METODE SPECTRALE .

INTRODUCERE

Curs 5-6

A se studia în plus pentru acest curs:

- Capitolele corespunzătoare din cartea Imre S., Muntean D.L.: Principii ale
analizei medicamentului, Editura University Press, Tg. Mureş, 2006
- Materialul suplimentar corespunzător bibliografiei indicate
Pentru animaţii, aveţi nevoie de o conectare la internet, apoi urmaţi link-ul respectiv.
1
 James Clerk Maxwell
1831-1879

a. Natura şi caracteristicile radiaţiei electromagnetice

2
 Din punct de vedere energetic, COMPONENTA CÂMP
ELECTRIC are contribuţia cea Amplitudine
mai importantă!!! şi practic
Perioadă în studiul
această componentă este importantă
Frecvenţă
interacţiunilor radiaţiilor electromagnetice cu materia.
Energie
Vizeză de propagare

E = h  = h c /  = h c
unde E – energia radiaţiilor (J - Joule), h – constanta lui Planck (6.626068 × 10-34
m2 kg / s),  - frecvenţa radiaţiei (Hz - Hertz), c – viteza luminii (m/s),  - lungimea
de undă (m şi submultipli ex. nm=10-9m), - număr de undă (1/m sau 1/cm) 3
 b. Tipuri de radiaţii electromagnetice

Sensul de creştere a energiei radiaţiilor electromagnetice E, a frecvenţei  şi a

numărului de undă 

Sensul de creştere a lungimii de undă  4

 c. Efectul produs de radiaţiile electromagnetice
EFECTUL RADIAŢIILOR ELECTROMAGNETICE LA NIVEL MOLECULAR
la nivel molecular

b. Metode spectrometrice

- spectrofotometria UV-VIS
- spectrofotometria IR/NIR
- spectrofotometria de absorbţie şi emisie atomică

5
 Spectrometria UV-VIS

1.PRINCIPII 2.ANALIZA CALITATIVĂ

CUPRINS 3.ANALIZA
4.INSTRUMENTE CANTITATIVĂ

6
 METODE SPECTRALE UV- VIS

SPECTROMETRIE
Au loc interacţiuni între
radiaţia UV VIS cu atomii şi
ATOMICĂ ionii din probă la nivel de
electroni de valenţă

Au loc interacţiuni între

radiaţia UV-VIS cu
MOLECULARĂ moleculele din probă la nivel
de electroni de legătură

Când radiaţia UV VIS interacţionează cu atomii, ionii sau

moleculele sunt afectate nivelele energetice ale
electronilor de valenţă, respectiv legătură
 METODE SPECTRALE UV-VIS

EMISIE ATOMICĂ

ABSORBŢIE

ATOMICĂ MOLECULARĂ

LUMINISCENŢĂ

FLUORESCENŢĂ FOSFORESCENŢĂ CHEMILUMINISCENŢĂ

ATOMICĂ MOLECULARĂ
 PRINCIPII

Radiaţie Radiaţie
reflectată refractată

Radiaţie
Radiaţie transmisă
Probă
incidentă

Radiaţie
împrăştiată Radiaţie
emisă
• Fenomene care pot descrie interacţiunea unei
9
radiaţii electromagnetice cu materia:
reflexia, absorbţia, împrăştierea, refracţia radiaţiei
şi emisia de radiaţii
 ABSORBŢIA MOLECULARĂ . PRINCIPII

• Spectrometria de absorbţie moleculară în domeniul UV(185-

380 nm) şi VIZIBIL(380-800nm) este o tehnică curentă de
control şi analiză
• Aplicaţii : grupelor de atomi(molecule, ioni,polimeri) care
absorb radiaţii electromagnetice din domeniul UV-VIS

10
 ABSORBŢIA MOLECULARĂ. PRINCIPII

• Radiaţiile UV-VIS:
• Acţionează asupra electronilor de valenţă/legătură ( atomi sau molecule)
• Electronii implicaţi în legături chimice trec în stare superioară de energie
(stare excitată)

SPECTROMETRIA UV-VIS = SPECTROMETRIA ELECTRONICĂ

Spectrometria UV-VIS  tehnică de măsurare a spectrelor de absorbţie a
radiaţiilor UV-VIS de către materie
11
 ENERGIA MOLECULEI. TRANZIŢII ENERGETICE

Energia totală a moleculei este suma energiilor electronice,

vibraţionale şi rotaţionale

Et  Ee  Ev  Er
Et  h e  h v (v  1)  hcBJ ( J  1)
e – frecvenţa radiaţiei optice care provoacă tranziţia energetică
electronică
v – frecvenţa radiaţiei optice care provoacă tranziţia energetică
vibraţională
v – numărul cunatic vibraţional (v = 0, 1, 2, 3,......n)
J – numărul cunatic rotaţional (J = 0, 1, 2, 3,.......n)
B – constanta , c – viteza luminii
ORIGINEA SPECTRELOR DE ABSORBŢIE
MOLECULARĂ IN UV VIS
Moleculele au trei nivele energetice cuantificate

NIVELE ENERGETICE
CUANTIFICATE PENTRU MOLECULE

ELECTRONICE Ee

Creşte energia
VIBRAŢIONALE Ev

ROTAŢIONALE Er

Pentru fiecare nivel electronic molecula are mai multe nivele

energetice vibraţionale şi pentru fiecare nivel vibraţional mai multe
nivele rotaţionale.
 ABSORBŢIA RADIAŢIILOR DIN DOMENIUL UV-VIS ŞI FACTORII DE
CARE DEPINDE ACEASTA

• Energia necesară schimbării distribuţiei electronilor implicaţi în legături chimice este

de ordinul a câţiva electronvolţi şi, în consecinţă, fotonii absorbiţi sau emişi în timpul
unui astfel de fenomen sunt din regiunea ultraviolet şi vizibil situată între 190 şi 700
nm (~1-7 eV). Culoarea percepută de ochiul uman este rezultatul unor tranziţii
electronice produse în urma absorbţiei radiaţiei din domeniul VIS. Există situaţii în
care schimbarea distribuţiei electronilor poate fi suficient de puternică încât să
determine ruperea legăturii chimice, deci disocierea moleculei, producându-se o
reacţie fotochimică.

14
O bandă de absorbţie
corespunzătoare unei tranziţii
electronice este formată dintr-un
număr de benzi suprapuse, unite sub
forma uneia singure în cazul probelor
aflate în stare condensată (lichidă,
solidă). Explicaţia acestei structuri
este în legătură cu producerea mai
multor tipuri de fenomene în cursul
unei tranziţii electronice. Nucleele
atomilor dintr-o moleculă se află într-
o permanentă mişcare oscilatorie,
unul faţă de celălalt, această
deplasare purtând numele de
vibraţie. Distanţa internucleară a
atomilor implicaţi în legături chimice
15
este guvernată de forţele
coulombiene care acţionează asupra
lor.
Orice tranziţie electronică este însoţită şi
de o schimbare a vibraţiei moleculei, din
această cauză ea se mai numeşte şi
tranziţie vibronică. În urma unei tranziţii
electronice, are loc o redistribuire a
electronilor în moleculă, având drept
consecinţă schimbarea forţelor
coulombiene care acţionează asupra
nucleelor.
Principiul Franck-Condon ne indică
probabilităţile tranziţiilor de vibraţie care
însoţesc tranziţiile electronice.
Tranziţiile sunt cele mai probabile în
momentele în care molecula adoptă în
cursul vibraţiilor o geometrie comună
stării fundamentale şi a celei excitate.

16
• Nucleele răspund acestei
schimbări prin vibraţie, o parte
din energia absorbită pentru
redistribuirea unui electron
fiind de fapt utilizată pentru
stimularea vibraţiilor
moleculelor probei. Prin
urmare, în spectru, în locul
unei singure benzi electronice
înguste, se observă o bandă
largă cu un maxim, rezultată
prin suprapunerea mai multor
benzi de absorbţie vibraţionale
17
18
 PRINCIPII
Este important de menţionat faptul că o tranziţie electronică nu se produce dacă în timpul acesteia nu are
loc o modificare a momentului de dipol, deoarece este impusă condiţia existenţei unui „cuplaj” între
câmpul electric al radiaţiei electromagnetice şi dipolmomentul moleculei.
În urma absorbţiei de radiaţie electromagnetică UV-VIS, electronii de valenţă trec dintr-un orbital de
legătură într-unul de antilegătură, de energie mai mare.
:
s antilegătură
Energie
p antilegătură

n nelegătură

p legătură

s legătură
 PRINCIPII

Fiecare electron într-o moleculă are o singură stare fundamentală şi nivele

excitate specifice
Tranziţiile( salturile de energie) posibile pentru electronii unei molecule date
sunt: previzibile şi în număr finit

Grad de
absorbţie

E*
Natura radiaţiei (
sau )
Absorbţie
Spectru de absorbţie
h În figură este un spectru cu 2 maxime de
E0
absorbţie, deci sunt absorbite cu intensitate
Radiaţie Probă Radiaţie mare 2 tipuri de radiaţii
transmisă
incidentă
20
Sunt absorbite acele radiaţii a căror energie este egală cu diferenţa de energie dintre două
stări energetice ale moleculei:
 PRINCIPII

• Un spectru reprezintă intensitatea absorbţiei la diferite lungimi de undă

A=f(λ)
• Un spectru UV-VIS este un spectru de benzi(/molecule) caracterizat printr-
un maxim de absorbţie (λmax) şi un minim de absorbţie (λ min)

21
 Maxime de
PRINCIPII absorbţie

22

Exemplu de spectru de absorbţie

ARIA DE UTILIZARE ŞI PERFORMANŢA METODEI

SPECTROMETRIA UV-VIS:
 Se aplică substanţelor care absorb în UV sau care pot fi convertite în substanţe
absorbabile
 Metodă utilizată preponderent pentru controlul calităţii substanţelor active şi
excipienţilor sau produselor farmaceutice
 Pentru probe complexe, metoda nu este utilizată în mod direct ci în combinaţie cu
HPLC-met standard de analiză a produselor farmaceutice
 HPLC cu detecţie UV- determinări din medii biologice
 EC cu detecţie UV
 Teste de dizolvare
AVANTAJE:
 Metodă simplă şi relativ performantă
 Aparatură ieftină şi simplă în comparaţie cu alte instrumente
ACURATEŢEA ŞI PRECIZIA- parametri importanţi în evaluarea metodei
Metodele oficiale din Ph.E pentru controlul purităţii materiilor prime şi produselor
farmaceutice testate în numeroase laboratoare au o acurateţe de 1-3%
Precizia- diferenţe între multiplele măsurători(paralele) pentru aceeaşi probă.
23
- Dovedeşte o precizie bună dar nu atât de mare ca în cazul celei obţinute în titrimetrie
 ANALIZA CALITATIVĂ

Semnal
măsurat

Informaţii
cantitative
Lungime de
undă /
frecvenţă /
Informaţii număr de undă
calitative

Utilitatea analitică a spectrelor de absorbţie 24

 ANALIZA CALITATIVĂ

Cromofori:
• Grupe de atomi la nivelul cărora se produce absorbţia
radiaţiilor UV-VIS

Compus Cromofor max [nm]

Etenă C=C 185

Butadienă C=C-C=C 217
Crotonaldehida C=C-C=O 217
Sulfanilamida în
HN-O2S-C6H4-NH2 251
soluţie alcalină
25
Sulfanilamida în 218
H2NO2S-C6H4-N+H3
soluţie de HCl 265
 ANALIZA CALITATIVĂ

Deplasarea lungimii de undă a maximului de absorbţie, max, şi

modificarea intensităţii benzii de absorbţie a unui cromofor, exprimată
prin coeficientul molar de absorbţie max , sunt determinate de
ambianţele atomice din molecula din care face parte , interacţiunea cu
solventul, deplasarea echilibrelor de ionizare în soluţie, etc.
Variaţiile mici de temperatură nu modifică spectrele electronice în
soluţie. Pentru a descrie aceste influenţe şi modificări spectrale se
lucrează cu câteva noţiuni specifice:
• grupare auxocromă – grupare saturată de atomi, -OH, -NH2, -S-, -Cl, -
N+H3, care ataşată unui cromofor modifică lungimea de undă max la
care are loc absorbţia şi intensitatea maximului de absorbţie
• deplasare batocromă „spre roşu” – deplasarea maximului de
absorbţie la lungimi de undă mai mari (energii de excitaţie mai mici)
• deplasare hipsocromă „spre albastru” - deplasarea maximului de
absorbţie la lungimi de undă mai mici (energii de excitaţie mai mari)
• efect hipocrom – scăderea intensităţii absorbţiei
• efect hipercrom – creşterea intensităţii absorbţiei
26
27
Cromofori conjugaţi Corelarea structurilor cu poziţiile maximelor
de absorbţie: regula Woodward-Feiser!

Introducerea unui nou cromofor

independent de celălalt:

- Ɛ este aditiv (deplasare hipercromă)

- λ constant
CH3CH2CH2CH=CH2: λmax= 184 Ɛmax =
~10,000
CH2=CHCH2CH2CH=CH2 λmax=185 Ɛmax =
~20,000

Dacă există conjugare între cromofori:

- Deplasarea λ la lungimi de undă mai mari
(deplasare batocromă)
H2C=CH-CH=CH2 λmax=217 Ɛmax = ~21,000
28
 ANALIZA CALITATIVĂ

pp* np* pp* np*

190 nm 230 nm 190 nm 230 nm

29
 ANALIZA CALITATIVĂ

Informaţii calitative:
• Stabilirea prezenţei unui cromofor
• Un spectru UV-VIS nu permite determinarea structurii complete a substanţei
de analizat!!!
Factori care influenţează poziţia şi intensitatea maximelor de
absorbţie
Ambianţa atomică Interacţiunea cu Factori fizico-
(efecte electronice) solventul chimici.

 max 
30
Semnal
măsurat 30
la max
Spectru de absorbţie UV-VIS
31
Spectrele hemoglobinei şi ale derivaţilor acesteia
32
Antracenul şi fenantrenul au aceeaşi formulă chimică dar spectre foarte
diferite pentru că...??? 33
Interacţiunea cu solventul: polaritatea solventului poate modifica structura
electronică şi absorbanţa cromoforului. Intensitatea şi forma benzii de absorbţie
sunt coroborate cu solventul. In determinările comparative se foloseşte acelaşi
solvent.

34
Spectrul benzofenonei în diverşi solvenţi O
Solventul ideal

35
 Aplicaţii: Identificare

a) Aspirina
acid max = 225 nm
acetilsalicilic  = 460

2014
b) Paracetamol

Chimie analytique instrumentale

N-(4-hidroxifenil
Etanamida)
max = 249 nm
 = 880

c) Acid salicilic
Spectrochimica Acta Part A: Molecular and
36
Biomolecular Spectroscopy
max = 235 nm Volume 68, Issue 2, October 2007, Pages
 = 506 275–278
 λmax = 497 nm εmax = 133000 M-1. cm-1

37
β-carotenul- polienă naturală cu 11 legături conjugate
DETECŢIA/IDENTIFICAREA UNOR BIOMOLECULE

38
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Legea Lambert-Beer

 I0 
A  log    a lc
 IT 
Cuvă cu soluţia
probă unde:
A - absorbanţă
a - absorbtivitate sau coeficient de
absorbţie  o constantă pentru o
I0 IT substanţă dizolvată într-un solvent dat
l - lungimea cuvei în care se află soluţia
c c - concentraţia substanţei în soluţie
I0 – intensitatea radiaţiei incidente
39
l IT – intensitatea radiaţiei transmise
39
 ANALIZA CANTITATIVĂ

• a   coeficient de absorbţie molar sau absorbtivitate molară,

atunci când concentraţia c se exprimă molar

• a  A1cm1% absorbanţa specifică atunci când concentraţia c se

exprimă în g la 100 ml soluţie, simbolizată %(m/V)

• a – caracterizează natura substanţei de determinat şi

ambianţa (matricea) în care aceasta se află în probă (natura
solventului, pH etc.)

40

40
 ANALIZA CANTITATIVĂ

I0
A  log A - Absorbanţa
IT
 IT   IT 
T    ; T %    100
 Io   Io 
T – Transmitanţa
T% - Transmitanţa procentuală 41
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Legea Lambert-Beer este lineară în următoarele condiţii:

 Soluţia de analizat are concentraţii mici(sub 0,01M) şi constante pe parcursul
determinării
 ε este constant- lumină monocromatică
 l este constant – fasciculul radiaţiei incidente este perpendicular pe cuva cu probă
 Soluţia este transparentă
 Soluţia de analizat nu este fluorescentă
 Soluţia de analizat este stabilă din punct de vedere fotochimic
 Nu există reacţii în soluţia de analizat

42
 ANALIZA CANTITATIVĂ

• Informaţii cantitative:
• Pornind de la legea Lambert-Beer
• Metode:
• Pe baza coeficientului de absorbţie
• Metoda standardului extern
• Metoda curbei de calibrare etc.

43
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative pe baza absorbtivităţii

Absorbanţa, A
cx la lungimea de
undă , cuva de
l cm A
Soluţia c x ,%(m/V)  f
probă 
Coeficientul de ! F =Factor numeric –
absorbţie,  se ţine cont de diluţiile
Tabele de sau A1cm1%, la efectuate, modul de
specialitate lungimea de exprimare a
undă  şi în concentraţiei, corecţia 44
datorată lungimii
cuva de l cm
cuvei – dacă este
cazul etc.
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative pe baza

standardului extern

Absorbanţa
Ap la
lungimea de
undă , în Apc s
Cuva cu
probă
cuva de l cm cx  f
As
Absorbanţa
AS la
lungimea de Unde cx şi cs sunt
undă , în concentraţia probei şi,
Cuva cu respectiv, a soluţiei
soluţia cuva de l cm
standard 45
standard
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative prin metoda standardelor externe

(metoda curbei de calibrare)

Ax
cx Absorbanţă

Absorbanţă
probă
Probă Ax
Concentraţie
probă
A1 A2 A3 … Ai
c1 c2 c 3 ci cx
Concentratie
Serie de 46
soluţii
standard
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative prin metoda standardului intern

Se măsoară absorbanţa Ax a soluţiei cu

concentraţia necunoscută Cx şi cu volumul
Vx.
Se adaugă acesteia un volum( mult mai mic
decât Vx) – ΔV dintr-o soluţie standard cu
concentraţia cunoscută Cs.
Absorbanţa măsurată se notează cu Axs iar
concentraţia Cx se va determina cu ajutorul
formulei de mai jos.
Metoda are avantajul că ţine cont de efectul
de matrice.

47
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Dozarea substanţelor în probe cu mai multe componente

• Există câteva metode ce pot fi aplicate la determinări cantitative

din amestecuri, principiul determinării bazându-se pe două
postulate:
• - absorbanţa unei soluţii este suma absorbanţelor
componentelor individuale;
• - absorbanţa măsurată este diferenţa dintre absorbanţa
totală a soluţiei şi absorbanţa soluţiei de referinţă.

48
DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI UNUI AMESTEC(A+B)

1. Nu există
interacţiuni A =  () x c x l Atot = AA + AB

A(1) = A (1) x cA + B (1) x cB

A(2) = A (2) x cA + B (2) x cB

2014
- Trebuie cunoscute sau determinate:

Chimie analytique instrumentale

A (1) , A (2) , B (1) şi B (2)
- Se măsoară A (1) A(2)
- Ecuaţie cu două necunoscute:

Amestec A+B

Substanţa A 49
Substanţa B
Continuare

A(l 2)
cA =
eB(l 2) ( A(l1) - eA(l1) )
eA(l 2) +
eB(l1)

2014
Chimie analytique instrumentale
A (l1)
cB =
eA(l1) ( A(l 2) - eB(l 2) )
eB(l1) +
eA(l 2)

Amestec A+B

Substanţa A 50
Substanţa B
 ANALIZA CANTITATIVĂ

2 A.Dacă interferenţa celorlalte componente este mare sau

contribuţia lor la absorbanţa totală nu poate fi estimată, atunci
este nevoie de separarea interferenţilor absorbanţi printr-un
procedeu de extracţie cu solvenţi. Acesta este indicat pentru
substanţele medicamentoase cu caracter slab acid sau bazic al
căror grad de ionizare şi, deci, coeficientul lor de repartiţie depind
de pH-ul celor două medii: mediul apos şi mediul organic
nemiscibil cu apa.
• Prin alegerea corectă a pH-ului se poate face separarea
completă a interferenţilor de analit, a cărui concentraţie poate fi
apoi estimată printr-o simplă măsurătoare de absorbanţă.
51
 ANALIZA
ANALIZA CANTITATIVĂ
CANTITATIVĂ

2B.Dacă compusul interferent e

cunoscut, cu un spectru definit(albastru),
eroarea introdusă de acest compus la
lungimea de undă analitică(λ1) poate fi
eliminată selecţionând o lungime de undă
de referinţă(λ2) la care interferentul are
aceeaşi absorbanţă(A2) ca şi la lungimea
de undă analitică (λ1).
A2 se va scădea din A1( absorbanţa
măsurată-analit+interferent).
A(absorbanţa analitului) va fi:
A= A1-A2

52
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Tipuri de probe şi principii practice de lucru

• Tipuri de probe:
• Lichide -Soluţii lichide
• Gazoase – mai rar
• Concentraţiile soluţiilor analizate – astfel alese încât valoarea
absorbanţei A să fie cuprinsă între 0,2 şi 0,9 (legea Lambert-Beer se
respectă doar dacă absorbanţa se încadrează între aceste valori); la
spectrometrele vechi A trebuie să fie între 0,3 şi 0,7
• Solvenţii probelor lichide se aleg a.î. aceştia să nu absoarbă
semnificativ la lungimea de undă maximă la care se fac măsurătorile.
• Măsurarea probelor se face faţă de un martor – o soluţie preparată în
acelaşi solvent ca proba şi care conţine aproape toţi compuşii probei,
cu excepţia substanţei de analizat. Prin folosirea martorului, se scade
din absorbţia probei, absorbţia datorată celorlalţi compuşi prezenţi în
probă. 53
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Tipuri de probe şi principii practice de lucru (continuare I)

• Cuvele în care se introduc probele:

• Sunt confecţionate din materiale care nu absorb în UV-VIS. Ex.:
• Sticla – domeniul VIS
• Cuarţ sau materiale plastice – domeniul UV-VIS
• Mărimea (lăţimea) cuvelor – de regulă, 1 cm, dar se pot folosi
cuve mai mici, dacă proba este într-un volum mic sau este prea
concentrată, sau mai mari, dacă probele sunt prea diluate. !!! Nu
toate spectrometrele sunt dotate cu suporturi pentru cuve cu
dimensiuni variate. !!! Nu întotdeauna există volum suficient de
probă şi atunci se folosesc cuve de lăţimi mici (5 mm, 2 mm, 1
mm)
54
 ANALIZA CANTITATIVĂ

Tipuri de probe şi principii practice de lucru (continuare II)

• Etape în analiza cantitativă spectrometrică UV-VIS:

• Se înregistrează spectrul de absorbţie pe domeniul UV-VIS

• Dacă în spectru sunt mai multe benzi de absorbţie, se alege ca lungime
de undă de lucru max cea mai mare, cu condiţia ca banda
corespunzătoare să fie intensă
• Se evită să se lucreze la  situate în jurul valorii de 200 nm deoarece în
această zonă absorb aproape toate substanţele (determinările în această
zonă sunt total nespecifice); dacă substanţa are un singur maxim de
absorbţie situat în acest domeniu, martorul trebuie pregătit extrem de
riguros şi pentru aceasta trebuie să se cunoască cu precizie natura
tuturor compuşilor posibili în probă
• Se procedează apoi conform metodelor cantitative descrise anterior. 55
 SPECTROMETRIA DERIVATĂ
Dacă un spectru se consideră ca fiind reprezentarea grafică a absorbanţei (A) în funcţie
de lungimea de undă (λ), spectrele derivate ale acestuia sunt descrise de ecuaţiile:
 Derivata de ordin 0
A  f ( )
 Derivata de ordin 1
dA
 f ' ( )
 Derivata de ordin 2
d
d2 A
 f ' ' ( )
2
d
 Spectrele derivate sunt întotdeauna mai complexe decât spectrele iniţiale,
denumite deseori spectre de ordin 0.
Derivatele cele mai des folosite în practică sunt cele de ordin 2 şi 4. Cea mai
importantă caracteristică a derivatei de ordinul 2 este banda negativă cu minimul la
aceeaşi lungime de undă λmax ca şi maximul din spectrul de ordin 0. Această derivată
prezintă şi două benzi satelit de fiecare parte a benzii principale. 56
Derivata de ordin 4 are o bandă pozitivă cu maximul la aceeaşi lungime de undă cu a
maximului din spectrul iniţial.
57
Testosteron:
derivata de ordin 0,
respectiv 1.

58
Aşa cum legea Beer - Lambert se aplică la spectrele de ordin 0 şi în cazul derivatelor
există o relaţie de linearitate între concentraţie şi amplitudine:

dn A dn 
 lc
dn dn
la lungimea de undă λ, unde A este absorbanţa, ε coeficientul molar de extincţie, l
lungimea stratului absorbant şi c concentraţia molară a probei.
Dintre tehnicile care permit dozarea substanţelor în amestec fără folosirea unor
procedee de separare prealabilă a acestora, spectrofotometria derivată are avantajul
simplităţii, rapidităţii şi exactităţii rezultatelor.
Spectrometria derivată a condus la progrese în spectrometria UV - VIS în
comparaţie cu spectrometria convenţională (denumită spectrofotometrie de ordin 0).
Spectrele derivate sunt folosite pentru a sesiza mai bine diferenţele dintre anumite
spectre, pentru a rezolva cazul benzilor suprapuse în analiza calitativă şi, cel mai
important, pentru a reduce efectele interferenţelor datorate împrăştierii luminii, absorbţiei
matricei sau a altor compuşi în analiza cantitativă.

59
Cea mai utilizată derivată în determinări cantitative este derivata de
ordinul 2. Indiferent de tipul derivatei, măsurarea semnalului derivat se
poate face prin trei metode : metoda tangentei, t, metoda pic-pic, p, şi
metoda pic-zero, z.

60
 ABATERI DE LA LEGEA LAMBERT-BEER

Pentru o serie de soluţii cu concentraţii diferite

ale unui analit dat, legea Beer-Lambert (B-L)
stipulează directa proporţionalitate A  c la o
anumită lungime de undă, atunci când lăţimea
cuvei şi solventul nu se modifică de la o
măsurătoare la alta
Nu totdeauna linearitatea descrisă de această
lege este aplicabilă. La concentraţii mici, sub
0,01 M, legea funcţionează foarte bine pentru
cele mai multe dintre substanţe. Deviaţii
aparente de la legea Beer - Lambert au loc la
concentraţii mari şi se datorează schimbărilor la
nivelul proprietăţilor soluţiei sau ale speciilor
absorbante.
Factorii care cauzează deviaţii de la linearitatea
absorbanţă – concentraţie se împart în funcţie
de natura lor în: A. Factori fizici şi chimici 61
B. Factori instrumentali
A. Factori fizici şi chimici
 diferenţă între indicii de refracţie ai soluţiei şi solventului folosit ca martor
 specii neabsorbante ce pot interacţiona cu specii care absorb în UV-VIS, alterându-
se astfel absorbtivitatea aparentă a soluţiei.
 folosirea unor solvenţi cu transmisie mică sau a unor soluţi fluorescenţi.
 stabilirea de echilibre chimice: utilizarea soluţiilor tampon, ajustarea tăriei ionice,
adăugarea unei cantităţi mari de agent complexant, etc. Dacă substanţa este un acid
slab şi cele două specii în echilibru absorb la lungimi de undă diferite, atât timp cât
soluţia este tamponată sau este foarte acidă, raportul între forma acidă şi forma
bazică rămâne constant, indiferent de concentraţia totală. Utilizarea unei curbe de
calibrare într-un domeniu de concentraţii adecvat corectează cele mai multe din
aceste deviaţii.

62
B. Factori instrumentali

Acurateţea şi precizia unei măsurători spectrofotometrice depind de :

 intensitatea radiaţiei incidente şi de condiţionarea probei (solvent,
concentraţie şi lungimea stratului străbătut de radiaţie)
 parametrii instrumentali (lungime de undă, deschiderea fantei şi viteza
de înregistrare).

63
APLICAŢII ALE SPECTROMETRIEI UV-VIS

DETERMINAREA COEFICIENTULUI DE REPARTIŢIE

În principiu, determinarea coeficientului de repartiţie

presupune agitarea solventului organic nemiscibil cu apa
împreună cu faza apoasă şi, după stabilirea echilibrului,
determinarea cantităţii de substanţă medicamentoasă în cele
două faze prin spectrometrie UV-VIS. Dacă se folosesc drept fază
apoasă soluţii tampon cu diverse pH-uri, variaţia coeficientului
de repartiţie în funcţie de pH permite determinarea, pe altă cale,
a valorii pKa a unei substanţe medicamentoase.

64
 ELIBERAREA SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE DIN FORME FARMACEUTICE
Spectrometria UV este folosită uzual la monitorizarea eliberării unui
principiu activ din formulări farmaceutice, dacă se demonstrează ca
excipienţii sau celelalte principii active nu afectează determinările în
condiţiile specifice realizate. În cazul formulărilor farmaceutice cu un singur
component, în general situaţia este mai simplă. Se monitorizează absorbanţa
la lungimea de undă a maximului de absorbţie a analitului max, la diferite
intervale de timp. Absorbanţa este convertită în concentraţie şi se reprezintă
grafic curba de dizolvare prin reprezentarea procentului de substanţă cedată
în timp.
Dacă nu se poate realiza condiţia de specificitate în raport cu
interferenţii prin spectrometrie simplă UV-VIS, atunci se apelează la metode
cromatografice de separare, de exemplu metoda cromatografiei de lichide
de înaltă performanţă cu detecţie UV. 65
 DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII

Solubilitatea unei substanţe într-un solvent, de exemplu în

apă, poate fi determinată prin agitarea substanţei adăugate în
exces în solventul ales până la stabilirea echilibrului de solubilitate
şi apoi determinarea concentraţiei substanţei rămase în soluţie.
Dacă substanţa prezintă grupări ionizabile, se prepară soluţii de
diferite concentraţii din sarea substanţei de analizat şi se acidifică,
dacă sarea provine de la un acid, sau se alcalinizează dacă soluţia
conţine sarea unei baze, până la trecerea sării în forma neionizată.
Atunci când se depăşeşte limita de solubilitate, are loc precipitarea
substanţei, gradul de turbiditate putând fi determinat prin
spectrometrie UV măsurând lumina împrăştiată la aproape oricare
lungime de undă.
66
UTILIZAREA SPECTROMETRIEI UV-VIS PENTRU
DETERMINAREA VALORILOR pKa

În cazul substanţelor cu caracter acido-bazic ale căror spectre UV-VIS

sunt influenţate semnificativ de pH, spectrometria UV-VIS reprezintă
tehnica instrumentală de alegere în vederea determinării valorilor pKa
ale acestora.
Constanta de aciditate a unui acid slab HA este dată de expresia:

sau

La trecerea dintr-o formă în alta prin schimb de protoni, se

produc modificări ale efectelor electronice în moleculă care se pot
reflecta în modificarea formei şi intensităţii spectrului de absorbţie .
67
 În cazul unui acid slab la un pH mic, există aproape exclusiv
forma HA, iar la pH mare, spectrul este dat de forma ionizată A-. La
valori intermediare de pH, există un echilibru între cele două forme, iar
absorbanţa observată la o anumită lungime de undă este suma
absorbanţelor celor două specii care intervin în echilibru:

A  AHA  AA-

Combinând cu legea Lambert - Beer, ecuaţia devine

( 
ε c l  εHA [HA]  ε A  [A  ] l

unde  este absorbtivitatea molară aparentă, c  HA  A  este concentraţia

-

totală, l lăţimea cuvei, iar HA şi A- sunt absorbtivităţile molare ale celor două forme
-
conjugate (HA şi A ).

68
Împărţind ecuaţia cu A- şi rearanjând termenii se obţine
:

[HA] ε A   ε


[A ] ε  εHA

69
În practică se prepară trei soluţii ale substanţei studiate cu aceeaşi
concentraţie, dar la trei nivele de pH: un pH la care să predomine
forma HA, un altul la care să existe practic numai forma ionizată A- şi
un pH intermediar între aceştia. Lungimea de undă se alege astfel
încât să existe cea mai mare diferenţă între absorbţiile celor două
specii. Este important de menţionat şi următoarele aspecte:
-trebuie să se cunoască aproximativ domeniul în care se află valoarea
pKa pentru a alege corect pH-ul intermediar la care se măsoară A şi
care trebuie să fie în domeniul  1 al valorii pKa
-pentru determinări de acurateţe, experimentul se măsoară la mai
multe valori de pH apropiate
-dacă prin creşterea pH-ului spectrul acidului sau bazei slabe studiate
suferă o deplasare hipso- şi hipocromă, termenul cu logaritm se
elimină; această situaţie este puţin comună substanţelor
medicamentoase
70
 ANALIZE CLINICE: DETERMINAREA ALCOOLULUI ÎN SÂNGE

ADH Absorbţia la
340 nm este
CH3CH2OH  CH3CHO + [2 H] corelată cu
NAD+ + [2 H]  NADH + H+ nivelul
alcoolului în
sânge

71
 APARATURA

Principiul spectrometrului UV-VIS

monofascicul clasic 72
 APARATURA

Schema unui spectrometru UV-VIS cu

73
fascicul dublu
 APARATURA

Schema unui spectrometru UV-VIS 74

cu şir de diode
 APARATURA

75
Spectrometru UV-VIS cu calculator încorporat
 APARATURA

Cuve de diferite tipuri folosite în spectrometria UV-

VIS 76