Microscoape

utilizate în
criminalistică

1
Cum putem vedea corpuri atât de mici?
Cum putem studia corpuri atât de mici?
Spectrul undelor electromagnetice.
Domeniul vizibil

4
 Fenomene fizice ale luminii
• Absorbția
– Când lumina trece printr-un mediu optic transparent intensitatea se reduce in funcție de
culoare absorbită. Astfel, absorbţia selectivă a luminii albe produce lumină colorată.
• Reflexia
– Fenomenul de întoarcere a luminii în mediul din care a provenit, atunci când întâlnește
suprafața de separare dintre două medii cu densități optice diferite.
• Refracția
– Schimbarea direcției de propagare a luminii la trecerea dintr-un mediu transparent în
altul cu densitate optică diferită (indice de refracție diferit).
O rază provenită dintr-un mediu mai puțin dens va fi deviată față de normala la
suprafața de separație dintre cele două medii.
Deviaţia este cu atât mai mare cu cât radiația este de lungime de undă mai mică.
• Difracția
– Devierea de la propagarea rectilinie a unei unde luminoase atunci când întâlnește un
obstacol cu dimensiunea de ordinul lungimii de undă a radiației (fenomenul de ocolire a
obstacolelor).
Cu cât lungimea de undă este mai mică cu atât fenomenul se manifestă mai puțin.
• Dispersia
– Separarea luminii în componentele spectrale, cu lungimi de undă constitutive, atunci
când străbate un mediu optic transparent - schimbarea indicelui de refracţie cu
lungimea de undă (ex: spectrul produs de o prismă sau un curcubeu).
5
 Alte tipuri de radiații de interes
 Fascicule de electroni – pot fi considerate radiatii (dualismul corpuscul – undă
asociată).
Electronul este caracterizat prin moment cinetic iar pachetul de unde asociat prin lungimea
de undă, λ0, legătura dintre ele fiind data de relația lui de Broglie:

h h unde, h – constanta lui Plank;

0   me – masa electronului;
me v 2me eU
U – tensiunea de accelerare a electronului.

Exemplu: pentru U=200kV, lungimea de unda λ0 = 0,0025nm.

 Radiatia X - este o radiatie

electromagnetica cu lungimea de unda mai
mica de ~100nm. Particula atribuită acestui
tip de radiatie este fotonul.

Ex: lungimea de unda a unei radiatii monocromatice obtinute prin bombardarea cu electroni a
unui catod de cupru este de 0,154nm.
Microscopie 1. Optică
2. Electronică
 Microscopul optic

• Instrument optic care utilizează o lentilă

sau o combinaţie de lentile pentru a mări
şi evidenția detaliile fine ale unui obiect.
• Lupele și primele microscoape aveau o
mărire de 5x până la 10x.

8
10x 20x 40x
 Importanță

• Primele metode de examinare a

probelor fizice, în laboratoarele de
criminalistică, s-au bazat aproape
exclusiv pe microscopie pentru a
studia structura și funcțiile
materiei.
9
 Tipuri de imagini
• Imagine virtuală:
- obiectul poate fi observat numai privind
prin lentilă.

Marirea maximă =
= mărire obiectiv x cea mai mare mărire a ocularului

• Imagine reală:
- obiectul poate fi observat direct 10
 Tehnici de mărire a contrastului
Creșterea contrastului prin:
• Folosirea filtrelor colorate
• Iluminare oblică
• Iluminare în câmp luminos (Bright Field)
• Iluminare în câmp întunecat (Dark Field)
• Contrast de fază
• Contrast interferențial
• Microscopie în lumină polarizată
• Microscopie de fluorescență
• Creșterea contrastului – intensificarea culorilor folosind
substante de contrast; prin modificarea temperaturii probei
• Tenici ce folosesc surse cu laseri 11
Caracteristici ale unor tehnici de
mărire a contrastului

12
Istoricul microscopiei optice

13
 Tipuri de microscoape
• Microscop compus

• Microscop stereoscopic

• Microscop de comparație

• Microscop în lumină polarizată

• Microscop în fluorescență

• Microscop electronic de baleaj (SEM & TEM)

• Microspectrofotometru
14
 Cum alegem tehnica de microscopie ce
trebuie să o utilizăm?
1. Ce tip de probă urmează să fie studiată?
2. De ce mărire este nevoie?
3. Doriți sa pregătiti proba în așa fel ca rezultatul sa conducă la
evidențierea anumitor aspecte (detalii)?

1. Ce tip de probă urmează să fie studiată?

Probe diferite au proprietăţi fizice diferite – intenția este să se
observe aproape orice cu ajutorul microscopului!
De exemplu, sângele este structural foarte diferit față de un
diamant al unui inel si prin urmare si tehnica de contrast
folosita pentru observare.
Prin urmare, cerinţele unui microbiolog pentru un microscop15 vor
fi foarte diferite față de cele ale unui producător de bijuterii!
Cum alegem tehnica de microscopie ce
trebuie să o utilizăm?
2. De ce mărire este nevoie?
Celulele roșii din sânge au 6 - 8 µm în diametru – o
dimensiune mică! Veti avea nevoie de o mărire de
minimum 400X pentru a vedea celule roșii din sânge, dar
dacă doriţi să vizualizaţi celulele roșii în detaliu, veţi avea
nevoie de o mărire mai mare. În plus, proba de sânge va
trebui să fie pregătită pe o lamelă de sticlă, astfel încât să
poată fi vizualizate detaliile pe care le doriți.

Un inel cu diamant are aproximativ 1,5 cm în dimensiune si

poate fi văzut cu ochiul liber. Un producător de bijuterii,
poate vedea toate detaliile complicate ale inelului cu o
mărire de 10X – 20X.
16
 Cum alegem tipul de microscop optic?
3. Doriți sa pregătiti proba în așa fel ca să fie
evidențiate anumite aspecte?

Când se așază un diamant într-un inel, bijutierul trebuie să

plaseze cu grijă piatra prețioasă. Pentru aceasta este nevoie
de vedere 3D deoarece acest lucru oferă percepția adâncimii,
care ajută la coordonarea mână-ochi.

Deși celulele roșii din sânge sunt prea mici, se dorește

observarea diferitelor aspecte. Acest lucru ar putea implica
modalități diferite de pregătire a probei de sânge şi / sau
tehnici diferite de iluminare: câmp întunecat sau iluminare în
contrast de fază (a se vedea tehnicile de iluminare).
17
Microscopul compus
ocular
Microscoapele simple au
doar un singur set de
lentile.

Microscoapele compuse
posedă obiectiv și
ocular.
obiectiv
Marirea maximă =
= mărire obiectiv X cea mai mare
mărire a ocularului
 Microscopul compus
• 40-450x mărire (pâna la 1000x ! (650 – 700x))

19
 Microscopul ocular

compus
tub de observare
Monocular

suport pentru
obiective
braț
(ecran)

(ocular)
obiective
controler coaxial
masă probe
(imagine plană masa pentru
intermadiară) probe reglaj grosier

(obiectiv) lentile condensor

(proba)
(condensor) diafragma irisului

(imagine virtuală) sursa de lumină reglaj fin

șasiu 20
Microscopul compus - terminologie
• Sursa câmpului de iluminare - iluminare prin
transmise
• Sursa de epi-iluminare - iluminare prin reflexie
• Diafragma irisului
Binocular
• Parfocal
• Monocular
• Binocular
• Adâncimea câmpului vizual
• Lărgimea câmpului vizual

21
Microscop cu vizualizare pe
deasupra probei (drept)
Sursa câmpului de iluminare
Iluminare prin transmise (în partea de jos)
Sursa de epi-iluminare
Iluminare prin reflexie (în partea de sus)

Sursa de
epi-
iluminare

Sursa
câmpului de
iluminare
Microscop cu vizualizare pe
dedesuptul probei (inversat)
Sursa câmpului de iluminare
Iluminare prin transmise (în partea de sus)
Sursa de epi-iluminare
Iluminare prin reflexie (în partea de jos)

Sursa
campului de
iluminare

Sursa de epi-
illumination
 Microscop stereoscopic
• Cel mai frecvent utilizat in
criminalistică
• Domeniu de mărire 10-125x
• Distanță de lucru mare
– bun pentru artefacte
voluminoase
• Câmp de vedere larg și
adâncime mare de focalizare
(imagini 3-D)
– evidențiază urme în artefacte 24
Microscop stereoscopic

25
Microscopul de
comparație

26
Microscopie în lumină polarizată
Examinarea interacţiunii luminii plan-polarizată cu materia este posibilă cu
ajutorul microscopiei în lumină polarizată.

Lumină polarizată
Ochelari 3D

27
Microscopie în lumină polarizată
(tuburi de observare)

(tuburi intermediare)
(ocular)
(cadru)
(lentile Bertrand)

(analizor)

(buton pentru
pornire/oprire)

(masă rotativă) (control pentru reglarea

(condensor) intensității lămpii)
(polarizor)

(lentilă de focalizare) (buton pentru

reglarea focalizării)
(lampă de halogen
cu tungsten)
(șasiu)
28
 Microscopie în lumină polarizată

Analizor Polarizor

(tub intermediar)
(fata lentilei)

(lentile Bertrand)
(controler pentru
lentilele Bertrand)
(polarizor)

(vernier gradat (controler (controlerul de (polarizor)

orientare (apertura
pentru orientarea polarizor) (controlul numeric
a polarizorului) diafragmei)
polarizorului) (compensator plat) al aperturii)

29
 Microscopie în lumină polarizată
• Analizorul înlăturat din
drumul optic = lumină
plan polarizată;
dă probei
“culoare adevărată”

• Analizorul intercalat în Fibră de poliester în Fibră de poliester în

drumul optic = polarizori lumină plan-polarizată lumină eliptic-polarizată
“în cruce”;
dă probei
“culoare de interferență” 30
Microscopie în lumină polarizată
• Îmbunătățirea contrastului probei prin
intensificarea culorilor
Ex: Fibre vegetale colorate

31
stânga - colorate; dreapta - lumina polarizata
Microscopie în lumină polarizată

• Birefringența

Ex:
Calciul produce două imagini atunci când este plasat peste un creion albastru.
Una dintre imagini apare în mod normal, ca atunci când se privește un obiect prin
sticlă clară. Cealaltă imagine a creionului apare deplasată din cauza naturii luminii
care este dublu refractată.

Atunci când cristalele anizotrope refractă lumina, razele rezultate sunt polarizate şi
se deplasează cu viteze diferite.
Una din raze se deplasează cu aceeaşi viteză în toate direcţiile prin cristal şi este
denumită rază ordinară.
Celelalte raze se deplasează cu o viteză care depinde de proprietăţile structurale
ale cristalului şi este denumită rază extraordinară. 32
 Microscopie în lumină polarizată
• Multe substanțe
cristaline sunt
birefringente
• Analiza medico-legală a
componentelor solului

• Multe fibre
sintetice sunt
birefringente
• Analiza medico-legală a
fibrelor naturale/artificiale

33
 Microscopia electronica de baleiaj
(SEM- Scanning electron microscopy)

34
 Microscopia de baleiaj (SEM)
• Măriri mari (până la 100.000X)
• Adâncime de pătrundere excelentă (3-D)
• Utilizat cu analizor de radiații X, poate
identifica elementele componente ale
probei
Ex: Suspectul a folosit arma
de foc?
Identificarea polenului
35
 TEM conventional (clasic)
• Lentilele condensor lumineaza o parte din proba
folosind fie modul paralel, fie modul focalizat;
• Lentilele obiectivului dau diagrama de difractie
aproape de planul de focalizare (f = 1-3 mm), acest
lucru determinand rezolutia (de obicei 0.1 nm).
• Grosimea probei este ~ 100 nm pentru 300 keV TEM
si pana la 1 μm pentru 1 GeV TEM.
• Diagrama de difractie sau imaginea intermediara
poate fi observata pe un monitor folosind lentile de
proiectie.
• Folosind un contrast de tip camp luminos (fascicolul
transmis), este posibil sa se observe dislocaţii,
precipitate, aglomerări, contururi granulate, interfeţe,
etc.
• Folosind un contrast de tip camp întunecat (fascicolul
difractat), se poate face caracterizarea imperfectiunilor
cristaline ale probei.
• Folosind metoda contrastului de faza (combinarea
celor doua fascicule: transmis si difractat) se obtin
interferente ce evidenţiază reţeaua cristalină
(ordonarea atomilor în reţea).