatură, cis, orientată spre nucleu şi reticulul endoplasmic
şi faţa distală, sau de maturare, concavă, trans, orientată spre zona de plasmalemă, prin care se vor
evacua produşii de secreţie celulară.

Microveziculele, cu diametrul de aproximativ 20-60nm, au conţinut heterogen şi sunt situate în

vecinătatea feţei formatoare.[11]

106
Macroveziculele au diametrul între 60-200nm, conţinut amorf sau granular, venind în raport cu faţa
de maturare a sacilor golgieni.[11](Fig. 45)

Din punct de vedere chimic, conţin proteine de structură şi protein-enzime 60% şi lipide 40%.

Enzima marker principală este TPP, respectiv tiaminpirofosfataza, care este localizată mai ales în
interiorul sacilor golgieni a feţei trans. Pe lângă aceasta, mai cunoscute sunt şi NDP, respectiv
nucleoziddifosfataza, localizată în interiorul sacilor intermediari golgieni şi
glicoziltransferazele.[12]

Funcţiile complexului Golgi constau în:[12]

- secreţie intracelulară

- formarea de endomembrane

- sinteza complexelor de hidraţi de carbon

- formarea proteoglicanilor sulfataţi, condroitinsulfaţii şi a glicoproteinelor sulfatate, mucina

- maturarea lipoproteinelor şi a albuminelor

- implicare în formarea lizozomilor primari şi a acrozomului

107
Fig. 45 Complexul Golgi, schemă şi aspect ultrastructural (după B. Alberts şi col., 2002)

17. ORGANITELE DIGESTIEI CELULARE

Lizozomii

Sunt organite sferice sau ovoidale, prezenţi în citoplasma celulelor animale cu excepţia hematiilor
adulte şi au fost descoperiţi de Christian De Duve în1955, prin tehnici de fracţionare celulară, fiind
descrişi ca organizare ultrastructurală de Alex Novikoff, în 1956.

Ultrastructural, prezintă o membrană delimitantă, membrana lizozomală, lipoproteică, mozaicată,

cu grosime de aproximativ 7-8nm, asemănătoare plasmalemei, privind conţinutul în lipide şi
colesterol şi matricea lizozomală, care este omogenă, fin granulară sau heterogenă, fapt ce

108
determină un polimorfism lizozomal în fiecare celulă.Diametrul lizozomilor este cuprins între 0,25-
0,8 micrometri.

Se cunosc două tipuri de lizozomi.

Lizozomi primari, omogeni,de talie mică, tineri, cu matrice omogenă sau fin granulară, care nu au
fost încă angajaţi în activitate şi set incomplet de hidrolaze acide.

Lizozomi secundari, heterogeni, ce conţin în matrice structuri granulare şi membranoase. Sunt de

trei tipuri, incluzând heterofagozomi, autofagozomi şi corpii reziduali. Unii autori includ şi corpii
multiveziculari, granulele de lipofuscină şi granulele de hemosiderină. Sunt funcţionali, cu
activitate enzimatică, au talie mare, matrice heterogenă şi set enzimatic complet.[12] (Fig. 46)

Din punct de vedere chimic, lizozomii sunt bogaţi în hidrolaze acide. Se cunosc aproximativ 36
activităţi enzimatice hidrolitice reprezentate prin proteaze, peptidaze, nucleaze, fosfataze, lipaze,
esteraze, glucozidaze.Unele digeră acizii nucleici, ca RN-aza şi DN-aza acidă. Altele hidrolizează
produşi organici sulfataţi şi fosfataţi, proteine şi lipide, ca fosfataza acidă, arilsufataza,
aminopeptidaza, beta-glucuronidaza, beta-galactozidaza. Enzimele sunt localizate în mare parte în
matricea lizozomală. Fosfataza acidă şi arilsulfataza sunt cunoscute ca enzime marker pentru
evidenţierea lizozomilor.[11]

Funcţiile lizozomilor sunt în concordanţă cu faptul că aceste organite celulare sunt responsabile de
digestia intracelulară, prin procese de:[12]

- heterofagie, respectiv digestia intracelulară prin lizozomi, a substanţelor nutritive, bacteriilor,

virusurilor introduse în citoplasmă prin endocitoză şi fagocitoză.

- autofagie, respectiv digestie intacitoplasmatică, prin enzimele lizozomale, a organitelor celulare

din celula respectivă, care şi-au terminat activitatea şi se află în grade de dezintegrare. Astfel
lizozomii intervin în turnoverul organitelor celulare din celule normale.

109
Fig. 46 Lizozomi, aspect ultrastructural (după B. Alberts şi col., 2002)

Peroxizomii

Sunt organite celulare prezente în citosolul tuturor celulelor, atât animale cât şi vegetale.

Se pot evidenţia cu 3-3’-diaminobenzidină, DAB.

Pot fi observaţi la microscopul electronic şi pot fi identificaţi cu structurile celulare eucariote

denumite „microbodies”.[12]

110
Au fost denumiţi glioxizomi, în cotiledoanele plantelor ce depozitează lipide, conţinând ciclul
glioxilat şi participând la transformarea grăsimii în carbohidraţi.[12]

Numărul peroxizomilor diferă în funcţie de momentul activităţii celulare.

Diametrul peroxizomilor este cuprins între 0,1-1,5 micrometri.

După dimensiuni, pot fi clasificaţi în macroperoxizomi, având 0,5-1,5 micrometri şi

microperoxizomi, 0,1-0,4 micrometri.

Ultrastructural se evidenţiază ca vacuole sferice sau ovoide, de forme uneori neregulate, cu

prelungiri.

Peroxizomii sunt delimitaţi de citomembrană cu grosime de 6,5-8nm şi conţin o matrice fin

granulară, uneori cu un cristaloid. Acesta este format din mănunchiuri paralele de tubuli denşi la
flux de electroni, care în secţiune transversală dau imaginea unui fagure de miere.

În matrice poate să existe o placă marginală, ca regiune densă la flux de electroni, îngroşată la
periferie.

„Citomembrana peroxizomală are compoziţie asemănătoare cu a membranei reticului endoplasmic

dar diferită de aceasta prin unele polipeptide şi enzime din structura ei”.[12] (Fig. 47)

Chimic, conţin proteine şi lipide.

Catalaza reprezintă enzima marker peroxizomală. Printre alte enzime se regăsesc uricaza, D-
aminoacidoxidaza, enzimele ciclului glicoxilat.[12]

Funcţii peroxizomilor sunt reprezentate de implicarea organitului în:[11]

- metabolismul apei oxigenate, care are loc în 2 etape, la final catalaza desfăcând hidrogenul
peroxid, toxic pentru celulă, în oxigen şi apă

- degradarea purinelor; adenină, guanină, prin uratoxidază

- intervenţia în metabolismul acizilor nucleici

- intervenţia glioxizomilor în metabolismul acidului glioxilic

111
- deţinerea unui sistem enzimatic activ pentru beta-oxidarea acizilor graşi

- intervenţia în biosinteza glicerolipidelor

- rolul în termogeneză, fiind implicaţi în procesul de adaptare la frig prin producerea de căldură

- intervenţia în metabolismul alcoolilor, prin metanoloxidază

Fig. 47 Peroxizomi, aspect ultrastructural (după B. Alberts şi col., 2002)

112
 18. INCLUZIUNI CELULARE

Incluziunile celulare sunt reprezentate fie de substanţe preluate din exteriorul celulei fie mai ales,
de substanţe produse în citoplasmă, unele dintre acestea având caracter de rezervă iar altele fiind
produşi de excreţie.
Incluziunile celulare lipidice apar sub forma unor picături sferice, electronodense, nedelimitate de
citomembrană.(Fig. 48)
Acestea se deosebesc de granulele de secreţie care prezintă citomembrană.[12]
Incluzinile de glicogen apar electronodense, cu aspect granular.(Fig. 49)
Unele granule secretorii reprezintă singurele forme de depozit ale proteinelor.
Pigmenţii apar sub formă de granule de melanină sau de lipofuscină iar în stări patologice se pot
găsi în citosol pigmenţi biliari sau hemosiderină.
Cristalele şi cristaloizii pot să apară în mod normal în citosolul unor celule cum sunt celulele
Sertoli sau Leydig din testicul, în nucleii unor hepatocite, incluziuni de fier în fagocite.[17]

113
Fig. 48 Incluziune lipidică (după B. Alberts şi col., 2002)

Fig. 49 Incluziuni glucidice(după B. Alberts şi col., 2002)

114
 19. CITOSCHELET CELULAR

În constituţia citoscheletului celular, se regăsesc trei tipuri de diferenţieri citoplasmatice. Acestea sunt
interconectate într-o reţea care străbate întrega hialoplasmă, sau matrice citoplasmatică, sau substanţa
fundamentală a citoplasmei, respectiv citosolul.

Componentele citoscheletului celular sunt reprezentate de microfilamentele de actină, cu diametrul

de 7nm, microtubulii, 24nm şi filamentele intermediare, 10nm.

Pe lângă aceste tipuri de filamente, în citoschelet se află numeroase proteine asociate. (Fig. 50)

Menţinerea formei celulei şi a prelungirilor ciliare, este realizată de citoscheletul celular. Totodată
se edifică şi funţia de susţinere şi de motilitate, respectiv mişcarea cililor şi flagelilor, precum şi
deplasarea celulelor, transportul intracelular, translocarea cromozomilor în diviziunea celulară,
citokineza şi contracţia musculară.[12]

115
 Microtubulii sunt structuri celulare prezente în citoplasma celulelor eucariote. Se găsesc izolaţi, ca
microtubuli citoplasmatici sau fasciculaţi, cu caracter efemer, de exemplu la nivelul fibrelor fusului
de diviziune sau permanent, spre exemplu la centrioli, corpusculi bazali, cili, flageli. S-a observat
că fiecare microtubul este format din 13 protofilamente dispuse circular, echidistant. Tubulina
reprezintă unitatea fundamentală şi este un dimer format din alfa şi beta tubulină.[12] (Fig. 51)

Caracterul polar al microtubulilor, pozitiv sau negativ, este dat de orientarea dimerilor de tubulină în
protofilamente. Funcţiile vitale realizate de microtubuli pentru celulă, sunt reprezentate prin: formarea
fusului de diviziune, deplasarea cromozomilor în plan ecuatorial, translocarea cromozomilor anafazici,
transportul intracelular. Microtubulii se depolimerizează la presiune înaltă sau temperatură joasă în
heterodimeri.[11] (Fig. 52)

Polimerizarea heterodimerilor în microtubuli cere concentraţii scăzute de calciu ionic. Acest proces
este facilitat de un număr de alte proteine, unele având greutate moleculară mare, numite proteine
asociate microtubulilor (MAP)[17]

Microfilamentele de actină sunt componente citoplasmatice ale tuturor celulelor eucariote, formate
din polimeri de actină. Monomerul de actină, având forma globulară, a fost denumit actină G iar
sub forma polimerizată, constituind filamente de actină, actina fibrilară, F. Microfilamentele sunt,
alături de microtubuli, structuri polare. Aproape în toate celulele, de actină, se leagă o altă proteină
fibrilară, miozina. Miozina de tip I este absentă în toate celulele musculare, fiind implicată în
fenomene de motilitate. Miozina tip II se află în celulele musculare din muşchii striaţi şi netezi dar
poate fi găsită şi în alte tipuri celulare. Miozina tip II este alcătuită din 6 lanţuri peptidice, respectiv
2 lanţuri grele şi 2 perechi de lanţuri uşoare.[5] La baza contracţiei musculare se află mecanismul
actină-miozină. Deplasarea şi păstrarea poziţiei corpului este dată de muşchii striaţi, ce primesc o
inervaţie motorie-somatică iar muşchii netezi, printr-o inervaţie vegetativă, asigură contracţia
organelor interne.[12] (Fig. 53,54)

Filamentele intermediare sunt componente ale citoscheletului celular, cu grosime mai mare decât
a microfilamentelor de actină şi mai redusă decât a microtubulilor. Acestea sunt formate din 5
tipuri de proteine: desmina, vimentina, citokeratinele- peste 30 specii moleculare, proteina glială
fibrilară acidă GFAP şi neurofilamentele.[6] Rolurile filamentelor intermediare sunt specifice
fiecărui tip celular în care acestea se găsesc.

116
Fig. 50 Componentele citoscheletului celular (după B. Alberts şi col., 2002)

117
Fig. 51 Microtubuli, schema componentelor (după I. Diculescu şi col., 1983)

118
Fig. 52 Asamblarea microtubulilor (după I. Diculescu şi col., 1983)

Fig. 53 Sarcomerul, schemă (după I. Diculescu şi col., 1983)

119
Fig. 54 Fibra musculară striată, aspect ultrastructural (după B. Alberts şi col., 2002)

Microvilii reprezintă o formă de organizare stabilă a microfilamentelor, fiind prezenţi în diferite

tipuri de celule nemusculare.

Sunt formaţiuni ale membranei celulare de suprafaţă, prezenţi de obicei la polul sau polii liberi,
nejonţionali ai unor celule foarte active în transportul celular.

Studiile au demonstrat că microvilii se găsesc bine reprezentaţi la enterocite, acestea fiind celule
absorbante ce căptuşesc intestinul sau la nefrocite, respectiv celule epiteliale absorbante din tubii
uriniferi.

În context, se poate afirma că microvilii au o formă de deget de mănuşă. Ei au înălţimi şi grosimi

egale la enterocite şi inegale, la nefrocite.[11]

Axul citoplasmatic, este prezent la fiecare microvil şi este delimitat de prelungirea membranei
celulare de suprafaţă. În axul citoplasmatic al fiecărui microvil se găseşte un mănunchi de 20-30
filamente de actină, paralele între ele şi paralele cu axul mare. Acestea sunt învelite într-o matrice
densă, la vârful microvilului. Filamentele amintite, sunt legate între ele de-a lungul lor, precum şi
de membrana celulară de suprafaţă, prin punţi transversale.[11](Fig. 55)

Se apreciază că filamentele de actină din axul vilar, au toate aceeaşi polaritate la vârful
microvilului, similară celei observate la nivelul liniei Z, în celulele musculare striate.

Reţeaua densă terminală numită şi buton terminal, aflată la baza microvilului, este alcătuită din
filamente de actină precum şi din filamente izolate, scurte de miozină. Ea se prinde într-o regiune

120
specializată a membranei plasmatice, numită zonulla adherens şi este conectată şi asociată
mănunchiului de filamente axiale.[12]

Se presupune că mişcarea întregului mănunchi de filamente axiale vilare precum şi contracţia

întregului microvil, se realizează prin interacţiunea actină-miozină din reţeaua terminală,
interacţiune ce tensionează filamentele dintre zonulla adherens.

De asemenea contracţia microvilului se face şi prin interacţiunea miozinei cu filamentele axiale

ca şi cu cele din butonul terminal.[11]

Fig. 55 Microvilul (după B. Alberts şi col., 2002)

Centriolii sunt organite microtubulare stabile în citoplasma celulelor.

Au diametru de circa 0,15 micrometri şi lungime până la 0,5 micrometri.

121
 Au fost observaţi şi descrişi la microscopul optic ca intrând în componenţa centrului celular,
localizat deseori lângă nucleu, chiar în vecinătatea Complexului Golgi. Peretele centriolului este
format din 9 triplete de tubuli ce înconjoară zona centrală a cilindrului, care apare de obicei
omogenă.[12]

„În fiecare triplet, tubul intern se notează cu A, cel mijlociu cu B iar cel exterior cu C. Rareori se
întâlnesc centrioli al căror perete este format din 9 dublete de tubuli sau 9 tubuli simpli”.[11]
(Fig.56)

Fig. 56 Centrioli, schemă (după I. Diculescu şi col., 1983)

122
Centrul celular poate conţine unul sau doi centrioli care sunt înconjuraţi de o zonă citoplasmatică
clară. Ultrastructural se observă că fiecare centriol apare ca un cilindru perpendicular pe celălalt.

Centrul celular este implicat în iniţierea şi declanşarea diviziunii celulare, formând fusul de
diviziune. Totodată generează mişcarea cililor şi flagelilor deoarece la baza acestora se găseşte
prezent un centriol numit corpuscul bazal.

Centriolii se divid în decursul diviziunii celulare şi migrează la cei doi poli ai celulei. Prin urmare,
se stabileşte între ei o legătură formată din microtubuli, care realizează fusul de diviziune:centriol-
centriol.[12]

Filamentele de actină şi miozină se prind de microtubulii care formează fusul de diviziune.

De-a lungul fusului de diviziune migrează cromatidele formate în metafază, către centriolii de la
cei doi poli ai celulei.[11]

În context, s-au constatat polimerizări intense, care au loc atât în profază cât şi în metafază. Acestea
conduc la alungirea microtubulilor din fusul de diviziune. În anafază şi telofază au loc procese de
depolimerizare, ce au ca urmare atât scurtarea microtubulilor cât şi migrarea cromatidelor către cei
doi poli ai celulei.[12] (Fig. 57)

123
Fig. 57 Organizarea microtubulilor în fusul de diviziune(după I. Diculescu şi col., 1983)

Citoscheletul postsinaptic a fost observat prin studii ale suprafeţei citoplasmatice a membranei
postsinaptice şi apare la microscopul luminiscent densificată ca un disc sau inel.

La nivelul acestei densificări, studiile de microscopie electronică au semnalat existenţa unei reţele
de filamente de 4nm diametru, cu grosime de 20nm, dispusă sub membrana postsinaptică.[11]

Cilii se întâlnesc sub formă de prelungiri celulare care se dispun la unul din polii celulei şi sunt
alcătuiţi din citoplasmă şi membrană celulară. La nivelul axonemei, respectiv a axului

124
 citoplasmatic ciliar, microtubulii sunt ordonat aranjaţi, cu axul lor mare paralel cu lungimea cilului.
Se poate remarca, la baza fiecărei axoneme, prezenţa unui corpuscul bazal, cu organizarea unui
centriol.[12] (Fig. 58)

Fig. 58 Schema organizării axonemei cilului şi a corpusculului bazal (după I. Diculescu şi col., 1983)

Cilii mobili prezintă axonema compusă din 2 microtubuli axiali, înconjuraţi la periferie de 9
dublete de microtubuli.

Subfibra A se găseşte la nivelul fiecărui dublet, fiind microtubul complet format din 13
protofilamente şi subfibra B, microtubul incomplet format din 11 protofilamente.

De la fiecare subfibră A pornesc spre subfibra B din dubletul vecin, două braţe simetrice, formate
din molecule proteice numite dineină, protein-enzimă bogată în ATP-ază.

Teaca centrală, se găseşte în jurul celor doi microtubuli centrali. Între aceasta şi subfibra A din
fiecare dublet periferic există un braţ de legătură, spiţă, cu ansamblu ce apare radiar.

125
 Legătura dintre subfibra A dintr-un dublet, de subfibra B din dubletul vecin, se face prin braţele
radiare, formate dintr-o structură proteică numită nexină.[12] (Fig. 59)

Cilii imobili-ficşi, exemplu stereocilii din epididim sau de la nivelul urechii interne, au aceeaşi
structură ca a cililor mobili dar în axonemă lipsesc cei 2 microtubuli centrali.

Mişcarea acestor cili se face prin alunecarea unui dublet periferic în raport cu dubletul vecin lui,
depinzând de legarea ciclică a dineinei din subfibra A dintr-un dublet de subfibra B a dubletului
vecin. Astfel braţele de dineină merg de-a lungul dubletelor, producând energia necesară bătăilor
ciliare. Mişcarea cililor necesită ATP şi Ca2+.[12]

Flagelii au structură asemănătoare cililor, la om fiind reprezentaţi prin gameţii masculini,

spermatozoizii.

Fig. 59 Cilul, schemă (după I. Diculescu şi col., 1983)

126
 20. NUCLEUL ÎN INTERFAZĂ

Nucleul reprezintă un centru metabolic activ, care realizează funcţii importante pentru celulă, cum
ar fi replicarea ADN, transcripţia informaţiei în ARN, pregătirea diviziunii celulare, repararea
ADN. În desfăşurarea acestor funcţii, proteinele deţin un rol important.

Structura nucleului cuprinde cel puţin patru componente care au fost identificate până în prezent, şi
anume: [19]

-membrana nucleară

-matricea nucleară

-cromatina nucleară

-nucleolul

Acestea prezintă caracteristici ultrastructurale distincte. (Fig. 60, 61)

127
Fig. 60 Nucleul celular (după site-ul http://www.answers.com/topic/nuclear-pore)

128
Fig.61 Componentele ultrastructurale ale nucleului (după site-ul
http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus.htm)

129
De regulă, pentru fiecare celulă există un nucleu.

Hepatocitele sunt celule binucleate; există şi celule cu câţiva nuclei sau cu zeci de nuclei -
osteoclastele. Celule cu sute de nuclei sunt fibrele musculare striate din muşchii scheletici.

Plasmodiul rezultă din multiplicarea nucleară repetată, fără diviziunea citoplasmei, respectiv
cariokineză fără citodiereză.

Sinciţiul rezultă din fuzionarea mai multor celule mononucleate, cu dispariţia graniţelor
membranare intercelulare.

Forma nucleului urmăreşte forma celulei şi poate fi: rotund-ovalar, alungit, turtit, lobat,
înmugurit.(Fig. 62)

Nucleul prezintă un oarecare grad de deformabilitate, după condiţiile mecanice intracelulare.

Deformarea nucleului se datorează prezenţei în vecinătatea sa a centrozomului, care este cea mai
rigidă sau densă porţiune din citoplasmă.

Aşezarea nucleului este de regulă centrală dar poate fi şi excentric, medio-bazal, bazal. În celulele
secretoare, deplasarea nucleului se face spre polul opus locului de acumulare şi eliminare a
produsului de secreţie.

Se apreciază că dimensiunile nucleilor sunt de circa 5-15 micrometri.

Există o relaţie directă între numărul de seturi cromozomiale din nucleu şi dimensiunile lor,
numită grad de ploidie. Se poate afirma că, cu cât gradul de ploidie este mai mare, cu atât nucleul
este şi el mai mare.[12]

130
Fig. 62 Forme de nuclei (după C. Cotrutz şi col., 1994)

Raportul nucleo-plasmatic este un parametru caracteristic fiecărui tip celular şi reprezintă raportul
volumetric nucleu – citoplasmă.[10]

R N/P=VN/VC-VN unde:

VN=volumul nucleului;

VC=volumul celulei;

VC-VN=volumul citoplasmei.

Se caracterizează în cele ce urmează, componentele nucleului amintite anterior, respectiv

membrana nucleară, matricea nucleară, cromatina nucleară şi nucleolul.

Membrana nucleară înconjoară nucleul. Ea reprezintă un sistem special de endomembrană,

alcătuit dintr-o cisternă perinucleară continuă care este din loc în loc străbătută de complexul por.
Este evidenţiabilă ultrastructural.[10]

Cisterna perinucleară se deosebeşte printre alte endomembrane, având consistenţă şi continuitate

în jurul materialului nuclear. Este alcătuită din 2 membrane concentrice, formate din fosfolipide şi
proteine, care au funcţii speciale.

131
Prin proteinele specifice, membrana nucleară internă se leagă de lamina nucleară, fiind în contact
cu ADN şi cu tipurile de ARN transcrise în nucleu.

Membrana nucleară externă, se continuă cu membrana reticulului endoplasmic, de suprafaţa căruia

se leagă ribozomi, ce fac parte din aparatul de sinteză a proteinelor.

Între cele 2 membrane nucleare există un spaţiu perinuclear sau cisternal, care are circa 20-40nm
lăţime. În spaţiul perinuclear, sunt transportate proteinele sintetizate de ribozomii legaţi de
membrana externă, ce se continuă cu lumenul reticulului endoplasmic.[10]

Porii nucleari apar în regiunile unde membrana externă se continuă cu cea internă şi reprezintă
structuri care perforează ambele membrane nucleare. Aceştia apar ca nişte canale de legătură între
conţinutul nucleoplasmatic şi cel citoplasmatic. Se apreciază că numărul porilor este variabil atât
cu specia, cât şi cu tipul celular. (Fig. 63)

Fig. 63 Complexul por nuclear (după site-ul http://sspatel.googlepages.com/nuclearporecomplex2)

132
S-a demonstrat că fiecare por este format dintr-o structură de proteine asociate, numite complexul
por nuclear. S-a observat că diametrul intern al orificiului porului este de 60-90nm, fiind variabil
de la un tip celular la altul, după condiţiile de prelucrare electronomicroscopică.[12]

Elementele ultrastructurale nemebranoase ce ocupă interiorul porului sunt:

-2 inele sau anuli, aşezate pe ambele fronturi ale porului, nuclear şi citoplasmatic, fiecare compus
din granule inelare cu diametrul de 10-25nm, aşezate în formă de octagon simetric

-8 conuri orientate dinspre peretele porului către lumenul său, constituite ca agregate de fibrile

-o particulă centrală granulară prezentă inconstant

- pachete de filamente nucleoplasmatice de 4-8nm, ce se termină cu o extremitate pe inelul intern

iar cu cealaltă se ancorează pe formaţiunile intranucleare.[12] (Fig. 64)

133
Fig. 64 Structura complexului por nuclear ( după site-ul
http://cellbio.utmb.edu/CELLBIO/nucpore1.jpg)

Enzimele identificate la nivelul membranei nucleare sunt numeroase, dintre acestea făcând parte
glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza, oxidaza, fosfataza acidă, arilsulfataza, nucleozid-difosfataza,
citocromoxidaza, tiaminpirofosfataza. [12]

O caracteristică a membranei nucleare este dată de separarea netă a conţinutul nuclear de

organitele citoplasmatice.

De asemenea, prin delimitarea nucleul de citoplasmă, membrana nucleară compartimentează fluxul

informaţional genetic în compartimentul nuclear şi compartimentul citoplasmatic.[10]

134
Replicarea ADN-ului precum şi transcripţia şi prelucrarea tipurilor de ARN, se realizează la
nivelul primului compartiment.

Traducerea mesajului genetic, prin sinteza proteinelor la nivelul ribozomilor, are loc la nivelul
celui de-al doilea compartiment.[12]

Matricea nucleară, sucul nuclear sau nucleoplasma filamentosum, este scheletul proteic care
înglobează cromatina şi nucleolii. Se sprijină la exterior pe membrana nucleară. Are rol în
organizarea nucleului: în sinteza ADN sau ARN, în medierea semnalelor hormonale şi în alte
funcţii nucleare.[12]

Aceasta este formată din matricea nucleară propriu-zisă şi din fracţiunea labilă a matricei.

Prima este reprezentată de reţeaua proteică iar cea de-a doua, este legată lax de reţeaua
proteică.[12]

Matricea nucleară propriu-zisă se compune din:[11]

- reţeaua fibrilară intranucleară, intercromatică şi pericromatiniană

- componentele nemembranoase ale învelişului nuclear formate din lamina densa internă şi
complexele por

- componenta nucleolară sau reţeaua fibrilară din pars fibrosa şi pars granulosa a nucleolului

Rolul matricei nucleare este de a menţine atât forma nucleului cât şi stabilitatea lui în
interfază.[12]

Cromatina se consideră a fi “ceea ce se vede la microscop, din cromozomii în interfază”.[12]

Acestea sunt două forme de organizare ale ADN-ului şi anume cromatina este forma de existenţă
interfazică iar cromozomii sunt forma de existenţă în timpul diviziunii. (Fig. 65)

135
Fig. 65 Cromatina (după C. Cotrutz şi col., 1994)

Cromatina este bazofilă. Din punct de vedere chimic cromatina se compune din ADN şi proteine
histonice şi din mici cantităţi de ARN şi proteine nehistonice.

Histonele sunt proteine bazice din genomul eucariotelor. S-au identificat 5 tipuri: H1, H2A, H2B,
H3 şi H4. S-a descoperit şi histona H5 numai în nucleii hematiilor de pasăre, unde înlocuieşte
H1.[12]

Funcţia de bază a histonelor este reprezentată de împachetarea ADN-ului sub formă de

nucleozomi.[12]

Cromatina se clasifică în: eucromatină şi heterocromatină.

Eucromatina - cromatina adevărată, se colorează puţin intens cu coloranţi bazici, este purtătoare
de gene structurale, este porţiunea funcţional activă a cromatinei, este cea pe care se face
transcripţie.

Se clasifică în eucromatină activă - fracţiunea pe care se face continuu transcripţie şi eucromatină

permisivă - fracţiunea potenţial activă, respectiv activă doar în urma acţiunii unor semnale
specifice modulatoare, ca cele date de hormoni.

Heterocromatina se colorează foarte intens cu coloranţi bazici. Se clasifică în constitutivă,

constant condensată în interfază, genetic inactivă, care nu conţine gene structurale şi pe care nu se
face transcripţie şi facultativă, condensată, care conţine gene structurale ce sunt represate,
nefăcându-se transcripţie pe ele.

Heterocromatina facultativă este de două tipuri, autozomală şi gonozomală.[12]

136
Cea autozomală corespunde porţiunilor condensate din cele 22 de perechi de cromozomi autozomi
iar cea gonozomică este reprezentată prin corpusculul Barr, cromatina X sau cromatina de sex,
care este un corpuscul cromatinian prezent la normal numai în nucleii celulelor somatice la sexul
feminin. Astfel, cromatina X, provine din inactivarea braţului lung al unuia din cei 2 cromozomi X
din celulele somatice ale organismului de sex feminin.

Studiile au arătat că, după colorare cu fluorocrom, în lumina ultravioletă, se observă corpusculul F
sau cromatina Y, specifică nucleului celulelor sexului masculin.[12]

Nucleozomii, constituie forma de organizare supramoleculară a cromatinei şi cromozomilor.

Se poate spune că nucleozomul reprezintă o formă de organizare a complexului ADN-histone.

Conceptul nucleozomal implică împachetarea obligatorie a ADN-ului, implicarea subunităţii

elementare a cromatinei, scindarea ADN-ului din cromatină şi cantităţile egale de histone din
cromatină.

Cercetările au arătat că nucleozomul este un octamer histonic care are forma unui cilindru turtit cu
dimensiuni de circa 11nm diametru şi 5,5nm înălţime, fiind înconjurat de două ori de un superhelix
de ADN.

De asemenea se apreciază că octamerul histonic este format din câte două molecule, din cele patru
tipuri de histone, H2A, H2B, H3, H4. Se menţionează că histona H1 nu face parte din structura
nucleozomului. S-a demonstrat că tetramerul H3-2H4-2 formează miezul nucleozomului, fiind
esenţial pentru superspiralizarea ADN-ului. S-a presupus că H1 ar fi implicată în spiralizarea fibrei
de cromatină, în formarea solenoidului.[12](Fig. 66)

Se consideră că eucromatina corespunde filamentului nucleozomic de 10nm iar heterocromatina,

solenoidului de 30nm. De asemenea se consideră că nucleozomul nu este o unitate de informaţie
genetică ci o unitate de împachetare a ADN-ului.[4]

137
Fig. 66 Alcătuirea nucleozomului( după site-ul
ht t p: / / www.bi o.davi dson.edu/ courses/ M ol bi o/ Mol St udent s/ spri ng2000/ l am a r/ nu
cl eos om e. gi f

Nucleolul, prezent numai în interfază, reprezintă o formaţiune corpusculară intranucleară.

Biogeneza ribozomilor, reprezintă principala funcţie a nucleolului.

La nivel nucleolar, se rezumă procesele care au loc în nucleu - replicare, transcripţie, transport,
fiind intermediar între cromozomi şi citoplasmă.

Importanţa nucleolului pentru celulă reiese din faptul că celulele fără nucleoli nu sunt viabile.
Concluzionând, nu există nucleu fără nucleol.[12]

De regulă, dimensiunile nucleolilor sunt de 1-2 micrometri.

138
 Se apreciază că nucleul celulelor somatice umane are de regulă câte un nucleol pentru fiecare set
cromozomial. Prin urmare, numărul nucleolilor se află în raport direct cu gradul de ploidie.[11]

Privind forma nucleolilor, aceştia sunt de obicei rotunzi-ovalari dar pot avea şi formă neregulată,
odată cu îmbătrânirea celulară.

Nucleolii sunt aşezaţi central sau paracentral în nucleu dar s-au descris şi mişcări ale nucleolului în
interiorul nucleului.

Datorită unei mari concentraţii de substanţă uscată din conţinut, se consideră că nucleolul reprezintă
cea mai densă porţiune din celulă.

La microscopul cu contrast de fază, în celulele vii, se identifică ca un corpuscul puternic

refringent, cu contur uşor neregulat şi cu un conţinut heterogen. Acest aspect, se datorează
cantităţii de apă, reduse.

Coloraţia uzuală în celulele fixate, este hematoxilină-eozină şi evidenţiază nucleolul ca pe un

corpuscul bazofil.

Cu ajutorul coloraţiei Feulgen, se evidenţiază electiv ADN-ul, cromatina apărând în nuanţă de

roşu-violet.

Impregnările argentice evidenţiază în structura nucleolului două componente, reprezentate de

nucleolonemă şi pars amorpha.[11]

Componentele ultrastructurale ale nucleolului: [12]

- fibrilară, din filamente de 55nm grosime şi 30-40nm lungime, grupate în pachete şi organizate ca
o reţea

- granulară, formată din granule de aproximativ 20nm diametru, dominantă în nucleol

- cromozomială, din filamente de 10nm, repartizată la periferia nucleolului cu benzi ce pătrund şi

în interior

139
 - astructurată, omogenă, cu densitate medie la flux de electroni, discutabilă dacă constituie totuşi
o componentă reală a nucleolului (Fig. 67)

Fig. 67 Componentele ultrastructurale ale nucleolului (după I.Diculescu şi col., 1983)

„Nucleolul nu conţine şi nu este delimitat de membrane”.[12]

Din punct de vedere chimic, nucleolul conţine ADN, ARN şi proteine.

Conţinutul relativ mare de ADN şi ARN, explică bazofilia nucleolului în microscopia optică.
Privind componentele ultrastrucutale nucleolare, componentele fibrilară şi granulară sunt formate
din ARN, componenta cromozomială din ADN iar componenta astructurată, din proteine.[12]

140
 21. DIVIZIUNEA CELULARĂ

Ciclul celular

Reproducerea celulară implică evenimente complexe care se succed ciclic, constituind ciclul
celular. (Fig. 68)

Fig. 68 Ciclul celular ( după site-ul http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel1.gif)

141
În funcţie de compartimentele celulare în care se desfăşoară aceste evenimente, se disting două
componente ale ciclului celular: ciclul cromozomial şi ciclul citoplasmatic.

În ciclul cromozomial replicarea ADN alternează cu mitoza.

Evenimentele principale ale ciclului citoplasmatic sunt dublarea constituenţilor celulari şi

citokineza, proces prin care celula parentală se scindează.

Mitoza şi citokineza, componente în stânsă interdependenţă, ocupă o scurtă perioadă de timp, 10%
din durata desfăşurării ciclului celular, numită perioada mitotică M.

Perioadele mitotice succesive sunt separate de interfază, care constituie perioada ciclului celular în
care celula desfăşoară o activitate biosintetică susţinută, asigurând condiţiile necesare realizării
diviziunii celulare.

Interfaza ocupă 90% din durata ciclului celular. În cadrul acestei etape au fost descrise trei
perioade,G1, S, G2.

Perioada G1, sau presintetică, a fost considerată iniţial ca o perioadă de gol sintetic.

Ulterior s-a constatat că în această etapă are loc o intensificare a transcripţiei şi a proteosintezei,
procese aproape blocate în perioada mitotică.

Perioada G1 se caracterizează prin desăvârşirea decondensării cromatinei iniţiate în anafază şi

reorganizarea nucleolului. Cantitatea de ADN corespunde unui cromozom monocromatidic,
alcătuit dintr-o moleculă de ADN dublucatenară.[3]

Perioada S, sintetică, urmează celei G1.

Pe întreaga perioadă S, se desfăşoară replicarea ADN nuclear astfel încât la sfârşitul ei cantitatea de
ADN nuclear se dublează.

În acest moment cromozomii sunt bicromatidici, fiecare fiind alcătuit din 2 cromatide surori.

Simultan cu replicarea materialului genetic se desfăşoară sinteza proteinelor histonice şi

nehistonice implicate în sinteza ADN.[1]

Perioada G2 postsintetică, separă perioada sintetică de cea mitotică.

142
În G2, transcripţia şi proteosinteza, au aceeaşi intensitate ca în G1, asigurându-se condiţiile
necesare intrării celulei în mitoză.

Totodată cromozomii bicromatidici prezintă un grad redus de condensare, nucleolul are mărimea
maximă iar volumul nuclear creşte.

Spre deosebire de perioada S, a cărei durată este constantă, în raport cu intervalul de timp
corespunzător interfazei, G1 are o durată variabilă.[2]

Timpul necesar parcurgerii perioadei G1 este influenţat de factori extracelulari, cum ar fi

elementele nutritive şi factorii de creştere.

Celulele neproliferative se găsesc în stadiu G0 al ciclului celular.

Durata ciclului celular este variabilă în funcţie de tipul celular, specie şi stadiu de dezvoltare
embriologică.

La mai toate celulele din organismele eucariote superioare, sunt necesare 10-24 ore pentru
derularea unui ciclu celular complet.

Pentru că desfăşurarea periodei S nu pare afectată de aceşti factori, se sugerează existenţa unui
punct critic între G1 şi S numit start.

Pentru majoritatea celulelor eucariote, depăşirea punctului de start - punct de restricţie, marchează
angajarea celulei în parcurgerea întregului ciclu celular.

Se consideră a exista şi un alt punct de restricţie, între G2 şi M.

Acest punct de restricţie este legat de condensarea cromatinei, fenomen ce trebuie să preceadă
mitoza.[12]

Mitoza este caracteristică celulelor somatice şi asigură conservarea garniturii cromozomiale,

celulele fiice prezentând acelaşi număr de cromozomi ca şi celula parentală.

Mitoza poate fi împărţită în patru- cinci etape, caracterizate prin modificări morfologice specifice.
Ultima etapă a diviziunii mitotice, citokineza, debutează în anafază şi se încheie la sfârşitul ciclului
celular.

143
Profaza se caracterizează prin condensarea cromatinei cu individualizarea cromozomilor
bicromatidici, diferenţierea fusului de diviziune şi dezorganizarea nucleolului.

Prometafaza debutează prin fragmentarea învelişului nuclear, în vezicule delimitate de membrană,

ce staţionează pe întreaga durată a mitozei, în jurul fusului de diviziune. Pe cromatidele surori se
dezvoltă complexe proteice, numite kinetocori, de care se ancorează fibrele kinetocorice. La final,
carioplasma fuzionează cu hialopasma.

Metafaza se caracterizeată prin alinierea cromozomilor în planul ecuatorial al fusului de diviziune.

Cromatidele surori ale cromozomului metafazic sunt situate una alături de cealaltă. Fibrele
kinetocorice aliniază cromozomii într-un singur plan perpendicular pe axul fusului de
diviziune.Acesta este localizat la jumătatea distanţei ce separă polii celulari şi formează placa
metafazică sau ecuatorială.

În anafază, cromozomii omologi se deplasează spre polii opuşi ai fusului de diviziune ca urmare a
două procese, depolimerizarea fibrelor kinetocorice şi polmerizarea fibrelor polare.

În telofază, cromozomii se găsesc la cei 2 poli ai fusului de diviziune, fibrele kinetocorice se

dezorganizează şi se remarcă decondensarea cromatinei. (Fig. 69)

Citokineza defineşte fenomenul de diviziune a citoplasmei. În cazul celulelor animale, citokineza

se ralizează prin clivaj. Regiunea centrală a celulei se îngustează progresiv sub acţiunea inelului
contractil asamblat încă din anafază. Cromatina este decondensată, reapar nucleolii, se
reorganizează membranele nucleare şi microtubulii primesc orientarea caracteristică interfazei.
Separarea completă a celulelor fiice, marchează finalizarea citokinezei şi are loc la începutul
următoarei interfaze.[11]

144
Fig.69 Mitoza:
a) profaza; b) metafaza; c) anafaza; d) ( după site-ul
telofazahttp://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel3.gif)

145
Meioza este caracteristică celulelor germinale. Mecanismul implică desfăşurarea succesivă a două
diviziuni indirecte. Meioza I este o diviziune reducţională, numărul cromozomilor fiind redus la
jumătate. Meioza II este o diviziune mitotică ecvaţională, materialul genetic fiind repartizat egal
celulelor fiice.

Profaza meiozei I cuprinde o succesiune de cinci etape, care se caracterizează prin evenimente
specifice: leptoten, zigoten, pachiten,diploten şi diachineza.

Leptoten se caracterizează prin alcătuirea cromozomilor din 2 cromatide înfăşurate una în jurul
celeilalte, care sunt ataşaţi de membrana nucleară prin intermediul plăcilor de ataşare.

În zigoten are loc conjugarea cromozomilor cu formarea bivalenţilor, a tetradei.

Pachitenul începe în momentul finalizării conjugării cromozomilor. Ca rezultat al condensării

progresive a cromatinei pe parcursul primelor 2 stadii ale profazei I, în pachiten cromozomii sunt
mai scurţi şi mai groşi. Principalul eveniment al acestui stadiu este crossing-over-ul, ce implică
ruperea în aceeaşi poziţie a extremităţilor unei cromatide materne şi a alteia paterne şi reunirea
încrucişată a fragmentelor. Prin schimbul reciproc de fragmente între cromatidele nesurori se
realizează recombinarea genetică. Procesul de recombinare este catalizat de complexe
multiproteice, numite noduli de recombinare.

În stadiul diploten, cromozomii omologi se separă parţial, rămânând ataşaţi la nivelul chiasmelor.
Chiasmele asigură segregarea corectă a materialului genetic în prima diviziune a meiozei.

Diachineza încheie profaza meiozei I. Cromozomii se detaşează de membrana nucleară. Datorită

condensării superioare a cromatinei, se remarcă cele 4 cromatide ce alcătuiesc bivalentul.
Chiasmele încep să se deplaseze spre extremităţile cromozomilor prin fenomenul numit
terminalizare.

Prometafaza meiozei I se caracterizează prin dezorganizarea învelişului celular şi formarea

aparatului acromatic. La nivelul centromerilor se diferenţiază kinetocorii. Cei 2 kinetocori ce se
dezvoltă pe centromerul unui cromozom din bivalent, sunt ancoraţi de fibre kinetocorice care
pornesc de la acelaşi pol al fusului de diviziune. Kinetocorii de pe centromerul cromozomului
omolog sunt legaţi prin fibre kinetocorice de polul opus.

146
Metafaza meiozei I se caracterizează prin mobilizarea bivalenţilor spre regiunea ecuatorială a
celulei şi alinierea lor în placa metafazică, ecuatorială, cei 2 centromeri ai bivalentului fiind
orientaţi spre polii celulari opuşi; kinetocorii cromatidelor surori sunt orientaţi spre acelaşi pol al
fusului de diviziune.

Anafaza meiozei I se caracterizează prin separarea completă a cromozomilor omologi ai

bivalentului şi migrarea spre polii opuşi ai celulei.

Telofaza meiozei I, are specific aflarea cromozomilor la polii fusului de diviziune. Decondensarea
cromozomilor continuă fără ca aceştia să-şi piardă individualitatea iar relaxarea cromatinei face
posibilă reînceperea sintezei ARN.[2]

Meioza I se încheie cu procesul de citokineză, prin care sunt separate celulele progene. Fiecare
progen conţine o jumătate din garnitura cromozomială a celulei parentale, deşi cantitatea de ADN
corespunde unei celule diploide. Aceasta se explică prin existenţa în fiecare celulă a 2 copii ale
aceluiaşi cromozom. Datorită recombinării genetice ce are loc în profaza I, copiile nu sunt perfect
identice. Astfel cele 2 copii corespund unui singur cromozom din fiecare pereche de omologi ai
celulei parentale.(Fig. 70)

147
Fig. 70 Meioza. Diviziunea reducţională:
a) profaza I b) metafaza I c) anafaza I d) telofaza I (după site-ul
http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel3.gif)

Interfaza meiotică, mai scurtă decât interfaza mitotică sau premeiotică, separă cele 2 diviziuni
meiotice şi se caracterizează prin absenţa perioadei S. În interfaza meiotică se desfăşoară procese
transcripţionale şi de proteosinteză ce pregătesc intrarea celulei în meioza II. De asemenea, în
această perioadă, are loc reorganizarea kinetokorilor. Aceştia se poziţionează pe feţele opuse ale
centromerului fiecărui cromozom bicromatidic.Reorientarea permite segregarea materialului
genetic pe parcursul celei de-a 2-a diviziuni meiotice. Se apreciază că interfaza meiotică nu este
întâlnită la toate celulele eucariote.

În celulele progene, rezultate în urma meiozei I, iniţierea celei de-a II diviziuni meiotice, are loc
simultan.

148
Meioza II reprezintă o diviziune mitotică, ecvaţională, ce asigură repartizarea egală a copiilor
cromozomiale din cele 2 celule fiice şi în consecinţă formarea gameţilor.

Etapele celulare şi conţinutul acestora, sunt similare celor din diviziunea mitotică.

Meioza II debutează cu profaza II, etapă mult mai scurtă decât profaza mitotică, în care are loc
formarea unui nou aparat acromatic şi dezorganizarea învelişului nuclear.

În metafaza II, fibrele kinetocorice ce radiază din polii opuşi ai fusului de diviziune, ancorează
kinetocorii de pe cele 2 cromatide ce alcătuiesc fiecare cromozom. Unite prin centromer,
cromatidele surori sunt deplasate şi aliniate în planul ecuatorial al celulei, formând placa
metafazică. Sfârşitul acestei etape este marcat de replicarea centromerului şi separarea celor 2
cromatide.

În anafaza II, cromatidele surori sunt translocate spre polii opuşi ai celulei. Cromozomii
monocromatidici anafazici, se alungesc, ca rezultat al relaxării cromatinei.

În telofaza II, decondensarea cromozomilor continuă astfel încât la sfârşitul meiozei II, cromatina
îşi recapătă aspectul specific interfazei. În jurul celor 2 spiremi situaţi la polii opuşi ai celulelor, se
reorganizează învelişul nuclear. Separarea celor 4 celule diploide, gameţi, este consecinţa directă a
procesului de diviziune citoplasmatică.[3] (Fig. 71)

149
Fig. 71 Meioza. Diviziunea ecvaţională:
a) profaza II b) metafaza II c) anafaza II d) telofaza II(după site-ul
http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel3.gif)

150
 22. DIFERENŢIEREA CELULARĂ

Creşterea celulei este un proces strâns legat de diviziunea celulară. Analizat separat, procesul de
creştere poate fi privit ca un proces de biosinteză pentru a cărui realizare sunt necesare anumite
condiţii cum ar fi în primul rând existenţa unei anumite energii libere care să permită realizarea
procesului de biosinteză.[12]
Orice organism adult indiferent de nivelul filogenetic, prezintă o structură heterogenă. Fenomenul
de heterogenitate, indiferent de structura implicată, defineşte diferenţierea. Heterogenitatea se
observă şi între diferitele organe componente ale organismului.[5]
Celulele diferenţiate se caracterizează prin proprietăţi morfologice şi funcţionale specifice datorate
caracterelor structurale şi enzimatice ale proteinelor lor specifice. Procesul de diferenţiere este
influenţat de anumiţi factori: externi, procese metabolice locale, inducţia şi represia enzimelor.
Dinamica procesului de diferenţiere se poate observa în studiul spermiogenezei şi al
ovogenezei.[10] (Fig. 72)
Atât îmbătrânirea celulară cât şi moartea celulelor, reprezintă două procese din viaţa celulei, care se
manifestă la un interval de timp, după o anumită perioadă de activitate.[12]
Celulele se clasifică în mod diferit, raportând durata de viaţă a celulei la durata vieţii organismului.
În acest context, se deosebesc celule labile, celule stabile şi celule perpetue.
Celulele labile au o durată de viaţă scurtă, fiind rapid distruse şi înlocuite treptat prin alte celule
tinere.
Celulele stabile au activitate mitotică intensă în perioada de creştere care scade la vârsta adultă fără
a înceta definitiv şi cu posibilitatea de a redeveni foarte intensă în anumite condiţii.
Celulele perpetue sunt cele care au în general o viaţă lungă dar care sunt lipsite de capacitate de
multiplicare. Moartea celulei se produce în general prin necroză şi necrobioză, în ultimul caz
procesul dezvoltându-se progresiv.

151
152
 Fig. 72 Diferenţierea celulară (după I. Diculescu şi col., 1980)

23. APOPTOZA

Apoptoza, cuvînt de origine greacă, a fost folosit din antichitate pentru descrierea căderii
frunzelor. „Acest cuvânt a fost folosit metaforic de cercetători în domeniu, încă din anul 1972 ,
pentru a defini un nou tip de moarte celulară şi anume moartea programată a celulei sau sinuciderea
celulei”.[20]
Termenul de apoptoză este uneori considerat sinonim cu moartea celulară programată, fapt ce
implică existenţa unui program respectiv set de gene, letal genetic.
Unii autori consideră că termenul de deleţie programată a celulelor ar fi mai potrivit pentru a
descrie acest fenomen.[20]
Moartea celulară are loc pe parcursul dezvoltării ontogenetice a organismelor şi a fost descrisă
prima dată de Glucksmann în 1951 apoi de Kerr în 1963 şi Saunders în 1966.
Apoptoza se descrie ca trăsătură fundamentală a dezvoltării, prin care celulele nelezate sunt
eliminate din ţesuturi.
Studiile în domeniu, au demonstrat existenţa unor deosebiri clare, între apoptoză şi necroză.[20]
Dacă în apoptoză moartea afectează celulele individuale, în necroză, moartea afectează o populaţie
mai largă.
O trăsătură caracteristică dezvoltării, prin care celulele nelezate sunt eliminate din ţesuturi, este
reprezentată prin mecanismele apoptozei. [20]
Apoptoza, asigură homeostazia organelor, prin participarea la turnover-ul celular. Apoptoza poate fi
accelerată sau inhibată de diverşi compuşi naturali cum ar fi hormoni, citokine, proteine efectoare sau
reglatoare.[5]

153
Studiile au demonstrat că în mecanismul apoptozei sunt implicate un număr de cel puţin 11 gene,
localizate în genomul nuclear. Produsele acestora par a fi implicate în apariţia unor modificări
morfologice şi biochimice, caracteristice procesului de apoptoză.
Se apreciază că un rol deosebit îl deţin mecanismele apoptotice în cadrul procesului de cancerizare.
Cunoaşterea mecanismelor moleculare ale procesului de apoptoză, este importantă în etapele de
prevenţie şi de tratare ale neoplaziilor.[20]
Pentru evidenţierea distinctă a tipului de moarte celulară, apoptoză sau necroză, se apreciază că
cele mai relevante sunt tehnicile de microscopie optică şi mai fidele, cele de microscopie
electronică.

154
 SURSA ILUSTRAŢIILOR

Fig.1 Scala mărimilor celulelor (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh., Popescu, L., M.; Biologie
Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig.2 Părţile componente ale microscopului [online]

Disponibil pe internet: (www.aas-tech.ro/microscoape/produse/22)

Fig. 3 Apertura unghiulară a unui obiectiv(2 α) (după Diculescu, I. şi colaboratorii; Biologie

celulară Ghid pentru lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti: Litografia IMF, Facultatea de
Medicină Generală, 1980)

Fig. 4 Comparaţie între microscopul optic şi microscopul electronic (după Diculescu, I. şi

colaboratorii; Biologie celulară Ghid pentru lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti: Litografia
IMF, Facultatea de Medicină Generală, 1980)

Fig. 5 Fig. 5 Microscop electronic de transmisie[online]

Disponibil pe internet:
(http://www2.uakron.edu/cpspe/images/micro_tem.jpg)
Fig 6 Microscop electronic de baleiaj [online]
Disponibil pe internet
(http://www2.uakron.edu/cpspe/images/micro_sem.jpg)

155
 Fig. 7 Etapele obţinerii preparatului electronomicroscopic (după Diculescu, I. şi colaboratorii;
Biologie celulară Ghid pentru lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti: Litografia IMF,
Facultatea de Medicină Generală, 1980)

Fig. 8 Microtom rotator [online]

Disponibil pe internet: (http://www.micros.at/Englisch/microtom.html)
Fig. 9 Principiul general al unui flux-citometru ( după Voiculescu, Constantin. Citometria de
flux în medicina clinică şi experimentală. Bucureşti: Editura Academiei Române, 1996.

Fig.10 Principiul sortării celulelor, ( după Voiculescu, Constantin. Citometria de flux în

medicina clinică şi experimentală. Bucureşti: Editura Academiei Române, 1996.

Fig 11 Moduri de sortare celulară prin citometria de flux ( după Voiculescu, Constantin.
Citometria de flux în medicina clinică şi experimentală. Bucureşti: Editura Academiei Române,
1996.

Fig.12 Tehnica culturii de celule pentru ţesuturi embrionare (după Diculescu, I. şi

colaboratorii; Biologie celulară Ghid pentru lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti: Litografia
IMF, Facultatea de Medicină Generală, 1980)

Fig.13 Schema obţinerii unei criofracturi (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu,
C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994)

Fig.14 Schema instalaţiei de sublimare şi metalizare a criofracturii (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen,
Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică,
1994)

Fig.15 Obţinerea replicii de platină –carbon a probei criofracturate (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen,
Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică,
1994)

Fig. 16 Separarea organitelor celulare prin centrifugare în gradient de densitate (după Cotrutz, C.;
Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău:
Editura Tehnică, 1994)

156
 Fig. 17 Fracţionarea celulară-etape (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.;
Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994)

Fig. 18 Separarea moleculelor mici prin cromatografie pe hârtie (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen,
Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică,
1994)

Fig. 19 Separarea moleculelor prin cromatografie pe coloană (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen,
Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică,
1994)

Fig. 20 Matricea cromatografică în cromatografia de afinitate (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen,
Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică,
1994)

Fig. 21 Difracţia cristalului de mioglobină (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu,
C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994)

Fig. 22 Reacţia de polimerizare în lanţ a unei secvenţe specifice ADN (după Ştefănescu,
Dragoş, T.; Călin, A., George; Ştefănescu, C., Fulvia; Genetica Medicală Progrese recente.
Bucureşti: Editura Tehnică, 1998)

Fig. 23 Etapele tehnicii de marcare radioactivă -Southern blotting ( după Ştefănescu, Dragoş,
T.; Călin, A., George; Ştefănescu, C., Fulvia; Genetica Medicală Progrese recente. Bucureşti:
Editura Tehnică, 1998)

Fig. 24 Grila Weibel universală 42 şi volumul relativ ocupat de structuri (după Diculescu, I.
şi colaboratorii; Biologie celulară Ghid pentru lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti:
Litografia IMF, Facultatea de Medicină Generală, 1980)

Fig. 25 Grila Weibel universală 100 (după Diculescu, I. şi colaboratorii; Biologie celulară
Ghid pentru lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti: Litografia IMF, Facultatea de Medicină
Generală, 1980)

Fig. 26 Efectul Holmes (după Diculescu, I. şi colaboratorii; Biologie celulară Ghid pentru
lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti: Litografia IMF, Facultatea de Medicină Generală,
1980)

157
 Fig. 27 Componentele ultrastructurale ale celulei ( după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria,
Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994)

Fig. 28 Forme celulare (după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de
lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994)

Fig.29 Membrana celulara [online]

Disponibil pe internet:
(http://www.fairfield.k12.ct.us/tomlinson/ctomlinson03/CellProject04/Per7/7HP/cell_membrane.gif)

Fig. 30 Orientarea moleculelor bimodale în monostrat (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga,
Gh., Popescu, L., M.; Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 31 Formarea miceliilor (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh., Popescu, L., M.;
Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 32 Proteinele membranei celulare [online]

Disponibil pe internet: (http://www.weizmann.ac.il/chemphys/gov/images/membrane.jpg)

Fig. 33 Joncţiune strânsă (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.;
Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science, 2002.)

Fig. 34 Schema desmozomilor (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts,
K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science, 2002.)

Fig. 35 Joncţiune GAP(după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.;
Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science, 2002.)

Fig. 36 Schema mitocondriei [online]

158
Disponibil pe internet:
(http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/mitochondria.jpg
)

Fig. 37. Ultrastructura mitocondriei (după Alberts et al. Molecular Biology of the Cell Third
Edition. New York-London: Garland Publishing, 1994)

Fig. 38 Cloroplastul (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter,
P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science, 2002.)

Fig. 39 Schema subunităţilor ribozomale (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.;
Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science,
2002.)

Fig. 40 Asamblarea subunităţilor ribozomale ( după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.;
Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland
Science, 2002.)

Fig. 41 Ribozomi, aspect ultrastructural (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.;
Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science,
2002.)

Fig. 42 Schema reticului endoplasmic (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.;
Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science,
2002.)

159
 Fig. 43 Reticul endoplasmic rugos, aspect ultrastructural (după Alberts, B.; Johnson, A.;
Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York:
Garland Science, 2002.)

Fig. 44 Reticulul endoplasmic neted, aspect ultrastructural (după Alberts, B.; Johnson, A.;
Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York:
Garland Science, 2002.)

Fig. 45 Complexul Golgi, schemă şi aspect ultrastructural (după Alberts, B.; Johnson, A.;
Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York:
Garland Science, 2002.)

Fig. 46 Lizozomi, aspect ultrastructural (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.;
Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science,
2002.)

Fig. 47 Peroxizomi, aspect ultrastructural (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.;
Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science,
2002.)

Fig. 48 Incluziune lipidică (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.;
Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science, 2002.)

Fig. 49 Incluziuni glucidice(după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.;
Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science, 2002.)

160
 Fig. 50 Componentele citoscheletului celular (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff,
M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science,
2002.)

Fig. 51 Microtubuli, schema componentelor (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh.,
Popescu, L., M.; Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 52 Asamblarea microtubulilor (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh., Popescu, L., M.;
Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 53 Sarcomerul, schemă (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh., Popescu, L., M.;
Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 54 Fibra musculară striată, aspect ultrastructural (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis.
J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland
Science, 2002.)

Fig. 55 Microvilul (după Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter,
P.; Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland Science, 2002.)

Fig. 56 Centrioli, schemă (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh., Popescu, L., M.;
Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

161
 Fig. 57 Organizarea microtubulilor în fusul de diviziune (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina;
Benga, Gh., Popescu, L., M.; Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 58 Schema organizării axonemei cilului şi a corpusculului bazal (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina;
Benga, Gh., Popescu, L., M.; Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 59 Cilul, schemă (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh., Popescu, L., M.; Biologie
Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 60 Nucleul celular [online]

Disponibil pe internet:

(http://www.answers.com/topic/nuclear-pore)

Fig.61 Componentele ultrastructurale ale nucleului [online]

Disponibil pe internet: (http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus.htm)

Fig. 62 Forme de nuclei ( după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de
lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994)

Fig. 63Complexul por nuclear [online]

Disponibil pe internet:

(http://sspatel.googlepages.com/nuclearporecomplex2)

Fig. 64 Structura complexului por nuclear [online]

Disponibil pe internet: (http://cellbio.utmb.edu/CELLBIO/nucpore1.jpg)
Fig. 65 Cromatina ( după Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de
lucrări practice de biologie celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994)

Fig. 66 Alcătuirea nucleozomului [online]

162
 Disponibil pe internet:

(ht t p: / / www.bi o.davi dson.edu/ courses/ M ol bi o/ Mol St udent s/ spri ng2000/ l am a r/ nucl eos o
m e.gi f )

Fig. 67 Componentele ultrastructurale ale nucleolului (după Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh.,
Popescu, L., M.; Biologie Celulară. Bucureşti: Editura Didactică şi Pedagogică, 1983)

Fig. 68 Ciclul celular [online]

Disponibil pe internet: (http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel1.gif)

Fig.69 Mitoza: [online]

Disponibil pe internet: (http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel3.gif)

Fig. 70 Meioza Diviziunea reducţională: [online]

Disponibil pe internet:
(http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel3.gif)

Fig. 71 Meioza. Diviziunea ecuaţională: [online]

Disponibil pe internet: (http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel3.gif)

Fig. 72 Diferenţierea celulară (după Diculescu, I. şi colaboratorii; Biologie celulară Ghid

pentru lucrări practice şi demonstraţii. Bucureşti: Litografia IMF, Facultatea de Medicină
Generală, 1980)

163
 BIBLIOGRAFIE

1. Alberts, B.; Bray, D.; Lewis. J.; Raff. M.; Roberts. K.; Watson, J.D.; Molecular biology of the cell. New
York-London: Garland Publishing Inc, 1989.
2. Alberts et al. Molecular Biology of the Cell Third Edition. New York-London: Garland Publishing, 1994.
3. Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis. J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P.; Molecular Biology of the Cell, 4th
ed. New York: Garland Science, 2002.
4. Alberts, Bruce; Alexander, Johnson; Julian, Lewis; Martin, Raff; Keith, Roberts; Peter, Walter;
Molecular Biology of the Cell,5-th ed. New York: Ed. Garland Science, 2008.
5. Benga, Gh.Biologie celulară şi moleculară. Cluj Napoca: Editura Dacia, 1985.
6. Bray, D.; Cell Movements. New York: Ed Garland Science, 2001.
7. Sluder, G., and D. Wolf, eds., Methods in Cell Biology. New York: Ed. Academic Press, 1998.
8. Celis J., Danish, Cancer Society; Institute of Cancer Biology and Danish Centre for Human Genome R,
Cell Biology 3-th. New York: Ed.Academic Press, 2006.
9. Cotrutz, C.; Cotrutz, Carmen, Kocsis, Maria, Ionescu, C., R.; Manual de lucrări practice de biologie
celulară. Chişinău: Editura Tehnică, 1994.
10.Diculescu, I. şi colaboratorii; Biologie celulară Ghid pentru lucrări practice şi demonstraţii.
Bucureşti: Litografia IMF, Facultatea de Medicină Generală, 1980.
11. Diculescu, I. şi colaboratorii, Biologie celulară. Bucureşti: Litografia IMF Facultatea de
Medicină Generală, 1981.
12. Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Benga, Gh., Popescu, L., M.; Biologie Celulară. Bucureşti:
Editura Didactică şi Pedagogică, 1983.
13. Diculescu, I.; Onicescu, Doina; Histologie medicală volumul I. Bucureşti: Editura Medicală,
1987.
14. Fawcett D. W.; A Textbook of Histology, 12th edition. Chapman and Hall, 1994.
15. Lackie, John, M.; The Dictionary of Cell & Molecular Biology 4-th ed. New York: Ed.
Academic Press, 2007.

16. Leland, J., Cseke. The University of Alabama, Huntsville, USA. Handbook of Molecular and
Cellular Methods in Biology and Medicine 2-th ed. Florida: CRC PRESS, 2003.

164
17.Lewis, Julian. Raff, Martin. Keith, Roberts. Alexander, Johnson. Peter, Walter. Bruce, Alberts.
Molecular Biology of the Cell 5-th ed. New York: Ed. Garland Science, 2008.
18. Pei-Show, Juo. State University of New York, Potsdam; New York, USA, Concise Dictionary
of Biomedicine and Molecular Biology. Florida:Ed. CRC PRESS, 2002.

19. Scott, F. Gilbert and Susan. R. Singer. Developmental Biology 8-th ed. Massachuestts: Ed.Sinauer &
Associates, 2006.
20. Ştefănescu, Dragoş, T.; Călin, A., George; Ştefănescu, C., Fulvia; Genetica Medicală Progrese
recente. Bucureşti: Editura Tehnică, 1998.
21. Voiculescu, Constantin. Citometria de flux în medicina clinică şi experimentală. Bucureşti:
Editura Academiei Române, 1996.
22. Walker, John, M. Rapley, Ralph. Molecular Biomethods Handbook 2-th ed. Berlin-New York:
Ed. Springer Verlag, , 2008.
www.aas-tech.ro/microscoape/produse/22
http://cellbio.utmb.edu/cellbio/membrane_intro.htm#Architec
http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus.htm
http://cellbio.utmb.edu/CELLBIO/nucpore1.jpg
http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel3.gif
http://old.ournet.md/~biochim/ghid/divcel/divcel1.gif
http://sspatel.googlepages.com/nuclearporecomplex2
http://www.answers.com/topic/nuclear-pore
http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring2000/lamar/nucleosome.gif
http://www2.uakron.edu/cpspe/images/micro_sem.jpg
http://www2.uakron.edu/cpspe/images/micro_tem.jpg
http://www.fairfield.k12.ct.us/tomlinson/ctomlinson03/CellProject04/Per7/7HP/cell_membrane.gif
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/mitochondria.jpg
http://www.micros.at/Englisch/microtom.html
http://www.weizmann.ac.il/chemphys/gov/images/membrane.jpg

165
166
167