Tehnici speciale de microscopie

Această lucrare urm ăreşte studierea metodelor de observare a preparatelor ce nu pot fi vizualizate
cu ajutorul microscopului în transmisie sau în reflexie.

I. N oţiu n i teoretice
Metodele clasice de m icroscopie nu pot pune în evidenţă detaliile preparatelor atunci când acestea
au dimensiuni foarte mici (sub 1 m ) sau nu prezintă un contrast bun (detaliile au aceeaşi culoare ca şi
restul preparatului). În această situaţie, la dispoziţia observatorului stau metodele de colorare a
preparatului sau tehnicile speciale de microscopie.
Tehnicile de colorare (ce se vor studia în cadrul disciplinei de H istologie) prezintă în anum ite
situaţii câteva dezavantaje: necesită o cantitate mare de timp, manopera şi substanţe chim ice; nu pot fi
observate celule sau organism e vii; im aginea obţinută diferă m ai m u lt sau m ai puţin de structura reală.
Pentru înlăturarea acestor deficien ţe pot fi utilizate tehnicile speciale de microscopie. Dintre
acestea amintim:
- Microscopia de imersie
- Microscopia în ultraviolet (UV)
- Microscopia de câmp întunecat
- Microscopia de polarizare
- M icroscopia de fluorescenţă
- Microscopia de contrast de fază
- Microscopia electronică

1. Microscopia de imersie
Cele două tehnici de microscopie prezentate (transm isie şi reflexie) nu perm it o m ărire m ai m are
de 1000 de ori deoarece apare fenom enul de difracţie a lum inii pe detaliile preparatului.
Pentru a permite observarea unor detalii m ai fine una din soluţii este introducerea între obiect şi
obiectiv a unui lichid omogen, transparent şi izotrop cu indice de refracţie cât mai mare, numit lichid de
imersie. De obicei, se utilizează ulei de cedru (n= 1.3 -1.5) sau compuşi sintetici (n=1.3-1.6). În acest mod
se poate creşte m ărirea până la cca. 2000 de ori fără să apară fenom enul de difracţie. Un alt avantaj al
folosirii im ersiei este m ărirea luminozitatii imaginii:
2h
(1  )
E d h 

E0 n 2 1
unde:
E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie
 E0 - iluminarea imaginii în absenţa lichidului
h - distanţa obiectiv-obiect
d - diametrul obiectivului
n - indicele de refracţie al lichidului de imersie
E=(1.2-4)·E0
În cazul utilizării tehnicii de imersie este necesar ca preparatul să fie acoperit cu o lam elă pentru
ca lichidul de im ersie să nu m odifice structura acestuia. D e asem enea, se utilizează obiective speciale (de
im ersie) ce sunt inscripţionate ”A po” caracterizate prin distanţă focală mică, având totodată posibilitatea
de a culisa, în scopul evitării contactului brutal dintre obiectiv şi lamelă.
A u fost studiate aproape toate tipurile de bacterii. P erform anţele m icroscoapelor cu lum ină
vizibilă m erg pana la m ărim i de ordinul 2000 -3000 de ori (=0.25m).

2. Microscopia de ultraviolet
O altă m odalitate de a creşte puterea separatoare este m icşorarea lungimii de undă a radiaţiei
folosite până în domeniul ultraviolet UV (6·10-10, 3.8·10 -7)m. În acest mod s-au putut distinge obiecte de
dimensiuni de 0,15m, atingându-se o m ărire de 6000 -7000 de ori.
În cazul folosirii radiaţiei U V este necesar ca toate com ponentele optice ale m icroscopului să fie
realizate din cuartz deoarece sticla com ună este o pacă la acest tip de radiaţii.
Im aginea finală va fi obţinută pe un ecran de proiecţie acoperit cu o substanţa fluorescentă. În
cazul folosirii radiaţiei U V este obligatorie folosirea ochelarilor şi a ecranelor de protecţie deoarece retina
este foarte sensibilă în acest dom eniu de lungim i de undă.

3. Microscopia de câmp întunecat

Tehnica de câmp întunecat este utilizată pentru observarea preparatelor transparente şi se bazează
pe îm prăştierea lum inii pe detaliile preparatului. O rice neom ogenitate din preparat va determina o
m odificare a direcţiei razelor de lum in ă. D in punct de vedere constructiv se utilizează un condensor
special alcătuit dintr-o oglindă concavă şi una convexă (figura 3.1) astfel încât doar razele de lumina
îm prăştiate pe neom ogenităţile preparatului să ajungă în obiectiv.
 Figura 3.1. Microscopia de câmp întunecat.

C ondensoarele de câm p întunecat oferă înclinări diferite razelor de lumina trimise spre preparat.
Când se doreşte observarea detaliilor foarte fine, se folosesc condensoare ce produc înclinări m ari
fascicolului incident, fiind necesar în acelaşi tim p m ărirea intensităţii luminoase, deoarece fluxul de
lum ină ce pătrunde în obiectiv este foarte m ic. A taşate la m icroscop, condensoarele de câmp întunecat
trebuiesc centrate foarte bine pe axul optic al microscopului, în caz contrar obţinându -se imagini cu
”um bre”.

4. Microscopia de polarizare
M icroscopia de polarizare se utilizează în evidenţierea şi observarea substanţelor optic active ce
se găsesc în preparat. Substanţele optic active au proprietatea de a roti planul luminii polarizate.

Figura 3.2. Microscopia de polarizare.

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la m icroscop un polarizor şi un

analizor, ambele confecţionate din Spat de Islanda, ce au proprietatea de a lăsa să treacă doar razele de
lumină ce au un anumit unghi de polarizare.
Aceasta tehnică se utilizează atât în m icroscopia de transm isie cât şi în m icroscopia de reflexie. În
cazul m ontării corecte a po larizorului şi a analizorului doar razele de lum ina ce străbat zonele din preparat
ce conţin substanţe optic active vor ajunge la observator.

5. Microscopia de fluorescenţă
Fluorescenţa este proprietatea anum itor substanţe de a em ite lum in ă (radiaţie vizibilă) atunci când
sunt excitate cu radiaţie U V . D eoarece m ulte substanţe de interes m edical prezintă fluorescen ţă (acizi
nucleici, proteine) această tehnică este foarte utilizată în practica de laborator şi de cercetare m edicală.
F iecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungim e de undă de excitaţie (în
U V ) şi de o lungim e de undă de em isie (în vizibil), astfel încât tehnica poate nu doar pune în evidentă dar
şi identifica substanţele respective. În acest scop, se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea
radiaţiei de excitaţie şi de emisie a substanţei ce urm ează a fi observată. Filtrele se dispun ca în figura 3.3.

Figura 3.3. Microscopia de flu o rescen ţă.

În cadrul acestei tehnici, pentru observarea substanţelor ce nu prezintă fluorescenţă în m od direct,

se utilizează ”markeri de fluore-scenţă”, substanţe ce au urm ătoarele proprietăţi:
- fluorescenţă intrinsecă
- aditivitate foarte mare
- deteriorează m inim structura (substanţa) de care se fixează
C ele m ai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor.

6. Microscopia de contrast de fază

Este o tehnică ce se utilizează în special pentru observarea celulelor şi organismelor vii atunci
când tehnicile de colorare nu pot fi folosite. Metoda pune în evidenţă diferenţa de drum optic pe care o
face lumina trecând prin diferite zone ale preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre
drumul geometric şi indicele de refracţie al m ediului pe care îl parcurge raza de lum in ă).
Deci această tehnică pune în evidenţă atât diferenţe de grosime între diferitele zone ale
preparatului cât şi diferenţe de indice de refracţie între acestea. Sunt utilizate obiective speciale
(inscripţionate C f) care au dispuse în planul focal o placa de fază, ce defazează lumina cu o semilungime
de unda (în + se num eşte contrast de fază pozitiv sau în – contrast de fază negativ), şi un inel parţial
absorbant.
De asemenea, condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui obiectiv folosit.
Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special cu ajutorul căruia se pot observa
sim ultan atât inelul parţial absorbant cât şi fanta inelară în scopul suprapunerii acestor două imagini.

II. P arte exp erim en tală

Materiale necesare:
1. Microscop de cercetare MC9
2. Microscop Biorom
3. Condensoare de câmp întunecat
4. Polarizor, analizor
5. Obiective de imersie
6. Obiective de contrast de fază
7. Lame cu diferite preparate
 Modul de lucru:
A. Observarea nucleilor celulelor
-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul călăreţilor;
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu preparat;
-se coboară m ăsuţa m icroscopului fără a deplasa preparatul;
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00;
-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (în dreptul obiectivului);
-cu foarte m are atenţie se coboară obiectivul p âna ce se imer-sează în lichid;
-privind prin ocular se pune la punct imaginea.

B. Determinarea depozitelor glucidice

-se m ontează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul;
-se fixează preparatul pe m ăsuţă;
-se pune la punct imaginea;
-se deplasează în plan orizontal preparatul pe m ăsuţă până când se găseşte o zona liberă;
-se roteşte încet polarizorul până în momentul în care imaginea este maxim de întunecată;
-se aduce din nou preparatul în câmpul vizual; zonele lum inoase reprezintă zonele în care se
găsesc substanţe optic active.
C. D eterm inarea încărcăturii biologice a apei
-se m ontează la m icroscopul B iorom condensorul şi obiectivele de contrast de fază;
-se înlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct;
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistem ul astfel încât inelul parţial absorbant din
obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului;
-se montează din nou ocularul m icroscopului;
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h);
-se fixează lam a la m icroscop şi se caută observarea germenilor existenţi în apă atât prin tehnica
de microscopie clasică cât şi prin cea de contrast de fază.