BIOSENZORI

Exempe constructiuve de senzori optici de fluorescenţă

Biosenzor de luminiscenţă

Senzorul de bioluminiscenţă este destinat convertirii valorii luminiscenţei unei specii

biologice din proba analizată într-o tensiune electrică proportională cu această valoare în scopul
determinări, identificării şi dozării rapide a acestei specii .
Chemoluminiscenţa alături de fluorescenţă şi de fosforescenţă stă la baza unor metode
fotometrice moderne de analiză instrumentală. Anumite specii biologice prezintă proprietatea de
emisie fotonică pe lungimi de undă specifice în domeniul vizibil atunci cînd participă la reacţii
chimice. Lungimea de undă a radiaţiei emise este specifică naturii speciei participante la reacţie
şi stă la baza analizei calitative, iar intensitatea emisiei de bioluminiscenţă (BL) stă la baza
analizei cantitative. Intensitatea radiaţiei (BL) a unei speciei biologice este proporţională cu
concentraţia (c) a acesteia :

CB = K. c (1)

Valoarea factorului de proporţionalitate (K) depinde de natura speciei şi reprezintă

totodată sensibilitatea metodei pentru acea specie.

Exemple de bioluminiscenţe cunoscute sînt:

- bioluminiscenţa folosită la identificarea petelor de sînge în criminalistică

H 2 O2  OH  Microperox
   Aminoftala t  N 2  3H 2 O  hν
idază
(2)
- bioluminiscenţa licuriciului (Ponthius Pyralis)
2
E  LH 2  ATP  E  AMP  PPi
Mg
(3)
E  AMP  O2  oxiluciferină  AMP  CO2  hν (560m)

Aceasta reacţie stă la baza a numeroase chituri comerciale de luciferin-luciferază

folosite in cercetarea biologică, medicală şi farmacologică
- bioluminiscenţa bacterială folosită pentru determinarea NAD (P)H cu
flavinmononucleotid (FMN)

NAD(P)H  FMN FMN

reductaza
 NAD(P)  FMNH 2
(4)
FMNH 2  RCHO  O2  FMN  RCOOH  H 2 O  hν (490nm)

Reacţiile sint doar exemple reprezentative, la ora actuală există o adevărată competiţie privind
dezvoltarea de noi aplicaţii pentru bioluminiscenţă, iar în această competiţie dezvoltarea de noi

1
senzori competitivi este de importanţă capitală. Tot în acest context se înscriu şi cercetări
astronomice privind identificarea bioluminiscenţei de pe alte planete ca o expresie a existenţei
vietii pe aceste corpuri cereşti. In acest sens sînt folosiţi senzori de înaltă performanţă ce au limite
de detecţie a speciei luminiscente la nivelul de 10-12.
Biosenzorul de bioluminiscenţă descris este de dimensiuni reduse, compact şi autonom
destinat identificării şi determinării concentraţiei unor specii biologice care pot da reacţii
luminiscente. Materia analizată poate să se prezinte sub formă solidă, lichidă, pulverulentă sau
sub formă lichidă îmbibată în suporturi lamelare poroase. In acest scop măsurarea radiaţiei difuze
de luminiscenţă se realizează folosindu-se un pachet opto-electronic format dintr-o lentilă
colectoare, un filtru de interferenţă şi un detector de mare sensibilitate de tip CCD, întreaga
structură fiind montată intr-un tub metalic cilindric de mici dimensiuni ce are în partea superioară
electronica de interfaţare de tip USB . Avantajele obţinute prin folosirea biosenzorului sînt
următoarele :
- senzorul are o construcţie simplă şi un preţ redus
- se obţine un senzor de bioluminiscenţă miniatural compact destinat identificării şi
măsurării concentraţiei diferitelor specii biologice conectându-se direct la un laptop
- senzorul de bioluminiscentă reprezintă un mijloc util în criminalistică pentru identificarea
şi cuantificarea urmelor de sînge invizibile cu ochiul liber folosindu-se reacţia de
bioluminiscenţă a sîngelui cu luminol.
- senzorul de bioluminiscentă permite construirea de chit-uri ieftine specializate pe o
anumită specie biologică cum ar fi de exemplu celule canceroase din plasma sanguină
pentru identificare şi dozare fiind necesară o singură picătură de sînge cu care se imbibă o
lamelă poroasă. In această execuţie senzorul are microprocesor propriu cu soft
inscripţionat şi sistem de afişare digital al rezultatelor.

Biosenzorul de lumibniscență, figura 1, are o structură compactă formată dintr-un

corp cilindric cav 1 ce conţine o lentilă colectoare 2, un filtru de interferenţă 3, şi un
detector CCD de mare sensibilitate 4, în partea superioară a structurii se găseşte un capac
5 ce conţine electronica de interfaţare whirless 6 cu un laptop, iar la partea inferioară un
capac 9

2
 Fig.1. secţiune prin senzorul de bioluminiscenţă. 1-corp cilindric cav, 2-lentilă colectoare, 3-filtru de
interferenţă, 4-detector CCD, 5-capac , 6-electronică de interfaţare, 7, 8,9-capace interschimbabile, 10-folie
poroasă , 11-probă de analizat

interschimbabil cu alte două capace 7,8 folosite la rîndul lor pentru adaptarea la condiţiile optime
de măsurare în funcţie de starea de agregare a probei. Reperul 10 reprezintă o folie poroasă
îmbibată cu proba de analizat 11 şi cu specia chimică ce provoacă luminiscenţă, ea este folosită
în cazul identificării cantităţii unui anumit component bioluminiscent din plasma sanguină.
Modul de lucru este simplu: se porneşte laptopul, se verifică prezenţa transmisiei whirless şi se
provoacă reacţia de chemoluminiscenţă prin amestecarea speciei biologice analizate cu specia
chimică ce dă emisie luminiscentă cu acea specie biologică după care se aduce cît mai repede
posibil proba analizată în dreptul senzorului şi se execută măsurătoarea. In funcţie de starea de
agregare a probei pentru determinări se foloseşte unul din cele trei capace speciale 6,7 sau 8, astfel
:
- pentru probe lichide sau pulverulente se foloseşte capacul cav 6, reacţia de
bioluminiscenţă provocîndu-se direct în cavitatea acestuia după care senzorul se
înşurubează cu grijă în capac şi se efectuează măsurarea
- pentru probe solide se înşurubează capacul 7 pe senzor, se provoacă reacţia de
biloluminiscenţă pe proba solidă prin adaugarea speciei chimice corespunzătoare şi se
aşează senzorul pe probă în aşa fel încît fereastra capacului 7 să fie in dreptul zonei de
reacţie după care se efectuează masurarea
- pentru determinări din probe sanguine se înşurubează capacul 8 pe senzor, se provoacă
reacţia de bioluminiscenţă prin picurarea unei picături de sînge proaspăt pe banda
siliconică poroasă 10, de tip chit, pe care se găseşte impregnată specia chimică de
luminiscenţă, după care se introduce banda prin orificiul lateral al capacului 8 pînă la
atingerea peretelui opus şi se efectuează măsurarea

3
Sondă fluorometrică

Sondele fluorometrice portabilă de mici dimensiuni destinate determinării valorii

fluorescenţei unei specii chimice sau biologice şi convertirea acesteia în unităţi de concentraţie
prin intermediul unui soft specific fiind conectată la un laptop sînt deosebit de utile la analiza in
situ . Fluorescenţa, alături de fosforescenţă şi de chemoluminiscenţă, stă la baza unor metode
fotometrice moderne de analiză instrumentală. Anumite specii chimice sau biologice prezintă
proprietatea de reemisie fotonică luminoasă, pe anumite lungimi de undă specifice, atunci cînd
sînt iradiate tot cu energie luminoasă. Reemisia are loc totdeauna la lungimi de undă superioare
celor de iradiere şi poartă denumirea de fluorescenţă atunci cînd reemisia încetează imediat după
iradiere şi de fosforescenţă atunci cînd reemisia persistă un anumit timp după încetarea iradierii.
La o intensitate a radiaţiei incidente (P0) constantă, fluorescenţa (intensitatea fluorescenţei) (F)
a unei speciei chimice sau moleculare este proportională cu concentraţia(c) a acesteia :

F= K. c (5)

Factorul de proporţionalitate (K) depinde de natura speciei şi reprezintă totodată sensibilitatea

metodei pentru acea specie. Ramura analitică ce se ocupă de folosirea acestei dependenţe în
scopul determinării concentraţiei poartă denumirea de fluorometrie. Unul din principalele
avantaje ale fluorometriei este dat de faptul că intensitatea radiaţiei fluorescente este proporţională
cu intensitatea radiaţiei incidente ceea ce permite ca prin mărirea intensităţii primeia să se ajungă
la o mărire la extrem a sensibilităţii metodei ceea ce determină implicit coborîrea limitei de
detecţie a urmelor speciilor chimice sau moleculare fluorescente analizate cu unul pînă la trei
ordine de mărime faţă de metodele spectrometrice clasice de absorbţie sau de transmisie, limitele
de detecţie obişnuite pentru fluorometrie fiind situate în domeniul părţi per bilion, (1 ppb =
1:10-9) sau chiar părţi per trilion (1ppt = 1:10-12). Un alt mare avantaj al fluorometriei este acela
că domeniul de liniaritate al relaţiei de mai sus (condiţie obligatorie pentru o precizie de măsurare
ridicată) este mult mai mare decît cel al metodelor spectrofotometrice clasice de absorbţie sau
de transmisie. De asemenea, în fluorometrie pentru analiză sînt suficiente cantităţi extrem de mici
de soluţie de ordinul μl, iar la metodele fluorometrice şi selectivitatea este mai bună decît la cele
spectrofotometrice. Dezavantajul evident al fluorometriei este acela că se poate folosi numai
pentru determinarea concentraţiei speciilor ce prezintă fenomenul de fluorescenţă.
Pentru măsurarea intensităţii fluorescenţei (F) speciilor chimice lichide sau gazoase,
substanţa de analizat este iradiată cu o radiaţie luminoasă monocromatică in domeniul vizibil şi
măsurată cu un senzor situat la un unghi de 900 faţă de direcţia radiaţiei incidente şi a unei
electronici corespunzătoare, intensitatea radiaţie de fluorescenţă situată tot în domeniul vizibil dar
la o lungime de undă superioară celei a radiaţiei incidente. Determinarea concentraţiei (c) a unei
specii chimice sau biologice se face prin extrapolarea valorii fluorescenţei (F) măsurate pe
o curbă de etalonare realizată în coordonate: fluorescenţă (F) - concentraţie (c), curbă realizată
cu ajutorul unor concentraţii cunoscute pentru acea specie.
Problema tehnică pe care o rezolvă sonda descrisă constă în realizarea unui senzor de
fluorescenţă miniatural compact şi autonom destinat măsurării concentraţiei speciilor chimice

4
sau biologice fluorescente de natură solidă, pulverulentă sau lichidă (ultimele numai dacă sînt
absorbite pe materiale solide sau poroase de tip folie poroasă). In acest scop măsurarea radiaţiei
de fluorescentă se realizează la 900 faţă de direcţia radiaţiei incidente folosindu-se o sursă de
radiaţie monocromatică de tip LED sau diodă laser cu emisie în albastru şi pentru recepţie un
detector de tip CCD în faţa căruia se găseşte un filtru de interferentă, iar în faţa filtrului o lentilă
colectoare, întreaga structură fiind montată intr-un tub metalic cilindric de mici dimensiuni, atît
alimentarea LED-ului cît şi preluarea datelor se realizează printr-o interfaţa de tip USB plasată
în partea superioară a senzorului.
Folosirea sondei duce şla obţinerea următoarelor avantaje:
- se obţine un senzor de fluorescenţă miniatural compact şi cu preţ redus destinat măsurării
concentraţiei speciilor chimice sau moleculare fluorescente
- senzorul de fluorescenţă nu necesită sursă electrică de alimentare, LED-ul emiţător de consum
extrem de mic fiind alimentat prin interfaţa USB a unui calculator sau laptop, aceeaşi interfaţă
prin care se preiau şi datele de la senzor în vederea procesării acestora
- senzorul de fluorescenţă permite impreună cu o unitate de calcul externă şi un soft specializat
determinarea concentraţiei speciilor chimice sau moleculare fluorescente de natură solidă
pulverulentă şi lichidă pe teren fără a fi necesară o pregătire complexă a probelor.
- printr-un suport prins cu două şuruburi senzorul permite analiza de fluorescenţă a unor specii
chimice picurate pe benzi de hirtie sau pe folii siliconice poroase
- folosindu-se avantajele enumerate mai sus, senzorul de fluorescenţă permite construirea de
chit -uri miniaturale, ieftine şi specializate pe anumite specii chimice, inclusiv pe analiza
plasmei sanguine folosind în acest scop o singură picătură de sînge. Este evident că, în această
situaţie senzorul devine o unitate autonomă de analiză şi trebuie echipat cu microprocesor cu
display electronic şi cu soft inscripţionat precum şi cu sursă electrică de alimentare proprie.
In figura 2 este prezentată o secţiune prin sonda fluorometrică. Detectorul de fluorescenţă
se compune dintr-o specie chimică sau biologică fluorescentă 1 existentă în substanţe solide,
pulverulente sau în lichide îmbibate în materiale poroase sau pulberi, un corp 2 în care se găseşte
canalul de excitare compus dintr-un un LED 3, cu emisie în albastru şi un canal de măsurare a
fluorescenţei aşezat la un unghi de 900 faţă de canalul de excitare, format la rîndul lui dintr-o
lentilă optică colectoare 4, un filtru de interferenţă 5, un senzor CCD 6 de mare sensibilitate şi o
unitate de interfaţare 7 de tip USB. Pentru măsurări pe solide şi pulberi pe corpul detectorului
se prinde cu două şuruburi un corp de adaptare 8, iar pentru măsurări la lichide imbibate pe benzi
de hîrtie sau pe benzi poroase siliconice este folosit un corp special de adaptare 9, fixat cu aceleaşi
două suruburi ca şi corpul de adaptare 8

5
Fig. 2. secţiune prin sonda fluorometrică. 1-specie chimică sau biologică fluorescentă, 2-corp , 3-LED,
4-lentilă optică colectoare, 5-filtru de interferenţă, 6-senzor CCD 7-unitate de interfaţare, 8-corp de
adaptare, 9-corp de adaptare

Rezonanţa plasmonică de suprafaţă (SPR)

Principiul rezonanţei plasmonice.

La rezonanţa plasmonică de suprafaţă ( SPR) o radiaţie monocromatică polarizată cade pe o

suprafaţă subţire de aur sau argint depusă pe faţa unei prisme de sticlă de unde este reflectată.
Fotonii radiaţiei laser incidente interferă cu electronii liberi ai aurului sau argintului şi formează
o aşa numită structură plasmonică . Dacă între electronii liberi şi fotonii de iradiere se ajunge la
rezonanţă se extrage din radiaţia reflectată energia consumată la rezonanţă, unghiul de reflexie
nemaifiind egal cu unghiul de incidenţă , în spectrul de reflexie apărînd o pierdere energetică
care generează un anumit unghi de reflexie, ( mai mare decît unghiul de reflexie normal în
absenţa condiţiilor de rezonanţă) , a cărui valoare este proporţională cu valoarea pierderii de
energie. Frecvenţa de rezonanţa şi prin ea unghiul de reflexie sînt la rîndul lor proporţionale cu
gradul de încărcare masică a stratului metalic de aur sau argint realizat de anumite specii
biologice ce aderă specific pe faţa metalică exterioară opusă feţei interioare iradiată cu radiaţia
monocromatică. La ora actuală SPR constituie una din cele mai performante metode pentru
determinarea unor creşteri masice extrem de mici de ordinul 10-15 g ( femto grame). În acest scop
un receptor specific este imobilizat pe suprafaţa metalică exterioară de aur sau argint iar
interacţiunea dintre receptor şi un potenţial ligand ce constituie de fapt specia sau speciile
biologice urmărite, creşte proporţional gadul de încărcare masică a stratului de metal, încărcare
care este măsurată cu mare precizie prin măsurarea modificării unghiului de reflexie cu ajutorul
unui fotodetector montat pe un goniometru unghiular sau prin intermediul unui detector Diode –
Array. O modificare a condiţiilor dielectrice în imediata vecinătate a stratului de metal depus
pe prismă , prin apariţia unei specii chimice sau biologice noi , duc la schimbarea condiţiilor de
rezonanţă ceea ce are ca efect deplasarea peak-urilor din pozitia 1 în poziţia 2 , (figura3.) valoarea
deplasării peak-uri fiind proporţională cu concentraţia masică a speciilor respective. Moleculede
precum : peptide, proteine, acizi nucleici , figura 4, pot fi imobilizate pe suprafaţa unor cipuri
senzoriale, care aduse in contact cu

6
Fig.3. Schema de principiu a măsurării variaţiilor mici de masă sau de grosime de strat prin fenomenul
de plasmonrezonanţă

specii chimice sau biologice ce urmeaza a fi determinate , reactioneză cu acestea rezultînd

produse de reacţie ce provoacă modificări masice pe suprafaţa acestor cipuri , modificari care sînt
sesizate prin fenomenul de rezonantă plasmonică care se materializează în modifiări ale unghiului
de refracţie ale unei radiaţii monocromatice incidente in funcţie de natura speciei şi in modificari
ale intensităţii radiaţiei refractate în funcţie de concentraţia speciei . Semnalele electrice ale unui
detector de tip Diode Array sînt transformate ulterior prin procesarea semnalelor în informaţii
analitice de natură calitativă şi cantitativa despre speciile biologice urmărite. Aplicaţia poate fi
extinsa şi la celule de curgere cu ajutorul cărora se poat determina cinetica diferitelor aplicaţii
biochimice. Expresiile grafice se prezintă sub forma unor reprezentări in coordonate: Intensitatea
Radiaţie reflectată (RI) in funcţie de ungiul de refracţie (teta) . Un dezavanta al tehnicii SPR îl
reprezintă faptul că nivelul rezonanţei plasmonice este dependent de temperatură ceea ce
necesită o termostatare avansată a sistemelor de analiză.
Biosenzorii SPR sint folositi în bioanalitică în special ca senzori de afinitate in analiza
de interacţiune biomoleculară fără markeri (BIA) , pe suprafaţa stratului metalic pot fi
imobilizati parteneri de legare foarte diferiţi . In cazul clasic acesta este un anticorp orientat
spre o anumită proteină. Cu ajutorul anticorpilor pot fi legate însă şi celule intregi. In
figura4. este reprezentată schematic posibilitatea legarii pe un film de aur de diferite tipuri de
receptori .

7
Fig. 4. Suprafaţa aurită a prismei pe care s-au fixat diferite tipuri de receptori: a- receptor, b- anticorp
pentru proteina, c- anticorp pentru structură celulară, d-hidrat de carbon ce leagă lectine, e - receptor ce
interacţionează ţintit cu structuri proteinergene

Tehnice de valorificare a efectului rezonanţei plasmonice de rezonanţă

In figura sint prezentate tehnici actuale de valorificare a efectului rezonanţei

plasmonice de suprafaţă . in figura 5a este prezentată schema de principiu a

Fig. 5. Diferite modalităţi de valorificare a fenomenului rezonanţei plasmonice de suprafaţă. a- clasic cu

prismă cu film de aur, b- sondă cu fibră optică cu depunere exterioară de film de aur , c-nanoparticule
de aur analiyate optoelectronic

8
montajului devenit clasic cu folosirea unei prismei aurite pe o faţă . Una din tendinţele actuale
în biosenzorică este obţinerea de sisteme de măsurare miniaturale care pe cît posibil să poată
determina minimalinvaziv diversi parametrii direct în organismul viu . Această tendinţă are şanse
reale în cadrul SPR. In acest sens la tehnica SPR este avantajos faptul că fenomenul SPR apare
şi atunci cînd pe o fibră optică prin care trece lumină este depus pe o porţiune laterală un strat
subţire de aur pe care este depus un strat subţire din substanţa biologic activă. O asemenea sondă
, figura 5b, poate fi scufundată direct într-un recipient de lichid în vederea efectuarii de măsurători
dar poate fi introdusă şi într-un ţesut viu datorită diametrului fibrei optice a cărui valoare se
situează în domeniul µm. are şi un Dezavantajul aceastei tehnici constă în imposibilitatea
realizării termostatării ceea ce duce la anumite probleme la interpretarea rezultatelor , efectul
rezonanţei lasmonice de suprafaţă fiind puternic dependent de temperatură.
Pasul următor în miniaturizare îl constituie « nano SPR » unde aurul nu este imbilizat pe
o suprafaţa de sticlă ci introdus sub formă de nanoparticule în soluţia de cercetat , figura 5c,
suprafaţa acestor nanoparticule este acoperită ca în cazul clasic cu structura de legare. Dacă pe
suprafaţa acestor nanoparticule se ajunge la reacţii apar efecte ale fenomenului SPR măsurabile
prin tehnică microscopică sau prin tehnica fibrelor optice care deschid noi posibilităţi de
investigare cum ar fi de exemplu în depistarea şi investigarea tumorilor. Este posibilă injectarea
de asemenea nanoparticule în tumoare urmată de investigarea efectului SPR prin fibră optică
introdusă în ţesut. După rezultatul analizei , rezultat care este instantaneu, prin aceaşi fibră optică
poate fi introdusă energie laser în ţesut în vederea distrugerii acestuia rezultînd concepte de
terapie noi şi deosebit de performante.

Exemple constructive de biosenzori bazaţi pe fenomenul rezonantei

plasmonice de suprafată

Biosenzor pentru determinarea continuă a variaţiei de masă sau a

grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă

Asa cum s-a arătat în scopul determinarii grosimii filmelor în zona activă a biosenzorilor
sînt folosite aparate şi echipamente bazate pe rezonanţa plasmonică de suprafaţă (SPR) ce
permite măsurarea unor variaţii de masă extrem de mici sau a unor grosimi de strat în domeniul
nm. Tehnica folosirii rezonanţei plasmonice de suprafaţă (SPR) pentru determinarea de creşteri
de masă şi de grosimi de strat este relativ simplă şi constă în transmiterea unei radiaţie
monocromatice, emisă de o diodă laser sau de un LED, perpendicular pe latura unei prisme
echilaterale de sticlă , latură care este acoperită cu un strat foarte subţire de metal ( zeci de nm),
de regulă aur sau argint, efectul iradierii metalului depus pe prismă are urmări asupra structurii
electronice a acestuia el răspunzînd iradierii printr-un aşa numit cimp evanescent care duce pe
de-o parte la modificarea valorii unghiului şi intensităţii reflecţiei specifice metalului depus .
De asemenea orice modificare a condiţiilor dielectrice în imediata vecinătate exterioară a
stratului de metal depus pe prismă , prin apariţia unei specii chimice sau biologice noi , duc la
schimbarea condiţiilor de rezonanţă prin deplasarea peak-urilor ce reflectă absorbşia de energie
fotonică, deplasarea acestor peak-uri fiind proporţională cu cresterea de masă ( de grosime de
strat) pe suprafaţa exterioară a stratului metalic. Rezonanta plasmonică de suprafaţă are utilizări
importante în bioanalitică în special ca senzori de afinitate in analiza de interacţiune
biomoleculară fără markeri (BIA) , pe suprafaţa stratului metalic pot fi imobilizati parteneri de

9
legare foarte diferiţi . In cazul clasic acesta este un anticorp orientat spre o anumită proteină pe
care o leagă rezultînd produse ce provoacă creşteri masice pe suprafaţa metalizată a prismei ,
modificari care sînt sesizate prin fenomenul de rezonantă plasmonică care se materializează în
modificări ale unghiului de refracţie ale unei radiaţii monocromatice incidente în funcţie de masa
speciei ce s-a depus pe suprafaţa exterioară a metalului de pe prismă. Aplicaţia rezonanţei
plasmonice de suprafaţă poate fi extinsa şi la celule de curgere cu ajutorul putîndu-se urmări
cinetica diferitelor aplicaţii biochimice. In cazul unor măsurări unice expresiile grafice se
prezintă sub forma unor reprezentări în coordonate: unităţi ale intensităţii radiaţiei reflectată (URI)
in funcţie de ungiul de refracţie (  ) (fig.6), iar în cazuil unor fenomene dinamice, măsurate prin
intermediul unor celule de curgere , expresiile grafice se prezintă sub forma unor reprezentări în
coordonate : unităţi ale intensităţii radiaţiei reflectată (URI) în funcţie de timpul (t) (fig.7).
Dezavantajul pe care-l prezintă acest procedeu este faptul că activarea suprafeţei prismei cu un
ligand specific este greoaie, operaţia necesită de regulă demontarea urmată de timpi de uscare
care duc la scăderea productivităţii procesului. De asemenea metalizarea suprafeţei prismei ,
după un anumit număr de utilizări , prin depunere de aur în vacuum este scumpă şi greoaie.
Problema tehnică pe care o rezolvă biosenzorii descrişi constă în realizarea unui
echipament care permite pe baza măsurării rezonanţei plasmonice de suprafaţă (SPR)
determinarea rapida şi precisă a cresterii grosimii de strat la măsurări succesive independente
folosind lamele aurite interschimbabile sau care permite determinarea continuă a grosimii de strat
atunci cînd pe el este montată o celulă de curgere. În scopul materializării acestor echipamente
este folosită o structură modificată a aparatului clasic de rezonanţă plasmonică de suprafaţă,
astfel :
- În loc ca aurirea să fie realizată pe o faţă a unei prisme optice aceasta se realizează pe
una din feţele plan paralele a mai multor lamele din sticlă optică lamele ce au suprafaţa aurită
egală cu cea a unei laturi a prismei. În funcţie de situaţiile analitice concrete partea aurită a
lamelelor se tratează cu acelaşi sau cu mai mulţi liganzi biologici specifici după care sînt fixate
pe rînd pe prisma de măsurare folisindu-se pentru cuplarea optică un ulei cu indice de refracţie
mare.
- în locul unui goniometru electronic de mare precizie echipat cu detector optic singular,
specific aparatelor clasice, ce are ca sarcină căutarea unghiului de refracţie obţinut ca urmare a
modificării rezonanţei plasmonice, este folosit un detector optoelectronic de tip diode - array care
determină indicele de refracţie instantaneu , fără cautare unghiulară, cu o rezoluţie foarte mare.
Din montajul experimental pentru măsurători succesive şi independente fac parte o sursă
de radiaţie monocromatică de tip diodă laser sau LED prevăzut cu un sistem de rotaţie fără divizare
unghiulară, un detector optic de tip diode - array şi o unitate de calcul cu un program de achiziţie
şi prelucrarea datelor, iar la măsurători continue în by - pass mai este folosită suplimentar o pompă
peristaltică, o celulă de curgere şi furtune siliconice transparente cu diametru interior mic.
Folosirea acestor tipuri de echipamente duce la următoarele avantaje:
- folosirea unor plăcute de sticlă optică cu feţe plan paralele, din care o faţă este aurită, fixate
pe o prismă de sticlă cu un material lichid transparent cu indice de refracţie mare dă
posibilitatea folosirii succesive şi rapidă a mai multor lamele pregătite în prealabil cu
material biologic şi prin această creşte mult productivitatea procesului de analiză.
- evitarea auririi directe a suprafeţei prismei scade costurile şi timpii morţi prin nefolosirea
acesteia în timpul procesului de aurire şi creşte totodată durata de viaţă a prismei optice.
- face posibilă folosirea aceleaşi echipări a prismei atît la la măsurători succesive
independente cît şi la măsurători in -situ continuie în regim de by - pass.

10
 - folosirea unui detector optoelectronic de tip diode – array în locul unui fotodetector
monocelular montat pe un sistem goniometric de precizie duce la eliminarea celui din
urmă al cărui preţ reprezintă cca 2/3 din preţul unui aparat actual de rezonanţă
plasmonică de suprafaţă. In plus un detector diode – array face posibilă preluarea
instantanee a tuturor ungiurilor de refracţie eliminînd timpii necesari pentru cautarea
şi măsurarea unghiului de
Se dă în continuare un exemple de realizare a biosenzorilor în legătura cu:
- figura 6. care reprezintă schema de principiu pentru determinarea rezonanţei plasmonice de
suprafaţă cu lamele de sticlă aurite
- figura 7care reprezintă schema de principiu pentru determinarea continuă în regim de by-pass
a variaţiei de masă sau a grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă

Fig.6. schema de principiu pentru determinarea rezonanţei plasmonice de suprafaţă cu lamele de

sticlă aurite. 1- prismă din sticlă optică, 2-lamela din sticlă, 3-depunere de aur, 4-strat biologic activ, 5-
strat subţire de ulei, 6,7-sistem de strîngere, 8-corp, 9-sursă de radiaţie monocromatică, 10-detector
optoelectronic de tip diode- array, 11-unitate electronică centrală, 12-unitate de calcul

Echipamentul pentru determinarea grosimii de strat sau a variaţiei acesteia în timp conform
figurii 6 este format dintr-o prismă 1 din sticlă optică, o lamela 2 din sticlă optică avînd o
depunere 3 de aur pur subţire pe una din feţe , un strat 4 biologic activ depus pe stratul de aur,
un strat 5 subţire de ulei special cu indice de refracţie ridicat folosit pentru cuplarea prismei cu
lamela de sticlă, un sistem 6 şi 7 de strîngere, un corp 8, o sursă 9 de radiaţie monocromatică de
tip diodă laser sau LED un detector 10 optoelectronic de tip diode- array pentru măsurarea
unghiului de refracţie  , o unitate 11 electronică centrală, şi o unitate 12 de calcul ce dispune de
un soft specific pentru achizitia şi prelucrarea datelor.

11
Fig.7. Schema de principiu pentru determinarea continuă în regim de by-pass a
variaţiei de masă sau a grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă. 1- prismă din sticlă optică, 2-lamela
din sticlă, 3-depunere de aur, 4-strat biologic activ, 5-strat subţire de ulei, 6,7-sistem de strîngere, 8-corp, 9-sursă
de radiaţie monocromatică, 10-detector optoelectronic de tip diode- array, 11-unitate electronică centrală, 12-unitate
de calcul, 13-celulă de curgere, 14-recipient sau reactor, 15-pompă peristaltică, 16-motor electric.

Echipamentul pentru determinarea variaţiei grosimii de strat conform figurii 7este format dintr-
o prismă 1 optică din sticlă, o lamela 2 optică avînd o depunere 3 de aur pur subţire pe una din
feţe , un strat 4 biologic activ depus pe stratul de aur, un strat 5 subţire de ulei special cu indice
de refracţie ridicat, un sistem 6 şi 7 de stringere cu colier , un corp 8, o sursă 9 de radiaţie
monocromatică de tip diodă laser sau LED, un detector 10 optoelectronic de tip diode- array pentru
măsurarea unghiului de refracţie  , o unitate 11 electronică centrală, o unitate 12 de calcul , o
celulă 13 de curgere , un recipient sau reactor 14 cu speciile biologice urmărite, o pompă 15
peristaltică acţionată cu un motor 16 electric.

Microbalanţa piezoelectrică
Microbalanţa piezoelectrică reprezintă un sistem de măsurare foarte sensibil a variaţiilor
de masă folosit cu precădere în aplicaţii de biosenzori dar şi în alte aplicaţii unde se reclamă
măsurarea cu mare sensibilitate a unor variaţii masice extrem de mici cu rezoluţii de pînă la 80 .10-
15
g (10-15g = 1 femtogram). Microbalanţa piezoelectrică se bazează pe modificarea frecvenţei de
rezonanţă f a oscilaţie a unui detector piezoelectric ca urmare a modificării masei m pe
cele două suprafeţe 2A ale oscilatorului conform relaţiei :

m
f  K  (6)
2A

12
unde K reprezintă o constantă ce ţine cont de frecvenţa de rezonanţă, de modulul de forfecare şi
de densitatea a cuartului .
Din punct de vedere constructiv o piezobalanţă se compune un sistem oscilator format
dintr-un generator electronic de înaltă frecvenţă şi un oscilator piezoelectric cu două feţe
planparalele, figura 8. ce oscilează pe frecvenţa de rezonanţă, denumit cip

Fig. 8. Schema de principiu a unei piezobalanţe . 1-piezocuarţ, 2-matial biologic activ, 3,4 – conductori
electrici, 5- parte electronică

piezoelectric pe care se depune o componenta biologic activă , fig.9a., ca receptor în măsură să

ducă la interferenţe cu specia urmărită ceea ce duce la modificări de masă la suprafaţa
piezocipului sesizate prin modificarea frecvenţei de rezonanţă. Peste microcipurile de cuarţ cu
depunere de biomaterial receptor sînt trecute fie cantităţi mici din substanţa de analizat în flux
continuu fie microcipul este scufundat în substanţa de analizat unde este menţinut un anumit
timp

a) b)

Fig.9. Apectul celor două feţe ale oscilatorului piezoelectric, a- faţa activă pe care se depunde materialul
ce fixează specia biologică urmărită, b- faţa opusă feţei active.

Dezavantajul folosirii microbalanţei piezoelectrice constă în faptul că un cip cu depunere

de receptor poate fi folosit o singură dată , iar frecvenţa de rezonanţă este influentată de variaţii de
temperatură. Primul dezavantaj nu este major deoarece depunerea de specie activă receptoare pe
cele două feţe ale cip-ului se face uşor iar după o scurtă tarare electronică balanţa este funcţională.
Dependenţa valorii frecvenţei de rezonanţă de temperatură reclamă în schimb termostatări
avansate şi destul de costisitoare.

13
 INTREBARI

1. Descrieti un biosenzor de bioluminiscenta

2. Descrieti un biosenzor tip sonda fluorometrica
3. Ce este rezonanta plasmonică de suprafata
4. Descrieti biosenzori bazati pe rezonanta plasmonică de suprafata
5. Descrieti un biosenzor bazat pe microbalanta piezoelectrică

14