Detectoare folosite in cromatografia de lichide de tip HPLC

In cromatografia de lichide sint folosite urmatoarele tipuri de detectoare:

- de absorbţie în ultraviolet
- şir de fotodiode (diode - Array)
- de fluorescenţă
- electrochimic
- refractometrici

Detectoare de absorbţie în ultraviolet. Aceste detectoare sint de natură

semiconductoare şi sînt cei mai folosiţi senzori in cromatografia de lichide
datorită faptului că foarte multe molecule organice absorb in ultraviolet iar
detectorul este fiabil şi ieftin. Sensibilitatea maxima a acestor detectoare este
situată în domeniul radiatiei ultraviolete 200-300 nm. In figura 1 este
reprezentată o asemenea caracteristică.

LINSAY

Fig. Caracteristica de sensibilitate a unui detector de absorbţie în ultraviolet

Faza mobilă ce iese din coloana cromatografică este trecută printr-o

celula de masurare etanşa , figura 2, prin care trece fasciculul ultraviolet .
Lungimea drumului optic prin asemenea celule este de 10 mm iar diametrul
interior al tubului este de 1 mm. Selectivitatea acestui detector este dat de faptul
ca pot fi detectate calitativ si analizate cantitativ numai molecule ce absorb in
domeniul ultraviolet. Asemenea substanţe sînt alchene, hidrocarburi aromatice,
sau compusi cu legături multiple intre C, O, sau S. Faza mobila nu trebuie să
prezinte absorbţie in ultraviolet.

1
 Fig.1. Schema de principiu a unei cuve de absorbţie dintr-un detector cu ultraviolete

Absorbţia radiatiei ultraviolete de către moleculele probei de analizat este dată

de legea Lambert - Beer şi este o funcţie de concentraţie a acestora .

Detectoare şir de fotodiode (Diode - Array) . Radiaţia policromatica,

trimisa printr-o celula speciala ermetica prin care circula faza mobila ce iese
din coloana cromatografică , figura 3, cade pe o oglinda de reflecţie totala si
de aici pe o reţea de difracţie unde este descompusă după componentele
spectrale acestea fiind reflectate pe detectorul sir de fotodiode.
( vezi şi cap….)

Fig. 3. Schema de principiu a detectorului cromatografic tip şir de fotodiode

2
În situaţia clasică se lucrează cu o singura fotodioda sau cu un fotomultiplicator
ca detector, diferitele lungimi de undă fiind aduse in dreptul fantei detectorului
prin rotaţia automata a reţelei de difracţie. Marele avantaj al detectorului cu şir de
fotodiode constă in faptul ca spectrul este obţinut instantaneu şi in mod continuu
neexistînd pericolul ca unii compusi de concentraţie mică să nu fie surprinşi de
detector. In cazul clasic al scanarii lungimilor de undă cu un monocromator si a
folosirii unui detector cu un singur canal acest pericol există deoarece in
momentul ieşirii din coloana cromatografică scanarea lungimilor de undă se
poate găsi la alte lungimi de undă decît cele unde absorbţia este maximă pentru
acea specie moleculară ea nefiind sesizată în amestecul substanţei de analizat.
Alt avantaj al folosirii detectorului şir de fotodiode constă in faptul că pentru
fiecare peak cromatografic se poate inregistra si reda ulterior spectrul fiind
posibilă compararea cu alte spectre. Este posibilă o identificare mai avansată a
peak-urilor precum şi găsirea lungimii de undă optime pentru detecţia lungimilor
de undă individuale., găsirea peak-urilor de sensibilitate maximă sau găsirea
peak-urilor ce deranjează. Rezultatele masurătorilor cu detector şir de fotodiode
pot fi redate prin curbe de contur, figura , care reprezintă secţiuni în peak-uri la
diferite absorbţii, figura 4.

Fig.4. Spectrogramă de absorbţie clasică pentru două substanţe x şi y - (a), cromatograma celor
două substanţe - (b) şi spectrul de absorbţie in trei dimensiuni avînd curbe de contur
pentru cele două substanţe - (c)

3
 Reprezentarea este asemănătoare cu cea care redă prin curbe de nivel inălţimi
de dealuri sau munţi pe harţi geografice. In cazul concret al aplicaţiei
cromatografice acest tip de reprezentare este foarte sugestiv reuşind să redea o
imagine sintetică in trei dimensiuni a legăturilor dintre absorbţie , lungime de
undă şi timp cu posibilităţi largi de interpretare inclusiv privind identificarea de
impurităţi care nu pot fi evidenţiate prin alte metode. In figura 4a este
reprezentat un spectru de absorbţie clasic pentru doua substanţe x şi y, in figura
4b cromatograma celor doua substanţe a şi b , iar in figura 4c diagrama in
coordonate lungime de undă - timp avînd curbe de contur care leagă puncte ce
reprezintă aceeaşi absorbţie.

Detectoare de fluorescenţă. La iluminare cu lumină ultraviolretă unele

substanţe sint în măsură să absoarbă radiaţie ultravioletă si ca urmare a
acestei absorbtii să emită lumină vizibilă pe o lungime de undă mai mare decît
cea absorbită. Dacă emisia de lumină are loc imediat după iradiere fenomenul
poartă denumirea de fluorescenţă , iar dacă emisia are loc cu întîrziere se
vorbeşte de fosforescenţă. Raportul intre energia luminii emise si energia
radiaţiei absorbită este subunitar şi pentru majoritatea substanţelor este atît de
mic încît nu poate fi valorificat instrumental. Abia pentru substanţele la care
valoarea acestui raport se situează la valori intre 0,1 şi 1 este posibilă detecţia
prin fluorescenţă. Exista substanţe care prezintă în mod natural fluorescenţă.
Asemenea substanţe au o structură ciclică conjugată aşa cum prezintă de
exemplu hidrocarburile aromatice policiclice. Multe substanţe ce nu prezintă în
mod natural fluorescenţă , tratate cu reactivi corespunzători pot fi transformte în
derivate fluorescente. În figura 5 este reprezentată schema de principiu a unui
detector de fluorescenţă.

Fig. 5. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip de fluorescenţă

1- sursă de radiaţie, 2- fantă, 3- lentilă , 4- filtru, 5- celulă cu soluţie de analizat, 6- lentilă, 7-
fantă, 8-filtru, 9-detector de radiaţie,

4
Radiaţia emisă de o sursă de radiaţie de deuteriu (1) este trecută printr-un
filtru (4) şi cade pe celula cromatografică specială cu soluţia de analizat unde
generează radiaţie de fluorescenţă pe toate direcţiile, măsurarea acesteia se
face însă la 90 0 faţă de radiaţia incidentă ea fiind trecută printr-un filtru (8)
înainte de a cădea pe detectorul (9). Avînd în vedere că măsurarea fluorescenţei
are loc la 90 0 faţă de radiaţia incidentă unele aparate permit măsurarea
concomitentă şi a absorbţiei cea din urmă fiind măsurată pe direcţia radiaţiei
incidente ( Fig. -linie punctata cu săgeată) după ce aceasta a traversat celula
de măsurare cromatografică (5). Avantajul mare al detectoarelor de fluorescenţă
faţă de alte detectoare este sensibilitatea lor deosebită. Edificatoare în acest
sens este figura 5 unde [Linsay ] este prezentată cromatograma

Fig.6. Cromatograme pentru substaţe aromatice policiclice efectuate in ultraviolet (a) şi în

fluorescenţă (b)
unor substanţe aromatice policiclice, prezente ca toxine în aer in cantităţi mici ,
efectuată în UV (a) şi cromatograma pentru aceleaşi substanţe efectuată în
fluorescenţă (b). De asemenea detectoarelor de fluorescenţă au şi o selectivitate
foarte mare, deosebit de utilă în analiza urmelor, dată de faptul prin filtre
adecvate poate fi variată atît lungimea de undă incidentă cît şi lungimea de undă
detectată după generarea fluorescenţei. În condiţiile în care cantitatea de
radiaţie absorbită de probă nu depăşeşte 10% răspunsul detectorului dă un
răspuns liniar pe plaja 103-104 [ Lindsay]

Detectoare refractometrice. Acest tip de detector se bazează măsurarea

indicelui de refracţie a eluentului ce soseşte din coloana ca reprezentînd
diferenţa între indicele de refracţie a substanţei analizate şi indicele de refracţie
a fazei mobile pure. Detectoarele refractometrice au marele avantaj de a putea fi
folosite la aproape toate substanţele sînt fiabile iar indicaţiile lor nu depind de
viteza de curgere în schimb indicaţia este influenţată de variaţii de temperatură.

5
Detectoarele refractometrice au o sensibilitate mai mică decît detectoarele de
ultraviolete. Cele mai scăzute nivele de zgomot care se pot obţine se situează
la 10-7 unitati de refracţie ceea ce corespunde pentru majoritatea compuşilor
unei concentraţii echivalente de 10-6 g/ml [ Lindsay]. In ce priveşte liniaritatea
aceasta se situează in jurul valorii de 104. Dacă se doreşte o sensibilitate inalta
este necesara termostatarea aparatului şi un control foarte bun al compoziţiei
fazei mobile. In figura 7 este prezentata schema de principiu a unui detector
refractometric.

Fig.7. Schema de principiu a unui detector cromatografic de tip refractometric

Radiaţia luminoasă trece printr-o celulă paralelepipedică specială (1) cu două

compartimente despărţite de un geam de sticlă (2). Unul din compartimente
este pentru proba de analizat şi unul pentru soluţia etalon. După traversarea
celulei radiaţia luminoasă cade pe o oglindă semitransparentă (3) şi este
despărţită in două fascicule, unul cade pe fotocelula (4) iar celălalt pe fotocelula
(5). Atunci cînd indicele de refracţie se modifică se modifică unghiul de incidenţă
al radiaţiei ce cade pe oglinda (3) şi ca atare se modifică şi cantităţile de radiaţie
ce cad pe cele două fotocelule (4) şi (5), şi proporţional şi fotocurenţii celor două
celule. Fotocurenţii sînt trecuţi într-un amplificator diferenţial (6) ce dă un semnal
de eroare (  ) proporţional cu modificarea indicelui de refracţie. Semnalul de
eroare comandă un servomotor (7) care roteşte oglinda semitransparentă (3)
pînă cînd semnalul de eroare are valoarea zero.Oglinda semitransparentă este
legată de un ac inregistrator astfel încît deplasarea acesteia este inregistrată în
timp sub forma unei cromatograme ce are pe ordonată indicele de refracţie iar
pe abscisă timpul.
Detectoare electrochimice. Aceste detectoare există într-o varietate mare
şi se bazează pe principii electroanalitice diferite precum:
- amperometrie
- coulometrie
- conductometrie
Detectoarele electrochimice sînt simple, au limite de detecţie scăzute şi
aplicabilitate la un număr extrem de mare de substanţe. Pentru a putea fi

6
detectabile prin amperometrie şi coulometrie substanţele trebuie să fie uşor
oxidabile respectiv uşor reductibile. Pentru a putea fi detectate pe cale
conductometrică substanţele trebuie să existe sub formă ionică.
La metodele electrocimice de tip amperometric sau conductometric
cromatogramele au pe ordonată curentul şi pe abscisă timpul. Din punct de
vedere constructiv detectoarele amperometrice sau coulometrice sint relativ
simple, in figura 8 este reprezentată o asemenea celulă. Aşa cum se observă
detectorul nu este altceva decît o celulă electrochimică clasică cu trei electrozi
adaptată pentru condiţii de masurare sub presiune. Folosirea detecţiei

Fig.8 Detector cromatografic de tip amperometric

1 - corpul celulei, 2-electrod de lucru, 3- electrod auxiliar, 4 - electrod de referinţă,

amperometrice sau coulometrice presupune cunoastera exactă a potenţialului

unde specia respectivă are activitate maximă. În acest sens de un real folos sînt
curbele curent -tensiune care se pot trasa pentru diferitele specii ionice cu celule
electrochimice cu trei electrozi. Dacă se se aplică unei asemenea celule tensiuni
progresiv crescătoare atunci prin înregistrarea parametrilor curent- tensiune intre
electrodul de lucru (2) şi electrodul de referinţă se obţine o curbă specifică ce dă
infomaţii valoroase despre activitatea electrochimică a speciei respective. In
figura 9 este reprezentată o asemenea curbă pentru trei substanţe diferite X,Y,
Z:

7
Fig.9. Curba curent tensiune pentru trei specii moleculare X, Y, Z active electrochimic

Dacă se pleacă din poziţia (O) de curent zero si se aplică o tensiune negative
crescătoare in poziţia (E1) se instalează un curent la care specia (Z) este
redusă. Din palierul crescător al curbei electrocinetice se observă creşteri mari
mari de curent la creşteri mici de potenţial. Acest lucru se manifestă pînă în
zona curentului limită -corespunzător tensiunii (E 2). După această tensiune la
creşteri relativ mari de potenţial cresterea de curent este nesemnificativă.
Situaţia se schimbă după depăşirea potenţialului (E 3) cînd din nou la variaţii
mici de potential corespund creşteri mari de intensitate, in acest caz este vorba
însă de descărcarea (reducerea) altei substanţe respectiv solventul. Acelaşi
raţionament se face pentru substanţele (X) şi (Y) care sînt oxidate atunci cînd
potenţialul se deplasează din punctul (O) spre dreapta ceea ce corespunde unui
potenţial pozitiv. Substanţa (X) este oxidată mai uşor ( oxidarea începe la E 4)
decît substanţa (Y) (oxidarea începe la E 5), oxidarea solventului necesită
potenţilaul cel mai ridicat şi începe la (E 6). Importanţa interpretării acestei curbe
constă în posibilitatea alegerii potenţialului de descărcare care dă sensibilitatea
cea mai ridicată pentru o anumită specie ionică moleculară prezentă într-un
amestec. Aşa cum se observă din figură dacă potenţialul celulei cromatografice
ar fi cel corespunzător poziţiei (O) nu ar putea fi identificata nici una din cele trei
substante deoarece peak-ul de pe cromatogramă ar avea valoarea zero. La
stînga sau la dreapta acestui punct cele trei substanţe pot fi identificate cu
sensibilităţi diferite în funcţie de valoarea potenţialului aplicat celulei. Situaţia
alegerii potenţialului de descărcare pentru obţinerea unei sensibilitati maxime
este analoga cu modificarea lungimii de undă în romatografia cu detectoare UV
pentru obţinerea sensibilităţii maxime pentru o anumită specie. Linia punctată din
figura de mai sus reprezintă curba curent- tensiune reziduală
corespunzătoare solventului atunci cînd ar lipsi cele trei substanţe (X),(Y) şi (Z)
La metoda electrochimică conductometrică este folosită o celulă cromatografică
relativ simplă, figura 10. Pentru evitarea apariţiei transportului ionic şi a

8
 Fig.11. Detector cromatografic de tip conductometric
1 celula conductometrică, 2,3- electrozi de platina, 4- generator de frecventă, 5- amplificator , 6-
inregistator

fenomenului de polarizare intre cei doi electrozi pentru alimentarea lor este
folosit un curent alternativ cu frecvenţa cuprinsă între 1000 Hz şi 5000 Hz.
Cromatogramele cu celule conductometrice au în ordonată conductivitatea
electrolitică si pe abscisă timpul. Pot fi analizate pe această cale numai
substanţe care disociază ionic.