Lucrarea Practică Nr.

8
Metode Optice de Analiză
Noţiuni introductive. O categorie importantă a metodelor optice de analiză este
reprezentată prin metodele spectrale. Metodele spectrale pot fi de absorbţie a radiaţiilor
electromagnetice sau de emisie a acestora. Metodele spectrale absorbţiometrice se bazează pe
absorbţia şi interacţiunea radiaţiei electromagnetice de o anumită lungime de undă cu atomii sau
moleculele substanţei de analizat, în timp ce cele de emisie utilizează fenomenele de emisie a
radiaţiei electromagnetice caracterizată printr-o lungime de undă λ, ce se desfăşoară la trecerea unui
fascicol de radiaţii prin proba de analizat.
Emisia sau absorbţia radiaţiilor electromagnetice de către sistemul cercetat duce la apariţia
unui semnal analitic ce oferă informaţii exacte asupra compoziţiei cantitative a substanţei de
analizat (asupra concentraţiei acesteia), dar şi asupra identificării unor atomi, grupe de atomi,
grupări funcţionale şi legături chimice existente în molecula substanţei supusă analizei. Intensitatea
semnalului analitic este direct proporţională cu numărul de particule (ioni, atomi, molecule) care au
cauzat acest semnal, deci cu concentraţia componentului din proba de analizat.
În cazul metodelor spectrale de absorbţie, semnalul analitic este absorbanţa, A.

Spectrofotometria prin absorbţia luminii - Spectrofotometria în UV-VIS

Principii generale
Spectrofotometria se bazează pe proprietatea substanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile
electromagnetice de anumite lungimi de undă şi este utilizată pentru identificarea şi analiza
cantitativă a acestora.
Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicol de radiaţii continue prin proba de
analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia.
Prin urmare, sub numele de absorbţiometrie sau spectrofotometrie prin absorbţia luminii se
înţeleg toate metodele ce au la bază principiul: un fascicol luminos de o anumită lungime de undă
străbate proba de analizat şi după proporţia în care este absorbită radiaţia luminoasă, se determină
cantitatea de substanţă absorbantă (concentraţia probei în componentul analizat).
Radiaţiile electromagnetice absorbite care interacţionează cu proba de analizat şi dau naştere
unui semnal analitic (absorbanţa probei) direct proporţional cu concentraţia probei în componentul
studiat, provin din trei domenii spectrale de bază:
 domeniul ultraviolet (UV) ce cuprinde radiaţii cu lungimi de undă λ între 185-400 nm;
 domeniul vizibil (VIS) ce conţine radiaţii cu lungimi de undă cuprinse între 400-800 nm;

24
  domeniul infraroşu (IR) ce prezintă radiaţii cu lungimi de undă mari şi foarte mari, peste 800
nm. Domeniul IR se împarte, la rândul lui, în trei subdomenii:
 IR apropiat , radiaţii cu λ = 800 – 2500 nm (sau 0,8 – 2,5 μm);
 IR mediu, ce cuprinde radiaţii cu λ = 2500 – 25000 nm (sau 2,5 – 25 µm);
 IR îndepărtat, cu radiaţii caracterizate de λ > 25000 nm (sau λ > 25 μm).

Domeniul IR mediu se mai numeşte IR fundamental. Acesta este cel mai bogat în informaţii
şi cel mai accesibil experimental. Acest domeniu serveşte în mod curent atât pentru analiza chimică
cât şi pentru identificarea şi analiza calitativă a substanţelor anorganice, organice, naturale şi pentru
determinarea structurilor chimice ale unor clase variate de compuşi.
Analizele cantitative spectrofotometrice în ultraviolet şi vizibil (UV-VIS) se bazează pe
măsurarea luminii absorbite de o probă de analizat, atunci când este respectată legea Bouguer-
Lambert-Beer, care stabileşte relaţia directă între lumina absorbită, structura şi concentraţia în
substanţa de analizat a soluţiei şi grosimea stratului absorbant, pentru radiaţii electromagnetice de o
anumită lungime de undă λ exprimată în nanometri (nm).
I = I0 .10-εcl (1), în care I = intensitatea luminii transmise; I0 = intensitatea luminii incidente; ε
= coeficient molar de extincţie (constantă caracteristică fiecărei substanţe); l = grosimea stratului
absorbant de probă (în cm); c = concentraţia soluţiei în substanţa de analizat (% m/v).
Realaţia (1) se mai poate exprima ca I / I0 = 10-εcl (2). Raportul I / I0 = T = transmitanţă sau
transmisie este deci raportul dintre intensitatea luminii transmise I şi intensitatea luminii incidente
I0. Dacă se aplică logaritmul zecimal pentru I0 / I din relaţia (2), se obţine:
lg (I0 / I) = lg (1/T) = ε.c.l = A = D = E (3). A = D = E = absorbanţă sau extincţie sau
densitate optică. - Legea Bouguer-Lambert-Beer
Legea Bouguer-Lambert-Beer se poate rezuma astfel: A = ε.c.l (4) şi constituie legea de
bază a spectrofotometriei. Absorbanţa (extincţia) A - a luminii absorbite de către o probă de analizat
este direct proporţională cu concentraţia probei în componentul studiat c şi cu grosimea stratului
absorbant de soluţie l .
Din relaţia (4) se poate deduce o altă mărime utilizată în spectrofotometrie – absorbtivitatea
a: a = A/c.l, în care c = concentraţia probei exprimată în g/L şi l = grosimea stratului absorbant
(cm).
Dacă în relaţia (4) c = 1 mol/L iar l = 1 cm, atunci se obţine: A = ε, unde ε în acest caz se
numeşte absorbtivitate molară (absorbanţă molară sau coeficient molar de extincţie).Această
mărime este o caracteristică a substanţei de analizat şi variază numai cu lungimea de undă. Deci,
prin absorbtivitate molară se înţelege absorbanţa unei soluţii cu concentraţia de 1 mol/L şi

25
grosimea stratului absorbant de 1 cm, la o anumită valoare a lungimii de undă la care absorbţia este
maximă.
Absorbanţa specifică (coeficient de extincţie specifică sau extincţia specifică) se notează
cu A1cm1% (F.R.X) sau E1cm1% şi reprezintă absorbanţa unui strat de soluţie cu concentraţia 1% (m/v)
şi grosimea de 1 cm, la o anumită lungime de undă. Este o constantă caracteristică fiecărei
substanţe.
Determinările spectrofotometrice în UV-VIS se fac cu ajutorul spectrofotometrelor. Schema
bloc a unui spectrofotometru în UV-VIS este reprezentată în fig. 1.

Sursã de Amplificator Înregistrator

Monocromator Cuve cu probã Detector
luminã

Fig. 1 Schema bloc a unui spectrofotometru în UV-VIS

Sursa de radiaţii este o lampă de incandescenţă cu filament de wolfram pentru domeniul

VIS, iar pentru domeniul UV este reprezentată de un tub de descărcare umplut cu hidrogen sau
deuteriu. Monocromatorul este un sistem optic destinat separării, selecţiei pe cale manuală sau
automată a unei radiaţii elecromagnetice de o anumită lungime de undă dintr-un fascicol complex
de radiaţii emis de sursă. Radiaţia electromagnetică separată va traversa apoi prin cuvele cu probe.
Pentru domeniul UV atât monocromatorul cât şi cuvele sunt confecţionate din cuarţ.
Monocromatoarele dispozitive optice constituite dintr-un sistem dispersiv alcătuite din o prismă sau
o reţea de difracţie (sistem de oglinzi plane) şi o fantă. Pe lângă sistemul dispersiv,
monocromatoarele mai conţin lentile, sisteme mecanice sau electromecanice precis calibrate.
Selecţia unei anumite lungimi de undă se face prin deplasarea fantei în dreptul lungimii de undă
dorite. Pentru domeniul VIS, atât monocromatorul cât şi cuvele cu probe sunt confecţionate din
sticlă.
Pentru analizele spectrofotometrice se folosesc două cuve identice : una pentru soluţia de
analizat şi alta pentru martor. Martorul conţine toţi reactivii şi solvenţii utilizaţi la prepararea
probei. În mod obişnuit se folosesc cuve de 1 cm, la temperatura ambiantă (20 ± 0,5ºC).
Concentraţiile soluţiilor etalon şi ale celor de lucru se aleg astfel încât valorile absorbanţelor să fie
cuprinse între 0,30-0,80, pentru a avea o precizie satisfăcătoare a determinărilor.
În urma absorbţiei radiaţiei electromagnetice selectate de către componentul (analitul) din
proba de analizat şi interacţiunii cu acesta, la ieşirea din cuvele cu probă este generat automat un
semnal analitic (absorbanţa A) direct proporţional cu concentraţia componentului din soluţia
analizată conform legii Bouguer-Lambert-Beer. Semnalul analitic generat la lungimea de undă

26
stabilită este detectat automat de către un sistem de detecţie reprezentat printr-un dispozitiv
electronic tip multidiodă, o fotodiodă, sau un fotomultiplicator.
Semnalul este apoi amplificat la trecerea printr-un amplificator (fig.1) şi apoi înregistrat pe
scala unui aparat de măsură direct în unităţi de absorbanţă sau pe un ecran al unui sistem electronic
digital sau calculator.

Metode directe de dozare utilizate în spectrofotometria UV-VIS

A. În cazul substanţelor la care se cunoaşte valoarea absorbanţei specifice sau molare,

determinarea decurge astfel: se măsoară absorbanţa A a soluţiei de analizat la lungimea de undă
caracteristică maximului de absorbţie al compusului de determinat, λmax. Prin folosirea relaţiei A =
ε.c.l se determină concentraţia soluţiei de probă în componentul de analizat cunoscând valorile
pentru ε şi l (ε este constant caracteristică substanţei, iar l = grosimea cuvei = 1 cm).
Dacă pentru o substanţă se cunoaşte valoarea absorbanţei specifice A 1cm1% se poate calcula
concentraţia probei în substanţa de analizat astfel:
A1cm1% .................................1g/100 mL
A ……………………….c g/100 mL, de unde c = A/ A1cm1%, rezultă concentrația c în
substanța de analizat, exprimată în g% (m/v).

B. Se poate folosi şi metoda curbei de etalonare sau calibrare, ţinând cont de graficul A
= f(c). În acest scop se prepară o serie de soluţii etalon cărora li se determină absorbanţele la
lungimea de undă specifică maximului de absorbţie al analitului din probă (λ max.). Se reprezintă
grafic variaţia absorbanţelor în funcţie de concentraţiile soluţiilor etalon, obţinându-se curba de
etalonare, care este o dreaptă a cărei ecuație este y = ax + b . Se măsoară apoi absorbanţa probei la
aceeaşi lungime de undă (λmax.) şi se reprezintă pe acelaşi grafic Ap = f(cp). Proba a fost obţinută în
aceleaşi condiţii cu soluţiile etalon. Dacă se foloseşte absorbanţei probei, din curba de etalonare se
determină, prin interpolare, concentraţia analitului din probă, cp (fig.2). În mod identic, prin
folosirea ecuaţiei dreptei obţinute de forma y = ax + b unde y = Ap = absorbanța probei iar x = cp =
concentrația probei, se poate determina direct x = c p = (y – b)/a. Pentru a avea o bună precizie,
concentraţiile soluţiilor etalon se aleg astfel încât valorile absorbanţelor să fie cuprinse în domeniul
0,20 - 0,80. Aparatura modernă permite limite mult mai largi.

27
 A
A6
A5

A4
AP
A3

A2

A1

0 c1 c2 c3 cP c4 c5 c6 c%
Fig. 2 Curba de calibrare (etalonare) în spectrofotometria de absorbţie UV-VIS

Determinarea spectrotofometrică în domeniul vizibil (VIS) a manganului Mn2+ dintr-o probă

de analizat

Principiul metodei. Prin oxidarea ionului Mn2+ (incolor) la MnO4- permanganat (violet),
culoarea soluţiei trece din incolor în violet cu o absorbţie maximă în vizibil la λmax. = 530 nm, ceea
ce permite dozarea unor cantităţí mici şi foarte mici de ioni Mn2+. Acest aspect serveşte la analiza
spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a manganului din diverse produse: biologice (sânge
total, ser, urină, spută, salivă), produse farmaceutice (comprimatele sau tabletele unor suplimente
alimentare), aliaje metalice, izvoare de ape subterane, ape din pânze freatice și de suprafață, diverse
tipuri de soluri. Oxidarea Mn2+ la MnO4- se face cu KIO4 (metaperiodat de potasiu), care prezintă
avantajul că nu necesită catalizatori. Reacţia care are loc este următoarea:

2Mn2+(incolor) + 5IO4- + 3H2O = 2MnO4-(violet) + 5IO3- + 6H+. Este importantă o

aciditate ridicată, pentru a nu se forma MnO2.

Reactivi şi aparatură.
- soluţie stoc de Mn2+ (MnCl2 . 4H2O sau MnSO4 . H2O), 10 mg/mL;
- soluţie de lucru Mn2+, 1 mg/mL, obţinută printr-o diluţie 1:10 din soluţia stoc;
- HNO3 concentrat p.a. 65% ;
- soluție KIO4 5%, sau NaIO4 5% , preparată din KIO4 sau NaIO4 solid p.a.

28
 - o serie de soluţii etalon cu un conţinut de 0,1-1 mg/mL ioni Mn 2+, preparate din soluţia de
lucru prin diluţii cu apă distilată;
- spectrofotometru în UV-VIS;
- eprubete gradate de 20-25 mL;

Modul de lucru.
a) Prepararea soluţiei stoc de Mn2+ , 10 mg/mL:
Se cântăreşte la balanţa analitică a = 1 g de MnCl2 . 4H2O sau MnSO4 . H2O ce se aduce
cantitativ cu apă distilată într-un flacon cotat V = 100 mL. Se omogenizează până la dizolvare
completă şi apoi se aduce cu acelaşi solvent la semn.

b) Prepararea soluţiei standard de lucru de ioni Mn2+, 1 mg/mL:

Se iau 5 mL soluţie stoc Mn2+ 10 mg/mL şi se aduc cantitativ cu apă distilată într-un flacon
cotat de V1 = 50 mL. Se omogenzează şi se completează cu apă distilată până la semn.

c) Prepararea soluţiilor etalon de Mn2+(0,1-1,0 mg/mL) din soluţia standard de lucru prin
diluţii:
Se folosesc eprubete gradate de 20-25 mL . Obţinerea soluţiilor etalon este redată în tabelul 1.

d) Pregătirea soluţiilor probă de Mn2+

Se cântăresc la balanţa analitică digitală circa b = 0,04 - 0,1 g MnCl2 . 4H2O sau MnSO4 .
H2O, ce se aduc cantitativ cu apă distilată într-un flacon cotat V1 = 100 mL. Se omogenizează până
la dizolvare completă şi se completează cu apă distilată la semn. Apoi 1 mL soluţie probă ce
conţine ionul Mn2+ se aduce cantitativ într-un pahar Berzelius, se adaugă 4 mL HNO3 conc. 65% + 5
mL H2O distilată + 2,5 mL KIO4 5% şi se fierbe circa 5-8 minute la flacără moderată a unui bec de
gaz, pe sită de azbest. Se răceşte la temperatura camerei sau sub jet de apă rece şi se trece cantitativ
conținutul paharului într-o eprubetă gradată de 20-25 mL. Se completează cu apă distilată până la
20 mL, iar după omogenizare, se citeşte absorbanţa probelor (Ap) la 530 nm , în cuva de 1 cm, faţă
de apa distilată ca martor. Prepararea soluţiilor de probe este redată în tabelul 1.

29
 Tabelul 1. Prepararea soluţiilor etalon Mn2+ (0,1-1,0 mg/mL) şi a probelor

Nr. (mg/mL) mL sol. de mL H2O Reactivi adăugaţi: A

det. Mn2+ lucru distilată - (λmax. = 530
nm)
1 0.1 0,1 0,9 - câte 1 mL din fiecare soluţie etalon (0,1-
2 0,2 0,2 0,8 1,0 mg/mL) + 4 mL HNO3 + 2,5 mL KIO4
3 0,3 0,3 0,7 5%, fierbere 5-8 minute. Răcire, apoi
4 0,4 0,4 0,6 transvazare în zece eprubete gradate şi
5 0,5 0,5 0,5 completare cu H2O la 20 mL. Se
6 0,6 0,6 0,4 omogenizează şi se citesc absorbanţele
7 0,7 0,7 0,3 soluţiilor etalon la λ = 530 nm, în cuva de
8 0,8 0,8 0,2 1 cm faţă de apa distilată ca martor.
9 0.9 0,9 0,1
10 1,0 1 -
- câte 1 mL soluție probă Mn2+ + 4 mL
HNO3 + 2,5 mL KIO4 5%, fierbere 5-6
minute, respectiv 2mL soluție probă
Mn2+ în altă eprubetă. Răcire sub jet de
apă rece apoi transvazarea conținutului în
Pregătirea probelor de ioni Mn 2+ eprubete gradate de 20 – 25 mL şi
completare cu H2O la 20 mL. Soluțiile se
omogenizează și se citesc absorbanțele
probelor la λ = 530 nm în cuva de 1 cm,
față de apa distilată ca martor.

Se trasează curba de etalonare (de calibrare) a spectrofotometrului, A = f(C) cu ajutorul

celor zece soluţii etalon de concentraţii Ce = 0,1-1,0 mg/mL. Din curbă, prin interpolare grafică, se
determină concentraţia Cp (mg/mL) a probei analizate în ioni de Mn2+. Într-un mod asemănător,
ecuația dreaptei de calibrare est: y = ax + b, unde y = absorbanța probei Ap, iar x = concentrația
2+
probei în ioni Mn = Cp. Din noua formă a ecuației dreptei Ap = Cp.a + b, se poate determina
concentraţia probelor în ioni Mn2+ : Cp = (Ap – b) / a, exprimate în (mg/mL).

Importanţa biologică a manganului, Mn2+

Manganul este prezent în organism sub formă de biomicroelement, în cantitate de 20 mg
per total. Îndeplineşte în organism roluri importante:
- este bioconstituent al unor metalo-enzime: piruvat-carboxilaza, Mn-superoxid-dismutaza
(responsabilă de eliminarea radicalilor liberi produşi de activitatea mitocondriilor),
diamino-oxidaza, glutamin-sintetaza;
- este efector metabolic cu rol de activator enzimatic pentru o serie de enzime : fosfataza
alcalină, fosfataza acidă, galacto-transferaza, arginaza;

30
 - participă specific sau nespecific în procesele de oxidare celulară, prin diferite sisteme
enzimatice: enzimele ciclului Krebs (decarboxilaze, izocitrat-dehidrogenază, malat-
dehidrogenază), enzime fosforilante, arginază, tiaminază, fosfatază alcalină;
- intervine activ în biosinteza unor proteine şi şi a unor polizaharide (glicozaminoglicani)
ce participă la procesele de osificare şi la formarea cartilagiilor (are rol de cofactor
enzimatic);
- manganul Mn2+ intervine direct în metabolismul lipidic, în reacţiile de fosforilare
oxidativă, în procesul de biosinteză a colesterolului.
Pentru vindecarea rănilor şi leziunilor pielii, organismul are nevoie de o producţie
crescută de colagen. Manganul activează enzima care participă implicit la formarea
colagenului, prin furnizarea aminoacidului prolină.
Necesar. Se consideră că necesarul mediu zilnic de mangan este de 0,74 mg/zi. Deficitul
nutriţional de mangan este corelat cu o serie de simptome ce apar: scăderea greutăţii corporale,
greţuri, vărsături, dermatite, afectarea profundă a sistemului osos (demineralizarea oaselor,
malformaţii ale scheletului) şi a funcţiei de reproducere. Absorbţia şi utilizarea digestivă a
manganului este diminuată de excesul de calciu, magneziu şi/sau de fosfor în organism.

Surse nutriţionale de Mn2+

O alimentaţie echilibrată asigură un aport optim de mangan pentru organismal uman.
Alimentele ce asigură acest aport recomandat sunt: cerealele (grâu, porumb, orz, ovăz, secara), făina
cu grad mare de extracţie, fulgii de ovaz, orezul brun, pâinea integrală, nucile, migdalele, alunele,
ananasul, ceaiul, cafeaua, spanacul, cartofii dulci.
Intoxicarea, rezultată în urma aportului excesiv de mangan în organism, produce tulburări
neurologice foarte grave. În cazul copiilor, aceasta poate produce scăderea inteligenţei şi
hiperactivitate.
Apa este o sursă importantă de mangan şi o cauza a excesului. Cantitatea prezentă în apă
variază de la 1 la 100 µg/litru (în special în izvoarele de ape subterane) Concentraţia maximă
admisă (CMA) de ioni mangan Mn2+ din apa potabilă nu trebuie să depăşească 50 µg/litru.

Bibliografie

1. Rodica Cuciureanu, Igiena Alimentului, ediţia a II-a revizuită şi adăugită, pag. 75-132, Editura
Performantica, Iaşi, 2012.
2. Vasile Dorneanu, Maria Stan, Marcel Florin Musteaţă, Chimie Analitică, pag 164-331, Editura
Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa”, Iaşi, 2003.
3. Vasile Dorneanu, Maria Stan, Metode Chimice şi Instrumentale de Analiză, Ediţia a II-A
Revizuită, pag 236-332, Editura Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa”, Iaşi, 2007.
31
4. Vasile Dorneanu, Maria Stan, Chimie Analitică – lucrări practice, pag. 224-322, Editura
Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa”, Iaşi, 2000.
5. ***SR 8662-1;2/96 şi SR ISO 6333/96. (standarde în vigoare).

32