Analiza instrumentala

Curs 13 Semestru II
 Analiza microscopică

• Reprezintă o metodă optică de analiză structurală şi de micrografiere a

suprafeţei. Fenomenul de compunere a imaginii microsctructurii
examinate în ocularul unui microscop sau pe fotoelementul CCD al unei
camere de luat vederi este un fenomen complex, înglobând reflexii,
refacţii şi absorbţii de lumină.
• Din punct de vedere principal şi construvtiv un microscop optic este un
ansamblu optomecanic ce are ca scop obţinerea unui ordin de mărire cât
mai ridicat în condiţiile unei rezoluţii (putere de separare) şi a unei
adâncimi de pătrundere cât mai bune. Partea optică a microscopului este
formată dintr-un grup de lentile grupate în două elemente optic
principale: obiectivul (partea optică dinspre obiectul examinat) şi ocularul
(partea optică dinspre ochiul omenesc) şi un sistem de iluminare.
• Rezolutia este definita ca distanta minima dintre doua puncte
care pot fi distinse. Aceasta nu este echivalenta cu obiectul cel
mai mic care poate fi decelat, care poate fi mai mic decat
limita de rezolutie. Chiar daca microscopul ar fi dotat cu
lentile ideale, tot ar fi limitat de efectul de difractie a luminii,
care are loc pe apertura obiectivului si duce la aparitia unor
serii de discuri luminoase (discuri Airy - Fig.1.1a). Limita de
rezolutie este suficient de bine stabilita de criteriul Rayleigh:
doua puncte pot fi distinse cand maximul central al discului
Airy al primului coincide cu primul minim al celui de-al doilea
(Fig.1.1b).
• Lumina provenită de la sistemul de iluminare
este focalizată spre obiectul examinat de unde
prin transmisie sau reflexie ajunge la ochiul
omenesc cu informaţii optice despre structură
sau micrografia examinată.
• Microscoapele optice se împart în două categorii mari:

• Microscoapele cu transparenţa, sunt folosite în special pentru examinarea

luminii transmise prin probă. Se folosesc în biologie, hematologie precum
şi pentru examinarea altor structuri transparente. La ora actuală aceste
microscoape cunosc o varietate constructivă foarte mare. Plecând de la
microscoape simple cu un singur obiectiv şi iluminare naturală s-a ajuns la
ora actuală la microscoape cu cap revolver pe care se găsesc dispuse mai
multe obiective, prevăzute cu sisteme bioculare sau chiar trioculare care
permit, pe lângă vizualizarea, preluarea imaginii direct cu o cameră de luat
vederi.
• Microscoapele cu reflexie, bazate pe
examinarea luminii reflectate sunt folosite în
special pentru examinarea structurii opace
(metale, nemetale, alte materiale masive). Alte
microscoape cu transparenţă cât şi cele cu
reflexie au ca elemente constructive şi
funcţionale o sursă de lumină, un sistem de
susţinere a probei şi un sistem optic în
componenţa căruia întră un obiectiv optic, unul
sau mai multe oculare, diverse prisme şi oglinzi.
• Ordinul de mărire al unui microscop se calculează ca produs între ordinul
de mărire al obiectivului şi cel al ocularului. Pentru a obţine diferite ordine
de mărime atât ocularele cât şi obiectivele se pot schimba cu altele având
măriri diferite.

• Unele microscoape dispun de sisteme rotative speciale, denumite şi cap

revolver, pe care se găsesc montate obiective cu diferite ordine de mărire.
În felul acesta schimbarea obiectivelor în scopul obţinerii de diverse măriri
se face mult mai uşor rotind doar capul revolver până când în dreptul
traseului optic se găseşte obiectivul dorit. Din punct de vedere constructiv
s-ar putea realiza microscoape optice cu ordine de mărire de 10.000 şi
chiar mai mult.
• Avantaje are ca principal avantaj faptul ca imaginea obiectului investigat
este vazuta ca atare, fara sa fie nevoie de prelucrari sau pro cesari
secundare. Un alt asp ect imp ortant consta in faptul ca este o tehnica ne-
invaziva. Nu mai putin important este si faptul ca este cel mai vechi tip de
microscopie, a jungand la un stagiu de tehnologie matura si avand costuri
relativ scazute fata de celelalte metode.
• Dezavantaje: poate investiga numai obiecte care reflecta sufcient de bine
in sp ectrul vizibil, sau care au un indice de refractie suficient de ridicat.
Este de asemenea limitata, din cauza difractiei, la detalii de aproximativ
200 nm (in cazul folosirii radiatiei ultraviolete) si implicit o marire maxima
de 1000x (adica un detaliu de 200 nm va aparea ca avand 200 um {ochiul
distinge detalii de pana la 100 um}, iar orice marire ulterioara nu aduce
nici un avantaj, deoarece doar va mari detaliile fara sa creasca rezolutia
 Microscopia electronică

• Oportunitatea dezvoltării unor microscoape

electronice se na;teîn 1924, odată cu emiterea,
de către fizicianului francez Louis de Broglie
(1892–1987), a teoriei că „orice particulă în
mişcare are o undă asociată”. Astfel se pun
bazele unui nou domeniu al fi zicii: mecania
undelor. Datorită lungimi de undă mai scurte a
electronilor, microscopul electronic furnizează o
rezoluţie mult mai bună decât cele optice sau
fotonice (L. de Broglie, 1929).
• Avantaje: avantajul cel mai important este magnificarea mult
crescuta fata de microscoap ele optice, de la 300.000 pana la
2.000.000 de ori (Hitachi S-5500), si nu in cele din urma mo
durile multiple de investigare de p e urma carora se poate
obtine o gama vasta de informatii.
• Dezavantaje: costul ridicat al aparaturii, sensibilitatea ridicata
la diversi factori externi (campuri electromagnetice, vibratii) si
faptul ca unele prob e (de exemplu tesuturile vii) trebuiesc
preparare in prealabil sau au nevoie de conditii sp eciale in
timpul examinarii la microscop si, in unele cazuri, chiar nu pot
fi studiate eficient cu a jutorul unui microscop cu electroni.
• Microscopia de electroni se îmapte în două
categorii: microscopie de transmie şi
microscopie de baleiaj
 Microscopia electronică de
transmisie
• Este o microscopie în care fascicului de electroni este
transmis prin proba de analizat (trece prin probă).
Dat fiind faptul că electronii sunt puternic absorbiţi
datorită masei mici şi încărcării electrice este necesar
ca probele să fie extrem de subţiri, grosimea acestora
depinzând de numărul de ordine a substanţei de
analizat şi de ternsiunea de accelerare. Printre
tehnicile de obţinere pentru asemenea probe se
numără depunerea în vacuum, dizolvarea chimică,
dizolvarea electrochimică, şlefuirea mecanică.
Microscopia electronică de baleiaj

• Este folosită tot mai des pentru analize

microscopice a suprafeţei diferitelor materiale.
Marele avantaj pe lângă puterea de mărire
ridicată este adâncimea de pătrundere ridicată
ceea ce permite folosirea în refractometrie la
examinarea suprafeţelor corodate sau
erodate.
• https://
www.youtube.com/watch?v=uQ1gCIkCbIQ
• Accelerarea electronilor are loc într-un tun electronic format dintr-un
catod (1), o grilă de comandă (2) un anod (3), lentile condensatoare
electromagnetice (4) şi lentile de focalizare electromagnetice (5). În tunul
electronic vidat se găseşte proba de analizat (6) şi detectorul optic
(fotomultiplicatorul) (7). Ca unităţi de deservire respectiv de prelucrare a
datelor mai sunt folosite: sursă de alimentare cu joasă şi înaltă tensiune
(8), sursă de alimentare a lentilelor electromagnetice (9), unitate de
baliere (10), unitate de mărire (11), amplificatorul (12) şi unitatea de
procesare şi afişare (13). Principal, fasciculul de electroni de înaltă
tensiune (energie), bombardează proba (6) producând emisia de electroni
secundari (purtători de informaţie optică despre structură şi
microtopografie), precum şi radiaţii X purtătoare de informaţii despre
compoziţia şi concentraţia substanţei. Prin forlosirea unui senzor şi a unui
lanţ de procesare adecvat prin microsconde se poate realiaza şi
microscopie optică şi spectroscopie cu raze X.
 Microscopie fluorescentă
• Microscopia de fluorescență este o ramura a microscopiei care studiază
fluorescența compușilor organici și anorganici concomitent cu absorbția și reflexia.
• De obicei cercetarea respectivei proprietăți are loc în prezența unei molecule
numite fluorofor : proteina verde fluorescentă, fluoresceină .Proba de analizat este
supusă unei lumini cu o anumită lungime de undă.Radiația luminoasă este
absorbită de către fluoroflor, care mai apoi va emite o altă radiație luminoasă cu o
altă lungime de undă (de aici și o altă culoare a luminii emise, culoare diferită față
de cea primită).Un microscop folosit în acest scop este format din: sursă de lumină
–de regula o lampă cu xenon sau lampă cu vapori de mercur-, oglindă dicroică , un
filtru de excitație și u filtru de emisie.Microscopia de fluorescență este utilizată mai
ales în biologie, ea fiind etalonul pentru alte tipuri de microscopie: microscopia cu
laser confocal și TIRF (total internal reflection fluorescence microscope). Fluroflorul
își poate pierde capacitatea de a emite fluorescența printr-un fenomen numit
photobleaching, fenomen care poate fi redus fie prin utilizarea unor fluoroflori mai
puternic sau prin reducerea intensității luminii .
 Microscopia epifluorescentă

• Este o metodă de analiză a microscopiei fluorescente în care lumina de

excitație este emisă de deasupra (spre deosebire de microscopia inversă în
care ea este emisă de dedesupt), prin obiectiv apoi spre specimen (proba
de analizat).
• Fluoroflorul prezent în probă va emite o lumină cu o anumită lungime de
undă, captată apoi de detector prin același obiectiv prin care s-a emis
lumina de excitație.Filtrul dintre obiectiv și detector separă lumina de
excitație de fluorescență. Cum lumina de excitație ajunge aproape în
totalitate la suprafața specimenului, numai lumina reflectată și lumina
emisă ajung la obiectiv, iar acest fapt conferă metodei obținerea unui
semnal îmbunătățit în comparație cu interferențele care apar.
https://www.youtube.com/watch?v=PCJ13LjncMc
 Microscopia confocală
• Tehnica de microscopie confocala bazată pe baleierea fasciculului laser permite vizualizarea în
profunzime a specimenelor vii sau fixate (celule, tesuturi), iar observaţia tridimensională precisă
este rezultatul colectarii seriale de secţiuni optice din grosimea probelor, pe baza carora este
generata imaginea digitala.
• Fata de microscopia convenţională de câmp optic larg microscopia confocală oferă o serie de
avantaje, inclusiv abilitatea de control asupra adâncimii câmpului, reducerea/eliminarea informaţiei
de fundal din planul focal (informaţie ce duce la degradarea imaginii), şi capacitatea de colectare de
secţiuni optice seriale din grosimea probelor.
• Un avantaj suplimentar al microscopiei confocale include posibilitatea ajustării electronice a măririi
(zoom) prin varierea ariei scanate de laser fără a schimba obiectivul, facilitate cunoscută ca factor
de zoom; cresterea factorului de zoom reduce aria baleiată a probei simultan cu rata de baleiaj, iar
rezultatul este un număr mai mare de eşantioane pe o lungime comparabilă, ceea ce mareste
rezoluţia spaţială a imaginii.
• Microscoapele confocale reprezinta sisteme electronice de imagistica complet integrate în care
microscopul optic joacă un rol central într-o configuraţie care conţine multiple surse de excitare
laser, combinate cu dispozitive de selecţie a lungimii de undă, detectori electronici (uzual
fotomultiplicatori), un ansamblu de baleiere a luminii laser şi un computer performant al
caruisoftware permite crearea de reprezentari 3D a specimenului investigat.
https://www.youtube.com/watch?v=QFtZFbug1SA
Aplicaţii ale microscopiei confocale
la produsele alimentare
• Microscopia confocală facilitează examinarea
microstructurilor și a mai multor specimene
alimentare 3D, cum ar fi brânza, la diferite
planuri focale, cu o pregătire de probă de la
minim la puțin. Prin ajustarea stadiului
microscopului, informațiile din mai multe
secțiuni optice consecutive ale specimenului
pot fi obținute cu o rezoluție laterală
excepțională. Unele dintre aplicațiile comune
ale microscopiei în analiza alimentelor includ:
1. Descrierea grăsimilor
Secțiunile optice ale alimentelor bogate în grăsimi sunt dificil de
preparat folosind tehnici de microscopie ușoară, deoarece
prepararea probei ar duce la migrarea globulelor de grăsime.
De exemplu, grăsimea din lapte, care este unul dintre cele
mai frecvente ingrediente din multe produse alimentare, are
aproximativ 400 de acizi grași diferiți. Acizii grași prezenți în
grăsimea din lapte au intervale largi de cristalizare și topire.
Cercetătorii au folosit microscopia confocală pentru a studia
distribuția microstructurilor și proprietățile reologice ale
diferitelor fracțiuni de grăsime din lapte. Prin utilizarea
acestei tehnici poate fi studiat comportamentul grăsimilor în
diferite condiții, cum ar fi schimbările de temperatură și
agitația.
• Efectul ratei de răcire asupra dimensiunii cristalului pentru
grăsimea din lapte după 90 de minute la 35 ° C și 24 de ore la
10 ° C / min. A) răcire lentă (0,1 ° C / min) și B) răcire rapidă
(5,5 ° C / min).
2. Studierea amestecurilor de biopolimeri
Proteinele și carbohidrații, precum polizaharidele, coexistă în majoritatea
probelor alimentare. Tehnologiile de prelucrare, cum ar fi prelucrarea la
presiune înaltă, sunt utilizate pentru a ambala astfel de materiale
alimentare din biopolimeri într-un mod de a-și prelungi durata de
valabilitate fără a le epuiza proprietățile nutritive. Microscopia confocală
poate fi, prin urmare, utilizat pentru a vizualiza comportamentul
amestecurilor de biopolimeri utilizate în mod obișnuit, cum ar fi un
amestec de lapte-gelatină degresat, prin examinarea modificărilor
microstructurilor prezente în eșantionul alimentar atunci când sunt supuse
diferitelor condiții reologice, cum ar fi modificările vâscozității în raport cu
modificările de presiune și viteza de forfecare.
3. Analiza emulsiilor
Emulsiile sunt sisteme bifazice în care faza dispersată este
distribuită în mediul de dispersie. De exemplu, într-o
emulsie ulei în apă, picăturile mici de ulei, care ar fi faza
dispersată, sunt de obicei acoperite cu un emulgator și
sunt dispersate în apă, care este considerată a fi mediul
de dispersie. Compoziția acestor sisteme bifazice și
microstructurile pot fi vizualizate și caracterizate prin
utilizarea fluoroforilor specifici pentru proteine ​și lipide
folosind microscopia confocală.
• Imagini confocale ale emulsiilor obţinute cu 10% ulei de
pește, 4,5% cazeinat de sodiu și diferite concentrații de
trehaloză: A) 0, B) 20, C) 30 și D) 40%
Cum functioneaza microscopia
confocala de reflectanta?
• Arhitectura microscopului confocal de reflectanta este
ilustrata in figura alaturata. O dioda LASER produce un
fascicul luminos coerent monocromatic. Lumina trece
printr-un splitter, apoi este focalizata printr-un obiectiv
optic si apoi prin fereastra de examinare ce se afla in
contact cu pielea. Fasciculul luminos penetreaza pielea
si ilumineaza un punct la nivelul ei. Lumina se reflecta
din acel punct inapoi prin obiectivul optic si este
focalizata printr-o apertura punctiforma determinand o
imagine pe un senzor. Apertura punctiforma permite
doar luminii provenite din acel punct sa atinga senzorul.
Sursa de iluminare, punctul de la nivelul pielii si
apertura punctiforma se afla in planuri focale
conjugate, de unde denumirea de confocal. E ca si cum
am face o fotografie alb-negru a pielii dumneavoastra,
in profunzimea ei.
• Asadar, tehica de biopsie virtuala se bazeaza pe
reflectanta luminii de catre anumite structuri endogene
cum ar fi melanina, keratina, colagenul, hemoglobina si
anumite organite celulare. Fenomenul de reflectanta se
produce la granita dintre doua structuri cu indici de
refractie diferiti.