Microscopul cu fluorescenta

Similar cu microscopul cu contrast de faza si cel cu lumina polarizata, microscopul cu fluorescenta este
folosit pentru examinari speciale. Utilizand componente aditionale, microscopul cu
contrast de faza permite detectarea unor caracteristici importante ale probelor.
Un microscop cu fluorescenta este constituit din urmatoarele parti componente:
-sursa de radiatie in domeniul vizibil
-condensor
-masuta cu proba
-obiective
-elemente de aliniere
-oculare
Partile componente specifice microscopului cu fluorescenta sunt:
-sursa de radiatie in domeniul ultraviolet (UV)
-filtre de excitare
-barrier filters???
Radiatia cu lungime de unda mica provine de la sursa de radiatie in domeniul ultraviolet (UV). Aceasta
radiatie trece apoi printr-un filtru de excitare. Filtrele de excitare sunt deci plasate intre sursa de radiatie
ultraviolet si proba. Lumina este in continuare redirectionata prin obiectiv cu ajutorul unei oglinzi si in
felul aceasta ajunge la proba. O parte din aceasta radiatie este absorbita de proba si re-emisa sub forma
de radiatie de fluorescenta. Aceasta radiatie re-emisa trece in continuare printr-un al doilea filtru (filtru
opreste banda), plasat intre proba si oculare, care a are rolul de a lasa sa treaca spre oculare (si
implicit spre ochi) numai radiatia de fluorescenta emisa de proba in domeniul vizibil. In acelasi timp,
cel de al doilea filtru blocheaza lumina ce trece de filtrul de excitare astfel incat fluorescenta emisa de
prba apare pe fundalul intunecat.
Microscopul cu fluorescenta utilizeaza in general oculare si obiective ce
furnizeaza o marire in domeniul 40X- 400X. Datorita maririi mari campul vizual si
adancimea campului sunt mici. Probele sunt analizate in lumina transmisa.
Probele pot fi vizualizate initial cu lumina transmisa (ca la microscopul obisnuit)
Experiment A: Familiarizarea cu microscopul cu fluorescenta:
-parti componente
-aspecte teoretice referitoare la fluorescenta
-utilizare
Exista materiale care prin iluminare cu radiatii cu anumite lungimi de unda absorb aceste lungimi de
unda si re-emit radiatii cu lungime de unda mai mare. Aceasta proprietate se numeste fluorescenta.
Microscopul cu fluorescenta permite observarea acestui tip de probe prin iluminarea cu radiatii ce
produc fluorescenta. Cu microscopul cu fluorescenta se analizeaza radiatia de fluorescenta emisa de
aceste probe.
In lucrarea de fata se vor analiza ca materiale fluorescente in special diverse sorturi de fibre.
In criminalistica punerea in evidenta a prezentei unei fibre si identificarea ei ca fiind de un anume tip
(acril, bumbac, nylon, poliester) poate sa nu fie o proba suficienta. Folosirea unei fibre ca proba consta

in unicitatea ei in raport cu celelalte fibre care exista in mod curent la locul crimei. In acest sens,
radiatia de fluorescenta emisa de o anume fibra poate fi specifica numai acelei fibre. Aceasta ajuta la
identificarea acelei fibre in mod unic (distingand-o cert de alte fibre).
Modul de operare al unui microscop cu fluorescenta este prezentat in Figura 1:

Excitarea fluorescentei probei are loc cand radiatia cu lungime de unda mica ce provine de la sursa de
radiatie in domeniul ultraviolet (UV) interactioneaza cu proba. Lungimile de unda care provoaca
fluorescenta probei depind de tipul probei motiv pentru care se folosesc mai multe tipuri de filtre de
excitare. In analize se observa radiatia fluorescenta emisa de proba. Radiatia UV provenind de la sursa
de lumina este blocata de un al doilea filtru (filtru opreste banda) plasat intre sursa si oculare.
Sursa de radiatie UV este de obicei o lampa cu descarcare in Xenon sau Mercur. Rolul filtrului de
excitare este de a lasa sa treaca catre proba numai o parte a radiatiei UV emisa de sursa. Filtrele de
excitare sunt in domeniul UV. Este important de avut in vedere ca lamele de sticla si majoritatea
mediilor de imersie pot absorbi radiatia UV si de asemeni pot emite radiatie de fluorescenta atunci cand
sunt iluminate cu radiatie UV. Lumina de la sursa de lumina UV poate fi observata atunci cand sursa e
privita printr-o lama de sticla deci sticla nu absoarbe complet radiatia UV insa uneori aceasta absorbtie
poate fi suficient mare astfel incat observarea unor probe cu fluorescenta mica sa fiecarecompromisa
(din cauza faptului ca lumina de la sursa de UV trece mai intai printr-o lama de sticla inainte de aajunge
la proba face ca radiatia UV incidenta pe proba sa aiba intensitate mai mica ceea ce face ca

fluorescenta emisa de proba sa aiba intensitate mai mica chiar impercetibila uneori). Pentru a minimiza
pe cat posibil aceste efecte se pot utiliza lame si lamele de cuartz precum si medii de montare speciale:
metanol, xylen, Norland 65, XAM.
Echipamente:
-microscop cu fluorescenta cu diverse filtre de excitare
-fibre cu fluorescenta cunoscuta
-lame si lamele de cuartz
Modul de operare cu microscopul cu fluorescenta:
-familiarizati-va cu microscopul cu contrast de faza.
-localizati si identificati fiecare parte componenta.
-plasati o proba pe masuta microscopului
-ajustati distanta interpupilara
-utilizand ocularul ne-ajustabil reglati pozitia masutei astfel incat sa vedeti
imaginea clara a obiectului/probei
-reglati al doilea ocular (daca e necesar)
-reglati iluminarea Kohler
-determinati locul de amplasare al sursei de radiatii UV
-determinati locul de amplasare al filtrului de excitare si al filtru opreste banda
-porniti sursa de alimentare a lampii UV
-inchideti diafragma de camp cat timp se incalzeste lampa UV
-preparati proba utilizand lame/lamele/medii de montare non-fluorescente
3. Turn on the power supply for the base light illuminator. Adjust the microscope to obtain Kohler
illumination.
4. Using the lowest magnification, place the prepared sample on the microscope stage and bring
it into focus. Lower the intensity of the base light and room lighting. (Steps 3 and 4 are only
necessary if the base light will be used to aid in the visualization of samples.)
5. Open the lamp diaphragm on the specialized illuminator. Refocusing of the sample may be
necessary.
6. Observe the sample and note the color of any light being emitted. Change excitation and barrier
filters and repeat your observations. In your notes fully describe the fluorescence characteristics
of your sample.
7. Repeat this examination with three more samples.
REPORT REQUIREMENTS
Include all drawings, calculations, or other information obtained during the laboratory procedure.
Notes and/or drawings should include the sample identification, magnification, and a complete
description.
REPORT QUESTIONS
1. Explain how a fluorescence microscope is used in forensic science. Give the purpose and
value of the examination.
2. What is fluorescence? How is fluorescence initiated?
3. What are the advantages and disadvantages of this optical property for forensic samples?
4. Explain the optics used in a fluorescence microscope.

5. If a forensic scientist has a polarizing microscope such as a Leica DMEP, which they want to
convert to a fluorescence microscope, could they use the same light bulb? Why or why not?
6. What is the purpose of the excitation and barrier filters?
7. How are excitation and barrier filters paired?
8. Does the color of light emitted from a fluorescent sample have any significance in distinguishing
and identifying the sample?
9. Why were quartz slides and cover slips used?
10. Name two types of evidence that could be examined with a fluorescence microscope. Of what
would the examination consist?
11. What types of evidence would not be examined with the fluorescence microscope? Why?
PART I: PARTS OF A FLUORESCENCE MICROSCOPE
Label the parts of the fluorescence microscope in Figure 2 by writing the name next to the
appropriate number.
In the space below write a single sentence explaining the function of each part. Attach additional
pages if necessary.
Figure 2 A typical fluorescence microscope with additional filter cubes.