Sunteți pe pagina 1din 37

Laboratorul de Nanotehnologii

TEHNICI DE SPECTROSCOPIE

Mihaela Miu (mihaela.miu@imt.ro)


Definitie generala:

Spectroscopia presupune analiza efectului interactiei radiatiei


electromagnetice cu proba

Proprietatile radiatiei

electromagnetice

 energia;

 viteza;
Lungine de unda
Amplitudin
e
 amplitudinea; Modificarea a cel putin una din
 frecventa; proprietati are loc la interactia
 unghiul de faza; radiatiei electromagnetice cu

 polarizarea; proba

 directia de
propagare.
UV Vis:
IR: unde Radio :
raze X: excitatia
starile de spin nuclear
excitatia electronilor de vibratii

moleculare (in camp magnetic)


electronilor adanci valenta
Excitarea electronica a electronilor intre orbitalii moleculari 4 tipuri de tranzitii posibile:

Orbitalii legaturilor simple


σ* – de antilegatura Nivele energetice libere
(neocupati)  σ → σ* necesita cea mai mare energie
Orbitalii legaturilor duble (posibile stari excitate >
(λ<150nm → UV indepartat) ;
π* – de antilegatura Ee)
(neocupati)  n → σ* sunt caracteristice sistemelor cu

heteroatomi (N, O etc.) care contin electroni

radiatie Orbitalii legaturilor duble


neparticipanti (λ ≈ 180 - 370 nm);

Nivele energetice
λ π → π* şi n → π* sunt caracteristice in

π – de legatura (ocupati)
ocupate (stari cazul moleculelor cu legături duble (λ ≈ 200
Orbitalii legaturilor simple fundamentale > Ef) - 700 nm).

σ – de legatura (ocupati)
ΔE = Ee – Ef = hc/λ

Nivelele vibrationale si rotationale superimpuse peste nivelele

electronice

Nivele
rotationale
Nivele
vibrationale
Stari electronice
excitate
Nivele
rotationale
Nivele
vibrationale
Stari
electronice
fundamentale
Metoda Fenomenul ce sta la baza Tipul de radiatie Domeniul de Domeniul de Numar de unda
spectroscopica electromagnetica lungimi de unda frecventa

Spectroscopie UV Vis Electronii


masoara absorbtiaexteriori
pentru a → determina comportarea
schimbarea chimica
avea tranzitii din starea
fundamentala
starii Lumina vizibila
electronilor in starea excitata 1000 nm – 100 nm
3·1014 Hz - 3·1016 Hz 104 – 106 cm-1
Radiatie UV
Spectroscopie de exteriori masoara tranzitiile din starea
excitata in starea fundamentala
fluorescenta

Spectroscopia IR Inregistreaza aparitia unor


miscari vibrationale ale
moleculelor
schimbarea radiatie IR
100 μm – 1μm 3·1012 Hz - 3·1014 Hz 100 - 104 cm-1
Spectroscopie Raman starii de Inregistreaza aparitia unor
oscilatie miscari vibrationale ale
moleculelor atunci cind sint
insotite de o modificare in
momentul dipolului

Spectroscopie de radiatia Rőntgen


electroni (ESCA) schimbarea starii electronilor adanci 10 nm -100 pm 3·1016 Hz - 3·1018 Hz 106 – 108 cm-1

Spectroscopia de
rezonanta de spin (ESR) schimbarea starii de spin a electronului microunde 1 m – 1 cm 300 MHz – 30 GHz 0,01 – 1 cm-1
sau a starii hiperfine

Spectroscopia de
I

Metoda Fenomenul ce sta la baza Tipul de radiatie Domeniul de Domeniul de Numar de unda
spectroscopica electromagnetica lungimi de unda frecventa

Spectroscopie UV Vis masoara absorbtia pentru a


schimbarea avea tranzitii din starea
fundamentala
starii Lumina vizibila
electronilor in starea excitata 1000 nm – 100 nm
3·1014 Hz - 3·1016 Hz 104 – 106 cm-1
Radiatie UV
Spectroscopie de exteriori masoara tranzitiile din starea
excitata in starea fundamentala
fluorescenta
1 SPECTROSCOPIE UV - VIZ
Spectrul
Frecvente Frecvente
mari vizibil mici

Lungimi de unda
(nm)
Violet: 400 - 420 nm

Indigo: 420 - 440 nm

Blue: 440 - 490 nm

Green: 490 - 570 nm

Yellow: 570 - 585 nm


> Cand lumina traverseaza sau este reflectata de o
Orange: 585 - 620 nm
substanta colorata, o parte caracteristica a lungimilor de
Red: 620 - 780 nm
unda este absorbita.

> Lumina ramasa din spectru se presupune a fi

complementara in culoare cu lungimile de unda absorbite.  Absorbtia luminii in domeniul 420-430


nm face ca substanta sa fie galbena, iar

 Absorbtia luminii in domeniul 500-520


nm face ca substanta sa fie rosie.

Absorbtia luminii din spectru este datorata tranzitiilor electronice


Schema de detectie in spectroscopia UV-Vis

Spectrometru cu monofascicul Spectrometru cu retea de


diode
(pentru fiecare lungime de unda este detectata (tot spectrul este obtinut
cantitatea de lumina transmisa / reflectata) odata)

Spectrometru
dublufascicul
1. Calcularea concentratiei de specii absorbante

Transmitanta: T = I / I0

Absorbanta: A = log10 I0 / I= log10 1/T = - log T

α – coeficient de absorbtie;

c – concentratia speciilor
α = εc
absorbante;

ε – absorbtivitatea molara sau


coeficient
Legea Lambert –
de extincţie molara.

A = ε·c·l Beer

lumina incidenta lumina transmisa lumina incidenta lumina transmisa lumina lumina
incidenta transmisa

Absorbanta este direct proportionala cu concentratia solutiei > dublarea concentratiei dubleaza absorbtia

Absorbanta este direct proportionala cu distanta parcursa in solutie > dublarea distantei dubleaza absorbtia
1. Calcularea concentratiei de specii absorbante
Legea Lambert –
A = ε·c·l Beer

Exemplu de

curbe de

absorbţie la

diferite curba de etalonare a


concentraţii de absorbantei la maximul de
analit absorbţie la λmax

Deviatii de la legea Beer – descrie corect solutiile diluate

La concentratii mari (> 10-2 M) apar interactii intre particulele

absorbante.

In plus, se modifica indicele de refractie al solutiei


Evolutia spectrului de absorbtie pentru
nanocristale cu diametre de la 1,7 nm pana la 2. Se poate calcula dimensiunea
12 nm cristalitelor
450 nm
(CdSe/ZnS core/shell700
QD)nm

Lungimi de unda mai mici / energii mai mari

 Apare deplasarea spre albastru – blue shift – odata cu scaderea

dimensiunilor

Eg (CdSebulk ) = 1.75 eV → λbulk = 710


Δλ ≈ 260 nm
nm

Eg (CdSeOD ) = 2.75 eV → λQD = 450


nm

 Ex: largirea BI ΔEg = 1eV corespunde unei deplasari Δλ ≈


scaderea dimensiunilor unui
262 nm
cristal pana la valori nanometrice

determina aparitia fenomelor de Apare fenomenul de largire a benzii interzise


(BI)
2 SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENTA

 detectie complementara spectroscopiei UV-Vis

> daca in spectroscopia UV-Viz se masoara energia absorbita de o molecula pentru

a trece dintr-o stare fundamentala in stare excitata,

> in spectroscopia de fluorescenta se masoara energia emisa de o molecula pentru

a trece din starea excitata in starea fundamentala.

Schema procesului de aparitie a fluorescentei

excitare

Fluorescenta

dezexcitar
e
Schema de detectie a unui spectrometru de
fluorescenta cu o geometrie la 90º utilizand o
sursa de Xe

Detaliu drum optic


Schema de detectie a fluorescentei in “Microarray
technology”
Diagrama Jablonski
Conversie interna > tranzitii
neradiative

Vi – stari energetice de
vibratie

S0 – stare fundamentala;

S1 – prima stare de tranzitie electronica


excitata

 Time resolve Se obtine timpul de viata al


fluorescence Proba este supusa unei iluminari in unei specii moleculare
pulsuri (durata pulsurilor trebuie sa
excitate
fie mai scurta ca timpul de viata) >
nanoFlash Lamp
ns μs

fluorescenta fosforescent
a

 Se obtine spectrul de
Steady state fluorescence
Proba este supusa unei iluminari emisie
(de fapt este o mediere a fenomenelor ‘time continue

resolve’)
Investigarea constantei de legatura a bioconjugatelor
BSA-Nanoparticule de aur
prin spectroscopia de fluorescenta
M. Iosin, F. Toderas, and S. Astilean,
Institutul de Cercetari Experimentale Interdisciplinare, Laborator de Nanobiofotonica, Universitatea Babes Bolyai,
Cluj-Napoca

Fenomen de stingere a
fluorescentei

NP
Au
e
er
Sf
Ba
st
on
as
e
Au
N
P
II

Metoda Fenomenul ce sta la baza Tipul de radiatie Domeniul de Domeniul de Numar de unda
spectroscopica electromagnetica lungimi de unda frecventa

Spectroscopia IR Inregistreaza aparitia unor


miscari vibrationale ale
moleculelor
schimbarea
Spectroscopie Raman starii de Inregistreaza aparitia unor 3·1012 Hz - 3·1014 Hz 100 - 104 cm-1
radiatie IR 100 μm – 1μm
oscilatie miscari vibrationale ale
moleculelor atunci cind sint
insotite de o modificare in
momentul dipolului
3 SPECTROSCOPIE IR si Raman

Fiecare atom are 3 grade de libertate > o molecula cu n atomi are 3n grade de
libertate
3 grade de libertate 3 grade de libertate
+
descriu translatia descriu rotatia moleculei
moleculei

Pentru o molecula liniara, rotatia in jurul 3n-6 grade de libertate descriu vibratiile fundamentale
axei nu conteaza (nu afecteaza energia
moleculei) Cele care produc o modificare neta
3n – 5 grade de liberate descriu vibratiile
fundamentale
in momentul dipolului in polarizare pot da

pot da o activitate IR o activitate Raman

Sunt vibratii active atat IR cat si Raman


Exemple:

• H2O – molecula neliniara cu 3 atomi 3n – 6 = 3 stari vibrationale

• CO2 – molecula liniara cu 3 atomi 3n – 5 = 4 stari vibrationale

• C6H6 (benzen) – molecula foarte mica, dar cu 30 de benzi de vibratie in IR si Raman

• molecula polimer – polistiren – contine 1000 de unitati monomere (16000 atomi) → aproximativ 50.000 de vibratii diferite
Este imposibili identificarea tuturor starilor vibrationale → simplificam luand in considerare numai gruparile chimice repetitive (ex: benzile nucleului aromatic,
vibratiile C-H, C-C sau C=C
Teoria spectroscopiei de absorbtie in
infrarosu
Pentru ca o molecula sa absoarba radiatia IR, vibratiile sau rotatiile in

interiorul ei trebuie sa determine o schimbare neta in momentul de dipol

Campul electric oscilant al radiatiei electromagnetice


interactioneaza cu fluctuatiile momentului de dipol al
moleculei

Daca frecventa radiatiei se potriveste cu frecventa


vibrationala a moleculei, atunci radiatia va fi absorbita

Va aparea o modificare in amplitudinea vibratiei moleculare.


Factori care afecteaza pozitia vibratiilor moleculelor in spectrul absorbtiilor
I // Cazul unor molecule
liniare
(i) Tipul de vibratii (ii) Taria legaturii

Exemplu Exemplu

Legatura C - N absoarbe la Legatura C ≡ N absoarbe la

1050– 1650 cm-1 ≈ 2200 cm-1

Energie mai Energie mai


mica mare
Exemplu Exemplu
In cazul unor legaturi similare, diferenta in
Legatura C - H stretch in alkene Legatura C - H bend in alkene
energia de absorbtie este data de masa
absoarbe la 2600 – 2800 cm -1
absoarbe la 1365 – 1485 cm-1
atomilor constituenti
Atomul cu masa mai Atomul cu masa mai mare

Energie mai Energie mai mica va vibra mai va vibra mai putin
puternic
mare mica

Legatura C – Cl Legatura C – Br
absoarbe la 600 – 800 absoarbe la 500 – 600
cm -1
cm-1
Atomul de Cl e mai usor >
energie mai mare de Atomul de Br e mai greu >
vibratie energie mai mica de
I I // Cazul unor molecule
neliniare
Exemplu: apa (H2O) – molecula neliniara cu 3 atomi

3n – 6 = 3 stari vibrationale

3 benzi de absorbtie in IR si Raman

n – 1 = 2 → vibratii 2n – 5 = 1 → vibratii

streching bending

pentru legaturile H - O pentru structura H – O - H


Felul in care radiatia este utilizata difera in spectroscopia Raman fata de spectroscopia IR :

 in FTIR energia care acopera un interval de frecvente este directionata catre

proba;

> absorbtia are loc cand frecventa radiatiei incidente se identifica cu cea la

care molecula trece intr-o stare excitata vibrationala

 in Raman se utilizeaza o singura frecventa a radiatiei pentru iradierea probei

> radiatia este imprastiata de molecula, detectandu-se unitatile de energie


Imprasierea Raman trebuie exprimata ca o deplasare in energie fata de radiatia de
vibrationale diferite de cele incidente (lumina care interactioneaza cu moleculele distorsioneaza –
excitatie

polarizeaza
 Pentru legaturi cu –
unnorul electronic)
moment puternic de dipol (care sunt active IR) mobilitatea electronilor sau polarizabilitatea este de obicei scazuta.

 Pentru legaturi cu un moment slab de dipol (care sunt inactive IR) polarizabilitatea este de obicei mare si starile vibrationale ale legaturilor

sint active Raman.

Spectru IR

Acid benzoic

Spectru
Raman
Spectroscopie Raman

Nu implica nici absorbtia, nici emisia, ci imprastierea


radiatiei
Radiatia IR incidenta determina miscarea electronilor in legaturi si poate fi: Este sensibila la

 absorbita; mobilitatea electronilor in


legaturi
 difuzata fara a i se modifica lungimea de unda > difuzie Rayleigh;
(polarizabilitatea
Masoara legaturilor)
cit de usor este sa misti un
- intensitatea Rayleigh depinde puternic de lungimea de unda
electron I ~ λsa
si implicit -4 polarizezi o

legatura
 imprastiata Raman-Stokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mare decât cea a radiatiei

incidente);

 imprastiata Raman-antiStokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mica decât cea a

radiatiei incidente);
Spectroscopie IR

 Energia asociata radiatiilor IR este suficienta sa stimuleze vibratiile moleculare (ale


legaturilor chimice)
Conditii pentru ca o molecula sa absoarba radiatia în domeniul IR:

� sa aiba o structura de dipol sau sa poata dobandi o astfel de structura prin

excitatie

� perioada de vibratie trebuie sa fie in faza cu perioada de oscilatie a radiatiei

incidente

� cantitatea de energie a radiaţiei IR trebuie sa fie permisa de restrictiile


Spectrul IR rezultat reprezinta absorbtia si transmisia
cuantice
moleculara, fiind amprenta moleculara a probei
Spectrele utilizate curent sunt de fapt spectre asupra carora s-a aplicat
transformata Fourier

Spectroscopia FTIR - o metoda de masura a tuturor frecventelor IR simultan utilizand


interferometria

Schema de detectie
Fasciculul IR incident este
divizat in 2 fascicule optice

Un fascicul se reflecta pe Al 2-lea fascicul se reflecta pe o


o oglinda plata fixa oglinda plata care se deplaseaza
pe distante scurte (inainte –
inapoi)

Se recombina cind se reintilnesc in splitter

Pentru ca au parcurcurs drumuri optice diferite, semnalul


rezultat este un semnal de interferenta

Fiecare punct contine o


informatie despre fiecare
frecventa IR care vine de la
sursa
Spectrul FTIR pentru o solutie de etanol

O-H

C-H

C-0

Observatii:

- o molecula contine legaturi care dau mai multe vibratii posibile > in spectrul IR trebuie sa se

regaseasca mai multe absorbtii care sa defineasca o molecula (nu numai o legatura chimica);

- se pot identifica legaturile specifice ale unei molecule (gruparile functionale) pentru a
III PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT
SCATTERING)
III PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT
SCATTERING)

 tehnica utilizata pentru determinarea dimensiunilor


nanoparticulelor
procesul de clusterizare a particulelor in
Se obtin in plus informatii despre suspensie
procesul de adsorbtie a anticorpilor pe
particule
Principiul de detectie:

proba cu particule in suspensie este iluminata

particulele vor imprastia lumina in toate


directiile

pe un ecran situat in
 daca particulele ar fi fixe > imaginea de pe ecran ar fi
vecinatate vor aparea spoturi stationara;
luminoase
 fiind in miscare browniana > imaginea nu este stationara
proba

Particule
in
suspensie

Intensitatea
luminoasa va fluctua
in timp
Din punct de vedere fizic

- Atunci cand un fascicul de lumina traverseaza o solutie cu particule sferice aflate in miscare

Browniana, interactiile cu particulele determina o deplasare Doppler, modificand lungimea de unda

initiala
Depinde de marimea
particulelor

Este posibila obtinerea distributia de dimensiuni ale


sferelor si sa ai implicit o descriere a miscarii
particulelor in mediul respectiv masurand coeficientul
de difuzie al particulelor si utilizand functia de
autocorelatie.
O functie caracteristica de autocorelatie a Particulele sau macromoleculele suspendate intr-un mediu lichid,
luminii imprastiate - determinate aflate in miscare Browniana determina fluctuatiii ale concentratiei
experimental
locale a particulelor apar neomogenitati locale ale indicelui de

refractie

Rezulta fluctuatii ale intensitatii luminii imprastiate

Semi-largimea emisiei la semi-inaltime (HWHM) este


proportionala cu coeficientul de difuzie al
particulelor D:
Γ = Dk2 unghiul de imprastiere

unde

lungimea de unda a LASER-ului


IV SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA
IV SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA

In curent continuu
E Sistem analizat I
E=IxR

In curent alternativ
E E0 + ΔE sin(ωt) Sistem analizat I0 + ΔI sin(ωt +θ) Z
E=IxZ

I, E
θ – deplasare de faza

timp
Prezentarea rezultatelor masuratorilor de
impedanta
Z (iωi) = E (iωi) / I (iωi)

numar complex

Prezentare in coordonate Carteziene:


Prezentare in coordonate Polare :

Z (iωi) = =Zejφi
Z (iωi) = Rei + iImi

indicele i = 1, 2 ,….n – frecventele din


Z= (Rei2 + iImi2)1/2 - modul ;
interval

f i = arc tan Imi/Rei - faza.


Se realizeaza o scanare descrescatoare
–Grafic in plan complex
de la frecvente (Nyquist)
mari la frecvente mici – Grafice Bode
Set de date 3D b)
-Im

D3 [ Rei, Imi, ωi] D3 [ ωi, Zi, f i ]


lg|Z|

φ
0
R1 R2 Re lg ω
Avantaje si dezavantaje ale EIS

 Pe de o parte functia impedanta contine toate informatiile pentru un sistem investigat

(daca ipotezele de lucru sunt alese corespunzator).

 Pe de alta parte aceasta informatie trebuie extrasa din datele experimentale,

(identificarea procedurii de analiza a datelor)


Utilizarea spectroscopiei de impedanta (i)

 caracterizarea materialelor si proceselor tehnologice

structura cristalina
caracterizarea densitatii de impachetare si
distributia de defecte in straturile auto-
- evaluare rapida pentru un material cu o structura
asamblate
policristalina a contributiei individuale la conductia electrica
transferul electronilor prin stratul auto-
sau la polarizare asamblat de alkanethiol si implicit prin
straturile corespunzatoare de
(efectele regiunilor de contact intergranulare sau a
recunoastere moleculara
caracterizarea
volumului)
electrozilor

-potentialul de flat-band, densitatea de sarcina (masuratori Mott-


Schottky);

- proprietatile catalitice ale nanoparticulelor metalice


transferul electric in materiale nanocompozite

- contributia starilor electronice de suprafatala transportul


electronilor

 caracterizarea dinamica pentru extragerea parametrilor celulelor solare

- concentratia de dopare a junctiunii,


- timpul de viata efectiv;
- efectul straturilor tampon asupra timpului de viata a purtatorilor
minoritari;
Utilizarea spectroscopiei de impedanta electrochimica (ii)

 caracterizarea sistemelor electrochimice / fenomenelor fizico-chimice care apar la interfetele electrochimice

- transportul de masa, transferul de sarcina prin interfata sau efectele


adsorbtiei;
1.
- parametrii de reactie (relatia intre geometria electrozilor si cinetica la
electrod, monitorizarea incarcarii surprafetei electrozilor datorita speciilor
dezvoltare
intermediare adsorbite;
a de
- mecanismele
efectele straturilor de interfata in cazul structurilor poroase.
ne-faradaice
senzori
(pierderile ohmice, conductivitatea ionica in membranele cu schimb protonic);
2.
- investigarea integritatii oxidului / straturilor de acoperire;
- ratele de corodare (proprietatile straturilor organice de acoperire in contact cu solutiile
corozive

 caracterizarea sistemelor bio-electrochimice

- instrument de detectie in care marcarea nu este necesara (label-free) a

modificarii proprietatilor de interfata prin legarea unor biomolecule incarcate

pe suprafata

- analiza hibridizarii AND-ului pe electrozi


Electrical / Impedance detection
Binding of DNA inside the PSi matrix induces a change in capacitance and conductance.
Mott-Schottky plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The capacitance of the Electrolyte/PS/Si


has been measured as function of DC
potential and the data recorded for
different concentration of DNA in
electrolyte solution are presented. The
figure illustrate that the test structure
capacitance plots suffer modifications
by adding different concentrations of
DNA in electrolyte solution: the flat
band potential is shifted to lower
values as DNA immobilization starts
from 0.31V to 0.24V and 0.21V
respectively.

Experimental data
Phosphate buffered saline- PBS) is a buffer solution commonly used in biological research. It is a salty solution
containing sodium chloride, sodium phosphate, and (in some formulations) potassium chloride and potassium phosphate.
The buffer helps to maintain a constant pH.
DNA 1 1 µM /50 ml PBS solution
DNA 2 2 µM/50ml PBS solution
Bode (a, b) and Nyquist (c) plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The Bode phase angle plots (a) reveal that phase angle attained a maximum at the value of -30° at
higher frequency region, which tends to -20° as the concentration of DNA is increased; opposing, in
lower frequencies domain, the maximum is initially around -70° and its value increases to -80° going
concomitantly with a gradual shift to lower frequencies, proving that the interface phenomena
became dominant. The corresponding impedance module plots fig. (b) show a similar behavior, with
a more evident decrease of values in low frequencies domain. The Nyquist graphs presented in fig. (c)
indicate that the data are not well separated above 200 Hz and clear distinct below, with a dominant
interface capacitance.