MICROBIOLOGIE LP 4 (saptamana 03 07. 11. 2008) TEHNICA EXAMENULUI MICROSCOPIC: 1.

. Tehnici de microscopie: examinarea frotiurilor din produse patologice si din culturi bacteriene, colorate A.M., Gram, Ziehl Neelsen, 2. Clasificarea bacteriilor dupa tinctorialitate, forma, mod de dispunere, 3. Evidentierea structurilor facultative (capsula, spori etc). 1. MICROSCOPIE, MICROSCOAPE, TEHNICI DE LUCRU: Microscoape: instrumente cu ajutorul carora pot fi observate si cercetate corpuri foarte mici, sub limita vizibilitatii cu ochiul liber. Obiectele sunt vazute sub un unghi U > unghiul U (sub care sunt vazute obiectele sau ar trebui sa fie vazute, daca ar fi posibil, cu ochiul liber). Se obtin imagini ale obiectelor, mult marite. Marimi ce caracterizeaza instrumentele optice: 1. Puterea de marire sau marirea liniara: = Raportul : marimea imaginii obtinute cu ajutorul instrumentului optic marimea reala a obiectului cercetat (de cate ori este mai mare imaginea fata de obiect), 2. Grosismentul sau marirea unghiulara: = Raportul: tg unghiului sub care se vede imaginea finala tg unghiului sub care se vede obiectul cu ochiul liber = tg U tg U Cele doua marimi fizice 1 si 2 sunt aproximativ egale, dar nu identice. 3. Limita de rezolutie a unui sistem optic: = Limita de separare, Distanta separatoare (d) : distanta minima dintre 2 puncte, necesara ca ele sa fie percepute separat, cu ajutorul sistemului respectiv. Este cea mai mica dimensiune observata cu claritate prin sistemul optic respectiv. Formula Abbe: d = 0,61 ____ n sin unde: d = distanta separatoare, limita de rezolutie, = lungimea de unda a radiatiei folosite in instrumentuil optic respectiv, n = indice de refractie al mediului strabatut de razele luminoase. (In cazul microscoapelor optice, n = indicele de refractie al mediului aflat intre obiect si lentila frontala a obiectivului microscopului) = unghiul de apertura care reprezinta jumatatea conului de lumina ce intra in obiectiv.

n sin: apertura numerica. Ochiul uman are o limita de rezolutie de 0,75 m. 4. Puterea de rezolutie: inversul distantei separatoare: P = 1/ d. Ochiul normal, ca sistem optic, distinge detalii mici, la 0,25m = distanta vederii optime. Pentru a observa detalii cat mai mici ale preparatelor cercetate e necesar sa folosim instrumente optice, a caror limita de rezolutie sa fie cat mai mica, adica putere de rezolutie cat mai mare. In concluzie: pentru caracterizarea fiecarui instrument optic sunt foarte importante Limita de rezolutie si Puterea de rezolutie si nu neaparat puterea de marire. Din analiza formulei Abbe rezulta ca se poate mari Puterea de rezolutie a unui sistem optic (se scade distanta separatoare), fie marind numitorul fractiei (n sin), fie scazand numaratorul (). Concret, Puterea de rezolutie se poate mari: - folosind ulei de imersie, unde n = 1,51 (> n aer = 1), - marirea factorului sin : microscopie cu fond intunecat - utilizarea radiatiilor cu mai mica (Ex: radiatii UV) sau in locul radiatiilor luminoase, utilizarea unor fascicule de electroni sau ioni, cand se folosesc microscoape electronice, ionice. Clasificarea microscoapelor in microbiologie: 1. Microscoape fotonice Radiatiile folosite sunt radiatii luminoase. a) microscop optic obisnuit = microscop fotonic, - radiatiile folosite sunt din domeniul vizibil, - = 380 750 m, - limita de rezolutie (d) = 0,2 microni sau 2000 A, b) microscoape speciale: ultramicroscop sau microscop cu fond intunecat : - foloseste radiatii luminoase din spectrul vizibil, - distanta separatoare sau limita de rezolutie (d) = 0,1 microni, microscop cu contrast de faza: - radiatii din spectrul vizibil, - distanta separatoare (d) = 0,2 microni, microscop cu fluorescenta: - radiatii din spectrul UV, - distanta separatoare (d): 0,1 microni, - = 180 400 milimicroni.(m), 2. Microscoape electronice: - in locul radiatiilor luminoase, se folosesc fascicule de electroni accelerati: a) microscoape electronice cu transmisie: - electroni accelerati, - tensiuni de 50 100 KV,

b) microscoape electronice cu baleiaj sau tip scanning: - undele asociate electronilor, accelerati la 15KV, au = 0,1, - distanta separatoare (d): 20A Microscoape, parti componente: * Microscopul obisnuit, fotonic: - limita de rezolutie (d) = 0,2 microni, - constituit dintr- o parte mecanica si una optica: a) partea mecanica: - piciorul microscopului , baza de sustinere (stabilitate), - coloana microscopului, fixata de picior, reprezinta suport pentru tubul si platina microscopului, - tubul microscopului: * la extremitatea inferioara contine revolverul cu obiective, * la extremitatea superioara prezinta sistemul de montare a ocularelor, asigurand prin constructie, distanta corecta dintre obiective si ocular, precum si coaxialitatea celor 2 sisteme. Tubul este montat pe coloana printr-un sistem de cremaliere, care, printr- o viza macrometrica si una micrometrica, ii permit deplasarea, in scopul cresterii sau scaderii distantei fata de platina microscopului. - platina microscopului: montata in partea inferioara a coloanei microscopului, sub tub, este prevazuta cu un orificiu central, deasupra caruia se aseaza lama de sticla, cu preparatul de examinat. Lama de sticla este fixata cu ajutorul a 2 cavaleri, si poate fi deplasata in plan orizontal, cu ajutorul a 2 suruburi. b) partea optica: - sistem de iluminare, - partea optica propriu- zisa: * sisteme de lentile: obiectiv (spre preparat) si ocular (spre ochi), Sistem de iluminare: - bec cu filament scurt, spiralat, - o lentila colectoare, - diafragmul de camp, - oglinda. Sistemul de iluminare e montat in piciorul microscopului. Ansamblul de lentile constituie condensatorul, prevazut cu un diafragm, numit diafragm de apertura (situat sub platina microscopului). Rolul condensatorului este de a focaliza radiatiile luminoase pe obiectul de examinat. Diafragmul de camp serveste la scaderea campului iluminat pana la strictul necesar, fara ca intensitatea luminoasa sa scada. Diafragmul de apertura este folosit pentru reglarea fasciculului luminos, in functie de obiectivul ales, pentru un bun contrast. Partea optica propriu- zisa: Obiective: - in apropierea preparatului ce se examineaza,

format din mai multe lentile de sticla, cu acelasi ax optic, montate intr- o armatura optica, - lentila frontala- spre preparat, in sistem telescopic, pentru a o proteja in cazul unor loviri accidentale, de lama pe care se afla preparatul, - da imagine marita, reala si rasturnata a obiectului, - lentila frontala da puterea de marire a obiectivului, - celelalte lentile din structura obiectivului au rol de a corija aberatiile celorlalte lentile: aberatia cromatica, de sfericitate, curbura de camp etc. Obiectivele sunt: - Uscate (mediul = aer), - Cu imersie (se interpune intre obiectiv si preparat, ulei de imersie/ ulei de cedru, n > 1), - Obiectivele cu imersie se noteaza cu indicativele: H.I. 60, 90, 100, 120- puterea de marire. Oculare: - ocularul este format din 2 lentile plan- convexe, separate printr-un diafragm, montate intr- un cilindru, care poate fi introdus in partea superioara a tubului microscopului. - imaginea finala formata este marita, virtuala, - puterea de marire a ocularelor e mentionata pe fiecare ocular, cuprinsa intre 3X si 25X, - microscopul binocular poseda 2 oculare identice si formeaza 2 imagini identice, - distanta dintre oculare difera in functie de distanta interpupilara, si este importanta pentru formarea unei singure imagini a obiectului de examinat. b) Microscoape speciale : Microscop cu fond intunecat : - microscop optic obisnuit, la care se adapteaza o sursa de lumina cu intensitate mare si un condensator cardioid (oglinzi sferice concentrice), - cu ajutorul lui se examineaza numai particule mici, de 0,1 m, numai in preparate proaspete, - iluminarea este laterala, perpendiculara pe axa optica a microscopului, - condensatorul cardioid este cu diafragma inchisa, - ridicam condensatorul pana la nivelul platinei microscopului si punem pe lentila condensatorului o picatura de glicerina, - pregatim preparatul proaspat (intre lama si lamela) si il plasam pe platina microscopului astfel incat sa vina in contact cu glicerina de pe lentila condensatorului, - se fixeaza preparatul cu ajutorul cavalerilor, - se examineaza initial cu obiectiv de 10 X, apoi cu obiectivul de 40 X, coborat pana aproape de suprafata lamelei, - cand obtinem imaginea curgerii curentului de lichid/ glicerinei, dintre lama si lamela sau a bulelor de aer din preparatul proaspat, inseamna ca am prins corect campul, - cu ajutorul microvizei se pun la punct detaliile, - Metoda indicata in examinarea morfologiei si mobilitatii caracteristice ale:

- Treponema pallidum in produs patologic (spirochete luminoase, fine, lungi, cu spire regulate, capete efilate, miscari de insurubare, flexie- translatie, pe fond negru), - Leptospira spp (filamente luminoase, spiralate, f. mobile, miscari de insurubare, flexie, pe fond negru). Microscopul cu contrast de faza; - se utilizeaza in studiul structurilor microscopice, in preparate proaspete, necolorate, - permite studierea obiectelor transparente, cu structuri neomogene, determinate de variatia compozitiei chimice sau de variatii de grosime/ densitate, prin transformarea diferentelor de faza ale luminii care traverseaza obiectul, in diferente de intensitate, * obiectivele sunt prevazute in interior cu o placuta de faza, in forma de disc: cu o zona inelara, numita arie conjugata si arie complementara, * diafragmul condensatorului de tip special: Forma inelara, Centrat pe planul placutei de faza, Diafragmul corespunde ariei conjugate, - se priveste prin ocular si se misca segmentul superior pana se vad clar : inelul luminos al diafragmului condensatorului si inelul intunecat al placutei de faza, - se misca vizele condensatorului pana cand cele 2 inele apar concentrice, Microscopul cu contrast de faza, utilizat in studiul preparatelor proaspete, necolorate, e avantajos si pentru examinarea preparatelor slab colorate: ricketzii, leptospire, treponeme. Microscopul cu fluorescenta: - foloseste ca sursa de lumina radiatiile UV din apropierea spectrului vizibil, radiatii cu lungimea de unda = 360- 400 nm. - * Luminiscenta este fenomenul de emitere a unor radiatii luminoase, din spectrul vizibil, de catre o substanta, daca aceasta este supusa actiunii unor radiatii excitante, provenite de la o sursa externa. Se cunosc doua tipuri de luminiscenta:
-7

a) fluorescenta: daca emisia luminoasa este < 10 sec,

-7

b) fosforescenta: daca emisia luminoasa este > 10 sec. Fluorescenta celulelor sau microorganismelor cercetate pote fi de 2 feluri: - fluorescenta primara sau naturala: proprie celulelor sau anumitor microorganisme,

- fluorescenta secundara sau consecutiva cuplarii celulelor de cercetat cu fluorocromi (substante cu proprietati fluorescente. * Fluorocromii: trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: - sa se poata cupla cu anticorpi (Ac), fara a le altera specificitatea sau activitatea (in tehnica de imunofluorescenta), - sa nu- si piarda fluorescenta prin cuplare cu anticorpi (Ac) sau dupa iluminare indelungata, - sa prezinte fluorescenta care sa difere de cea naturala a anumitor preparate de examinat, - fluorocromul sa se poata indeparta complet din conjugatul fluorocrom anticorp. * Fluorocromi frecvent utilizati in practica: - izocianatul de fluoresceina, - izotiocianatul de fluoresceina, - rodamina, - auramina (fluorescenta verde, sensibila la actiunea luminii, ieftina), - eozina (fluorescenta verde). * Aparatura: - microscop cu fluorescenta, care necesita o sursa de UV, - sursa de radiatii UV: lampi de sticla de cuart cu vapori de mercur, - din radiatiile UV se selecteaza cu filtre speciale, radiatiile excitante, cu frecventa mare, care produc fluorescenta, - filtrele de lumina se aseaza intre lampa UV si condensatorul microscopului, - exista filtru care retine radiatiile calorice (filtru anticaloric), - pentru protectia ochilor, se folosesc filtre de absorbtie, de protectie, de baraj etc, - filtrele protectoare sunt dispuse intre obiectiv si lentilele ocular, - obiective cu imersie, - oculare Pentru cresterea claritatii observatiei la microscopul cu fluorescenta, se introduce intre condensator si lama, un lichid de imersie nefluorescent : glicerina neutra, netamponata, ulei de parafina nefluorescent. * Microscopul cu fluorescenta este utilizat in diagnosticul de laborator al tuberculozei si leprei (se foloseste obiectivul de 40 X, nu este nevoie de imersie): - metoda se bazeaza pe colorarea bacililor (Mycobacterium tuberculosis si Mycobacterium leprae) cu auramina la cald, apoi decolorare cu acid alcool, ca si in metoda de colorare Ziehl- Neelsen. Bacilii apar fluorescenti, verzui, fiind singurele elemente din preparat care nu s- au decolorat si au pastrat coloratia cu auramina. * Imunofluorescenta: are ca principiu marcarea anticorpilor (Ac) cu substante fluorescente. Prin tratarea preparatului de cercetat, cu rol de antigen (Ag), cu Ac marcati, se formeaza complexe imune specifice Ag Ac marcati fluorescent, care apar ca inele luminoase, fluorescente, (Ag inconjurat de Ac fluorescenti) in camp intunecat.

Tehnicile de imunofluorescenta sunt metode moderne de diagnostic, prin care se pun in evidenta Ag specifice, complementare Ac- lor marcati fluorescent, in produse patologice prelevate de la bolnavi. In ultimul timp, metoda se aplica si in * histochimie, pentru localizarea Ag in tesuturi: antigene tumorale, antigene de transplant, antigene tumorale. 2. Microscopul electronic: - la microscopul fotonic, limita de rezolutie (d) este de 0,1 m, - imbunatatirea acesteia se poate realiza in microscoapele electronice, in care, examinarea preparatului se face cu un fascicul de electroni, - microscopul electronic foloseste un fascicul de electroni accelerati, cu o viteza de 147 000 km/ sec, lungimea de unda = 0,043, avand o putere de rezolutie (P) imbunatatita, de 100 000 ori mai mare fata de microscopul optic, ce foloseste radiatii UV. * Tipuri de microscoape electronice: a) cu transmisie - este folosit la examinarea unor preparate transparente, la trecerea prin acestea, a unui fascicul de electroni accelerati (sursa de electroni: tub electronic), - lentila condensator = lentila electronica, formata de un camp electric sau electromagnetic (rol de a focaliza electronii pe preparat), - pe platina port- obiect se aseaza preparatul de studiat, sub forma de pelicula fina, transparenta, - lentila obiectiv este o lentila electronica, - imaginea obiectului de cercetat se formeaza pe un ecran fluorescent sau pe o placa fotografica (imaginea se poate fotografia si stoca), - formarea imaginii: electronii strabat preparatul (unde unii sunt absorbiti, altii dispersati), ajung pe ecranul fluorescent, sub forma unui fascicul neomogen ca densitate. Diferentele de luminozitate, traduse prin diferente de fluorescenta pe ecranul microscopului, exprima variatii de densitate ale fasciculului de electroni, in functie de structura preparatului. In functie de preparatul studiat (sectiuni ultrafine prin celule, suspensii de microorganisme, suspensii de organite celulare), microscopul electronic, prin transmisie, permite observarea structurilor interne celulare, structuri de suprafata, etc. b) cu baleiaj: - utilizat pentru studierea suprafetelor obiectelor solide, - imaginea obiectului de studiat se formeaza pe ecranul unui tub cinescopic (TV): cand suprafata unui obiect este explorata de un fascicul fin de electroni, se obtin informatii corecte despre structura acestei suprafete, cu ajutorul electronilor reflectati, Elemente componente: - sursa de elctroni accelerati, - sistem care sa determine baleierea fasciculului de electroni pe suprafata preparatului de examinat, - sistem de detectie a electronilor secundari, reflectati, - sistem de amplificare video a electronilor detectati, - tub cinescopic: transformarea semnalelor electrice video in imagini luminoase pe un ecran, - puterea de rezolutie (P) este mai mica decat la microscopul electronic cu transmisie.

2. Clasificarea bacteriilor dupa tinctorialitate, forma, mod de dispunere, Examinarea unui preparat nativ (proaspat) intre lama si lamela: Pentru bacterii: lama cu preparatul proaspat acoperit de lamela se aseaza pe platina microscopului, fixata cu cavalerii, se coboara obiectivul la 1, 5 cm, diafragma condensatorului se deschide la jumatate, se foloseste obiectivul de 40 X, se coboara tubul microscopului cu ajutorul vizei macro, pana cand obiectivul se apropie de lamela (privind lateral), fara a o lovi, se utilizeaza viza macro pentru a ridica sau cobori tubul cu obiectivul, privind prin oculare, rotind viza macro, se ridica sau coboara obiectivul, pana cand apare campul microscopic cu germenii, punerea la punct a campului se face cu viza micro, se descrie prezenta germenilor, mobilitatea specifica, eventual forma bacteriilor, !!! la identificarea miscarii proprii a bacteriilor sa fim atenti, pentru a o diferentia de miscarea browniana determinata de agitatia termica a moleculelor din lichid.

Examinarea preparatelor colorate (clasificare dupa tinctorialitate) - frotiul colorat se aseaza pe platina microscopului, fixat cu ajutorul cavalerilor, - alegem cu obiectivul uscat (10 X, 40 X) o zona bogata in leucocite/ PMN neutrofile, - ridicam cu macroviza tubul microscopului, punem o picatura de ulei de imersie, in zona pe care dorim s-o examinam, rotim revolverul si alegem obiectivul cu imersie (100 X), - condensatorul cu diafragma complet deschisa se ridica pana sub platina microscopului, - se coboara tubul microscopului cu macroviza, pana cand lentila frontala face priza cu picatura de ulei, fara a tinge lama, - imaginea clara, cu detalii, se obtine rotind microviza, Se examineaza : - morfologia celulelor epiteliale, inflamatorii din produsul patologic, - prezenta leucocitelor, - prezenta bacteriilor si dispunerea acestora: intra- sau extra- leucocitar, - morfologia, tinctorialitatea (Gram pozitiv, Gram negativ) bacteriilor, modul lor de asezare (izolate, diplo, lanturi, gramezi, palisade, unghiuri ascutite/ litere chinezesti etc), aprecierea cantitativa (rare, relativ frecvente, f. frecvente etc), * coloratia albastru de metilen: - se vizualizeaza: celule epiteliale, celule inflamatorii (PMN, limfocite), cu o buna diferentiere a detaliilor structurale, - prezenta bacteriilor: colorate in albastru inchis, - forma si dispunerea bacteriilor, levurilor, - in cazul bacteriilor capsulate (Str. pneumoniae), capsula va aparea ca un halou necolorat, * coloratia Gram:

- permite descrierea morfologiei si tinctorialitatii bacteriilor (Gram pozitive/ violet si Gram negative/ roz), - frotiu din cultura pura: monomorfism al bacteriilor (aceeasi forma, colorabilitate, dispozitie), - frotiu colorat din produs patologic: celule epiteliale, celule inflamatorii, fibrina, detritusuri celulare, prezenta bacteriilor Gram (+), Gram (-) sau Gram la limita (Gramlabile), levuri, intra si extra- leucocitare, * coloratia Ziehl- Neelsen: - bacili acido- alcoolo- rezistenti (BAAR), rosii, fini, granulati, izolati sau grupati in mici gramezi sau in forma de funie/ cord factor (Mycobacterium tuberculosis), - celulele epiteliale sau inflamatorii, precum si alte bacterii raman albastre. Clasificarea bacteriilor dupa forma: 1. Coci: a) Gram (+): culoare violet: - bacterii perfect rotunde, sferice (Staphylococcus aureus): izolate, in diplo, fete adiacente aplatizate, tetrade, gramezi, - bacterii ovalare (Streptococcus pyogenes): izolate, in diplo, lanturi scurte, - bacterii lanceolate (Streptococcus pneumoniae): in diplo, in ax longitudinal, in prelungire, in flacara de lumanare, b) Gram (-), culoare roz rosie: - bacterii rotunde (Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae): in diplo, fete adiacente aplatizate, tetrade, gramezi, 2. Cocobacili Gram (-): - bacterii usor alungite, intermediare intre coci si bacili, bacili scurti: - Haemophilus, - Bordetella pertusis, - Brucella, - Pasteurella. 3. Bacili: a) Gram (+): - bacterii de forma cilindrica, bastonase drepte sau usor incurbate, cu capete rotunjite sau drepte, sporulate sau nesporulate: - Corynebacterium diphteriae: capete maciucate, dispusi in palisade, litere chinezesti, - Listeria monocytogenes: bacili Gram (+) scurti, subtiri, dispusi in palisade, unghiuri ascutite, - Clostridium botulinum, Clostridium tetani (spor rotund- ovalar deformant central, subterminal, terminal), - Bacillus anthracis, B. cereus, B. subtilis (spor cental, subterminal, ovalar, nedeformant), b) Gram (-) : - familia Enterobacteriaceae : E. coli, Klebsiella,. Proteus etc: bacili si cocobacili roz, grosi, capete rotunjite, izolati, diplo, gramezi, - Pseudomonas, - Fusobacterium: bacili fusiformi, lungi si subtiri, capete ascutite (anaerobi). 4. Vibrioni: - bacterii Gram (-), cilindrice, curbate intr- un singur plan, in forma de virgula, semiluna:

- Vibrio cholerae, 5. Spirili si spirochete: - bacterii in forma de spirala, Gram (-), - in cazul spirililor, corpul bacterian este rigid, pe cand la spirochete, corpul este flexibil si subtire: - Borrelia, - Treponema, - Leptospira. 6. Actinomicete: - bacterii care in stadiul culturilor tinere, au aspect filamentos (filamente lungi), Gram (+), - ruperea, fragmentarea filamentelor duce la obtinerea formelor bacilare, cu lungimi variabile, - tendinta de a forma ramificatii. Gruparea bacteriilor: Bacteriile sunt microorganisme unicelulare care se multiplica prin diviziune binara. Modul de grupare este caracteristic speciei, genului sau familiei bacteriene, in functie de orientarea in spatiu a diferitelor planuri succesive de diviziune. a)planuri de diviziune succesiva paralele: bacterii dispuse in perechi: - diplococi: Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, - diplobacili: Klebsiella pneumoniae, - bacterii dispuse in lanturi de lungimi diferite: - streptococi (Strteptococcus pyogenes), - streptobacili (B. anthracis) b)diviziune prin alunecarea celulelor fiice una fata de cealalta: - grupari de bacterii in forma de: - majuscule (Corynebacterium diphteriae), - palisade, - unghiuri ascutite, litere chinezesti, armonica etc... c) diviziune succesiva in 2 planuri perpendiculare: - grupari de 4 celule: tetrade (Mycrococcus tetragenes), d) diviziune succesiva in 3 planuri perpendiculare: - simetri cubica: Sarcina, Sporosarcina e) Grupari neregulate, in forma de ciorchine (Staphylococcus aureus)

2. Coloratii speciale: a) Colorarea sporilor (Verde malachit): - Reactivi:

10

* solutie verde malachit 5%, * fucsina bazica sau fenicata Ziehl 1%, dilutie 1/ 10, - Tehnica colorarii: - lama cu frotiul uscat, fixat la caldura, asezata pe suport, este acoperita cu colorant verde malachit 5%, - se incalzeste la flacara de gaz pana la emisia de vapori, - operatia de incalzire se repeta de 3 ori, in timp de aprox 5 min,. - se raceste, se spala cu apa de robinet, - se recoloreaza cu cu fucsina diluata 1/ 10, timp de 1 min, - se spala, se usuca, se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie, - corpii bacterieni apar rosii, sporii colorati in verde. b) Colorarea capsulei (coloratia HISS): - Reactivi: * solutie de violet de gentiana, dilutie 1/ 20, * sulfat de cupru 20% in apa distilata, - Tehnica colorarii : - frotiul subtire, fixat la caldura, este acoperit cu violet de gentiana, - incalzire la flacara pana la emisia de vapori, - se lasa la racit 30 sec, - se spala cu solutie de sulfat de cupru, - dupa uscare se examineaza : bacilii apar violeti, iar capsula roz. In coloratii obisnuite, capsula poate sa apara ca o zona refringenta, luminoasa, in jurul bacteriei. Ex: la coloratia albastru de metilen (AM), germenii apar intens colorati in albastru, iar capsula apare ca un halou luminos, necolorat, in jurul lor.

11