Studiul nanoparticulelor marcate fluorescent cu ajutorul

microscopiei confocale

Microscopia confocal creeaz imagini clare ale probelor scanate, cu o rezoluie mult mai
bun dect microscopul convenional. Acest lucru este realizat prin excluderea majoritii luminii
din eantionul care nu este n planul focal al microscopului. Imaginea obinut are mai puin
nceoare i un contrast mai mare dect cea a unui microscop convenional. Avantajul folosirii
microscopiei confocale cu scanare laser const n scanarea probelor cu grosimi de pn la 100
micrometri. Scanarea cu laser, n microscopia confocal, a devenit un instrument inestimabil
pentru seciunile subiri, cu o grosime de pn la 100 micrometri. Microscopia confocala este
capabil s evidenieze prezena unei molecule unice, acest studiu fiind realizat de ctre
Peterman, Sosa et al., n 2004. Microscoapele confocale moderne au pstrat elementele cheie ale
designului lui Minsky, apertura de deschidere i iluminarea punct cu punct a probei. ncepnd cu
anul 1990, dezvoltarea opticii i electronicii au oferit lasere mult mai stabile i puternice, sisteme
de oglinzi performante, filme dielectrice mult mai bune i detectori cu zgomot redus.

Imaginea ntr-un microscop confocal este realizat prin scanarea probei cu ajutorul unui
sau a mai multor fascicule lasere focalizate sau prin descrcarea de arc. De remarcat este faptul,
c se poate realiza i iluminarea probei pe lateral. Punctul iluminat este focalizat cu ajutorul
sistemelor de lentile. Punctele iluiminate de pe prob sunt mai apoi detectate de un
fotomultiplicator (PMT), iar imaginea este afiat pe monitor.

Dei specimenele neintenionate pot fi vzute folosind lumina reflectat napoi de pe ea,
cele mai multe eantioane sunt etichetate cu una sau mai multe sonde fluorescente. Un laser este
utilizat pentru a asigura lumina de excitaie. Lumina laser reflect o oglind dicroic, lovind dou
lentile montate pe motoare. Aceste oglinzi scaneaz laserul prin eantion, vopseaua din
eantionul fluorescent i lumina emis sunt descinse de aceleai oglinzi care sunt folosite pentru
a scana lumina de excitaie de la laser.
Lumina emis trece prin oglind i este focalizat printr-un orificiu. Lumina care trece
prin orificiu este msurat de un detector, adic un tub fotomultiplicator. Astfel, niciodat nu
exist o imagine complet a eantionului n orice moment dat; se vede un singur punct al
eantionului. Detectorul este ataat la un computer care construiete imaginea, cte un pixel la un
moment dat. O imagine de 512x512 pixeli s-ar putea face probabil de 3 ori pe secund din cauza
limitrii n oglinzile de scanare. Ulterior, pentru a accelera scanarea, a fost folosit un deflector
optic acustic special (AOD) n locul uneia dintre oglinzi. AOD utilizeaz un val de sunete de
nalt frecven ntr-un cristal special pentru a crea o reea de difracie, care deflect lumina
laserului. Prin modificarea frecvenei undelor sonore, AOD modific unghiul difraciei luminii,
permind astfel o scanare rapid care duce la imagini de 512x480 pixeli de 30 de ori pe secund.
Dac se uit la un cmp vizual mai mic, procesul poate fi chiar mai rapid (pn la 480 de cadre pe
secund).
Componentele miscoscopului confocal sunt:

1. Sursa de lumina (sistemul de laseri);

2. Filtre;
3. Diaspozitive optico-acustice;
4. Scanerul;
5. Detectorul (PMT, APD);
6. Apertura (pin hole).

n miscroscopia floroscent, dispozitivele de filtrare sunt utilizate pentru a separa

fasciculele de lumin de baz de lungimile lor de und. Sunt utilizate patru tipuri de filtre pentru
a transmite sau bloca selectiv intervalul de lungimi de und dorite.
a) Filtre de trecere scurt acestea taie lungimi de und mai lungi decat o anumit
lungime de und, de exemplu, filtrerele de cldur sunt utilizate pentru a exclude
lumina infraroie pentru a reduce nclzirea probelor prin iluminare;
b) Filtre de trecere lung de exemplu, filtre fluorescente care transmit lumina mai lung
dect o anumit lungime de und;
c) Filtru trecere band (band pass filter) care transmit lumina doar ntr-un interval de
lungime de und, mai ales atunci cnd se semnaleaz simultan semnale de la mai mult
de un fluorocrom;
d) Oglinzi dicrome care separ lumina emis de lumina excitat.

Imagistica confocal se realizeaz utiliznd un proces n dou etape. Mai nti, lumina
excitat care se concentreaz asupra specimenului de ctre obiectiv este iniial trecut printr-o
mic deschidere, o fant sau un orificiu. Alternativ, un fascicul foarte ngust de lumin laser
poate fi introdus n sistem printr-o fibr optic. Prin condiionarea luminii de excitaie n acest
fel, cantitatea de fluorescen nefiind focalizat poate fi controlat sau minimalizat. n al doilea
rnd, emisiile de fluorescen care provin deasupra sau dedesubtul planului de focalizare sunt
blocate de o a doua deschiztur sau fant n faa detectorului. Cu ct aceast a doua deschidere
este mai mic, cu att sunt mai mari ratele de respingere a luminii care nu se concentreaz i cu
att este mai subire seciunea optic.
 Alegerea fluoroforilor este cel mai important aspect al fluorescenei, microscopiei
confocale. Acesta este de obicei influenat de mai muli factori:

Fluoroforele trebuie s eticheteze partea corect a specimenului.

Trebuie s fie suficient de sensibil pentru lungimea de und dat de excitaie.
Pentru exemplarele vii nu ar trebui s modifice n mod semnificativ dinamica organismului.
Specimenul nu trebuie s afecteze fluoroforul deoarece mediul su chimic poate afecta poziia
vrfurilor spectrelor de excitaie i de emisie.

O problem major cu fluoroforii este aceea c ele se estompeaz (ireversibil) atunci cnd
sunt expuse la lumina de excitaie, un fenomen cunoscut sub numele de fotobleaching. Au fost
elaborate mai multe strategii pentru a reduce rata de fotobleaching. O metod este de a reduce pur
i simplu cantitatea de oxigen care ar reaciona cu starea tripl de excitare. Aceasta se poate face
prin deplasarea ei utilizand un gaz diferit. O alt metod este prin utilizarea de ageni de
colectare a radicalilor liberi pentru a reduce radicalii de oxigen. Scderea duratei de via a strii
triple de excitaie sa dovedit a fi eficient. Alte metode includ folosirea unei lentile cu diafragm
mare pentru a colecta mai mult lumin fluorescent i, prin urmare, utilizarea mai puin a
luminii de excitaie.
Scanarea biochimic cu microscopie confocal bazat pe laser se bazeaz profund pe
fluorescen ca mod de imagistic, datorit gradului su ridicat de sensibilitate, cuplat cu
capacitatea de a viza n mod specific componentele structurale i procesele dinamice n celulele i
esuturile fixate chimic, precum i n cel viu. n microscopul confocal acest lucru se realizeaz
prin fluorofori.

Progresele recente n designul fluoroforului au condus la probe sintetice i naturale

superioare, inclusiv proteine fluorescente i puncte cuantice, care prezint un nivel ridicat de
stabilitate foto i specificitate int. Sondele sintetice sunt construite n jurul unor substane
chimice organice aromatice sintetice, proiectate s se lege cu o macromolecul biologic sau s
se localizeze ntr-o regiune structural specific, cum ar fi citoscheletul, mitocondria, aparatul
golgi, reticulul endoplasmatic i nucleul. n plus, sondele fluorescente au fost aplicate pe scar
larg la cartografia genetic i analiza cromozomilor n domeniul geneticii moleculare.

O list a lungimilor de und de excitaie i de emisie ale probelor utilizate n cercetarea i

aplicaiile fluorescenei este prezentat n tabelul 1. Poziiile maximelor depind de solventul
utilizat n msurtori. Tabelul este destinat numai s ofere o indicaie a intervalului de lungime de
und acoperit de fiecare fluorofor.

Aplicaii ale microscopului confocal

Gama larg de aplicaii disponibile pentru scanarea cu laser a microscopiei confocale

include o mare varietate de studii n neuroanatomie i neurofiziologie, precum i studii
morfologice ale unui spectru larg de celule i esuturi. Alte aplicaii includ transferul de energie
prin rezonan, cercetarea celulelor stem, studiile de albire a fotografiei, imagistica pe durata
vieii, microscopia multiphoton, reflexia intern total, hibridizarea ADN-ului, probele de
membran, proteinele bioluminiscente i etichetarea epitopilor.

CLSM este utilizat pe scar larg n numeroase discipline biologice, de la biologie

celular i genetic pn la microbiologie i biologie de dezvoltare.
FRAP (recuperarea fluorescenei photobleaching) este o tehnic conceput pentru a
cuantifica difuzia lateral bidimensional a unei sonde fluorescente etichetate la probe
biologice cum ar fi nucleotidele i proteinele n celule singulare sau n pelicula subire
molecular. ntr-un experiment FRAP, o regiune cu molecule fluorescente este iradiat
sau foto-albit cu lumin laser. Rezult ca moleculele fluorescente din interiorul acelei
regiuni s devin non-fluorescente. Partea recuperat dup o perioad de timp a acestui
experiment se datoreaz redistribuirii ulterioare a moleculelor fluorescente i albite n
ntregul volum. Acest lucru ofer informaii despre mobilitatea acestora. Aceast tehnic
este foarte util n studiile biologice ale modelului mozaic fluid al membranelor celulare.
Acesta poate fi, de asemenea, utilizat pentru a determina dac o protein este capabil s
se deplaseze ntr-o membran sau dac este legat de alte componente structurale ale
celulei.
FRET (transfer de energie prin rezonan fluorescent) este o interaciune dependent de
distana ntre strile excitate electronice ale dou molecule de colorani n care excitaia
este transferat de la o molecul donor la o molecul acceptoare fr emisia unui foton.
Energia trece de la molecula excitat DONOR la molecula ACCEPTOR prin cuplarea
dipolului nonradiativ, care apoi emite fluorescen. Fluoroforii trebuie s fie extrem de
 apropiai unul de cellalt pentru a se ntmpla acest lucru (<0,1 mm). FRET este o
tehnic important pentru investigarea unei varieti de fenomene biologice care produc
modificri n apropierea molecular.
FLIM (durata de via a fluorescenei) este definit ca timpul mediu n care o molecul
rmne n stare excitat nainte de revenirea la starea de baz. Procesul de emisie de
fluorescen de ctre o molecul excitat apare ca radioactivitate cu o durat de via
semi-caracteristic sau o durat de via de decdere de cteva nanosecunde. Durata de
via variaz ntre diferite molecule fluorescente, dar i pentru aceeai prob ntr-un
mediu diferit. FLIM ofer mai multe oportuniti de a studia evenimentele dinamice ale
celulelor vii.
FLIP (pierderea prin fluorescen n procesul de photobleaching) este o tehnic n care o
parte dintr-o celul la o distan de unde exist un exces de proteine fluorescente este
albit cu un laser la intensitate sczut. nainte i la intervale constante dup albire,
moleculele albite se redistribuie prin celul.
FLAP (localizarea fluorescenei dup photobleaching) este o tehnic n care molecula care
urmeaz s fie localizat are 2 fluorofori, unul care urmeaz s fie albit i cellalt care s
acioneze ca o etichet de referin. Se poate apoi urmri distribuia moleculei dup ce
este albit.

Microscopia confocal poate servi drept un instrument valoros pentru imagistica

celular vie. Clinic, CLSM este utilizat n evaluarea diferitelor boli oculare i este util n special
pentru imagistic, analiz calitativ i cuantificare a celulelor endoteliale ale corneei (Patel
and McGhee, 2007). n industria farmaceutic, sa recomandat urmrirea procesului de fabricare
a formelor farmaceutice subiri, pentru a controla calitatea i uniformitatea distribuiei
medicamentului (Le Person, Puigalli et al., 1998).
Microscopia confocal ofer mai multe avantaje distincte fa de microscopia
tradiional cu fluorescen larg:
Avantajul principal al microscopiei confocale cu scanare laser este capacitatea de a
produce secvene optice subiri (0,5 pn la 1,5 microni) prin eantioane fluorescente care
au o grosime de pn la 50 micrometri sau mai mult.
Abilitatea de a controla adncimea cmpului.
 Cea mai important caracteristic a unui microscop confocal este capacitatea de a izola i
de a colecta un plan de focalizare din interiorul unei probe, eliminnd astfel "focul"
necontrolat, vizibil n mod normal, cu un eantion fluorescent.
Eliminarea sau reducerea informaiilor de pe fundal n afara planului focal (ceea ce duce
la degradarea imaginii).
Microscopul confocal are un motor pas cu pas ataat la focalizarea fin, permind
colectarea unei serii de imagini printr-un obiect tridimensional. Aceste imagini pot fi apoi
folosite pentru o reconstrucie de dou sau trei dimensiuni.

Cheia de baz pentru avantajele menionate mai sus este utilizarea tehnicilor de filtrare
spaial n microscop confocal pentru a elimina lumina sau strlucirea n afara focului n
eantioane a cror grosime depete dimensiunile planului focal.

Aadar, un microscop confocal ofer o mbuntire semnificativ a imaginii fa de

microscoapele convenionale. Creeaz imagini 2D mai clare i mai detaliate i permite
colectarea datelor n trei dimensiuni. n aplicaiile biologice este util n special pentru
msurarea proceselor dinamice. Au fost elaborate o serie de modele pentru a realiza
microscopia confocal video cu rat video, care permite captarea dinamicii de scurt durat.
Tabel 1: Lungimi de und de excitare i emisie ale unor cunoscui fluorofori.
 Pentru a proiecta detectarea dual a celulelor care implic imagistica prin fluorescen i
rezonan magnetic, ntr-o singur particul au fost inclui: un colorant fluorescent i un miez
superparamagnetic. Procedurile de sintez pentru conjugarea coloranilor fluoresceni pe
suprafaa nanoparticulelor magnetice necesit tratamente chimice n mai multe etape.
Nanoparticulele superparamagnetice de oxid de fier (SPION) prezint cteva aplicaii n
nanomedicin, variind de la diagnostic i terapie pn la livrarea de medicamente vizate. n
ultima vreme, exist un interes crescut de utilizare a SPION-urilor n biologia celular i terapiile
celulare. Aceste aplicaii noi au exploatat SPION-urile n studiile de biodistribuie prin
intermediul imaginilor prin rezonan magnetic (RMN), pentru a nelege migraia, localizarea i
funcia celulelor. SPION-urile pot fi fabricate sau procurate comercial. Suprafaa SPION trebuie
s fie modificat cu un biopolimer adecvat pentru o aplicare sigur i eficient n scopul dorit.
Despre aceste aplicaii, Vinod Kumar Verma1 i alii n Fluorescent magnetic iron oxide
nanoparticles for cardiac precursor cell selection from stromal vascular fraction and
optimization for magnetic resonance imaging publicat n Jurnalul Internaional de
Nanomedicin, 20 Ianuarie 2015 au studiat dezvoltarea unei nanoprobe pentru selecia celular i
imagistic cu o concentrare terapeutic direct. Strategiile de mbogire a celulelor progenitoare
ale celulelor cardiace nu au fost adesea fructuoase din cauza inaccesibilitii anticorpilor bine
caracterizai pentru un fenotip specific cardiac. Eludarea manipulrii majore a celulelor n
culturile celulare i mbuntirea mbogirii biocompatibilitii SPION-ului ntr-o singur etap
are potenialul de aplicare n terapia celular. Prin urmare, abordarea strategic primar este de a
evalua migraia, adaptarea i funcia celulelor stem, care vor contribui n cele din urm la
maximizarea eficacitii acestor terapii noi.
Nanoparticulele multifuncionale care furnizeaz terapie i imagistic molecular n
tandem dobndesc un impuls n cercetarea translaional. Acestea au asamblat diferite elemente
(PEG- polyethylene glycol i mAb- monoclonal antibodies) ntr-o nanoparticul magnetic
(SPION) fr a modifica proprietile lor inerente i au creat o nanoprob printr-o interaciune
electrostatic. Acest nanoprob este capabil s fac o separare selectiv a celulelor
progenitoare dintr-o populaie eterogen de celule i, ulterior, permite celulelor s fie urmrite
prin imagini neinvazive moleculare.
 Figura 1: Construcia, caracterizarea i distribuia nanoprobei - SPION-PEG-mAb n celulele marcate
prin TEM i CLSM ; A) Reprezentarea schematic a complexului SPION-PEG ncrcat negativ prin interaciune
electrostatic. Receptorii mAb (specifici cardiaci) sunt legai la SPION-PEG printr-o legtur covalent ; B) Imagini
TEM ale nanoprobelor: SPION (167 nm), SPION-PEG (250 nm) i SPION-PEG-mAb (300 nm) prezint variaii ale
dimensiunii lor la modificarea suprafeei. Imaginea complex SPION-PEG-mAb, utiliznd microscopia confocal,
demonstreaz un agregat SPION n etichet ntunecat cu PEG (FITC; verde), SIRPA mAb (PE; rou) utiliznd
puterea laserului de 60% i un ctig de 850 de setri.

Diferii polimeri au fost evaluai pentru acoperirea suprafeei SPION pentru a o face mai
biocompatibil. Miezul SPION a fost oxidul de fier, stratul cel mai existent fiind compus din
PEG cu greutate molecular 300. PEG s-a dovedit a fi cel mai eficient i mai puin toxic, formnd
o structur asemntoare micelilor pe suprafaa SPION.
n urma cercetrilor cei de la Department of Transplant Biology, Immunology and Stem
Cell Laboratory, au artat c ansamblul PEG care nconjoar SPION-ul i-a mrit mrimea
determinat de cele dou metode cele mai fiabile ale CLSM (microscopie confocal cu scanare
laser)i TEM(microscopie electronic de transmisie), indicnd acoperirea reuit pe SPION.
Datele CLSM demonstreaz n mod clar etichetarea eficient a PEG i mAb reprezentate
de doi fluorocromi diferii, dei exist i alte metode disponibile, cum ar fi microscopia forei
atomice i msurarea potenialului zeta. SPION avnd ca nucleu oxidul de fier, a fost tolerat
bine la oameni n cazul diagnosticul RMN. Totui, este necesar s se stabileasc utilizarea sa
sigur n studiul uman cu o bun viabilitate celular. Acest lucru a fost realizat cu complexul
SPION-PEG, similar cu cel al celulelor nemarcate, care confirm caracterul su netoxic. n
concordan cu descoperirile celor de la Department of Transplant Biology, Immunology and
Stem Cell Laboratory , Chang et al au raportat n studiul In vitro cytotoxicity of silica
nanoparticles at high concentrations strongly depends on the metabolic activity type of the cell
line(2007), c efectele citotoxice ale nanoparticulelor de silice pot fi reduse semnificativ prin
modificarea de suprafa a cochililor de silice cu chitosan sau PEG. Localizarea intracelular a
SPION este considerat un eveniment important care determin toxicitatea acestora fa de
celule. De asemenea, se presupune c suprancrcarea cu fier datorat degradrii SPION-urilor
provoac citotoxicitate. Au fost raportate mai multe efecte adverse cum ar fi deteriorarea
membranei, generarea de ROS, inducerea apoptozei i deteriorarea ADN-ului n celulele marcate
cu SPION.
Un aspect important al etichetrii SPION a celulelor stem este capacitatea sa de a urmri
celulele prin tehnici de imagistic neinvazive. IRM ofer imaginea celulelor marcate inerial
morfologic i viu marcate magnetic atunci cnd sunt utilizate n concentraii adecvate.
Concentraiile de SPION mai mici de 12,5 g / 1,5 x 105 celule au fost evideniate n hiposemnal
intens n secvena T2, variind att concentraia ct i numrul de celule.
Prin urmare, celulele progenitoare cardiace sortate au potenialul de a fi utilizate direct n
scopuri terapeutice i pentru mbuntirea ulterioar a urmririi celulelor cu ajutorul imaginilor
IRM. n concluzie, rezultatele ncurajatoare ale studiului realizat de Vinod Kumar Verma1 i
alii, justific o evaluare in-vivo a toxicitii pentru studiile translaionale n viitor.
n studiul prezentat mai sus modificarea suprafeei SPION a fost efectuat cu dextran sau
PEG prin adsorbie direct. Complexele SPION / dextran i SPION / PEG au fost realizate prin
incubarea componentelor mpreun la diferite raporturi (1: 2 - 1:10) la temperatura camerei timp
de 1 or ntr-un RotoSpin pentru a determina concentraia optim necesar pentru modificarea cu
succes a SPION-urilor.
 Figura 2: Scanarea IRM a celulelor marcate cu complex SPION ncorporate n fantomul de gel a fost
efectuat n secvena T2 utiliznd o instalaie IRM de 3T. Au fost efectuate 2 experimente: una cu concentraie
SPION fix (50 g / celule) i numere variabile de celule (0,0625-1,0 106 celule) i una cu un numr fix de celule
(1 x 105 celule) i diferite concentraii SPION (3,175 -50 pg / celule). (B) Parametrii secvenei T2 TSE coronal
utilizai n timpul scanrii sunt: TR=6250 ms; TE=150 ms; FOV=190 230 mm3; grosimea seciune=2 mm; timp de
achiziie= 5 minute i marimea voxelului= 0,6 0,8 2 mm3).

Pentru a obine proprieti fluorescente, dextranul i PEG au fost legate cu izotiocianat de

rodamin(rhodamine isothiocyanate) i respectiv cu izotiocianat de fluorescein (fluorescein
isothiocyanate FITC). Celulele au fost nsmnate n plci cu 96 de godeuri i incubate ntr-un
incubator umed 5% C02 la 37 C timp de 18 ore. Celulele au fost apoi expuse la diferite rapoarte
ale complexului SPION / biopolimer timp de 24 ore ntr-o atmosfer umidificat aa cum s-a
menionat mai sus. Celulele marcate cu SPION pe capace au fost fixate i montate utiliznd
DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole- is a fluorescent stain) pentru a evalua localizarea SPION-
ilor folosind microscopia confocal de scanare laser (CLSM).
Suprafaa SPION a fost modificat permind adsorbia PEG pe suprafa prin incubare
sub o rotaie uoar la temperatura camerei timp de 1 or. Complexul SPION a fost apoi marcat
cu mAb prin adsorbie direct la 4 C timp de 2 ore pentru a face nanoproba. n acest studiu, au
folosit un amestec de SIRPA/CD105 i KDR/CD105 pentru a construi nanoprobele specifice
celulelor progenitoare cardiace, deoarece aceste antigene de suprafa marcheaz celulele stem
progenitoare n SVF (stromal vascular fraction) care au caracteristicile cardiomiocitelor.

n concluzie, nanoparticulele superparamagnetice de oxid de fier (SPION) cu aplicaii n

imagistica de rezonan magnetic nuclear pot fi marcate fluorescent pentru a fi scanate cu
ajutorul microscopului confocal cu scanare laser (CLSM). Aceste particule marcate cu PEG-
polyethylene glycol i mAb-monoclonal antibodies , prezint hiposemnal intens n secvena T2 la
concentraii mai mici de 12,5 g / 1,5 x 105 celule.
Bibliografie

1. Fluorescent magnetic iron oxide nanoparticles for cardiac precursor cell selection
from stromal vascular fraction and optimization for magnetic resonance imaging,
Vinod Kumar Verma, Suguna Ratnakar Kamaraju, Ravindranath Kancherla, Lakshmi K
Kona, Syed Sultan Beevi, Tanya Debnath, Shalini P Usha, Rammohan Vadapalli, Ali
Syed Arbab, Lakshmi Kiran Chelluri, International Journal of Nanomedicine 2015:10
711726.
2. Fluorescent magnetic nanoparticles for biomedical applications, Nataliya Chekina,
Daniel Horak, Pavla Jendelova, Miroslava Trchova, Milan J. Benes, Martin Hruby, Vt Herynek,
Karolina Turnovcova and Eva Sykova, The Royal Society of Chemistry 2011, 21, 76307639

3. The Basics of Confocal Microscopy, Vineeta Rai and Nrisingha Dey* Institute of Life
Sciences, Laboratory of Plant Biotechnology, Dept. of Gene Function & Regulation, Bhubaneswar (Orissa),
India.

4. https://www.microscopyu.com/techniques/confocal