Caiet LP Microbiologie 1

Îndrumător practic de Bacteriologie generală
MĂSURI DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN

LUCRĂRILE DE LABORATOR
În laboratorul de bacteriologie se impune respectarea unor norme

obligatorii de protecţia muncii, stabilite de ministerele de resort şi
prelucrate periodic, cu întregul personal muncitor. În principiu, se vor
respecta următoarele norme:
• Lucrările de laborator se vor efectua numai de personal special
instruit, echipat cu îmbrăcăminte corespunzătoare (halat, şorţ,
bonetă, iar pentru anumite lucrări mască, ochelari, mănuşi şi
cizme de cauciuc etc.).
• La efectuarea necropsiilor se recomandă folosirea în exclusivitate
a instrumentarului, iar operaţiunile care impun manipulări directe
cu mâna trebuie executate sub protecţia unor mănuşi de cauciuc.
Instrumentarul folosit se supune sterilizării şi apoi curăţării.
• Manipularea materialului infectat (culturi microbiene, organe,
cadavre de animale mici) se va face numai în dreptul unei surse
de căldură (flacăra becului de gaz), cu deosebită atenţie, pentru a
evita difuzarea germenilor. După examinare, se sterilizează atât
instrumentarul, cât şi materialul patologic.
• După terminarea lucrărilor, mesele din laboratoare se
dezinfectează cu sublimat coroziv 0,1%, sau fenol 5%, timp de 10
– 20 minute.
• Dacă în timpul lucrărilor se sparge un recipient care conţine
material patologic sau culturi microbiene, suprafaţa contaminată
se va acoperi cu un dezinfectant, şi numai apoi se execută
curăţarea mecanică. Echipamentul stropit cu material patologic se
va steriliza prin autoclavare. De altfel, în laboratorul disciplinei,
orice accident trebuie adus la cunoştinţa cadrului didactic, care va
lua măsurile corespunzătoare pentru evitarea oricărui pericol de
contaminare.
• În laboratoare este interzis consumul alimentelor, iar în timpul
lucrului se evită atingerea cu mâna a feţei, părului etc.
• După executarea lucrărilor, personalul trebuie să se spele pe
mâini, şi apoi să se dezinfecteze cu alcool, sau, când se impune
o dezinfecţie mai severă, cu soluţie 0,1% de sublimat de mercur.
8
• Animalele de laborator infectate experimental vor fi ţinute în

camere speciale, în cutii speciale pentru rozătoare, cu etichete
care indică materialul cu care s-au infectat, iar de îngrijirea lor se
va ocupa personal instruit special în acest scop.
• Personalul din laborator trebuie să cunoască şi să fie instruit
periodic în privinţa funcţionării şi manipulării utilajelor şi aparaturii
din dotare, cu menţiunea că acestea vor funcţiona numai
supravegheate (autoclav, centrifugă, baie de abur, termostat,
sistemul de gaz etc.).
9
1. TEHNICA MICROSCOPIEI
Microorganismele sunt cele mai vechi, numeroase si

diversificate forme de viaţă pe pământ. Microorganismele au fost
descoperite relativ tardiv, după anul 1680. Datorită dimensiunilor
mici, studiul lor a trebuit să aştepte descoperirea microscopului.
Prima persoană care a văzut si a descris microorganisme a fost
Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), un postavar de meserie,
care avea pasiunea șlefuirii lentilelor și care examina tot ce îi cădea
la îndemână, făcând descrieri și desene amănunțite.
Microscopul pe care Antony van Leeuwenhoek l-a construit
singur, era constituit dintr-o lentilă biconvexă montată într-un cadru
metalic, cu o mărire de până la 270 de ori (fig. 1).
Figura 1. Antony van Leeuwenhoek și primul său microscop (original)
10
În secolele XIX și XX microscoapele au evoluat și s-au

perfecționat foarte mult, ajungându-se de la cele cu un singur ocular
și sursă naturală de lumină la microscopul electronic și microscopul
electronic și baleiaj (scanning microscopul)
***
În domeniul microbiologiei se folosesc mai frecvent, din
multitudinea de microscoape care există, trei tipuri și anume:
► microscopul optic cu lumină;
► microscopul cu câmp întunecat;
► microscopul cu contrast de fază.
Microscopul optic cu lumină poate fi utilizat pentru observarea
microorganismelor colorate prin diferite metode de colorare.
Microscopul cu câmp întunecat şi microscopul cu contrast de
fază permit amplificarea optică a contrastului dintre organism şi
fundal, prin utilizarea unor condensatoare speciale. În microscopia
cu contrast de fază, diferenţele mici în ceea ce priveşte proprietăţile
de refracţie a microorganismelor şi a mediului apos sunt transformate
în variaţii corespunzătoare ale luminozităţii, astfel că
microorganismele vor fi observate ca diferite grade de luminozitate
pe un fundal întunecat. Microscopia cu contrast de fază permite
studiul detaliilor structurale din interiorul celulelor vii.
1.1. Microscopul optic (cu câmp luminos)
Este un microscop ce permite razelor de lumină să treacă

direct spre ochi, fără a fi deviate de un câmp opac situat în
condensator. Mai este denumit microscop cu câmp luminos.
Deşi toate microscoapele cu câmp luminos au anumite
caracteristici comune, totuşi acestea pot prezenta anumite diferenţe
din punct de vedere mecanic.
11
Componentele principale ale microscopului optic (fig. 2) sunt:

microscopului.
• cadrul microscopului
• platanul
• sursa de lumină
• sistemul de lentile
• condensatorul
• obiectivele
• ocularele
• vizele de focalizare
Figura 2. Părțile componente ale microscopului optic (1)
12
Cadrul microscopului. Este o structură rigidă, alcătuită din

baza şi braţul microscopului. Pe această structură sunt montate toate
celelalte componente.
Platanul. Este platforma orizontală pe care se aşează
preparatele pentru examinar. Platanul prezintă două componente:
- dispozitivul de prindere, cu care se fixează preparatul;
- mecanismul de reglare, cu ajutorul căruia preparatul poate fi
mutat pe platan.
Sursa de lumină. La marea majoritate a microscoapelor, în
bază este montată o sursă de lumină, a cărei intensitate poate fi
reglată folosind butonul de reglare a intensităţii luminoase.
Sistemul de lentile. Acesta este compus din trei seturi de
lentile:
- condensatorul
- obiectivele
- ocularele
Condensatorul este situat sub platan și are rolul de a colecta
şi a concentra lumina pe proba de analizat, pentru o mai bună
iluminare. Condensatorul poate fi ridicat sau coborât cu ajutorul unui
buton rotativ, situat, de asemenea, sub platan. Marea majoritate a
condensatoarelor prezintă o diafragmă, care permite reglarea
cantității de lumină ce ajunge la preparat.
Obiectivele furnizează o imagine inversată şi mărită a probei
de analizat (a preparatului, a frotiului). In general, un microscop
dispune de trei sau mai multe obiective, ataşate pe un port-obiectiv
circular, ce permite rotirea acestora. De regulă, puterea de mărire a
obiectivelor de pe un microscop este cuprinsă între 4 şi 100X, după
cum urmează:
- obiectiv de putere mică – 4X;
- obiectiv de putere medie – 10X;
- obiectiv de putere mare – 40X şi
13
- obiectiv de imersie – 100X.

Ocularele sunt situate în partea superioară a microscopului,
este compus din două sau mai multe lentile şi asigură o mărire
suplimentară a imaginii furnizate de obiectiv, de regulă de 10X.
Reglarea ocularelor se realizează prin ajustarea distanţei
dintre acestea, prin apropierea sau îndepărtarea acestora, în funcţie
de distanţa pupilară a examinatorului
Vizele de focalizare. Sunt situate pe partea laterală a
microscopului şi dispuse concentric. Acestea permit ajustarea
grosieră (macroviza) şi ajustarea fină (microviza) a imaginii
preparatului.
Puterea de rezoluţie a sistemului de lentile este determinată
de deschiderea prin care trece lumina care ajunge la preparat
(apertură), de lungimea de undă a luminii şi de designul
condensatorului.
Rezoluţia optimă a celor mai bune microscoape cu obiective
de imersie este de 0,2 µm. Acest lucru înseamnă că două obiecte
situate la o distanţă de 0,2 µm vor fi văzute ca entităţi separate,
obiectele situate la o distanţă mai mică vor fi văzute ca un singur
obiect.
Pentru a obţine o rezoluţie cât mai bună de la un sistem de
lentile, trebuie ţinut cont de următorii factori:
- un filtru de culoare albastră, care trebuie plasat
deasupra sursei de lumină, deoarece lungimea de undă
scurtă a luminii albastre permite obţinerea unei rezoluţii
maxime;
- condensatorul trebuie poziţionat cât mai sus posibil,
pentru a permite pătrunderea în obiectiv a unei cantităţi
maxime de lumină;
14
- diafragma nu trebuie să fie prea închisă, deoarece prin

închidere, deşi se îmbunătăţeşte contrastul imaginii, se
reduce apertura;
- uleiul de imersie, care se utilizează în cazul în care se
foloseşte obiectivul de imersie (100X), trebuie să fie de
buna calitate.
Trebuie reţinut faptul că odată cu creșterea puterii de mărire
trebuie crescută şi rezoluţia. Prin simpla utilizare a unor oculare cu
putere de mărire de 20X nu se va obţine şi o creştere a rezoluţiei.
1.2. Modul de utilizare a microscopului optic
Puterea (gradul) totală de mărire a microscopului este obţinută

prin înmulţirea valorii obiectivului cu cea a ocularului (maximum
1000X).
Un microscop cu patru obiective are următoarele puteri de
mărire:
- putere redusă, respectiv o mărire de 40X, cu un
obiectiv de 4X;
- putere medie, respectiv o mărire de 100X, cu un
obiectiv de 10X;
- putere mare, respectiv o mărire de 400X, cu un obiectiv
de 40X;
- putere foarte mare, respectiv o mărire de 1000X, cu un
obiectiv de imersie de 100X.
Următoarele recomandări şi sugestii sunt necesare în vederea
unei utilizări corecte a microscopului:
Poziţionarea microscopului trebuie să se facă dependent de
înălţimea examinatorului. Examinatorul, în timpul lucrului trebuie aibă
o poziţie relaxată, care să ii permită să îşi sprijine coatele pe masă,
să ajungă cu mâinile la vizele microscopului. Acest aspect se poate
15
asigura folosind un scaun rotativ, care permite reglarea înălțimii

așezării la masa de lucru.
1.2.1. Examinarea preparatelor native
Examinarea inițială a preparatelor native, pentru care

utilizarea uleiului de cedru nu este necesară, se face mai întâi cu
obiectivul care are puterea de mărire cea mai mică redusă (10X),.
Principalul motiv pentru care se recomandă acest lucru este
posibilitatea de explorare a preparatului, în vederea identificării
formaţiunii care urmează a fi studiată. După identificare, se poate
trece la utilizarea obiectivelor cu indici de mărire superiori (40X).
În vederea utilizării obiectivului cu putere redusă de mărire se
recomandă parcurgerea următorilor paşi:
- se poziţionează pe platan preparatul cu materialul de
examinat în sus, apoi cu ajutorul mecanismelor de
deplasare a platanului se aduce materialul de cercetat
exact în centrul sursei de lumină;
- se pornește sursa de lumină utilizând în primă fază, un
voltaj minim;
- se verifică poziţia condensatorului, care trebuie să fie
ridicat la maximum;
- folosind macroviza, se ridică la maximum platanul cu
preparatul, mecanismul de blocare al microscopului va
împiedica contactul direct al obiectivului cu preparatul;
- se ajustează poziţia ocularelor, în funcţie de distanţa
pupilară a examinatorului;
- privind prin oculare se focalizează imaginea coborând
foarte ușor platanul cu ajutorul macrovizei;
- după prinderea imaginii se utilizează microviza pentru a
clarifica imaginea;
16
- după ce imaginea devine vizibilă, se deplasează uşor

preparatul în sus și în jos, dreapta -stânga, cu ajutorul
mecanismului de reglare a platanului, pentru a examina
întreg preparatul și a găsi structura cea mai concludentă;
- după identificarea structurii care urmează a fi examinată,
se poate trece la creşterea gradului de mărire a imaginii
utilizând obiectivul de 40X; înainte de schimbarea
obiectivelor, prin rotirea port-obiectivului, ceea ce se
dorește a fi examinat trebuie să fie fizat în centrul câmpului
microscopic.
1.2.2. Examinarea cu obiectivul de imersie
Numele acestui tip de obiectiv derivă de la faptul că un ulei

mineral special este poziţionat între lentila obiectivului şi preparatul
microscopic. Acest tip de ulei este utilizat întrucât are un grad (index)
de refracţie identic cu cel al sticlei şi previne pierderea unei cantităţi
considerabile de raze luminoase datorită refracţiei prin aer. Utilizarea
lichidului de imersie îmbunătăţeşte puterea de rezoluţie a
microscopului.
Obiectivul de imersie NU SE FOLOSEŞTE NICIODATĂ FĂRĂ
ulei de imersie. Dacă uleiul de imersie nu este clar, acesta trebuie
înlocuit.
În momentul utilizării obiectivului de imersie se recomandă
deschiderea totală a diafragmei. O diafragmă închisă poate altera
puterea de rezoluţie a microscopului. Condensatorul trebuie să
rămână poziţionat la nivelul cel mai de sus posibil. Dacă este posibil,
poziţionaţi în faţa sursei de lumină un filtru suplimentar, de culoare
albastră sau verde.
În principal se parcurg aceeași pași ca și la examinarea cu
obiectivele de putere mică, doar că pe preparatul de pe lamă se
17
depune o picătură de ulei de cedru, lasând să cadă picătura de la

sine, fără a atinge preparatul cu marginile sticlei în care este păstrat
uleiul de cedrul. Preparatul pe care s-a depus picătura se plasează
pe platanul microscopului. și de orientează în așa fel încât să fie cu
picătura în centrul luminii. Se ridică platanul la maxim în așa fel încât
obiectivul de 100X să pătrundă în picătură. Microscoapele moderne
posedă un dipozitiv care blochează la un moment dat obiectivul și
anulează posibilitatea pătrunderii acestuia în lamă și ca urmare
spargerea ei. Coborârea platanului în vederea prinderii imaginii
trebuie făcută cu foarte mare finețe deoarece datorită obiectivului cu
putere mare de mărire se trece ușor peste imagine
LA FINALUL EXAMINĂRII, SE VA ÎNDEPĂRTA ULEIUL DE

IMERSIE DE PE LENTILE, cu ajutorul unui material pentru îngrijirea
lentilelor, aşa cum a fost descris anterior.
1.2.3. Îngrijirea microscopului
Microscopul necesită o atenţie deosebită, pentru a preveni

distrugerea componentelor optice (lentilelor) şi a celor mecanice. Mai
mult decât atât, datorită complexităţii sale, microscopul necesită
anumite ajustări, care se realizează periodic.
Întreţinerea aparatului. Deoarece microscopul reprezintă o
investiţie considerabilă şi poate fi foarte uşor dereglat, este foarte
important ca aparatul sa fie utilizat cu deosebită grijă. De asemenea,
o importanţă deosebită trebuie acordată curăţirii microscopului, după
terminarea lucrului.
Pentru a preîntâmpina dereglarea microscopului, se fac
următoarele precizări:
► transportul microscopului dintr-un loc într-altul se
realizează ținând microscopul cu ambele mâini: o mână pe
18
braţul microscopului şi o mână sub talpa microscopului,

pentru a se evita pericolul lovirii de piesele de mobilier ori
de alte obiecte. Se interzice transportul de către aceeaşi
persoană, a două sau mai multe microscoape simultan;
► masa de lucru, în timpul utilizării microscopului, va fi
menţinută în ordine, toate obiectele care nu sunt necesare
în timpul examinărilor efectuate la microscop (cărţi, caiete,
stilouri, pixuri, creioane, penare) vor fi puse în bancă;
► cordonul de alimentare de la sursa de curent va fi
poziționat în aşa fel încât să se evite posibilitatea agăţării
lui şi răsturnării microscopului;
► îngrijirea lentilelor – la începutul şi la sfârşitul fiecărui
laborator lentilele vor fi verificate pentru a fi curate, uleiul
de cedru folosit pentru obiectivul de imersie (100X) va fi
îndepărtat cu hârtie şi xilen;
► protecţia împotriva prafului va fi asigurată prin
acoperirea microscopului cu husa de protecţie, la sfârşitul
fiecărui laborator.
Îngrijirea microscopului după terminarea lucrului. În acest

sens se parcurg mai mulți pași:
✓ se îndepărtează preparatul de pe platan;
✓ se șterg lentilele atât de la nivelul ocularelor, cât și de la nivelul
obiectivelor
✓ dacă în timpul examinării s-a folosit obiectivul de imersie, se
îndepărteazăi orice urmă de ulei de imersie de pe obiectiv;
✓ în cazul în care se dorește păstrarea unui preparat, nu se
îndepărtează uleiul de imersie de pe acesta;
✓ se aduce în poziţie verticală obiectivul cu putere redusă de
mărire, prin rotirea port-obiectivului;
19
✓ după debranşarea de la reţea, se înfăşoară cordonul în jurul

bazei microscopului;
✓ se ajustează poziţia platanului în aşa fel încât centrul acestuia
să fie sub obiectiv;
✓ se acoperă microscopul cu husa de protecţie
Menţinerea curată a lentilelor microscopului reprezintă o

preocupare constantă. În cazul în care chiar şi una dintre lentile este
prăfuită, ori cu urme de ulei, puterea maximă de rezoluţie nu poate fi
obţinută. Pentru curăţirea lentilelor se recomandă următoarele:
• materialul textil cu care se şterg lentilele trebuie să nu lase
scame şi să nu fie abraziv;
• solventul cel mai des utilizat pentru curăţirea lentilelor
obiectivelor este xilenul; cu maximum de precauţie pot fi
folosite şi alcoolul ori acetona, dar doar sub stricta
îndrumare a instructorului;
• obiectivele murdărite cu ulei de imersie, ori cu material de
pe preparatele examinate, se şterg cu fie cu ajutorul unui
material textil, fie cu ajutorul unui beţişor cu vată
• ocularele se şterg, de asemenea, cu un material textil
moale, care nu lasă scame;
•condensatorul, pe care se acumulează adesea praf, se
şterge, atunci când este nevoie, cu material textil care nu
lasă scame.
Parcurgerea paşilor mai sus menţionaţi dovedeşte că există
respect față de colegii care urmează să lucreze pe microscoape
20
1.3. Microscopul cu câmp întunecat
Microorganismele vii, datorită structurilor foarte fine şi

transparenței lor, pot fi mai uşor studiate cu ajutorul microscopului cu
câmp întunecat. Această metodă de examinare este utilizată mai
ales pentru identificarea spirochetelor.
Pentru a obţine efectul de câmp întunecat, fascicolul de raze de
lumină, care ajunge la obiectiv, trebuie alterat în aşa fel încât doar
razele incidente oblic să poată fi observate. Gradul de înclinare
trebuie să fie atât de mare, încât dacă nu există nici un obiect în
câmp, câmpul trebuie să rămână complet întunecat. Obiectele din
câmp devin strălucitoare datorită razelor de lumină reflectate prin
sistemul de lentile al microscopului (fig. 3).
Figura 3. Imagine obţinută la microscopul cu câmp întunecat a speciei

Borrelia burgdorferi – agentul etiologic al bolii Lyme (14).
Deşi există numeroase metode de a produce câmp întunecat,

variantele cel mai des utilizate sunt diafragma în formă de stea şi
condensatorul cardioid.
21
1.4. Microscopul cu contrast de fază
Un microscop care permite diferenţierea structurilor

periplamatice transparente fără a colora şi a omorî microorganismele
este microscopul cu contrast de fază.
Dificultăţile întâmpinate în încercarea de a examina organitele
celulare se datorează faptului că cea mai mare parte a materialului
periplasmatic este transparent. Din acest motiv, în studiile citologice
în microscopia cu câmp luminos se utilizează preparate (frotiuri)
colorate. Deoarece metodele de colorare determină moartea
celulelor, este clar că prin studierea microorganismelor pe frotiuri
colorate de cele mai multe ori se observă mai degrabă artefacte şi nu
celule vii.
Microscopia cu contrast de fază permite obţinerea unor
diferenţieri mult mai bune a componentelor intracelulare (fig. 4).
Figura 4. Comparaţie între imaginea obţinută cu microscopul cu câmp luminos

(stânga) şi cea cu microscopul cu contrast de fază (dreapta) (1)
22
1.5. Microscopul cu fluorescenţă
Microscopul cu fluorescenţă diferă din multe puncte de vedere

de microscopul cu câmp luminos.
În primul rând, sursa de lumină este reprezentată de o lampă cu
arc în vapori de mercur.
În al doilea rând, un condensator cu câmp întunecat este folosit
în locul condensatorului clasic Abbé, utilizat în microscopia clasică.
A treia mare diferenţă este reprezentată de faptul că utilizează
trei seturi de filtre pentru a modifica lumina care trece prin microscop
spre oculare.
Principiul de funcţionare a microscopului cu fluorescenţă se
bazează pe faptul că lumina reprezintă o formă de energie care se
propagă sub formă unor unde. O caracteristică interesantă a unei
astfel de unde electromagnetice este reprezentată de faptul că poate
influenţa electronii unor molecule pe care lumina le întâlneşte,
determinând interacţiuni semnificative. Într-o astfel de moleculă,
electronii care nu sunt puternic ataşaţi pot fi puşi în mişcare prin
oscilarea razei de lumină. Aceşti electroni nu doar că nu se vor mai
mişca în mod natural, ei vor fi forţaţi să oscileze în rezonanţă cu
unda de lumină care trece printre ei. Excitaţia cauzată de oscilaţie
necesită energie, energie care este furnizată chiar de raza de lumină.
Când un corp absoarbe energie, aşa cum e cazul moleculelor
activate, energia nu dispare, ci apare, din nou, sub altă formă. Noua
manifestare a energiei poate fi sub forma unei reacţii chimice,
căldură ori lumină. Fenomenul prin care moleculele energizate emit
lumină se numeşte fotoluminescenţă. În acest proces există
întotdeauna o perioadă foarte scurtă de timp între momentul
absorbţiei şi cel al emisiei luminii. Dacă intervalul de timp este mai
mare de 1/10.000 dintr-o secundă fenomenul se numeşte
23
fosforescenţă. Dacă intervalul de timp este mai mic decât pragul

menţionat anterior, fenomenul se numeşte fluorescenţă.
Pentru a putea fi studiat cu un asemenea microscop, materialul
microbiologic trebuie tratat în prealabil cu compuşi speciali, cu
proprietăţi fluorescente. Aceşti compuşi poartă numele de
fluorocromi. Cei mai cunoscuţi fluorocromi sunt reprezentaţi de
acridină, auramina O şi fluoresceina. Capacitatea ori proprietatea
unui material de a fi fluorescent depinde de structura moleculară, de
temperatură şi de pH-ul mediului.
În principiu, microscopul cu fluorescenţă este alcătuit din:
- sursă de lumină (bec cu vapori de mercur, care produce
lumină în gama ultraviolet – violet – albastru, cu lungimea de undă
între 200 şi 400 nm);
- filtru de căldură (care absoarbe căldura şi razele infraroşii
produse de sursa de lumină);
- filtru de excitare (care absoarbe razele de lumină cu alte
lungimi de undă decât cea dorită);
- condensator (asemănător cu cel de la microscopul cu câmp
întunecat);
- filtru barieră (poziţionat între obiectiv şi oculare, are rolul de
absorbi orice urmă de rază de lumină nedorită, astfel încât să poată fi
observată fluorescenţa).
Microscopul cu fluorescenţă este un instrument indispensabil în
anumite cercetări sau încercări de a stabili un diagnostic. Tehnicile
imunofluorescente şi coloranții diferenţiali au permis ca stabilirea
unui diagnostic de laborator în numeroase boli să se realizeze mult
mai simplu şi mai rapid, comparativ cu tehnicile de examinare
descrise anterior, datorită imaginilor obținute (fig. 5).
24
Figura 5. Imagine obţinută la microscopul cu fluorescenţă (22)
25
2. METODE DE STERILIZARE
Sterilizarea este o noţiune largă, care se referă la orice proces

care elimină (îndepărtează) sau omoară toate formele de viaţă,
inclusiv agenţi transmisibili (cum ar fi fungi, bacterii, virusuri, forme
sporulate sau alte microorganisme) din interiorul şi de pe suprafaţa
unui produs sau a unui obiect.
Sterilizarea poate fi obţinută cu ajutorul agenţilor fizici sau
chimici sau o combinare corespunzătoare a acestora. (căldură,
presiune, radiatii, ultasunete, filtrare si substanţe chimice). Recent,
termenul a inclus si dezactivarea sau distrugerea unor proteine cum
ar fi prionii (proteine responsabile de boli cum ar fi ESB).
2.1. Sterilizarea prin agenţi fizici
2.1.1. Sterilizarea prin căldură
Căldura reprezintă unul dintre cei mai importanţi agenţi

sterilizanţi, acţionând prin alterarea componentelor chimice de bază
ale bacteriilor (enzime, proteine), fiind utilizată atât sub formă umedă,
cât şi sub formă uscată. Steriliyarea se poate face folosind caldura
uscataşi caldura . umedă
2.1.1.1. Sterilizarea prin căldură uscată
Se realizează, în principal, prin patru metode:

- flambarea;
- încălzirea la roşu;
- arderea;
- sterilizarea cu aer cald.
26
FIambarea este cea mai simplă metodă de sterilizare şi constă

în trecerea repetată a suprafeţei de sterilizat prin flacăra becului de
gaz. Se utilizează pentru sterilizarea suprafeţelor exterioare a
pipetelor, a deschiderii eprubetelor şi flacoanelor (fig. 6), în momentul
folosirii lor, sau a unor instrumente metalice.
Figura 6. Flambarea eprubetei (17)
În condiţii de teren, flambarea se poate folosi la sterilizarea

cuştilor sau a adăposturilor neinflamabile. Operaţiunea se execută
prin trecerea flăcării lămpii de benzină sau a becului de gaz peste
suprafeţele de sterilizat.
Încălzirea la roşu se utilizează la sterilizarea anselor de
însămânţare, a spatulelor sau a altor obiecte metalice. Se realizează
prin menţinerea obiectului de sterilizat în flacără, până la înroşire.
Sterilizarea corectă a ansei de însamânţare se face prin încălzirea
până la roşu începand cu vârful firului ansei până la baza acestuia şi
apoi se prin flambarea tijei acesteia (fig. 7).
27
Figura 7. Sterilizarea prin încălzirea la roșu a ansei microbiologice (17)
Arderea (incinerearea) se aplică pentru sterilizarea materialelor

contaminate care se pot distruge în acest mod (în crematorii), sau
pentru sterilizarea unor zone de pe suprafaţa unor organe din care
urmează să se facă însămânţări sau alte examene bacteriologice.
Pentru aceasta se aplică pe suprafaţa organului o spatulă metalică
înroşită în foc, pentru câteva secunde.
Sterilizarea propriu-zisă prin aer cald se realizează în
cuptoare electrice (etuve, cuptoare Pupinel) prevăzute cu sisteme de
termoreglare (fig. 8)
28
Figura 8. Etuvă (23)
Aceste aparate au aspect paralelipipedic sau cilindric

(dependent de capacitatea lor) fiind formate din pereti metalici dubli,
între care este montată sursa de căldură, una sau mai multe
rezistenţele electrice. Peretele extern este placat cu un strat de
material termoizolant pentru a se reduce pierderea căldurii din
interior. Peretele interior este prevazut cu orificii pentru a permite
pătrunderea aerului cald în interiorul aparatului, care de regulă este
mişcat de unul sau două ventilatoare. Etuva este prevăzută cu
sistem de fixare şi de monitorizare a temperaturii (termometru) şi
sistem de reglare a timpului de funcţionare
Materialele care se sterilizează la etuvă (cu aer cald) sunt de
regulă Sterilizarea prin căldură uscată (etuvare) se aplică sticlăriei de
laborator (sticlă fuzibilă, pipete Pasteur, pipete gradate, flacoane
Erlenmeyer, plăci Petri etc.) şi instrumentarului metalic (pense,
29
bistuie, foarfece). Acestea, în prealabil, se spală, se usucă,

flacoanele se închid cu dopuri de vată învelite în tifon şi se
împachetează în hârtie albă.
O sterilizare perfectă se realizează la temperatura de 160 -
180°C, timp de 1 oră.
La această temperatură, hârtia în care au fost împachetate
obiectele, devine gălbuie, fapt ce indică o bună sterilizare. În caz că
se depăşeşte această temperatură, hârtia se înnegreşte,
carbonizându-se şi devenind extrem de friabilă, ceea ce nu mai
asigura condiţia de steril după scoaterea obiectelor din etuvă. Există
folii speciale cu care se pot împacheta obiectele care urmează a fi
sterilizate. Aceste folii se închid prin intermediul unei etichete
autocolante, care au pe suprafaţa lor un indicator de sterilizare, a
cărui culoare virează în momentul în care sterilizarea este completă.
2.1.1.2. Sterilizarea prin căldură umedă
Căldura umedă se foloseşte pentru sterilizarea unor soluţii, a

mediilor de cultură şi a unor obiecte metalice şi din sticlă.
Sunt folosite patru metode:

- sterilizarea prin fierbere
- sterilizarea prin aburi sub presiune (autoclavarea);
- pasteurizarea;
- tindalizarea
Sterilizarea prin fierbere. Se utilizează mai ales pentru

instrumentarul metalic (seringi, ace, pense, bisturie etc.) şi pentru
diferite obiecte din cauciuc. În acest scop se folosesc sterilizatoare
electrice (fig. 9), care sunt prevăzute cu o cuvă specială, aşezată
peste partea cu rezistenţa electrică, dar perfect izolată de aceasta, în
care se aşează obiectele de sterilizat. Acestea se acoperă cu apă în
30
așa fel încât să se asigure menținerea lor imersă pe tot parcursul

procedurii şi se fierb timp de 30 minute din momentul în care apa
începe să clocotească. Eficienţa sterilizării se poate mări, dacă se
adaugă în apă borax sau carbonat de sodiu în concentraţie de 4-5%,
substanţe care ridică punctul de fierbere al apei.
Figura 9. Fierbător electric (16)
Autoclavarea (sterilizarea în vapori de apă sub presiune). Se

face în autoclave la presiune de 1 – 2 atmosfere, când vaporii
supraîncălziţi ating temperaturi între 117 - 120°C. Pentru o sterilizare
corectă trebuie să se menţină această temperatură timp de 20 – 30
minute.
Prin autoclavare se sterilizează mediile de cultură, materialele
patologice, sticlărie, câmpuri operatorii, pansamente, vată, filtre
bacteriologice etc.
Autoclavul este format dintr-un cazan metalic cu pereţi groşi,
care se închide ermetic cu un capac metalic greu. Aparatul este
prevăzut cu supapă de siguranţă, robinet de evacuare a vaporilor,
manometru indicator de nivel, robinet de scurgere a apei; pâlnie de
alimentare cu apă (fig. 10). Autoclavul va funcţiona numai sub
supravegherea unei persoane instruite, pentru a evita accidentele.
31
Capac
Supapa de Cuva
sigurantă
Orificiu de Grilaj
evacuare
Rezistența
electrică
Figura 10. Schema de organizare a autoclavului (19)
Există şi autoclave mai moderne, prevăzute cu generatoare de

abur şi cu sisteme automatizate de funcţionare (combine de
sterilizare)
Presiunea şi implicit temperatura din interiorul autoclavului sunt
controlate cu ajutorul manometrului, dar se poate recurge la nevoie şi
la determinări cu ajutorul unor substanţe care la temperatura camerei
sunt solide dar peste anumite limite cunoscute, se lichefiază. În acest
scop, ele se introduc în tuburi capilare, închise la flacără, care se pun
în autoclav odată cu materialele de sterilizat şi se verifică dacă la
deschiderea capacului sunt sau nu în stare lichidă, aceasta indicând
atingerea temperaturii dorite. Dintre substanţele cele mai folosite pot
32
fi amintite următoarele, împreună cu punctul de topire: acidul oxalic -

101°C, benzonaftolul - 110°C, chinina - 116°C, sulful (floarea de sulf
- 120°C, acidul benzoic - 121°C, ureea - 132°C.
În vederea sterilizării materialele trebuie pregătite
corespunzător:
- pipetele gradate se astupă la extremitatea prin care se aspiră,
cu un dop de vată, după care se învelesc în hârtie sau staniol;
- plăcile Petri şi mojarele se împachetează în hârtie de ambalaj;
- bucăţile de ţeavă de sticlă din care se confecţionează pipetele
Pasteur se astupă la ambele capete cu dopuri de vată şi se
ambalează în hârtie, câte 20 - 30 într-un pachet ;
- baloanele se astupă cu dopuri de vată, se înveleşte gâtul
acestora cu hârtie şi apoi se leagă cu sfoară;
- la aparatele de filtrare se împachetează în hârtie filtru şi
tubulatura laterală a balonului;
- eprubetele se astupă cu dopuri de vată şi tifon, se învelesc în
hârtie şi se pun în coşuri de sârmă;
- instrumentele metalice se pun în cutii nichelate, prevăzute cu
orificii care se închid la scoaterea din autoclav;
- materialele moi (vată, tifon etc.) se sterilizează în casolete a
căror orificii se închid la scoaterea din autoclav.
Tindalizarea. Este o metodă de sterilizare care se bazează pe
încălzirea materialelor de sterilizat la temperaturi de 60 - 90°C, timp
de o oră, trei zile consecutiv, urmată de păstrarea lor, între
perioadele de încălzire, la temperatura camerei sau la termostat, la
37°C.
Prin acest procedeu se sterilizează unele medii de cultură,
serurile sau soluţiile care conţin substanţe proteice şi hidrocarbonate,
care s-ar degrada la temperatura de fierbere.
Această metodă de sterilizare se bazează pe faptul că formele
bacteriene sporulate, rămase după prima încălzire, având condiţii
33
favorabile, vor trece până a doua zi în forme vegetative, ce vor fi uşor

distruse prin încălzire a doua zi. Încălzirea de a treia zi se face pentru
distrugerea formelor vegetative rezultate din germinarea sporilor care
au rămas şi după a doua încălzire.
Pasteurizarea. Se utilizează numai pentru lichide şi este o
metodă curent folosită în industria alimentară. Numele procedeului
provine de la cel care l-a inventat, cercetătorul francez Louis Pasteur,
acesta realizând primul test de pasteurizare împreună cu Claude
Bernard în 20 aprilie 1862. Pasteurizarea nu are ca scop omorârea
tuturor microorganismelor, ci mai degrabă o reducere logaritmică a
numărului acestora, astfel încât cele care rămân viabile să nu poată
determina apariţia unor boli.
În funcţie de temperatură, pasteurizarea poate fi:
• joasă, când se aplică temperaturi de 50 - 60°C, timp
de 30 minute;
• medie, se aplică temperaturi de 70 - 75°C, timp de 10
- 20 minute;
• înaltă, se aplică temperaturi de 85 - 90°C, timp de
câteva secunde.
În toate cazurile, se realizează răcirea bruscă la 4°C. Moartea
bacteriilor survine datorită şocului termic produc prin răcire.
O altă metodă de pasteurizare este reprezentată de
pasteurizarea UHT (Ultra High Temperature), care presupune
încălzirea materialului de sterilizat la 138°C pentru o fracţiune de
secundă, urmată de răcire bruscă.
2.1.2.Sterilizarea prin radiaţii
Ca agenţi sterilizanţi pot fi folosite razele ultraviolete şi radiaţiile

gamma.
Sterilizarea prin raze ultraviolete. Se aplică la suprafeţele
34
plane şi încăperi (mai ales boxe sterile). În acest scop se folosesc

lămpi speciale, de diferite intensităţi, ce emit radiaţii cu o lungime de
undă între 2400 şi 2800 Ᾰ. Numărul acestor lămpi depinde de
mărimea suprafeţei sau volumul încăperii de sterilizat. Durata iradierii
este variabilă, în general câteva ore până la 24 de ore. Acţiunea lor
bactericidă se limitează la formele vegetative.
Sterilizarea prin radiaţii gamma. Se foloseşte în special
pentru obiectele şi instrumentele de material plastic (plăci Petri,
seringi, catetere etc.).
2.1.3.Sterilizarea prin filtrare şi ultrafiltrare
Filtrarea este o metodă mecanică de sterilizare, care constă în

trecerea unui lichid prin pereţii groşi ai unui filtru. Se utilizează la
sterilizarea lichidelor care se degradează prin încălzire (lichid pleural,
ascitic, ser sangvin, medii speciale de cultură etc.), sau ca mijloc de
purificare a virusurilor, când acestea se găsesc în amestec cu diferite
microorganisme.
Filtrele utilizate în microbiologie sunt constituite din diferite
materiale poroase, iar în cadrul fiecărui tip se folosesc notări, în
funcţie de dimensiunile porilor.
Filtrele Berkefeld. Sunt confecţionate din pământ de infuzorii
(Kiselgur) cu aspect de bujie şi cu porozităţi diferite. Cele notate cu
litera V (Viel) au porii mari, cele notate cu W (Wenig) au porii mici, iar
cele notate cu N au porii de dimensiuni intermediare. Bacteriile sunt
reţinute de filtrele notate cu N şi V, iar virusurile doar de cele notate
cu W.
Filtrele Chamberland. Sunt formate din porţelan gros, au
formă de bujie, iar dimensiunile porilor sunt notate cu litera L urmată
de o cifră (L1,L2 etc.). Cu cât numărul este mai mare, cu atât porii
sunt de dimensiuni mai mici.
35
Filtrele Seitz. Sunt confecţionate din plăci de azbest cu diferite

porozităţi, având indicativele EK1, EK2 etc. Filtrele notate cu EK1 reţin
bacteriile, iar cele notate cu EK2 reţin şi virusurile.
Filtrele de sticlă. Se prezintă sub formă de plăci filtrante
montate în pâlnii, de diferite forme, care se adaptează la baloane cu
tubulatură laterală sau dispun de dispozitive proprii de etanşare. Cel
mai frecvent folosite sunt filtrele tip Schott, notate cu G1 până la G5,
acestea din urmă având porozitatea cea mai fină. Aceste filtre au
avantajul că nu influenţează pH-ul lichidelor filtrate şi se pot folosi
vreme îndelungată, dacă sunt îngrijite corespunzător după fiecare
folosire. Sterilizarea lor se face numai la autoclav.
Membranele filtrante. Se pot confecţiona din diferite materiale
(colodiu, celuloză sau material plastic) şi se folosesc în special în
virusologie, când sunt necesari pori de dimensiuni foarte mici (5 -
3000 milimicroni).
Deosebit de răspândite au devenit în ultimul timp membranele
filtrante celulozice de tip Milipore. Acestea au pori de diferite
dimensiuni, sunt foarte uşor de manevrat şi servesc în scopuri foarte
variate: debarasarea unor lichide de germeni, determinări cantitative
de germeni din lapte, produse lactate, ape potabile sau reziduale.
După scopul în care se folosesc, ele se pot adapta la seringi, la vase
racordate la pompe de vid sau la pompe de presiune şi au capacităţi
variabile.
Tehnica filtrării: Filtrele se montează la un balon Kitasato (cu
tubulatură laterală) şi se sterilizează prin autoclavare, împachetate în
hârtie. Aparatul de filtrare steril se adaptează apoi prin intermediul
unui tub de cauciuc la o pompă de vid, care prin presiunea negativă
care o formează în balonul Kitasato va obliga trecerea lichidului de
sterilizat prin porii filtrului. După folosire aparatul de filtrare se
sterilizează prin autoclavare.
36
2.1.4. Sterilizarea prin centrifugare şi ultracentrifugare
Se utilizează pentru separarea germenilor din culturi executate

pe medii lichide, a unor toxine bacteriene şi a virusurilor de bacterii.
Se realizează în aparate speciale (centrifugi), care prin forţa
centrifugă dezvoltată determină sedimentarea microorganismelor în
funcţie de greutatea lor. Se pot folosi două tipuri de centrifugi:
- centrifugă obişnuită, care realizează până la 6000 turaţii / minut,
sedimentând bacteriile în 15 - 60 minute;
- ultracentrifugă, care poate dezvolta peste 10000 turaţii / minut şi
chiar mai mult și care se utilizează pentru sedimentarea virusurilor,
2.2. Sterilizarea prin agenți chimici
Pentru sterilizarea prin agenţi chimici se foloseşte, în mod curent

termenul de dezinfecţie. Această metodă se aplică la dezinfecţia
meselor de lucru, încăperilor sau a altor materiale şi obiecte
contaminate (tabelul 1).
37
Tabelul 1
Principalele substanţe dezinfectante
Nr. Denumirea Scopul în care este folosită

crt. substanţei
1. Acid acetic Dezinfecţia pipetelor şi a lamelor în laboratoarele care se
ocupă cu studiul germenilor din genul Leptospira
3. Alcool medicinal Dezinfecţia curentă a mâinilor
4. Apa oxigenată 1% Dezinfecţia mucoaselor
5. Bicromat de Dezinfecţia pipetelor întrebuinţate
potasiu
6. Cloramina 5% Dezinfecţia mâinilor
Dezinfecţia meselor de laborator, cuştilor de animale
7. Clorură mercurică Dezinfecţia meselor şi a altor categorii de mobilier din sticlă,
(sublimatul faianţă, tăvi de material plastic etc.
coroziv) Dezinfecţii mai riguroase ale mâinilor
8. Creolina 5 –10% Dezinfecţia adăposturilor - în cazul bolilor provocate de
agenţi nesporulaţi (dezinfectant slab)
9. Clorura de var (2 - Dezinfecţia curentă a grajdurilor
5% clor activ)
10. Detergenţi diferiţi Dezinfecţia mâinilor (sol. 0,1%)
Spălarea sticlăriei
11. Formol Dezinfecţia obiectelor din sticlă, faianţă, tăvi de metal din
(sol. 40% laborator (sol. 5% aldehidă formică)
aldehidă formică) Dezinfecţia grajdurilor, curţilor, obiectelor în diferite infecţii
bacteriene şi virale (sol. 5% aldehidă formică)
Inactivarea culturilor microbiene în vederea preparării unor
vaccinuri (sol. 0,1 - 0,2% aldehidă formică)
12. Hidroxid de sodiu Dezinfecţia mobilierului, duşumelelor, cuştilor de animale
(soda caustică) (sol. 0,5 - 3%)
Dezinfecţia adăposturilor de animale si a curţilor în caz de
epizootii (sol. 2 – 3%)
13. Fenol(acid fenic) Dezinfecţia diferitelor obiecte din sticlă, porţelan, metal etc.
(sol. 5%)
16. Tinctura de iod Dezinfecţia locului de puncţie
38
3. TEHNICA CULTIVĂRII BACTERIILOR
3.1. Tehnica preparării mediilor de cultură
În vederea realizării unui diagnostic bacteriologic corect, sigur şi

prompt, folosirea unor medii de cultivare corespunzătoare pentru
bacterii este o condiţie de o importanţă hotărâtoare.
Un mediu de cultură poate fi definit ca un suport nutritiv steril,
care permite dezvoltarea şi studiul unei bacterii în afara nişei
ecologice.
Un bun mediu de cultură trebuie să asigure substratul nutritiv
pentru creşterea şi multiplicarea bacteriilor, să aibă un pH care să
permită desfăşurarea normală a proceselor metabolice microbiene
(în general 7,2 - 7,4), să corespundă tipului respirator al gemenilor
cultivaţi (aerob sau anaerob) şi să fie steril, iar recipientul în care
este păstrat să nu permită contaminarea cu alţi microbi.
Mediile de cultură se pot clasifica după mai multe criterii:
- după starea de agregare:
• lichide;
• solide;
• semisolide.
- după compoziţie:
• simple;
• complexe.
- după tipul respirator al bacteriei cultivate:
• medii pentru bacterii aerobe;
• medii pentru bacterii anerobe.
- după frecvenţa de utilizare pot fi:
• medii uzuale sunt medii de cultură utilizate în mod curent
în lucrările de laborator, cu o compoziţie simplă şi uşor
de preparat;
39
• medii speciale: de izolare, de îmbogăţire, selective si de

diagnostic diferenţial
Acestea se întrebuinţează pentru cultivarea speciilor bacteriene
care nu se dezvoltă pe medii uzuale, fiind mai pretenţioase din punct
de vedere al necesităţilor de substanţe nutritive sau se folosesc
pentru izolarea unor specii bacteriene în cultură pură, în cazul în care
acestea se găsesc în amestec cu alte specii. Aceste medii
favorizează şi dezvoltarea unor specii bacteriene care în mod
obişnuit se găsesc în număr redus în materialul patologic de
cercetat, având astfel loc o selecţie prin stimulare. Mediile de
diagnostic diferenţial sunt acele medii de cultură pe care două sau
mai multe specii bacteriene se comportă diferit, ajungându-se astfel
identificarea lor.
3.1.1. Medii uzuale
3.1.1.1. Medii uzuale pentru bacterii aerobe
Bulionul de carne. Reprezintă un mediu de bază în

bacteriologie, din care, prin adăugarea unor ingrediente diverse, se
poate obţine un număr mare de medii de cultură .
Tehnica de preparare:
Se cântăresc 500 g de carne de cal sau vită, curăţată de
aponevroze, tendoane, grăsimi, se toacă mărunt, se adaugă 1000 ml
apă, se lasă la macerat, la temperatura camerei, timp de 12 - 24 ore,
apoi maceratul se fierbe 30 minute şi se filtrează prin vată. Maceratul
de carne poate fi substituit cu extractul de carne, care se prezintă
sub formă de pastă standardizată, preparată de diverse firme (Merk,
Difco etc.), în cantitate de 10 g Ia 1000 ml apă.
La lichidul obţinut se adaugă 10 g peptonă, 5 g clorură de sodiu
şi se încălzeşte la 80 - 90°C, pentru solubilizarea ingredientelor. Se
ajustează pH-ul cu soluţie de NaOH 10%, se încălzeşte la 100°C şi
40
se filtrează. Se repartizează în eprubete sau baloane, care se astupă

cu dopuri de vată şi tifon şi se sterilizează prin autoclavare timp de
30 minute, la 115°C.
Agarul nutritiv (geloza). Este un mediu solid, preparat prin
adăugarea la bulionul obişnuit a fibrelor de agar, ce se obţin dintr-o
algă marină. Fibrele de agar au proprietatea de a se dizolva în apă la
80 - 90°C şi de a se solidifica la temperaturi de sub 45°C, cu
menţiunea că sunt lipsite de substanţe nutritive pentru bacterii.
La 1000 ml bulion se adaugă 18 - 20 g fibre de agar fin
mărunţite, se încălzeşte amestecul la 90°C. Amestecul încă fierbinte
se filtrează prin vată şi se repartizează în flacoane sau eprubete,
care se astupă cu dopuri de vată şi tifon şi se sterilizează la autoclav
timp de 30 minute, la 120°C. Se solidifică prin răcire în poziţie
înclinată sau dreaptă.
Dacă fibrele de agar adăugate sunt în cantitate mai redusă (2 –
5g la 1000 ml bulion) se obţine prin acelaşi procedeu geloza moale,
mediu utilizat la conservarea bacteriilor.
3.1.1.2. Medii uzuale pentru bacterii anaerobe
Bulionul cu ficat sau albuş de ou (Kitt-Tarozzi). Ficatul şi

albuşul de ou conţin cisteină, care fixează oxigenul din mediu,
determinând astfel condiţii favorabile dezvoltării bacteriilor anaerobe.
Se fierbe ficatul (de cal sau de vită), apoi se taie în fragmente
de formă paralelipipedică, acestea se introduc în eprubete cu 8 - 10
ml bulion simplu sau glucozat 1%. Se sterilizează prin autoclavare la
120°C timp de 20 minute. În loc de ficat se poate adăuga albuş de ou
fiert tare.
Mediile mai vechi se regenerează înainte de însămânţare, prin
fierbere timp de 10 minute.
41
Geloza Veillon. Este un mediu solid cu următoarea compoziţie:

1000 ml bulion, 8-10 g fibre de agar, 5-10 g glucoză şi 1-2 g azotat
de potasiu.
Se dizolvă glucoza şi azotatul de potasiu în bulion, se adaugă
fibrele de agar mărunţite, se încălzeşte în autoclav cu capacul
deschis; se filtrează prin vată şi se repartizează în tuburi înguste şi
înalte, mai mult de jumătate din înălţimea tubului (tuburi Weinberg).
Se sterilizează prin autoclavare, 15 minute la 115°C şi se solidifică
vertical.
3.1.2. Medii speciale
Mediile speciale de izolare favorizează dezvoltarea anumitor

germeni, care nu se pot cultiva de la început pe mediile obişnuite,
aceştia necesitând anumite condiţii speciale sau anumiţi "factori de
creştere". Astfel sunt mediile cu ser, cu sânge (pentru pasteurele,
corynebacterii), cu glicerină, cu cartof glicerinat, cu ou (pentru
micobacterii).
Mediile de îmbogăţire. Sunt folosite pentru cazurile în care în
produsul patologic de examinat se bănuieşte o cantitate redusă de
germeni patologici şi un număr mare de germeni din flora de
asociaţie. Astfel de medii sunt mediul Kaufman - Muller (pentru
Enterobacteriaceae); mediul Korthoff (pentru leptospire). mediul cu
selenit acid de sodiu, pt. izolarea salmonelelor.
Mediile selective. Favorizează, prin compoziţia lor chimică,
dezvoltarea anumitor germeni. Astfel sunt mediile hiperclorurate
Chapman şi Bayrd – Parker pentru stafilococi patogeni, mediile
Wilson - Blair şi Drigalski pentru salmonele, mediul Istrati - Meitert
pentru Escherichia, Shigella, Salmonella, mediile Löwenstein -
Jensen, Youmans pentru micobacterii mediile Czapek şi
Sabouraud pentru ciuperci.
42
Mediile de diagnostic diferenţial. Permit creşterea diferenţiatã a

unor specii microbiene sau pun în evidenţă anumite particularităţi
metabolice cu semnificaţie de diagnostic. Ele evidenţiază anumite
procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de
bacterii, permiţând în acest fel identificarea lor (fenomene
proteolitice, zaharolitice, oxidoreducătoare etc.). Includerea în
componenţa acestor medii a unor substanţe indicatoare sau
revelatoare este menită să facă vizibil procesul respectiv. Astfel, pot
fi citate mediul Fergusson (pentru evidenţierea ureazei), mediul cu
acetat de plumb (pentru detectarea formării de hidrogen sulfurat),
mediul Drigalski (pentru diferenţierea speciilor lactozo-pozitive),
mediul Levine, agarul Mac Conkey, agarul SS (agar pentru
Salmonella și Shigella), mediile MM (Miller and Mallinson Agar), MIU
(Motility Indole Urea), MILF (Mobile Indole Lysine Fenilaminase), TSI
(Triple Sugar Iron).
Pentru speciile de germeni anaerobi se folosesc, de asemenea,
medii speciale, cum ar fi bulionul cu ficat, geloza Veillon, iar pentru
determinarea mobilităţii unor germeni mediul semisolid Tittsler -
Sandholzer. Există şi medii sintetice, bazate pe componente
cunoscute din punct de vedere a structurii chimice. În comparaţie cu
bulionul, agarul, sau alte medii ale căror componente nu sunt
identificate chimic în totalitate, mediile sintetice au avantajul că
permit anumite determinări capabile să ofere relaţii asupra
metabolismului microbian (prin dozarea înainte şi după cultivare a
diferitelor componente se poate cunoaşte ce anume a fost consumat
în cursul multiplicării şi în ce cantitate).
În prezent, atât mediile uzuale sau componente ale acestora, dar mai
ales mediile speciale, sunt standardizate, se produc în laboratoare
speciale, iar preparea lor în laborator se face conform rețetei
producătorului
43
3.1.3. Medii cu preparare extempore
În laboratoarele de diagnostic se prepară în mod curent

următoarele medii speciale:
Medii cu ser. Se prepară prin adăugarea de ser la mediile
uzuale (bulion, geloză)
Tehnica de preparare: în tuburile cu bulion se adaugă, în mod
steril, "ser normal", de obicei de cal, în proporţie de 1/10. Se
omogenizează bine şi se solidifică prin răcire.
Controlul de sterilitate se face prin ţinerea la termostat, la 37°C,
timp de 24 ore.
Medii cu sânge. Se prepară prin adăugarea la mediile uzuale
(bulion, geloză) de sânge recoltat în mod steril, în baloane cu perle
de sticlă pentru defibrinare.
Tehnica de preparare: este similară cu cea a mediilor cu ser, cu
menţiunea că sângele se adaugă în proporţie de 5 -10%.
Medii cu glucoză. Se prepară prin adăugarea la mediile uzuale
(bulion, geloză) a 0,5 – 1% glucoză, înainte de sterilizare.
Medii glicerinate. Se prepară prin adăugare de glicerină, în
proporţie de 1%, la mediile uzuale (bulion, geloză), urmată de
sterilizarea prin autoclavare la 110°C, timp de 20 minute. Dacă la
bulionul glicerinat se adaugă şi cartof se obţine mediul cu cartof
glicerinat.
Tehnica de preparare: se decupează bucăţi cilindrice din cartof
cu ajutorul dispozitivului Queyart, se secţionează în două, se spală şi
se neutralizează prin ţinerea lor timp de trei ore într-o soluţie de
carbonat de sodiu de 1%. Apoi se introduce câte o felie în eprubete
de tip Roux, peste care se adaugă bulionul glicerinat. Mediul se
sterilizează prin autoclavare, 20 minute, la 110°C.
44
3.2. Materiale şi aparate necesare cultivării bacteriilor
Materialele și aparatele necesare cultivării bacteriilor sunt

următoarele:
- eprubete de sticlă, cu diferite utilizări, forme şi dimensiuni, în
funcţie de scop;
- baloane de sticlă de diferite forme şi dimensiuni utilizate în
diverse scopuri:
• balon cilindric pentru conservarea cantităţilor mai mari de
materiale lichide;
• balon Erlenmeyer, de diferite dimensiuni, utilizat pentru
culturi bacteriene, recoltări de sânge, preparare de
soluţii, suspensii;
• balon rotund cu fund plat, pentru păstrarea mediilor de
cultură şi a diverselor soluţii
- plăci Petri de sticlă
- pipete;
- anse;
- thermostat.
Cele mai utilizate eprubete sunt eprubete obişnuite, cu

dimensiuni de 160 / 16 mm.
În plus, se mai folosesc eprubetele Roux pentru mediul cu
cartof glicerinat, se prezintă sub forma unui tub mare (150 / 20 mm)
prevăzute la o distanţă de 5 - 6 cm de bază cu o gâtuitură, a cărei
diametru este de 1 / 2 din diametrul tubului, tuburile Weinberg,
folosite pentru cultivarea bacteriilor anaerobe, de 200 / 10 mm și
tuburi de reacţie (Wassermann), pentru reacţii serologice sau
repartizarea mediilor în cantităţi mici, au dimensiuni de 90 - 100 mm.
Există diferite tipuri de plăci destinate cultivării germenilor pe
medii solide.
Placa Petri este o cutie de sticlă cilindrică, cu capac de mărime
45
variabilă (8 – 12 cm) şi înălţimea de 2 - 3 cm.

Placa Dold - Gildermeister este o placă cu fundul divizat; placa
Roux are o formă paralelipipedică, dreptunghiulară cu dimensiunile
de 21 / 15 / 4,5 cm.
Placa Jonan diferă de placa Roux prin formă; fiind prismatică,
trapezoidală (suprafaţa Plăcile se păstrează sterile, împachetate în
hârtie, se despachetează în momentul utilizării; inferioară mai lată ca
cea superioară).
Termostatul (fig. 11) este aparatul necesar asigurării condiţiilor
de dezvoltare pentru bacterii, format din: dulap de tablă, cu pereţi
dubli, termoizolat între cei doi pereţi, cu uşi duble, cea interioară fiind
de sticlă; parte electrică - un sistem de rezistenţe electrice între
pereţi. La unele termostate, pentru a realiza o temperatură cât mai
uniformă, între stratul de rezistenţe şi peretele interior există un
rezervor de apă, încălzirea realizându-se prin intermediul apei, un
sistem automat de termoreglare pentru menţinerea constantă a
temperaturii.
Figura 11. Termostat (20)
46
3.3. Tehnica însămânţării şi transplantării bacteriilor
3.3.1. Tehnica însămânţării bacteriilor
Prin însămânţare se înţelege operaţiunea de trecere a

microorganismelor din mediul natural de viaţă, pe medii de cultură,
pentru multiplicarea lor, în scopuri diferite (identificare, conservare,
prepararea de vaccinuri, determinarea patogenităţii etc.).
Însămânţarea se va efectua astfel încât să se evite
contaminarea cu germeni nedoriţi, din aer sau de pe instrumentarul
cu care se lucrează. În acest sens, operaţiunea se va executa la
flacăra unui bec de gaz, în săli lipsite de curenţi de aer, sau în boxe
speciale cu aer sterilizat.
Prelevarea materialului patologic se va face în mod steril, cu
ansa de însămânţare sau cu pipeta Pasteur, sterilizată la flacără, în
funcţie de caracteristicile acestuia (tabelul 2).
Tehnica de lucru diferă în funcţie de starea fizică a mediului
(lichid, solid, semisolid) şi de modul cum este repartizat (eprubete,
flacoane, plăci Petri etc.).
47
Tabelul 2
Metode de prelevare a materialului patologic pentru

însămânţarea mediilor de cultură
Materialul Instrumentarul MOD DE LUCRU

patologic folosit
Organe Cu pipeta Pasteur Se aspiră din profunzimea organului,
după sterilizarea prealabilă a zonei
de pătrundere a pipetei prin ardere
Cu acul de
însămânţare drept
Cu porţiuni de organ Când organul a fost recoltat steril, se
secţionează cu instrumentar steril, iar
cu suprafaţa de secţiune se şterge
suprafaţa mediului de cultură dintr-o
placă Petri
Prin introducerea Recoltarea şi manipularea organelor
directă a unor în condiţii de sterilitate perfectă
porţiuni de organ în
mediu
Os Pipeta Pasteur Se secţionează osul, se sterilizează
suprafaţa de secţiune prin flambare
şi se aspiră din canalul medular
Materiale Pipeta Pasteur Prin aspirare
patologice Ansa bacteriologică O picătură în bucla ansei
lichide
De pe Tampoane de vată Prin tamponarea suprafeţei
mucoase sau fixate pe tije metalice şi
alte suprafeţe adaptate la eprubete cu
ser fiziologic sau mediu
de cultură, totul sterilizat
Sânge Seringă cu ac Se recoltează sângele prin puncţie
venoasă şi se înglobează în proporţie
de 1 / 10 în mediul de cultură (dacă
mediul este solid, se lichefiază prin
încălzire şi se răceşte la 45°C
Secreţii (nazală, Tampoane sterile Direct cu tamponul steril cu care a
oculară, mai rar fost recoltată
salivară)
48
Modul de lucru. Pentru însămânțarea dintr-o probă pe mediul

de cultură în stare lichidă (bulion), repartizat în eprubete, se parcurg
următoarele etape (fig. 12):
- eprubeta cu mediul de cultură se ţine în mâna stângă, iar ansa
bacteriologică sau pipeta Pasteur cu care s-a preluat
materialul de inoculat în mâna dreaptă, identic cu ţinerea unui
creion;
- se sterilizează ansa la flacără şi se prelevă materialul
patologic de însămânţat (a);
- cu degetul mic de la mâna dreaptă, în care se ţine ansa
bacteriologică (sau pipeta Pasteur), se prinde dopul de vată al
eprubetei cu mediul de cultură şi, prin mişcări de răsucire, se
scoate și apoi se flambează gâtul eprubetei la flacăra becului
de gaz (b);
- se descarcă ansa bacteriologică pe care s-a preluat materialul
patologic în mediu (sau dacă s-a preluat cu pipeta Pasteur se
depun câteva picături din materialul patologic) (c);
- se scoate ansa (sau pipeta) din eprubetă, cu atenție fără a
atinge pereții acesteia și fără a stropi în exterior și se
sterilizează gâtul epubetei la flacără (d);
- se închide eprubeta (e)
- se sterilizează ansa prin înroșire în flacără, iar dacă s-a folosit
pipeta Pasteur, aceasta se pune în recipientul cu soluție
dezinfectantă (f);
- se omogenizează conținutul eprubetei în care s-a inoculat
materialul prin o ușoară agitare şi se depune eprubeta în stativ
(g).
49
a b
c d
e f
Figura 12. Tehnica înămânțării cu ansa din probă pe mediul lichid (1)
50
Bacteriile anaerobe se pot cultiva şi în medii uzuale folosite

pentru bacteriile aerobe, dacă se elimină oxigenul. Anaerobioza se
poate realiza prin metode variate cum sunt:
• introducerea mediilor însămânţate în recipiente pentru
anaerobioză numite anaerostate - recipiente metalice de
formă cilindrică, care se pot închide ermetic și sunt
prevăzute cu tubulatură laterală pentru scoaterea aerului
cu ajutorul unei pompe de vid sau anaerostate în care se
introduc pliculețe cu substanțe chimice ce pot genera
producerea de H2 și CO2 (fig. 13)
• utilizarea unor substanţe chimice care, prin combinaţia
lor, consumă oxigenul dintr-un spaţiu ermetic închis
(exicator, plăci Petri). Ca substanţe chimice se pot
utiliza: acidul pirogalic şi hidroxidul de potasiu sau
amestecul reducător format din pirogal, carbonat de
potasiu şi pământ de infuzorii.
Mediile însămânţate se introduc în termostat, pentru

dezvoltarea coloniilor (incubare), la temperatura de 37°C, timp de 24
- 48 ore (temperatura şi timpul de incubaţie se va stabili în funcţie de
cerinţele fiziologice ale speciei bacteriene cultivate)
51
Șurub de închidere
Camerăde de
Cameră cataliză
cataliză (conține(conține
granule
de paladium)
granule de paladium)
Conține granule la paladium Capac exterior
Capac interior Garnitură de cauciuc
Plic cu generator de gaz (se

adaugă 10 ml de apă în plic pentru
Reacția: Oxigenul este
a genera producerea de H2 și CO2.
înlocuit prin combinarea cu
Bioxidul de carbon permite
hidrogenul de la suprafața
creșterea mai rapidă a bacteriilor
granulelor de paladium
anaerobe
Bandă indicatoare a reacției

anaerobe (albastru de metilen
se decolorează în absența
oxigenului
Figura 13. Anaerostat (2)
3.3.2. Tehnica transplantării bacteriilor
Transplantarea are ca scop izolarea din culturile mixte a

germenilor în stare pură sau menţinerea lor în timp, în condiţii de
laborator (tulpini de colecţie).
Din culturile pe mediile lichide transplantarea se face cu pipeta
Pasteur sau cu ansa de însămânţare. În primul caz se recoltează o
cantitate arbitrară (câteva picături) din cultura veche, care apoi se
însămânţează pe mediul proaspăt. În cel de al doilea caz, se
introduce ansa flambată şi răcită în cultura veghe, după care se
realizează însămânţarea pe mediile proaspete (întâi în mediu! lichid
şi apoi în mediul solid, dacă este cazul).
Din culturile solide, transplantarea se face cu ansa
bacteriologică, raclând o cantitate foarte redusă de cultură, care apoi
se depune pe mediile proaspete.
52
3.4. Tehnica izolării bacteriilor în culturi pure
În mod obişnuit, la prima însămânţare efectuată dintr-un

material patologic se obţin culturi polibacteriene. Acest fapt impune,
pentru stabilirea diagnosticului, izolarea unei anumite specii
bacteriene, în cultură pură. Această operaţiune se poate realiza prin
metode mecanice, fizice, chimice şi biologice.
Metodele mecanice. Urmăresc dispunerea germenilor din
materialul patologic pe suprafeţe cât mai mari de mediu solid, astfel
încât să se obţină colonii izolate.
Dispunerea se poate realiza prin:
- metoda epuizării, pe suprafaţa gelozei înclinate (5-6 tuburi),
sau pe suprafaţa gelozei turnată în plăci Petri, se bazează pe
principiul descărcării materialului patologic pe suprafața
mediului prin executarea de numeroase linii de însămânțare
(fig. 14);
53
Figura 14. Modele de insămânțate prin tehnica epuizării ansei (2)
- metoda diluţiilor succesive în mediu lichid (bulion) sau ser

fiziologic, urmată apoi de însămânţări din fiecare diluţie pe
suprafaţa unui mediu de cultură (fig. 15).
Insămânțar
e cu ansa Insămânțare Insămânțare
cu ansa cu ansa
Cultura mixtă
Insămânțare Insămânțare Insămânțare
cu ansa cu ansa cu ansa
Figura 15. Tehnica însămânțării în culturi pure prin metoda diluțiilor succesive
54
Metodele fizice. Se utilizează pentru separarea speciilor

sporulate de cele nesporulate şi constă în încălzirea materialului
patologic la 70 - 80°C, temperatură care distruge formele
vegetative, fără să fie nocivă pentru spori. După inactivarea
formelor vegetative se fac însămânţări pe medii de cultură
adecvate dezvoltării speciilor respective.
Metodele chimice. Constau în adăugarea la mediul de
cultură a unor substanţe bactericide sau bacteriostatice pentru
unele specii, dar inactive pentru specia bacteriană care trebuie
izolată. Acest principiu stă la baza preparării şi folosirii mediilor
selective.
Metodele biologice. Se bazează pe inocularea materialului
patologic la animale sensibile faţă de specia bacteriană care se
doreşte a fi izolată. Organismul animal joacă, în acest caz, rolul de
filtru biologic, distrugând germenii saprofiţi la poarta de intrare, iar
specia patogenă se multiplică, producând moartea animalului. Din
cadavre, prin însămânţări pe medii de cultură se obţin, de regulă,
culturi pure.
3.5. Metode de conservare a tulpinilor bacteriene în colecţii
Conservarea tulpinilor bacteriene izolate în laborator, pentru

a se continua studierea lor, se poate realiza prin mai multe
procedee, în funcţie de scopul urmărit.
Una dintre metode este conservarea în culturi prin
însămânţarea pe medii de conservare (geloză moale), la o anumită
temperatură şi interval de transplantare, în funcţie de specia
bacteriană. Pentru a se evita uscarea mediilor, recipientele se
închid cât mai etanş, prin următoarele procedee:
• închiderea la flacără;
• aplicarea unui dop de plută sau cauciuc peste dopul de vată;
55
• etanşeizarea dopului de vată cu leucoplast sau prin

parafinarea acestuia
• folosirea unor capace metalice.
Uscarea se utilizează pentru conservarea speciilor
sporulate. În acest sens, se introduc în culturi fire de mătase sau de
burete steril, se usucă cultura prin evaporare lentă, în recipiente
sterile.
Congelarea culturilor la temperaturi scăzute (între -20 și -
30°C).
Liofilizarea constă în sublimarea apei pe gheaţă carbonică
în vid, cu ajutorul unui aparat special, numit liofilizator.
Conservarea culturilor omorâte, cultura bacteriană se
inactivează în mod obişnuit în formol, apoi se închide cu parafină,
pentru a se evita uscarea mediilor.
56
4. EXAMENUL CARACTERELOR CULTURALE
Bacteriile, prin multiplicare in mediul de cultură, determină

modificări caracteristice ale acestora, modificări care poartă denumirea
de caractere culturale.
Caracterele culturale ale unor specii bacteriene sunt foarte
caracteristice, utilizându-se în scop de clasificare şi diagnostic.
La aprecierea caracterelor culturale se va ţine cont de starea fizică
a mediului de cultură şi de specia cultivată.
4.1. Caractere culturale pe medii lichide
Modificările induse de multiplicarea bacteriilor în mediile lichide sunt

mai puţin caracteristice comparativ cu modificările induse de bacterii prin
cultivare pe mediu solid (geloza nutritivă).
În cazul mediilor lichide se vor face aprecieri cu privire la
următoarele caractere:
Turbiditatea. Poate fi absentă sau prezentă, caz în care se
apreciază ca fiind discretă, moderată, abundentă (fig. 16);
Turbiditate Turbiditate Turbiditate

absenta moderată abundentă
Figura 16. Aprecierea turbidității (18)
57
Depozitul. Se formează prin sedimentarea celulelor bacteriene,

a căror densitate este mai mare decât a apei.
Poate fi prezent sau absent.
Atunci când e prezent se apreciază:
- cantitatea: depozitul putând fi discret ori abundent,
- aspectul: depozitul poate fi granular sau floconos, omogen
sau neomogen (prin agitare).
Formaţiunile de suprafaţă. Pot fi absente sau prezente și pot

adera sau nu la pereții eprubetei.
Atunci când există (fig. 17) sunt reprezentate de:
• inel,
• peliculă,
• membrană (niciodată două sau trei).
Inel Peliculă Flocoane Membrană
Figura 17. Tipuri de formațiuni de suprafață (4)
58
4.2. Caractere culturale pe medii solide
Multiplicarea bacteriilor pe suprafaţa mediilor solide formează

aglomerări de celule, vizibile cu ochiul liber, care poartă denumirea
de colonii.
Coloniile au dimensiuni variabile, unele se pot observa numai
cu lupa, iar la alte specii bacteriene coloniile formate pot atinge
câţiva milimetri.
Datorită acestui fapt în cazul culturilor pe medii solide
caracterele culturale se referă la aspectul coloniei.
În caracterizarea unei colonii, se iau în considerare mai multe
aspecte:
- dimensiunea coloniei - aceasta poate fi mare sau mică;
- forma coloniei (fig. 18) - rotundă, rotundă și cu margini
dințate, rotundă cu margini ridicate, rotundă și cu margini radiante,
neregulată, filamentoasă și rizoidă;
Rodundă Rotundă cu Rodundă cu Rotundă și cu

margini dințare margini ridicate margini
radiante
Neregulată Neregulată și Filamentoasă Rizodă

filiformă
Figura 18. Forma coloniei (4)
59
- profilul coloniei (fig. 19) - plat, convex, concav, papiliform,

ombilicat (formă de pălărie), mamelonat;
Plat Convex Umbonat
În formă de picătură Crateriform Mamelonat
Figura 19. Profilul coloniei (4)
- suprafaţa coloniei - netedă şi lucioasă sau aspră şi rugoasă,

granulară;
- marginile coloniei - uniforme sau cu prelungiri;
- consistenţa coloniei - cu consistenţă cremoasă, onctuasă,
mucoidă, pulverulentă;
- gradul de opacitate a coloniei - opacă sau translucidă;
- gradul de aderenţă la substrat, la mediu- colonii uşor
detaşabile sau greu detaşabile;
- gradul de emulsionabilitate, de omogenizare a coloniei –
colonii emulsionabile omogenizabile (se suspendă uşor în ser
fiziologic, formând o emulsie), neomogenizabile;
- pigmentogeneza (sinteza de pigment) - poate fi absentă sau
prezentă.
Dacă acest caracter este prezent, interesează tipul de pigment,
care poate fi:
- difuzibil în mediul de cultură (la anumite specii pigmentul
secretat difuzează în geloză, colorând mediul – singura specie
bacteriană patogenă care elaborează pigment difuzibil în mediul de
60
cultură este Pseudomonas aeruginosa, cunoscută şi sub denumirea

de bacilul puroiului albastru ori bacilul piocianic). Pseudomonas
aeruginosa colorează mediul în albastru verzui.
- nedifuzibil în mediul de cultură (la numeroase specii
bacteriene pigmentul secretat colorează numai colonia, neavând
capacitatea de a invada şi a colora şi mediul);
- culoarea coloniei - culoarea acestor pigmenţi variază de la alb
la gălbui - citrin, verde, roşu, portocaliu etc., dependent de specie (de
exemplu, specia de stafilococ se stabileşte după culoarea
pigmentului, care poate fi auriu, galben - citrin, alb).
Aspectul coloniilor face posibilă gruparea lor în patru mari tipuri
culturale (fig...):
Colonii de tip S (smooth = neted): se caracterizează prin formă
rotundă, margini regulate, suprafaţa netedă şi lucioasă,
omogenizabile (suspendate în ser fiziologic formează suspensii
omogene, stabile), uşor detaşabile;
Colonii de tip R (rough = rugos): se caracterizează prin
margini neregulate (cu prelungiri), suprafaţa uscată, aspră şi
rugoasă, neomogenizabile (instabile în ser fiziologic). Coloniile
transplantate în mediu lichid formează depozit abundent;
Colonii de tip M (mucous = mucoid) se preling pe suprafaţa
mediului, au aspectul unor picături de miere. Trecute pe mediu lichid
determină creşterea vâscozităţii acestuia;
Colonii de tip G (pitice) vizibile numai la lupă, prezintă aspecte
asemănătoare coloniilor de tip S, apar de obicei în momentul
cultivării unor specii bacteriene pe medii de cultură improprii (fig. 20).
61
Colonii netede Colonii rugoase Colonii mucoide
Figura 20. Tipuri de colonii (24)
Când bacteriile sunt cultivate pe medii speciale de izolare şi

identificare, aspectul coloniilor diferă în funcţie de compoziţia
mediului dar şi în funcţie de modul în care s-a realizat însămânţarea.
Când bacteriile sunt cultivate pe medii cu preparare extempore,
cum ar fi geloza cu sânge, aspectul coloniilor şi al mediului diferă în
funcţie de proprietăţile speciilor bacteriene de a sintetiza hemolizine
(secreţii ale bacteriilor care distrug hematiile). În cazul speciilor
hemolitice în jurul coloniei apare un halou decolorat datorită
distrugerii eritrocitelor şi invers, lipsa secreţiei de hemolizine duce la
lipsa haloului produs prin hemoliză.
4.3. Caractere culturale ale bacteriilor anaerobe
În cazul acestor bacterii caracterele culturale sunt mai puţin

caracteristice.
În mediul lichid (bulion cu ficat sau cu albuş de ou) determină o
turbiditate necaracteristică a mediului.
În mediul solid (geloza Veillon) determină formarea a două tipuri
de colonii:
- colonii lenticulare, uşor bombate, translucide, cu margini
neregulate, formate de bacteriile anaerobe imobile (fără cili);
62
- colonii pufoase (cu aspect de puf de păpădie), formate de

bacteriile anaerobe mobile (cu cili).
4.4. Metode şi mijloace de identificare a bacteriilor
Identificarea presupune un examen complex care urmăreşte

aspectele specifice fiecărei specii bacteriene. În acest scop se
studiază caracterele morfologice, caracterele culturale, caracterele
biochimice, caracterele antigenice (se evidenţiază prin reacţii
serologice), caracterele de patogenitate. Patogenitatea poate fi
determinată fie in vitro (în laborator) fie in vivo (pe animale de
laborator).
4.4.1. Examenul caracterelor morfologice
Caracterele morfologice reprezintă un mijloc important de

identificare a speciilor bacteriene. Studiul caracterelor morfologice se
realizează prin examen microscopic care poate fi realizat pe
preparatul în stare nativă sau pe frotiu colorat.
4.4.1.1. Examenul microscopic direct al bacteriilor

(preparate in stare nativă)
Acest tip de examen permite vizualizarea bacteriilor vii și se

poate realiza prin două metode:
- pe un preparat nativ între lamă și lamelă;
- în picătură suspendată
Examenul pe preparat nativ între lamă și lamelă. Pe o lamă
de sticlă degresată prin flambare se depune în mod steril o picătură
din cultura bacteriană dezvoltată în mediu lichid (fig. 21). Se acoperă
cu o lamelă şi se examinează la microscop, la lumină directă sau
câmp întunecat. În cazul culturilor pe mediu solid pe lama degresată
63
se depune o picătură de apă distilată sau ser fiziologic iar cu ajutorul

ansei bacteriologice se preia o cantitate mică din cultura bacteriană
şi se trece în picătura de apă, descărcând ansa de bacterii prin
omogenizare, după care se acoperă cu o lamelă.
Examinarea se realizează inițial cu obiectiv de 10X și apoi cu
obiectiv de 40X.
Examenul în picătură suspendată. Se execută pe lame cu
godeuri. O picătură din cultua bacteriană se depunde pe o lamelă,
după care peste aceasta se depune o lamă cu godeu. Printr-o
mişcare bruscă lama se răstoarnă și se permite astfel menținerea
suspendată a picăturii depuse (fig. 21). Examinarea se realizează
inițial cu obiectiv de 10X și apoi cu obiectiv de 40X. Prin acest
examen se pot aprecia mobilitatea şi dimensiunea bacteriilor.
Figura 21. Obținerea preparatului în picătură suspendată (23)

http://ttktamop.elte.hu/online-tananyagok/practical_microbiology/ch06s04.html
64
4.4.1.2..Examenul microscopic pe frotiu
Frotiul se obține după etalarea unei cantități mici de cultură

bacteriană pe o lamă de sticlă, într-un strat fin și după fixarea și
colorarea acestuia printr-o anumită metodă
În executarea unui frotiu se parcurg următoarele etape de lucru
(fig. 22):
- curăţirea şi degresarea lamelor;
- etalarea;
- uscarea;
- fixarea;
- colorarea;
- examenul microscopic.
Curăţirea şi degresarea lamelor. Se face prin fierbere în apă
cu săpun sau detergenţi, urmată de limpezire şi uscare. Degresarea
lamelor se face prin trecerea lor prin flacăra becului de gaz de câteva
ori (se ţine lama de un colţ pentru arderea oricărei urme de grăsime
rămasă). De asemenea, se poate executa şi prin menţinerea lamelor
într-un vas cu alcool.
Etalarea. Constă în aplicarea materialului de examinat (a unei
cantități mici de cultură bacteriană) pe o lamă de sticlă, în strat fin şi
uniform, fără să atingă marginile lamei. Procesul de etalare diferă în
funcţie de natura culturii bacteriene, care urmează a fi examinată.
În cazul culturilor în mediu lichid (bulion) etalarea se face cu
pipeta Pasteur sau ansa bacteriologică prin depunerea unei picături
din cultură, care se întinde uniform pe suprafaţa lamei;
În cazul culturilor pe medii solide, iniţial pe suprafaţa lamei
degresate se depune o picătură de apă distilată sau ser fiziologic
după care se preia, în mod steril, cu ansa bacteriologică o cantitate
mică dintr-o colonie, care se descarcă în picătura de apă depusă pe
65
striclă și apoi, prin omogenizare se întinde uniform pe suprafaţa

lamei.
În cazul organelor, etalarea se poate executa prin trei metode:
- metoda amprentării, care constă în aplicarea lamei pe
suprafața obținută prin secționarea organului;
- metoda ştergerii, se realizează după ce organul se
secţionează, iar cu lama degresată se şterge uşor suprafaţa
secţionată;
- metoda strivirii, care constă în depunerea unui fragment mic
din organ, recoltat în mod steril, pe lama degresată, iar cu ajutorul
unei alte lame degresate se presează şi prin tragere se obţin două
frotiuri.
Uscarea. Materialul etalat pe lamă se face la temperatura
camerei pe suport.
Fixarea. Această operație are scopul de a mări aderenţa
materialului pe suprafaţa lamei şi totodată și de a inactiva celulele
bacteriene. Se poate realiza prin următoarele procedee:
- prin căldură - frotiul uscat se trece de câteva ori prin flacăra
becului de gaz, cu faţa opusă celei pe care s-a etalat materialul de
examinat.
- prin alcool-flambare - se depune pe suprafaţa frotiului uscat
alcool (metilic sau etilic) şi se aprinde;
- cu lichide fixatoare - care sunt reprezentate de un amestec de
alcool etilic şi eter. Frotiul se acoperă cu acest lichid, fixarea e
încheiată după evaporarea lichidului.
66
Etalarea din mediul solid, într-o

Etalarea din mediul lichid
picătură de apă
Uscarea la temperatura camerei
Fixarea prin trecerea prin flacără
Figura 22. Etapele executării unui frotiu (1)
67
4.5. Metode de colorare
4.5.1. Clasificarea metodelor de colorare
Dependent de frecvența utilizării și de complexitatea colorării,

metodele de colorare se clasifică după cum urmează:
► Uzuale. Acestea sunt metode care se folosec pentru colorarea
corpului bacterian. Acestea se clasifică la rândul lor în două mari
categorii, în funcție de complexitatea colorării și anume:
✓ Simple. Sunt metode în care se folosește un singur colorant și
anume:
➢ metoda de colorare cu albastru de metilen;
➢ metoda de colorare cu fuxină Ziehl diluată;
✓ Complexe. Sunt metode în care folosesc doi sau mai mulți
coloranţi:
➢ metoda de colorare Gram;
➢ metoda de colorare Ziehl – Neelsen;
► Speciale. Acestea sunt metode de colorare folosite pentru
evidenţierea unor particularităţi morfologice ale bacteriilor.
✓ Pentru evidenţierea sporului bacterian:
➢ metoda de colorare cu verde de Malachit;
✓ Pentru evidenţierea capsulei bacteriene:
➢ metoda de colorare Giemsa;
➢ metoda de colorare cu albastru de metilen;
➢ metoda de colorare cu albastru de toluidină;
➢ metoda de colorare cu tuş de China.
✓ Pentru evidenţierea cililor bacterieni:
➢ Metoda Casares Gill
➢ Metoda Fontana - Tribondeau sau metoda cu
impregnare argentică)
68
4.5.2. Metode de colorare uzuale
4.5.2.1. Metode de colorare uzuale simple
Metoda de colorare cu albastru de metilen. Este o metodă

uzuală, simplă prin care se pot examina formele vegetative, prezența
sporilor și / sau a capsulei.
Tehnica de lucru: Frotiul uscat, fixat şi răcit, se acoperă cu
soluţia de albastru de metilen 2 – 5 minute, se spală cu apă de
robinet, se usucă în hârtie de filtru şi se examinează la microscop cu
obiectivul de imersie (90X).
Interpretare:
- formele vegetative se colorează în albastru uniform.
- sporii, dacă există, se evidenţiază ca o vacuolă necolorată.
- capsula, dacă există, se colorează în roz – pal.
Metoda de colorare cu fucsină Ziehl diluată 1/10 Este o

metodă uzuală, simplă prin care se pot examina formele vegetative,
prezența sporilor și / sau a capsulei
Tehnica de lucru. Se execută identic cu metoda de colorare

cu albastru de metilen, dar se folosește fucsină Ziehl diluată 1/10.
Interpretare:
- formele vegetative se colorează în roşu uniform.
- sporii, dacă există, se evidenţiază ca o vacuolă necolorată.
- capsula, dacă există, se colorează în roz – pal.
69
4.5.2.2 Metode de colorare uzuale complexe
Metoda de colorare Gram. Este cea mai folosită metodă

uzuală complexă, care permite împărțirea bacteriilor în două
categorii: Gram pozitive și Gram negative.
Afinitatea tinctorială a bacteriilor este dependent de natura
componentelor endocelulare şi mai ales de deosebirile de structură
morfochimică ale pereţilor celulari şi ale membranei citoplasmatice
Peretele bacteriilor Gram pozitive este relativ gros şi are o
structură relativ omogenă, densă şi compactă. Constituentul
predominant cantitativ este mureina, până la 80-90% din greutatea
uscată a componentelor parietale, situată în zona profundă a
peretelui. Spre suprafaţa peretelui, sunt legate covalent la mureină
molecule proteine şi polizaharide, precum şi puţine lipide. Dintre
componentele polizaharidice, cele mai caracteristice pentru bacteriile
Gram-pozitive şi mai bine reprezentate cantitativ sunt: acizii teichoici.
Peretele bacteriilor Gram negative este mai subţire şi mai puţin rigid.
Conţine mai puţină mureină, aceasta reprezentând doar 5-20% din
totalul componentelor parietale, în schimb, conţine cantităţi mari de
lipopolizaharide, precum şi lipoproteine, fosfolipide şi alte
componente. Datorită acestor diferențe, bacteriile se colorează diferit
prin această metodă de colorare. În conferirea gram-pozitivităţii
intervine apoi şi faptul că peretele celulat opune rezistenţă la
pătrunderea în celulă a alcoolului acetonă, care acţionează ca
decolorant. La bacteriile Gram-negative, peretele celular este mult
mai bogat în lipide şi mai puţin dens, ceea ce permite pătrunderea
rapidă şi intensă a decoloranţilor.
70
Tehnica de lucru (fig. 23): frotiul uscat, fixat şi răcit se

tratează astfel:
▪ se acoperă frotiul cu soluţie violet de genţiana care se
menține timp de 1 minut, după care se înlătură
colorantul;
▪ se spală frotiul cu apă de robinet;
▪ se acoperă frotiul cu soluţie Lügol (cu rol de
mordansare), ce se menține timp de 1 minut, apoi se
înlătură colorantul;
▪ se realizează o decolorare prin depunere de soluţie de
alcool – acetonă, care se menține timp de 20 – 30
secunde;
▪ se întrerupe decolorarea prin spălarea frotiului cu apă
de robinet;
▪ se acoperă frotiul cu de fucsină diluată, timp de 1
minut.
Se spală frotiul cu apă de robinet, se usucă în hârtie de filtru şi
se examinează la microscop cu obiectivul de imersie (90X sau
100X).
71
violet de genţiana – 1 minut spălarea preparatului
soluţie Lügol (rol de mordansare) decolorare cu soluţie de alcool –

1 minut acetonă
câteva secunde
spălarea preparatului fucsină diluată – 1 minut
spălarea preparatului uscarea în hârtie de filtru

Figura 23. Etapele colorației Gram (1)
72
Interpretare:
- bacteriile Gram pozitive se colorează în albastru – violet;
- bacteriile Gram negative se colorează în roşu.
Trebuie reţinut faptul că există şi bacterii Gram labile, ele

având proprietăţi intermediare.
Gram pozitivitatea este influenţată şi de vârsta bacteriilor,
astfel că celulele tinere, care iniţial sunt Gram pozitive, prin
îmbătrânire devin Gram negative.
Metoda de colorare Ziehl – Neelsen. Este de asemenea, o

metodă uzuală, complexă de colorare, care se foloseşte pentru
colorarea bacteriilor: acido-alcalo-alcoolo-rezistente (bacilul
tuberculozei, leprei etc.). Acido-alcoolo-rezistenţata unor specii de
bacterii se datorează unor particularități de structură a peretelui
celular.
Penetraţia mai dificilă a colorantului în celulă şi rezistenţa la
decolorare cu acizi diluaţi şi alcool se datorează ceridelor şi
lipoproteinelor existente în cantităţi mari în peretele celular al
bacteriilor acido-rezistente. Un rol esenţial se pare că îl au mai ales
complexele lipido-proteice, în structura cărora intră acidul micolic.
Lipidele celulare permit o mai bună şi mai intensă solubilizare a
colorantului fenicat. Procesul ar consta în esenţă în faptul că, fuxina
fenicată ar fi legată mai intens de constituenţii celulari, fenolul fiind
mai solubil în lipidele celulare, decât în apă. Aceasta face ca
bacteriile acidorezistente, ale căror structuri parietale sunt deosebit
de bogate în componente lipidice, să reţină intens fuxina fenicată.
73
Tehnica de lucru (fig. 24): frotiul uscat, fixat şi răcit se

tratează astfel:
▪ se acoperă frotiul cu fucsină Ziehl;
▪ se încălzeşte uşor până la emisie de vapori timp de 5
minute, evitând fierberea colorantului pe lamă,
încălzirea realizându-se cu un tampon de vată fixat pe
o tijă metalică şi îmbibat cu alcool;
▪ dacă în timpul colorării se evaporă colorantul, frotiul se
acoperă din nou cu fucsină, cu grijă pentru a nu sparge
lama;
▪ frotiul se spală (opţional) cu apă de robinet;
▪ se face apoi decolorarea frotiului cu acid sulfuric diluat,
timp de câteva secunde;
▪ decolorarea se întrerupe prin spălarea frotiului cu apă
de robinet;
▪ frotiul se recolorează cu soluţie de albastru de metilen,
timp de 1 minut;
▪ se spală frotiul cu apă de robinet, se usucă în hârtie de
filtru şi se examinează la microscop cu obiectivul de
imersie.
74
fucsină Ziehl încălzire uşoară până la emisie de

vapori
5 minute
spălare cu apă de robinet decolorare cu acid sulfuric diluat -

câteva secunde
spălare cu apă de robinet albastru de metilen – 1 minut
uscare în hârtie de filtru

spălare cu apă de robinet
Figura 24. Etapele coloratiei Ziehl – Neelsen (1)
75
Interpretare: Bacteriile acido-alcalo-alcoolo-rezistente (AAAR)

apar colorate în roşu, iar restul bacteriilor, apar colorate în albastru.
4.5.3. Metode pentru evidențierea unor particularităţi morfologice ale

bacteriilor
Particularităţile morfologice ale bacteriilor sunt reprezentate de

cili, capsulă, spori bacterieni şi constituie criterii importante de
identificare, în vederea stabilirii apartenenţei la specie a bacteriilor.
4.5.3.1.Evidenţierea capsulei bacteriene
Capsula bacteriană este un înveliş exterior al bacteriei de

grosimi variabile, secretat de peretele celulei bacteriene. Consistenţa
capsulei este variabilă, în general puţin dură, cu structură chimică
specifică şi importante funcţii patogenice. Poate fi evidenţiată prin
diferite metode de colorare, deoarece are proprietatea de a se colora
diferit de restul celulei bacteriene.
Metoda de colorare Giemsa

Tehnica de lucru: Frotiul uscat, dar NEFIXAT, se acoperă cu
soluţie Giemsa, in strat subţire, numărând picăturile care se depun
pe lamă.
După 30 - 60 secunde se adaugă, un număr egal sau dublu
de picături de apă distilată. Amestecul colorant se lasă pe lamă un
timp de 2 - 4 minute, apoi se varsă, se spală frotiul cu apă de robinet,
se usucă în hârtie de filtru şi se examinează la microscop, cu
obiectivul de imersie.
Interpretare: capsula se colorează în diferite nuanţe de roz-
violet, iar corpul bacterian în albastru violet.
76
4.5.3.2.Evidenţierea sporului bacterian
Evidenţierea sporilor se poate realiza atât prin metode de

colorare, cât şi prin metode indirecte (de încălzire).
Sporul bacterian constituie o formă de conservare a speciei
bacteriene. Sporogeneza este caracteristică numai bacteriilor din
familia Bacillaceae (genul Bacillus – specii aerobe) şi familia
Clostridiaceae (genul Clostridium – specii anaerobe).
Forma, dimensiunile şi aşezarea sporilor în celula bacteriană,
în raport cu forma vegetativă, constituie criterii importante de
identificare.
La bacteriile din genul Bacillus, sporii au diametrul mai mic
decât cel al formei vegetative, ca urmare nu deformează celula și pot
fi dispuşi central, subterminal sau terminal (fig. 25).
Spor terminat Spor subterminal Spor central
Figura 25. Forma și dispunerea sporilor la speciile din genul Bacillus (4)
La speciile din genul Clostridium, sporii sunt dispuși, de

asemenea, central; subterminal sau terminal, dar au diametrul mai
mare decât celula, fapt ce determină deformarea celulei, aceasta
putând prezenta o formă de suveică sau de lămâie (spor central), de
sticlă de lampă sau de pară (spor subterminal) sau de băţ de chibrit
ori rachetă de tenis (spor terminal) (fig. 26).
77
Spor terminat Spor subterminal Spor central
Figura 26. Forma și dispunerea sporilor la speciile din genul Clostridium (4)
Evidenţierea sporilor prin colorare. Pentru colorarea

sporilor se folosesc metode energice de colorare, deoarece structura
chimică a peretelui sporal nu permite pătrunderea facilă a
coloranţilor. Din acest motiv, prin colorarea sporilor prin metode
uzuale, aceştia apar ca nişte vacuole necolorate.
Metoda de colorare cu verde de malachit
Tehnica de lucru: frotiul uscat, fixat şi răcit se acoperă cu
soluţie de verde de malachit 5% şi se încălzeşte uşor, timp de 3
minute, completând colorantul, pe măsură ce se evaporă.
Se spală frotiul cu apă de robinet, apoi se acoperă lama cu
soluţie de fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 1 minut, apoi se spală
cu apă de robinet, se usucă în hârtie de filtru şi se examinează la
microscop, cu obiectivul de imersie.
Interpretare: sporii apar coloraţi în verde, iar formele
vegetative în roşu.
Evidenţierea sporilor prin metode indirecte. Aceste metode

se utilizează în cazul unor materiale patologice (conţinut intestinal),
sau a unor probe din mediul ambiant (sol, apă etc.), în care sporii
sunt în cantitate mai mică, prezenţa lor putând trece neobservată la
examenul microscopic. Ca principiu, aceste metode au la bază
78
proprietatea sporilor de a rezista la temperaturi mai mari decât

formele vegetative.
Tehnica de lucru: materialul de examinat se supune încălzirii
într-o baie de apă la 65°C, timp de 15 minute pentru speciile genului
Bacillus sau la 70 – 80°C pentru speciile genului Clostridium.
Aceste temperaturi, distrug formele vegetative, dar nu şi
sporii. După încălzire se fac însămânţări pe medii de cultură
convenabile speciei ce urmează a fi izolată.
Interpretare: sporii prezenţi în materialul patologic
germinează în mediile de cultură incubate la 37°C şi dezvoltă culturi,
care se pot examina pe frotiuri colorate prin metode simple de
colorare.
79
5. DETERMINAREA MOBILITĂŢII ŞI A DIMENSIUNILOR

BACTERIILOR
5.1. Evidenţierea mobilității bacteriene
Unele specii de bacterii posedă la suprafaţa celulei organite de

locomoţie numite cili sau flageli, cu ajutorul cărora pot efectua în
mediile hidrice diferite deplasări, cu viteze relativ mari. Acestea sunt
organite cilindrice foarte subţiri, lungi şi flexibile, cu numeroase
ondulaţii helicoidale regulate.
Organite de mişcare, cilii reprezintă în general un caracter de
specie. Numărul şi aşezarea lor sunt caracteristice, constituind, la
rândul lor, criterii de identificare (fig. 27).
În raport cu aceste caracteristici, bacteriile se împart în
următoarele tipuri:
- atricha (gr. tricha = păr), lipsite de cili şi deci imobile;

- monotricha, care au un singur cil sau flagel situat la un pol al
celulei;
- amphitricha, care posedă doi cili situaţi câte unul la polii celulei;
- lophotricha, care au mai mulţi cili (5-30) grupaţi într-un smoc
situat la un pol al celulei;
- peritricha, care au un număr mare de cili (de regulă între 30-
100 cili) dispuşi jur-împrejur, pe toată suprafaţa celulei (de
exemplu, la Proteus vulgaris numărul lor ajunge chiar la
câteva sute)
80
monotricha amphitricha
lophotricha peritricha
Figura 27. Clasificarea bacteriilor în funcție de numărul și dispunerea cililor
(15)
http://en.wikipedia.org/wiki/Flagellum#mediaviewer/File:Flagella.svg
Pierderea cililor nu este incompatibilă cu viaţa. Mişcarea
bacteriilor, cu ajutorul cililor, poartă numele de taxie, fiind
determinată de condiţiile mediului înconjurător: fototaxie, aerotaxie,
chemotaxie.
Evidenţierea cililor se poate face:
- prin metode directe, care presupun evidenţierea cililor prin
diferite metode de colorare;
- prin metode indirecte (prin cultivare).
Examinarea mobilităţii se realizează pe preparate native.
5.1.1. Evidenţierea cililor bacterieni metode directe
Se poate realiza prin examinarea unui preparat nativ sau prin

examinarea unui preparat colorat
Examenul în preparat nativ. Se execută în preparat nativ

(între lamă şi lamelă) din cultura de cercetat şi se examinează la
microscop. În câmp se vor observa bacteriile care se deplasează,
81
traversând câmpul microscopic în diferite direcții. Se va face

diferenţierea între mişcările proprii ale bacterilor (mişcări pe loc, cu
aspect de tremurat, prezente la bacteriile lipsite de cili) şi mişcările
datorate curenţilor de lichid (în acelaşi sens), induse de
compresiunea lamelei sau a poziţiei înclinate a lamei.
Metoda de colorare Casares Gill. Foloseşte fucsină Ziehl şi

o soluţie mordantă. Soluţia mordantă se prepară prin mojararea a 10
g tanin şi 18 g clorură de aluminiu lichidă în 33 ml alcool de 70°. Într--
un alt mojar se dizolvă 10 g clorură de zinc şi 1,5 g fucsină bazică în
10 ml apă distilată. Cele două soluţii se amestecă vărsând picătură
cu picătură cea de a doua soluţie în prima. Păstrarea soluţiei se
poate face la întuneric şi rece, vreme îndelungată.
În vederea colorării, pe o lamă bine degresată se pune o
picătură de ser fiziologic, în care urmează să se facă suspensia de
germeni, cu mişcări foarte lente, dată fiind fragilitatea deosebită a
cililor, care se desprind cu uşurinţă. După uscare la aer se obţine
frotiul propriu - zis. Pentru obţinerea unor imagini mai clare se poate
recurge la suspensionarea prealabilă a germenilor în apă distilată şi
ţinerea la 37°C, timp de 2 ore, din suspensia respectivă efectuându-
se frotiul.
Frotiul se acoperă cu soluţia mordantă, diluată 1 / 5 (o parte
mordant la 4 părţi apă distilată) şi filtrată extempore. Soluţia se ţine
pe lamă până la apariţia unui luciu metalic, după care se varsă. Se
pune apoi fucsina Ziehl, care se lasă să acţioneze 1 - 2 minute, se
varsă, se spală cu apă de robinet, se usucă în hârtie de filtru şi se
examinează la microscop, cu obiectivul de imersie.
Corpii bacterieni apar coloraţi în roşu, iar cilii în roz pal.
82
5.1.2. Evidenţierea cililor bacterieni metode indirecte
Determinarea mobilităţii prin metode de cultivare se poate

realiza prin mai multe metode de lucru, după cum urmează:
- însămânţarea germenilor în plăci Petri cu geloză nutritivă;
- însămânţarea germenilor în eprubete cu geloză nutritivă
înclinată;
- însămânţarea germenilor în tuburi in forma literei "U";
- însămânţarea germenilor în medii semilichide
5.1.2.1. Metoda însămânţării germenilor în plăci Petri cu geloză

nutritivă
Tehnica de lucru: germenii se însămânţează cu ansa

bacteriologică, în plăci Petri cu geloză nutritivă, într-un singur punct,
fie la marginea plăcii, fie în centrul ei, apoi se incubează în termostat,
la 37°C, timp de 24 ore.
Interpretare: speciile bacteriene neciliate (imobile) se
dezvoltă doar în locul în care s-a efectuat însămânţarea, iar speciile
bacteriene ciliate (mobile), vor invada întreaga suprafaţă a gelozei
nutritive. Fenomenul poartă numele de roire (fig. 28).
83
Figura 28. Aspecte privind mobilitatea bacteriilor prin metoda cultivării în

plăci Petri (21)
5.1.2.2. Metoda însămânţării germenilor în eprubete cu geloză

nutritivă înclinată
Tehnica de lucru: se execută însămânţarea germenilor cu

ansa bacteriologică într-un tub de geloză înclinată, în lichidul de
condens, şi se incubează la 37°C, timp de 24 ore.
Interpretare: speciile bacteriene imobile se dezvoltă doar la
fundul tubului, pe când speciile bacteriene mobile invadează mediul
pe întreaga suprafaţă. Fenomenul poartă numele de căţărare şi este
84
prezent la speciile foarte mobile (genul Proteus şi unele specii ale

genului Bacillus).
5.1.2.3. Metoda cultivării în tuburi in forma literei "U"
Tehnica de lucru: se îndoaie un tub de sticlă fuzibilă în forma

literei U, se repartizează geloza moale şi se sterilizează prin
autoclavare. Se însămânţează germenii cu ansa bacteriologică, într-
una din ramuri şi se incubează la 37°C, timp de 24 ore.
Interpretare: speciile imobile se dezvoltă numai în ramura în
care s-a efectuat însămânţarea, în timp ce speciile mobile se
dezvoltă în toată masa mediului, inclusiv în ramura neânsămânţată.
Acest fenomen poartă denumirea de transmigraţie.
5.1.2.4. Metoda cultivării în medii semilichide
Tehnica de lucru: se însămânţează cu acul de însămânţare

un mediu semisolid (geloză moale, manită mobilitate) repartizat în
tuburi în coloană dreaptă, care se incubează la 37°C, timp de 24 ore.
Interpretare: bacteriile mobile se dezvoltă în toată masa
mediului opacifiindu-I uniform, pe când bacteriile imobile se dezvoltă
numai pe linia de însămânţare (fig. 29).
85
a b
Figura 29. Motilitatea bacteriilor prin metoda cultivării în medii semilichide

(a - creșterea bacteriilor pe linia de insămânțare
b -creșterea bacteriilor în tot mediul din eprubetă (24)
5.2. Determinarea dimensiunilor bacteriilor
Poate fi realizată, cu oarecare aproximaţie, prin comparaţie cu

diferite elemente având dimensiuni cunoscute, sau folosindu-se
metode micrometrice.
5.2.1. Metoda comparaţiei
Foloseşte în special elementele eritrocitare, al căror diametru

este în general de 7,7 - 8 micrometri. În acest scop se amestecă o
suspensie bacteriană în ser fiziologic cu o picătură de sânge. Din
amestec se face un frotiu care se colorează şi se examinează la
microscop, cu obiectivul de imersie. Metoda are doar o valoare
orientativă.
86
5.2.2. Metoda micrometrică
Permite aprecieri mai exacte şi foloseşte dispozitive speciale

din sticlă, pe care sunt gravate scări gradate şi care se adaptează la
microscop.
În acest sens se folosește unmicrometru ocular, care se
montat sub lentila superioară a ocularului şi un micrometru obiectiv,
care se așează pe platina microscopului.
Inițial se realizează calibrarea micrometrului ocular (fig 30). În
acest sens, privind prin oculare, se deplasează platina microscopului
până când valoarea 0 de pe scala micrometrului ocular se suprapune
peste valoarea o de pe micrometrul obiectiv.
Se urmărește apoi și se notează care din diviziunile celelalte
se suprapun perfect. Valoarea (cifra) găsită la micrometrul obiectiv
se înmulţeşte apoi cu 10 (valoarea în microni a unei diviziuni) şi se
împarte la valoarea (cifra) de pe scara micrometrului ocular,
obţinându-se valoarea în micrometri a unei diviziuni de pe
micrometrul ocular, cu care se fac apoi determinările.
Apoi, micrometrul obiectiv se scoate de pe platina
microscopului, iar în locul lui se pune preparatul de examinat.
Numărul de diviziuni ocupat de formaţiunea bacteriană sau celulară
care se măsoară se înmulţeşte cu cifra corespunzătoare valorii în
micrometri a unei diviziuni de pe micrometrul ocular, determinându-
se astfel mărimea formaţiunii respective (fig. 31).
Figura 31. Masurarea dimensiunii unei formațiuni celulare (25)
87
Figura 30. Calibrarea micrometrului obiectiv (1)
88
6. DETERMINAREA SENSIBILITĂŢII GERMENILOR

FAŢĂ DE SUBSTANŢE CU ACŢIUNE ANTIBACTERIANĂ
Sensibilitatea germenilor faţă de antibiotice şi chimioterapice se

stabileşte în mod curent prin:
- metode difuzimetrice;
- metoda diluţiilor seriate.
6.1. Metoda difuzimetrică
Metodele difuzimetrice se execută pe medii solide şi au la

bază proprietatea antibioticelor de a difuza în mediul de cultură, pe
diferite suprafeţe de la locul în care sunt depuse. Testul este
cunoscut şi sub denumirea de antibiogramă. Antibiograma se poate
efectua în scop clinic, în scop epidemiologic şi în scop ştiinţific.
În majoritatea ţărilor, în laboratoarele de diagnostic s-a
acceptat pentru antibiogramă metoda standardizată recomandată de
O.M.S., care se bazează pe utilizarea microcomprimatelor care
conţin substanţe antibacteriene, din care substanţa activă difuzează
în mediul de cultură solid pe care se dezvoltă tulpina bacteriană
studiată.
Pentru efectuarea testului sunt necesare următoarele
materiale:
- cultură bacteriană obţinută prin izolarea germenilor în stare
pură, în mediul lichid de cultură (bulion sau bulion Müller-
Hinton). Această cultură, în vârstă de 18 - 24 de ore se
poate utiliza ca atare sau se poate dilua în bulion steril
pentru a realiza o anumită concentraţie de germeni ca
inocul pe mediul solid;
- microcomprimate cu antibiotice, livrate de firmele
producătoare specializate;
89
- mediul de cultură, se recomandă mediul special pentru

antibiogramă, respectiv geloza Müller - Hinton;
- germeni martori de referinţă, care se pot utiliza în scop de
cercetare sau de control, fiind preluaţi din colecţii
bacteriene, de exemplu: tulpina de E. coli ATCC 25922,
tulpina de Staphylococcus aureus ATCC 25423, tulpina de
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Tehnica de lucru:
În prealabil se obţine o cultură tânără (de 18 - 24 ore) în
mediu lichid din germenul de studiat. Pentru obţinerea unor rezultate
corespunzătoare, tulpina trebuie să fie izolată în cultură pură.
Din acest moment se trece la pregătirea mediului pentru
antibiogramă. Astfel, mediul solid Müller - Hinton se lichefiază şi se
repartizează în plăci Petri în strat gros de 4- 5 mm. După solidificarea
mediului, plăcile Petri se lasă la termostat cu capacul întredeschis,
timp de 10 - 15 minute, pentru evaporarea apei de condens.
În cazul în care cultura în mediul lichid are o concentraţie prea
mare în germeni, cultura poate fi diluată cu mediul lichid steril.
Această cultură sau diluţia ei se inoculează pe mediul Müller -
Hinton din plăcile Petri, prin inundarea suprafeţei mediului şi apoi,
după câteva minute se aspiră excesul de cultură. Însămânţarea
trebuie făcută astfel încât să se obţină în final colonii apropiate, dar
nu confluente.
După uscarea suprafeţei mediului însămânţat, placa Petri se
menţine cu capacul întredeschis, timp de 10 - 15 minute la termostat.
Se depun microcomprimatele cu substanţe antibacteriene (cu
ajutorul dispenserelor în care acestea sunt condiționate sau cu o
pensă fină), respectându-se distanţa de 30 mm între
microcomprimate şi 15 mm de la marginea plăcii Petri. În acest mod
90
pe o placă Petri cu diametru de 100 mm se pot grupa 4 sau 5

microcomprimate.
După 10 - 15 minute (timp de predifuziune) de la plasarea
micocomprimatelor, plăcile Petri se incubează la termostat la 37°C,
urmând o primă citire la 6 - 8 ore şi interpretarea definitivă la 18 - 20 ore.
Interpretarea se face în funcţie de diametrul zonei de inhibiţie, măsurat în
mm cu rigla, în două - trei direcţii de la comprimat (fig. 32).
repartizarea mediului de cultură în

inocularea culturii
plăci
depunerea microcomprimatelor citirea zonelor de inhibitie
Figura 32. Executarea unei antibiograme (1)
91
Exprimarea rezultatelor se face fie direct prin transcrierea

diametrului zonei de inhibiţie în mm, cu indicarea valorilor
corespunzătoare sensibilităţii sau rezistenţei, fie prin traducerea
acestei valori în atribute calitative: tulpini rezistente, cu rezistenţă
intermediară sau tulpini sensibile, conform anumitor criterii
specificate în tabele pentru fiecare substanţă antibacteriană în parte.
În interpretarea rezultatelor nu se iau în considerare
următoarele rezultate:
- cultura foarte fină ce poate apare în zona
microcomprimatelor cu sulfamide din cauza diferenţei de timp între
apariţia culturii (sunt necesare câteva generaţii de creştere) şi
începutul procesului de inhibiţie;
- colonii foarte mici, punctiforme, vizibile numai cu lupa la
marginea zonei circulare de inhibiţie (mai ales la cloramfenicol),
cauzată de roirea tulpinii;
- zona de creştere foarte fină pe aria de inhibiţie (mai ales la
cloramfenicol), cauzată de roirea germenilor Proteus, în prezenţa
unei zone circulare de inhibiţie foarte net vizibilă;
În schimb se vor lua în considerare următoarele aspecte:
- colonii mari, bine dezvoltate, apărute în interiorul zonei de
inhibiţie, acestea reprezintă mutante rezistente în cadrul unei
populaţii predominant sensibile; astfel de colonii se vor reizola,
reidentifica şi retesta pentru sensibilitate, notându-se totodată şi
numărul lor;
- cultura net vizibilă, chiar dacă prezintă opacitate mai redusă,
în cazul în care aceasta este dispusă circular şi există o zonă de
inhibiţie completă, se va nota numai diametrul interior al inhibiţiei
totale, dacă cultura rezistentă cu opacitate mai redusă este prezentă
pe toată aria, se va nota diametrul zonei de inhibiţie parţială, cu
specificarea prezenţei culturii rezistente.
92
Situaţiile de mai sus sunt generate de mutante rezistente, dar

şi de bacterii cu viteză de multiplicare diferită în cadrul unei populaţii
heterogene.
De asemenea, în interpretarea rezultatelor trebuie avute în
vedere următoarele limite sau precauţii:
- rezistenţa la polimixină şi colimicină este uneori inexactă,
eroarea fiind cauzată de un inocul prea bogat, asociat cu un
coeficient redus de difuziune a acestor antibiotice, astfel de situaţii se
controlează prin metoda diluţiilor;
- unele tulpini de stafilococ pot demonstra o falsă sensibilitate
la meticilină, în condiţiile termostatării la 37°C, rezistenţa la acest
antibiotic se decelează mai bine la 30°C sau prin adăugarea la mediu
a 5% NaCI, cu condiţia folosirii unui inocul bogat;
- tulpinile de Pseudomonas şi de stafilococ cu un grad redus
de rezistenţă la gentamicină vor fi greu de diferenţiat de tulpinile
sensibile, care dau zone de inhibiţie cu 3 - 6 mm mai reduse decât
tulpinile de referinţă.
În concluzie, deşi în interpretarea rezultatelor există unele
posibilităţi de eroare, de neconcordanţă cu situaţia existentă în
clinică, totuşi testul antibiogramei prin metoda difuzimetrică rămâne
un test rapid, destul de eficient pentru alegerea unor medicamente
utilizate în scopul tratamentului unor infecţii bacteriene.
De remarcat că pe lângă metoda difuzimetrică prin intermediul
microcomprimatelor, mai există alte variante şi sisteme de execuţie a
metodei. Astfel, se pot utiliza rondele de hârtie de filtru îmbibate în
soluţii de antibiotice sau direct antibiotice sub formă de pulberi sau
soluţii depuse în cilindrii de sticlă (prin ţeavă fuzibilă), sau în godeuri
excavate în mediul solid din placa Petri.
93
6.2. Metoda diluţiilor
Această metodă are avantajul unei evaluări cantitative exacte

şi astfel permite stabilirea dozei minime utile în cazuri deosebite, ca
şi definirea exactă a concentraţiei minime inhibante (CMI) sau a
concentraţiei minime bactericide (CMB).
Fiind mult mai laborioasă decât metoda difuzimetrică, această
metodă se foloseşte frecvent în fabricile de antibiotice, pentru
testarea unor produse noi sau în scop de cercetare.
Principiul metodei: Metoda se bazează pe punerea în

contact a germenului de testat cu diluţii decrescânde din agentul
antimicrobian, în condiţii standard de lucru.
Metoda poate fi realizată prin două variante tehnice, respectiv
diluţii seriate în bulion sau diluţii seriate în mediul gelozat. Indiferent
de procedeul folosit, metoda diluţiilor necesită pregătirea prealabilă a
soluţiilor stock de antibiotice şi chimioterapice.
6.2.1. Metoda diluțiilor în bulion
Metoda diluțiilor în bulion presupune prepararea inițială sau

procurarea soluţiilor stock. În acest scop se utilizează substanţe
antimicrobiene preparate de firme cunoscute, special pentru
antibiogramă.
Nu este recomandat să se utilizeze la prepararea soluţiilor
medicamentele de uz clinic, deoarece acestea conţin pe lângă
substanţa activă şi alte ingrediente. Concentraţiile uzuale în
substanţa activă a soluţiilor stock folosite pentru antibiogramă sunt
de 1000 până la 1280 mcg / ml. Pentru fiecare substanţă activă
trebuie ales agentul diluant specific. Soluţiile stock, având
concentraţii mari de substanţă activă nu necesită sterilizarea, dacă
prepararea lor s-a făcut cu material şi manoperă sterilă.
94
De la aceste soluţii stock se obţin diluţiile seriate în mediul de

cultură. Diluţiile pornesc de regulă de la limita superioară de 100 -
120 mcg / ml, rareori de la 400 mcg /ml şi pot ajunge până la 0,1 mcg
/ ml.
În cazul metodei diluţiilor în bulion se pune în contact inoculul
din germenul de testat cu diluţii descrescânde din agentul
antimicrobian - în mediul lichid (bulion Muller - Hinton, sau bulion
special cord - creier).
Astfel, în tuburile cu bulion în care s-au executat diluţiile de
antibiotic se inoculează câte 0,1 ml din diluţia de 1 / 1000 a culturii de
20 de ore în bulion a germenului testat.
După incubare de 18 - 24 de ore la 37°C se interpretează
rezultatele, comparând dezvoltarea culturii faţă de tubul martor în
care nu se introduce antibiotic.
C.M.I. :Titrul bacteriostatic corespunde cu cantitatea minimă de
antibiotic, care inhibă total dezvoltarea culturii (CMI).
C.M.B.: În vederea stabilirii concentraţiei minime bactericide
(CMB) se transferă câte 0,1 ml sau o ansă plină în plăci cu geloză
simplă sau geloză cu sânge fără antibiotic, din toate tuburile în care
s-a constatat inhibiţia creşterii.
6.2.2. Metoda diluţiilor în agar
Se aseamămănă cu metoda anterioară, folosindu-se de

asemenea, soluții stock.
Ca mediu gelozat se foloseşte geloza Muller - Hinton care
poate fi suplimentată cu 5% sânge defibrinat de berbec sau de cal
pentru a permite dezvoltarea germenilor cu necesităţi deosebite de
creştere. Mediul este repartizat în cantităţile necesare în balonaşe
separate pentru fiecare placă.
Din soluţiile stock de antibiotice se realizează soluţii
descrescânde de la 100 sau 120 mcg / ml până la 0,15 mcg / ml, în
95
geloza topită şi răcită la cca. 50°C. De regulă, un volum de antibiotic

trebuie adăugat la 9 volume de mediu. De exemplu 10 ml soluţie de
antibiotic de 100mcg / ml se amestecă în 90 ml de mediu obţinându-
se astfel 100 ml de mediu care conţine 100 mcg / ml substanţă activă
care se poate turna în plăci Petri şi aşa mai departe.
Diluţiile se pot efectua şi după alte scheme de lucru. Pe
suprafaţa plăcilor cu mediu gelozat şi antibiotic se aplică inoculul sub
formă de spoturi de 5 - 8 mm cu ajutorul unei anse calibrate, ce
eliberează 0,001 - 0,002 ml. Inoculul provine din diluţia culturii de 20
- 24 de ore în bulion a germenului de testat.
Se inoculează prima dată plăcile cu concentraţii mici de
antibiotice şi apoi în continuare în ordine crescândă a conţinutului în
substanţă antimicrobiană. Pe o placă se pot testa 6-8 culturi.
Ca martor se foloseşte întotdeauna o placă fără antibiotice.
Incubarea plăcilor se face la 37°C, pentru 16 - 20 de ore.
După incubare plăcile se citesc notându-se, după caz,
intensitatea culturilor, numărul de colonii sau absenţa culturii.
Concentraţia minimă inhibantă (CMI) reprezintă diluţia cea mai
joasă de agent antimicrobian care inhibă creşterea. Nu se ia în
considerare prezenţa unei singure colonii.
6.3. Metode rapide pentru testatarea sensibilităţii tulpinilor

bacteriene la antibiotice şi chimioterapice
Alături de metodele standard pentru determinarea sensibilităţii

tulpinilor bacteriene la antibiotice şi chimioterapice tot mai frecvent se
utilizează în laboratoarele de diagnostic unele metode care permit o
interpretare rapidă şi chiar automată a rezultatelor.
Astfel, există trei categorii de metode:
- metoda difuzimetrică cu citire rapidă;
- metoda microdiluţiilor;
96
- metode automate.
Dintre metodele difuzimetrice cu citire rapidă amintim
metodele bazate pe reducerea hemoglobinei, pe folosirea rezazurinei
ca indicator redox şi a trifeniltetrazoliumclorid (TTC). Prin aceste
metode interpretarea rezultatelor se poate face la 5 - 8 ore.
Rezultatele acestei primei citiri au ca coeficient de potrivire de 80 -
85%, cu citirea în ziua următoare, citire care este obligatorie pentru
un rezultat definitiv.
6.3.1. Metoda microdiluţiilor
Reprezintă o simplificare a metodei cantitative de determinare

a sensibilităţii germenilor microbieni la antibiotice şi chimioterapice.
Metoda este accesibilă laboratoarelor de diagnostic, mai ales
că ea se practică în plăci de plastic cu godeuri în care repartizarea
soluţiilor de substanţe cu acţiune antibacteriană se poate face cu
pipete automate.
În prezent laboratoarele pot beneficia de plăci cu godeuri în
care substanţele antibacteriene sunt gata reprezentate congelate
(sistemul SENSITITRE).
Interpretarea rezultatelor se face uşor prin urmărirea
turbidităţii din godeuri, după un timp scurt de incubaţie de 3 - 4 ore.
Testarea sensibilităţii germenilor la antibiotice prin metoda
microdiluţiilor este un procedeu de mare utilitate, dar necesită un
control de calitate cu tulpini bacteriene de referinţă, foarte riguros.
6.4. Determinarea valorii antibacteriene a substanţelor

antiseptice şi dezinfectante
Valoarea antimicrobiană a unei substanţe antiseptice sau

dezinfectante se exprimă în raport cu o altă substanţă şi anume
fenolul, prin coeficientul sau indicele fenolic. Indicele fenolic reflectă
97
cu cât o substanţă este mai activă sau mai slabă în comparaţie cu

fenolul.
Pentru determinarea indicelui fenolic se pregătesc
următoarele materiale:
- cultură de 24 de ore în bulion din germenii faţă de care se
determină valoarea antibacteriană a substanţei de cercetat;
- o soluţie de 2% sau 4% din substanţa a cărei valoare
antibacteriană se cercetează;
- eprubete sterile;
- eprubete cu bulion steril.
Tehnica de lucru
Din soluţia antiseptică de cercetat se fac diluţii seriate. Din
fiecare diluţie se amestecă 1 ml cu câte 1 ml din cultura bacteriană,
în bulion de 24 de ore. După 5 minute de contact între germeni şi
substanţa de cercetat se fac transplantări cu ansa în bulion, din
fiecare eprubetă a diluţiei seriate, pentru a controla dacă germenii au
fost distruşi sau nu în acest interval de timp. Aceeaşi manoperă se
efectuează la 10 minute. În paralel se lucrează la fel şi cu fenolul.
Stabilirea indicelui fenolic se face astfel: după 24 de ore se
notează diluţia minimă de fenol şi diluţia maximă din substanţa care
omoară o suspensie microbiană, în 10 minute, dar nu şi în 5 minute.
Pentru calcularea coeficientului sau indicelui fenolic se împart cele
două cifre şi anume cifra diluţiei active a substanţei examinate cu
cifra diluţiei active de fenol.
Indicele fenolic = ultima diluţie activă a substanţei de cercetat /
ultima diluţie activă de fenol.
98
7. DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE GERMENI

DINTR-UN MATERIAL PATOLOGIC
Determinarea numărului total de germeni mezofili aerobi, existenți

într-o probă (pe unitatea de volum - ml sau de masă – g) sau pe o
suprafaţă, este o etapă indispensabilă în cercetările de bacteriologie.
Examenele bacteriologice cantitative se execută în mod permanent atât
pentru prepararea şi verificarea produselor biologice (seruri, vaccinuri),
cât şi în scop de diagnostic. Astfel, pentru probele de urină o
semnificaţie clinică - patologică o are urocultura cantitativă (se
consideră infecţie urinară dacă numărul de germeni depăşeşte 10000 /
ml).
Pentru determinările bacteriologice cantitative se pot obţine
date cu privire fie la numărul total de germeni vii și morţi (metoda
nefelometrică), fie numai germenii vii (metoda culturilor în plăci Petri
şi metoda diluţiilor).
7.1. Determinarea numărului total de germeni prin metoda

nefelometrică
Principiul metodei constă în compararea turbidităţii unei culturi

în bulion sau a unei suspensii microbiene, cu turbiditatea unei diluţii
standard de germeni sau de pulberi inerte.
În munca de laborator se utilizează mai frecvent scările
nefelometrice Mac Farland şi Brown, alcătuite pe bază de clorură de
bariu. Pentru uniformitatea datelor obţinute mai ales în laboratoarele
de producere a vaccinurilor, O.M.S. a stabilit o scară nefelometrică
de referinţă, cu ajutorul căreia se evaluează opacitatea suspensiilor
bacteriene în aşa numitele unităţi de opacitate (U.O.). Această scară
este constituită dintr-o suspensie de particule de sticlă Pyrex în apă
distilată, tratate prin agitare şi spălări consecutive, până când
99
particulele de sticlă au atins dimensiunea de 1,5 - 3 microni.

Concentraţia etalon a suspensiei este egală cu 10 U.O., iar eroarea
acestei scări nu depăşeşte 10%, adică o unitate. După această scară
etalon s-a trecut la prepararea de subetaloane utilizate în
laboratoarele de bacteriologie, cu menţiunea că numărul de germeni
reprezentaţi de 1 U.O. variază după specia microbiană.
7.2. Determinarea numărului total de germeni prin metoda

culturilor în plăci Petri
Prin această metodă se determină numărul de

microorganisme aerobe, în majoritate bacterii, fapt ce a determinat
ca denumirea metodei să fie la ora actuală de determinarea
numărului total de bacterii aerobe, denumire care se apropie de altfel
de cea folosită în literatura americană aerobic plate count, sau
numărul total de germeni mezofili aerobi (N.T.G.M.A.). De reţinut
este faptul că în majoritatea laboratoarelor există posibilităţi de a se
determina numărul de germeni anaerobi, drojdii, mucegaiuri, spori
bacterieni.
Tehnica de lucru: din materialul de examinat se execută
diluţii seriate din 10 în 10, procedându-se astfel: se repartizează cu o
pipetă gradată sterilă câte 4,5 ml (sau 9,0 ml) din lichidul diluant
(mediul de cultură, apă distilată sau ser fiziologic steril) într-un număr
de eprubete.
Apoi, cu o altă pipetă se adaugă în prima eprubetă 0,5 ml (sau
1,0 ml) din materialul de examinat, se omogenizează bine,
obţinându-se diluţia 1 / 10 (10-1). Din această eprubetă, cu o altă
pipetă gradată se prelevă 0,5 ml (sau 1,0 ml) şi se trece în cea de a
doua eprubetă, se omogenizează rezultând diluţia de 1/100 (10-2)
ş.a.m.d. până la sfârşitul şirului de eprubete. Numărul diluţiilor
(eprubetelor) este în funcţie de bogăţia în germeni ce se presupune a
100
o conţine materialul de cercetat, în aşa fel încât pe plăcile Petri,

coloniile dezvoltate să poată fi numărate.
Din aceste diluţii se fac însămânţări în plăci Petri sterile, câte
1 ml pentru fiecare placă Petri, cu menţiunea că din fiecare diluţie se
vor însămânţa cel puţin două plăci Petri şi se notează diluţia pe placa
Petri. Se toarnă în fiecare placă cca. 10 ml mediu solid topit şi răcit la
45°C şi se omogenizează bine pentru răspândirea uniformă a
bacteriilor pe suprafaţa plăcii Petri (fig. 33).
Plăcile astfel însămânţate se lasă la temperatura camerei
pentru solidificarea mediului, după care se incubează la termostat la
37°C, timp de 24 de ore, în funcţie de specia microbiană.
Figura 33.Tehnica executării diluțiilor zecimale seriate (original)
101
Aprecierea numărului de germeni se face prin numărarea

coloniilor care s-au dezvoltat, direct sau cu numărătorului de colonii,
considerând că din fiecare germen se dezvoltă o colonie.
In situația în care numărul de colonii este mare, se pot citi
numai coloniile de pe o jumătate de placă sau de pe un sfert de
placă, iar numărul astfel obținut se va înmulți cu 2 sau respectiv 4
pentru a obține număr de colonii pe toată placa.
Exista situații în care coloniile sunt foarte mici, iar numărul lor
este foarte mare. In aceste cazuri de face o citire a numărului de
colonii de pe 1 cm2 de pe placă, iar numărul astfel obtinut se va
înmulți cu suprafața plăcii pentru a obține număr de colonii pe toată
placa (suprafata placii: S =π x r2)
Numarul total de germeni se va calcula dupa formula:

NTGMA = n x d/ N
unde:
n – este numărul de colonii citite pe placă
d – este dilutia corespunzătoare placii respective
(x10 sau x 100 sau x 1000 etc.)
N – numărul de plăci citite
Rezultatul se exprima in unitati formatoare de colonii (ufc) / ml
Exemplu:
Să se calculeze cunoscând că:
Dilutia x10 (10-1) – placa 1 25000 colonii/ placă

placa 2 26000 colonii/placă
Dilutia x 100 (10-2) - placa 1 200 colonii/placă

placa 2 220 colonii/ placă
Dilutia x 1000 (10-3) placa 1 20 colonii/placa

placa 2 10 colonii/placa
102
103
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. BENSON J. - Microbiological Applications Lab Manual, Eighth

Edition, The McGraww-Hill Companies, 2001.
2. BÎLBÎE V., POZSGY N. - Bacteriologie medicală Vol. I, II -, Ed.
Medicală, Bucureşti, 1985.
3. BUIUC D., NEGUŢ M. - Tratat de Microbiologie clinică –, Ed.
Medicală Bucureşti, 1999
4. JOHNSON R. T., CASE L. CHRISTINE – Laboratory
Experiments in Microbiology, Ninth edition, Benjamin
Cummings 2010.
5. MISCA CORINA – Microbiologie generală- Lucrpri practice.
Editura Eurostampa, Timișoara. 2011.
6. PRESCOT H. – Laboratory exercises in Microbiology, Fifth
Edition, The McGraww-Hill Companies, 2001.
7. RĂDUCĂNESCU H., BICA-POPII VALERIA - Bacteriologie
veterinară - Ed. Ceres, Bucureşti, 1986.
8. RĂPUNTEANU GH., RĂPUNTEAN S. - Bacteriologie specială
veterinară - Tipo. Agronomia, Cluj - Napoca, 1999.
9. TAȘBAC B. A. – Microbiologie veterinară generală. Lucrări
practice ilustrate. Editura Larisa, Câmpulung, 2014.
10. TRIF R., GROZAV S. - Îndrumător de lucrări practice de
Microbiologie generală, Lito Inst. Agronomic Timișoara,
1990.
11. TRIF R., NICHITA ILEANA - Microbiologie generală. Editura.
Mirton, Timişoara, 2007.
12. TIRZIU E., CUMPĂNĂȘOIU C. GROS R.V., ȘEREȘ MONICA
– Bacteriologie Specială – Practicum. Ediția a III-a, Editura
Waldpress, Timișoara, 2014.
13. ZARNEA G. - Tratat de microbiologie generală - Vol. I. II, III -, Ed.
Academia Române, 1990.
14. http://dailyparasite.blogspot.ro/2010_01_01_archive.html
(accesat în 2014)
15. http://en.wikipedia.org/wiki/Flagellum#mediaviewer/File:Flagell
a.svg (accesat în 2014)
16. http://fragoimpex.com/equipments/autoclave.htm (accesat în
2014)
104
17. http://homepage.smc.edu/wissmann_paul/microbiology/flamin
g.html (accesat în 2014)
18. http://microbiologya.blogspot.co.uk/ (accesat în 2014)
19. http://sriwindayani1994.blogspot.ro/2014/06/cara-
penggunaan-alat-alat-dalam-lab.html (accesat în 2014)
20. http://www.memmert.com/products/incubator/incubators-
overview/ (accesat în 2014)
21. http://www.nature.com/nrmicro/journal/v8/n9/fig_tab/nrmicro24
05_F7.html (accesat în 2014)
22. http://www.rp-photonics.com/fluorescence_microscopy.html
(accesat în 2014)
23. http://www.tecnos.ro/details/etuva-750-litri-ventilatie-
fortata.html (accesat în 2014)
24. www.textbookofbacteriology.net (accesat în 2014)
25. www.microscopyu.com (accesat în 2014)
105

Caiet LP Microbiologie 1

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Caiet LP Microbiologie 1

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Îndrumător practic de Bacteriologie generală

MĂSURI DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN

În laboratorul de bacteriologie se impune respectarea unor norme

• Animalele de laborator infectate experimental vor fi ţinute în

Microorganismele sunt cele mai vechi, numeroase si

Figura 1. Antony van Leeuwenhoek și primul său microscop (original)

În secolele XIX și XX microscoapele au evoluat și s-au

1.1. Microscopul optic (cu câmp luminos)

Este un microscop ce permite razelor de lumină să treacă

Componentele principale ale microscopului optic (fig. 2) sunt:

Figura 2. Părțile componente ale microscopului optic (1)

Cadrul microscopului. Este o structură rigidă, alcătuită din

- obiectiv de imersie – 100X.

- diafragma nu trebuie să fie prea închisă, deoarece prin

1.2. Modul de utilizare a microscopului optic

Puterea (gradul) totală de mărire a microscopului este obţinută

asigura folosind un scaun rotativ, care permite reglarea înălțimii

1.2.1. Examinarea preparatelor native

Examinarea inițială a preparatelor native, pentru care

- după ce imaginea devine vizibilă, se deplasează uşor

1.2.2. Examinarea cu obiectivul de imersie

Numele acestui tip de obiectiv derivă de la faptul că un ulei

depune o picătură de ulei de cedru, lasând să cadă picătura de la

LA FINALUL EXAMINĂRII, SE VA ÎNDEPĂRTA ULEIUL DE

1.2.3. Îngrijirea microscopului

Microscopul necesită o atenţie deosebită, pentru a preveni

braţul microscopului şi o mână sub talpa microscopului,

Îngrijirea microscopului după terminarea lucrului. În acest

✓ după debranşarea de la reţea, se înfăşoară cordonul în jurul

Menţinerea curată a lentilelor microscopului reprezintă o

1.3. Microscopul cu câmp întunecat

Microorganismele vii, datorită structurilor foarte fine şi

Figura 3. Imagine obţinută la microscopul cu câmp întunecat a speciei

Deşi există numeroase metode de a produce câmp întunecat,

1.4. Microscopul cu contrast de fază

Un microscop care permite diferenţierea structurilor

Figura 4. Comparaţie între imaginea obţinută cu microscopul cu câmp luminos

1.5. Microscopul cu fluorescenţă

Microscopul cu fluorescenţă diferă din multe puncte de vedere

fosforescenţă. Dacă intervalul de timp este mai mic decât pragul

Figura 5. Imagine obţinută la microscopul cu fluorescenţă (22)

Sterilizarea este o noţiune largă, care se referă la orice proces

2.1. Sterilizarea prin agenţi fizici

2.1.1. Sterilizarea prin căldură

Căldura reprezintă unul dintre cei mai importanţi agenţi

2.1.1.1. Sterilizarea prin căldură uscată

Se realizează, în principal, prin patru metode:

FIambarea este cea mai simplă metodă de sterilizare şi constă

Figura 6. Flambarea eprubetei (17)

În condiţii de teren, flambarea se poate folosi la sterilizarea

Figura 7. Sterilizarea prin încălzirea la roșu a ansei microbiologice (17)

Arderea (incinerearea) se aplică pentru sterilizarea materialelor

Figura 8. Etuvă (23)

Aceste aparate au aspect paralelipipedic sau cilindric

bistuie, foarfece). Acestea, în prealabil, se spală, se usucă,

2.1.1.2. Sterilizarea prin căldură umedă

Căldura umedă se foloseşte pentru sterilizarea unor soluţii, a

Sunt folosite patru metode:

Sterilizarea prin fierbere. Se utilizează mai ales pentru

așa fel încât să se asigure menținerea lor imersă pe tot parcursul

Figura 9. Fierbător electric (16)

Autoclavarea (sterilizarea în vapori de apă sub presiune). Se

Figura 10. Schema de organizare a autoclavului (19)

Există şi autoclave mai moderne, prevăzute cu generatoare de