W_

1.3. Cromatografia de lichide de înaltă performanţă

Sub aceastä denumire sunt descrise principalele şi cele mai frecvent aplicabile
mclmle mnderne de umili/i\ ermnulugrnlieă bir/.ale pe reparliţia lichid-lichid, pe adsor-
Miu lichidwsulid. pe scliilnbmnri de iuni şi pe procesele de excludere-difuzia. adicã
gel-permeaţin şi gel-filtrarea. ln figurii 1.29 este prezentată o schemă privitoare la
domeniile de aplicaţie n ermnalografiei de. lichide` inclusiv a IIPLC.

pnlarilatc crescătoarc

mmliţi insulubili în apă I analiţi solubili în apă

nepolnri | I ionici

-___
I polari neionici I

„I repartiţie
I\I.P`Il `-3-x I|

10 l:-
repartitie repartitie
pn`
adsorbtie pe lua-
` _
pe faza-
v

'5 normală
Emi- inversã
h
V
'E
N
'510L
u
0
'5
E
3105- 35

N
E

106- gel-permeaţie gel-filtrare

Figura 1.29 Prezentarea schematică a aplicaţiilor cromatograñei de lichide

- În cazul moleculelor mici (deci cu masă moleculară mică) se preferămetodele de

repartiţie(par1aj) iar pentru moleculele cu M>lOOOO se utilizează metodele-de excludere
şi anume: gelpermeaţia pentru analiţi-nepolari şi gelfiltrarea pentru compuşii polari şi
ionici; iar pentru analiţii ionici cu masă moleculară mică se utilizează cromatografia de
schimb ionic.
Cromatograf ia de lichide de înaltă performanţă se poate practica pe coloană sau
pe o suprafaţă plană, de exemplu pe straturi subţiri de fază staţionară, de unde şi
denumirea de cromatografie planară. Această tehnică se notează prescurtat prin sigla
TLC (thin layer chromatography), iar tehnica de înaltă performanţă se notează cu
HPTLC (high performance thin layer chromatography); tehnicile TLC şi HPTLC au
două avantaje şi anume: simplitatea şi costuri mici pentru aparatura utilizată.
66 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFlA. APLlCAŢlI iN ANALlZA sa CONTROLUL MEDmAMENŢELOR

De asemenea, se pot considera ca tehnici

cromatografice de inalta performanţă şi
cromatografia cu fluide supercritice (CFS) şi
electroc romatografia capilară (C EC),
este de fapt o tehnică hibridă care combină care
eficienţa deosebită a electroforezei
(CE) cu puterea de separare a HPLC pe fază capilare
inversă.
ln croniatografia de lichide de
înaltă performanţă HPLC sunt
mari de câteva sute de atmosfere necesare presiuni
pentru a asigura debite
mobile, având în vedere că granulaţia corespunzătoare ale fazei
fazei staţionare în HPLC este
particulelor (dp) fiind de 3-10 um', din mică, diametrul
acest motiv aparatura
şi deci mai scumpă. utilizată este mai complicată

1.3.1. Cromatografia HPLC pe

coloană
Este tehnica cea mai utilizată în
' prezent pentru separări, detecţii şi
determinări cantitative. mai ales pentru

1) Cromatografia HPLC de adsorbţie

Această tehnică relativ puţin
utilizată se practică pe faze
de alumină (singurele care se staţionare de silicagel şi
întrebuinţează în această tehnică). Dintre
stationare se utilizează mai ales aceste două faze
silicagelul, deoarece acesta are o
putând fi folosit intr-o varietate mai capacitate mai mare
mare de condiţionare. Evident că
altfel şi alumina) sunt fin divizate, şi silicagelul (ca de
are proprietăţi adsorbante
de aluminiu. Adsorbanţii Si02 similare cu ale oxidului
şi Al203 se utilizează în formă
fină (3-20 pm) cu suprafaţă poroasă cu o granulometrie
Specifică mare de 200-600 m2/g (faţă de
culari cu suprafaţă specifică redusă de adsorbanţii peli-
numai 7-14 mZ/g). Structura
in HPLC se poate reprezenta astfel silicagelului utilizat
(Figura 1.30):
1

n'y/"'"d-oH
, .
`X
o

. /'\ /sl/O
s Si
SI
"OH 3

\
„o \°"/\.°/„/
° `°\ 0,.
. /°
SI 0- 5|/` \ \ Si
2
: o Si o
\ OH o\
51//
Su
\ o *

\ s'\ o"
H0 \5|/0 o
o
\ 0
/
SI

\o o
/S\1 0\s/O/5l\
|
o

//
Sl\0\/ /
0 0/ \\
/0 5./
/0 o

\5.
.

H0 s' 0\Si 0/ o”
OH o" CH\ 4

Figura 1.30 Structura silicagelului utilizat în HPLC

l- legăturide hidrogen vicinale; 2 - legături silanol izolate;
3- legături siloxan; 4 - legături silanol geminale.
MENTELOR

munţi] ŞI
CAPIŢOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII ÎN ANALIZA ŞI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

retinut că in cronmtograi'iadcadsorhtic numai compw.

lâstc important dc „ `
S7
Î
-Iţia ia/_ci
TC).care mobile poate controla coeficientii dc distribuţie a analitului. spre deosebire de
capilare gratia de repartitie în care poate fi modulată şi polaritatea fazei staţjOnarc „fronttitm E
retenţie pentru SiOZ şi A503 cresc odată cu polaritatea analiţilor` iar modific. ",hpf' de
arta Iazei
›rcsmm mobile determină variaţii însemnate ale parametrilor de retenţie` deci ale
separării. rCZOIllţiei
e fazei
unctrul Ca fază mobilă se utilizează de regulă în acest caz un solvent
plicalá *dd' I' fld l'
amestçc e 0| sau mai' mu ţi ast e e so \en,I.
t`
organic
““1".

Cromategraña HPLC de adsorbţie se aplică la separarea unor Q

substanţe
relativ nepolare deci, insolubile în apă, cu M S 5000, datorită mai ales organice
capacităţii metodei
de a fracţiona amestecul de izomeri de poziţie cum sunt de ex.
derivaţii disubstituiti
›entru
meta şi para ai nucleului aromatic. '
în ` ll

2) Cromatografia HPLC de repartlţle

Această tehnică este cea mai utilizată dintre
u
gel şi tehnicile
lichida şi ea se poate practica sub forma cromatografice _în fază
faze cromatografia AHPLC llçhldjl'ChId ŞI
lichid-fază grefată (legată), între aceste două HPLC
mare
:a de
modul de fixare a fazei staţionare pe
variante eXistaiid numai
suportul SOlld. ln varianta o'diferenţalprivmd ll
stationară se fixează prin adsorbţie fizică, în lichid-lichid, faza
iului timp ce în varianta cu fază
de legături covalente. Trebuie legată este vorba
etrie subliniat faptul că varianta
Deli-
practice, mult mai utilizată fiind
cromatografia HPLC pelichici-lichidarepuţme
faza legata chimic.
aplicaţii D
lizat ln cromatografia HPLC de
repartiţie se disting două
polaritatea fazelor staţionară şi procedee în funcţie de
mobilă:
cromatograf ia pe „fază stationară
- etc); ca
fază mobilă se utilizează un
normală“, foarte polară (ex. apă, E
trietilenglicol
solvent practic nepolar (sau
cum este n-hexanul sau
eterul izopropilic; foarte slab polar)

l
cromatograf ia
- hidrocarburi pe „fază inversa“, în
care faza staţionară
lichide), iar faza mobilă este este nepolarã (ex.
E
relativ polară. ,

În plan practic se
observă că în cromatograf
analiţi, primul care se ia pe fază normală
/ eluează este analitul mai aunui amestec de
mobile reduce timpul de puţin polar, iar creşterea
eluţie al acestuia_ În polarităţii fazei
mai întâi analitul cel cromatografia pe fază
mai polar, iar inversă este eluat
de eluţie al acestuia. creşterea polarităţii fazei
mobile prelungeşte timpul F1p
În cromatografia de
modul lor de repartiţie există două tipuri
imobilizare: de faze staţionare în funcţie de
faze staţionare
- pot fixa pe impregnate, formate din
suprafaţa lor sau în
particule solide foarte fin divizate,.ca're
suficient de mare, lichid porii lor (într-un volum mic) o
cantitate de llCl`lld
solide constituie
care constituie faza
suportul lor); evident că,
staţionară propriu zisă (particulelî
în procesul de separare cromatograf'Ca
h
[1
 CONTROLUL MED'CAMENTELOR
68 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATH iN ANAUZA 5'

staţionară lichidă şi faza mobilă

de repartitie analiţii se repartizează între faza
repartiţie` deci de solubilitatea lor
în
lichida. în funcţie de coeficientul lor de cromatogra-
stationare solide utilizate în
cele două lichide. De reţinut că „fazele
stare poroasă ca „suport“ pentru lichidele utilizate
lîa de adsorbţie“„ pot fi utilizate în suporturi sunt
cromatografia de reparliţie; cele mai utilizate
ca fază staţionară în
reţină apă până la 70% din greutatea lor formând
cele pe bază de silicagel care pot să
capacitate de împregnare, mai păstrează totuşi
geluri. Deşi aceste suporturi au o mare
reacţia grupelor
adsorbante. Silanizarea acestor suporturi prin
din proprietăţile lor de solvenţii
Creşte afinitatea lor faţă
Silanolice -OH, cu clorsilani (Figura 1.31)
hidrofobi: '

H3C
/C”"
- \
o---S'1\CH3
Si OH
+ 2 CI-Si-CH3
/CH3

--› -2HCl
sa

Si O'Si<CH3
Si OH \CH3
CH3
trimetilclorsilan H3C/
silicagel cu
grupe silanolice silicagel silanizat

H3C\ R

Si O--Si
OH CH3 \CH3
Si
+
/
2 Cl-Si- R
_f-› CH3
\ -2HCI
Si
Si OH CH3
o-/s<
silicagel cu R,dimetilclorsilan H3C R
grupe silanolice
silicagel silanizat

-
Figura 1.31 Schema silanizãrii suporturilor de silicage|

În schema următoare se prezintă formarea

monomerilor organici (a) şi a polimeri-
lor (b), pe suprafaţa silicagelului (Figura 1.32).
 CROMATOGRAFIA. APLICATII ÎN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 69
CAPITOLUL 1

„Mi/_J
..j
@won â* O 'm SINÎCŢ R

R=C\H,~(RP-ä)
ClSiMe; R
(a) @am z » Si-OH R:(`„H~.~(RP7|\\`)

@1-011 51- O'- SüHc: R

_j Me R
I \,51/
$1~OH
51-O-SMcR-O... ` O_, /' \
R R 95mm ,r 9” 9 O
_va
\
ClgSiMeR
Su -O -SII
-O-SIL,
Si-OH
+“30
tv'le Alle
s.
x\ /:'\
5'
" O II\ O
/ Si'
\ W\ /I5' \ O S' \
O
5

O
›l

Si--OH _ Si-O-SmlcR-O... OSiMe:OR OH '

suprafaţă modiñcală prin A

sinteza polimericã

Figura 1.32 Formarea monomerilor organici (a) şi a polimerilor (b) pe suprafaţa

silicagelului

Ca suporturi se mai pot utiliza în cromatografia de

repartiţie, pudra de celuloza.
impregnate pe astfel de suporturi
unii polimeri sintetici derivaţi de polistiren, dar fazele
sunt mai puţin utilizate. ~

- faze staţionare grefate (legate), sunt faze legate chimic, proces prin care se măreşte
stabilitatea lor pe suport; acestea se prepară prin eterificarea grupelor
silanol cu
care
molecule de polioli, obţinându-seansambluri de lanţuri polare resfirate pe
se produce repartiţia analiţilor; aceşti eteri sunt solvolizabili,
hidrolizabili şi labili
termic de aceea nu se pot utiliza de regulă alcooli ca faze mobile: de aceea se pot
obţine faze staţionare legate (grefate) prin silanizarea grupelor silanol, de
exemplu cu dimetildiclorsilan, care pot fixa apoi grupe radicalice (lanţuri) cu
polaritate variabilă conform reacţiilor date în figura 1.33. _

Cu toate acestea, numai 25-40% din grupele_ silanolice sunt silanizate, astfel că
rămân încă' numeroase grupări silanol -OH, libere, care provin din hidroliza
grupărilor clorsiîanice rămase (în afară de grupe silanol Si-OH se pot forma şi
siloxani, Si-O-Si). De aceea suprafaţa silicagelului cu grupe grefate (legate
chimic) se poate reprezenta ca în figura 1.34.

De regulă pentru fazele staţionare inverse, grupările alchil legate sunt radicali octil
(deci C8) sau octadecil (deci C18). Aceste lanţuri hidrocarbonate de C8 şi C18 sunt
paralele unele cu altele şi fixate perpendicular pe suprafaţa particulelor, ceea ce conferă
un caracter răsfirat nepolar. Pentru un astfel de suport faza mobilă este polară. fiind
formată dintr-un amestec de apă şi alţi solvenţi precum metanolul, acetonitrilul, tetra-
hidrofuranul etc, desigur în anumite
 70 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

s.

\>57
on +
clu;
CI-Sll-CI
CH:
-_›
-HCI
CH;
I
Sl-Cl
l
_› 0â"
+R-OH
-HCl
/>Ă
SI
j` O
*H

Sl-~î`
l
CH:
R

\97 CHţ

silicagel dimelildiclorsilan silicagel silanizal silicagel silanizal

si ctcriñcat

s: OH +
Rl
I.
x--sl.-R2
R3
_›
-HX
ŞO _SI-
'Îl
l R,
>

R1

silicagel halogen0~lriR-Si|an silicagel silanizal

` conţinând grupe alchil

Figura 1.33 Obţinerea fazelor staţionare legate chimic

R7 R R
I' I' HO\ /R' Il
R,-şl'_R3 /5j\
`

HO-?i-OH _ HO-?i-OH suprafeţe silanizate şi legate

î î î
`

?H Î?

-îi- -îi- -îi-

`

Ţ
_,51_ _'Si_ _'Si- 1
silicagel

Figura 1.34 Suprafaţa silicagelului cu faze legate, conţinând grupe silanol libere
provenite dintr-o hidrolizã parţială

. Pentru asigurarea unei mari eficienţe a separării cromatografice prin repartiţie

trebure să existe un echilibru bun,judicios între forţele intermoleculare care au loc între
cei trei participanţi la procesul de separare cromatografică: analitul, faza stationară si
faza mobilă. Forţele intermoleculare depind de polaritatea relativă a grupărilor
funcţionale organice implicate în procesul cromatografic, polaritate care creste "în
ordinea următoare: hidrocarburi alifatice < olefine (alchene) < arene < halogenuri <
sulfuri < eteri < nitroderivaţi < esteri E aldehide scetOne < alcooli E amine < sulforie' <
- sulfoxizi < amide < acizi carboxilici < apă. "

Ca regulă generală, pentru realizarea de separări cromatografice bune şi eficiente,

în majoritatea cazurilor polaritatea fazei staţionare trebuie să lie asemănătoare cu cea a
analitului, în timp ce polaritatea fazei mobile trebuie să lie diferită. Dacă faza mobilă are
o polaritate apropiată de aceea a analitului, dar foarte diferită de aceea a fazei staţionare,
eficacitatea separării este mai mică, deoarece faza staţionară nu poate reţine analitul, iar
timpul de retenţie este foarte scurt. Nu este de dorit nici cazul în care polarităţile fazei
staţionare şi analitului sunt foarte apropiate.

l:
 `1
CAPITOLUL 1
CROMATOGRAFIA. APLICATlI |N ANAUZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR
71

lot ca regulă generală pentru cromatogralia de rcpartiţie. alegerea fazei inob'ţ\

si condiţiile ei de utilizare sunt oarecum Similare celor pri\ itoare la cromatouralh !dit
adsorbţic şi anume: L i k

- faza mobilă trebuie să aibă o mare putere de dizolvare dar să nu interacţioneze chimic`
cu analiţii din probe (deci să fie inertă faţă de acestia):
- să fie compatibilă cu sistemul de detecţie;
- să nu dizolve faza staţionară şi să nu interacţioneze chimic cu aceasta (deci fie
inertă chimic faţă de ea); această condiţie este mai greu de indeplinit deoarece este
practic imposibil să se obţină o miscibilitate perfectă între douã faze lichide; acest
inconvenient se poate rezolva prin saturarea reciprocă a celor două faze, una cu alta`
înaintea separării cromatografice, sau trecând faza mobilă printr-o precoloanä
încărcată cu faza staţionară lichidă (într-o măsură mai mare decât solubilitatea
acesteia în faza mobilă; această 'coloană se poziţionează înaintea sistemului de
injecţie a probei;Îîn acest mdd faza mobilă intră în coloana cromatografică incarcata
cu faza staţionară, neexistând riscul antrenării ei din coloană.

Trebuie făcute încă două precizări şi anume:

- în cromatografia clasică de repartitie pe coloană, faza staţionară este de regulă apa.

iar faza mobilă este formată din solvenţi organici mai puţin polari. între care
n-butanolul, alcoolul benzilic, cloroformul sau toluenul
- în cromatografia de lichide de înaltă performanţă - HPLC faza staţionară este de
regulă un lichid polar vâscos cum este B'B'-oxipropionitrilul. polietilena.
etilenglicolul etc, iar faza mobilă este formată din solvenţi nepolari sau puţin polari
cum sunt: "
- unele hidrocarburi lichide pure precum pentanul, ciclohexanul, hexanul, heptanul.
izooctanul; uneori acestora li se pot adăuga mici cantităţi de cloroform sau metanol.
- dioxan, eter butilic, nitrometan.
În cromatografia pe fază inversă, faza staţionară este nepolară, iar faza mobilă
este polară, fiind formată din apă, metanol, acetonitril sau din amestecuri în diferite
proporţii ale acestora.
Este interesant şi important faptul că se pot utiliza coloane cu fază legată cu C8
sau C18 pentru separarea analiţilor capabili să formeze perechi de ioni cu
caracter
hidrofob, dacă 'în faza mobilă se introduc anumite substanţe iOnice care pot participa la
formarea perechilor de ioni. Prin urmare, prin acest artificiu se pot separa prin HPLC Şi
substanţe ionice sau ionizabile (vezi extracţia perechilor de ioni). În cazul substanţelor
ionizate se poate introduce în faza mobilă acid sau bază care produc molarizarea ionilor
silicagelul
(sau a substanţelor) prin neutralizare, compuşii neionici putând fi reţinuţi pe
coloane
cu faze legate C8 sau C18. In figura următoare este prezentată schema unei
(cartus) gata preparată, de tip Zorbax şi componentele ei (Figura 1.35).
`AMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENYELOR
73

Aceastã échemă corespunde unei :muraturi optimimtc ale cărei

componcmç
asigură proportiile necesare din fiecare sol\ cut pentru a obţinc faza mobilă dorită. De
asemenea` un rol important il are amortizorul de pulsatii al pompei peristaltice
curc
asigurã presiunea. Prin construcţie aceastä aparatură optimizată mită la maximum
ã
contaminarea probelor.
i
Fiecare rezervor din cele patru date in figura 1.36 (pot fi şi mai multe) conţine
câte 500 ml de solvent pur. Acest modul permite efectuarea eluţiei cu un singur
sohent
cu compoziţie constantă. iar acest tip de eluţie se numeşte eluţie izocraticã. Se poate
realiza
şi o eluţie cu
un amestec de 23_ sau 4 solvenţi cu compoziţie programată (este programată
cantitatea/volumul din fiecare solvent) a fazei mobile. Aceasta se numeste elutie cu
gradient de compoziţie (sau de concentraţie). solvenţii care formează o astfel de fază
mobilă având polarităţi diferite. Compoziţia fazei mobile (amestec de solventi) se poate
modifica discontinuu conform unui program corespunzător prestabilit sau se poate
:romato- modifica în mod continuu. Eluţia programată cu gradienţi are rostul de a îmbunătăţi efi-
›sfere În cacitatea separării cromatografice (un rol similar îl are temperatura programată in GC).
îlmer (a) Aşa cum se poate observa din figura 1.36. înaintea coloanei cromatografice şi a
fere, dar sistemului de injecţie se intercalează o coloană mică-filtru cu rolul de a reţine praful şi
fere, sau eventualii contaminanţi existenţi în solvenţi, conţinând aceeaşi fază staţionară ca şi
presiunii coloana cromatografică dar cu particule mai mari. Această precoloană mai are şi rostul
i). de a satura faza mobilă cu faza staţionară. micşorându-se în acest fel pierderile de fază
staţionară din coloana analitică.
Este de asemenea de subliniat că pentru multe aplicaţii ale HPLC se lucrează la
temperatura ambiantă, dar în alte cazuri este necesar un control riguros al temperaturii.
care trebuie să fie menţinută constantă. la câteva zeci de grade (°C). Pentru aceasta
coloanele sunt termostatate, iar în unele cazuri ele pot fi introduse într-un manşon incarc
se poate controla temperatura până la 150 °C.

Odată separate, diversele substanţe supuse analizei HPLC sunt detectate cu ajutorul
unuia dintre detectorii înscrişi în tabelul 1.2, în care sunt date şi unele performanţe
analitice ale acestora. Aşa cum se poate observa din acest tabel în HPLC nu există
detectori universali atât de sensibili ca cei utilizaţi în gaz-cromatografie. Dintre detecto-
rii mai frecvent utilizaţi în HPLC se prezintă pe scurt numai doi şi anuine detectorul UV
şi detectorul electrochimic:(amperometric).
Tabelul 1.2. Detectori HPLC '
l
) Limita de detecţie pentru Limita de detecţie
*oloanã„
- de absorbanţă (UV, VlS, lR) 100 pg - lng l pg
ierisire
:ţie - de fluorescenţã l-lO pg lO fg
oană, - electrochimic 10 pg - l ng lOO fg
›uclã - refractometric lOO ng o l pg lO ng
re) - de conductivitate 500 pg - l ng 500 ng l

- sectometru de masă lOO u: -l n 1 '1

2
 IN ANA( 3:" 5! i`l`N`ROl “î .I`Url
\'U'
MR NH` ›1
wa
CAP” k“ Ul I CHUMĂÎUURÄP H\ AU'l H`›\'\ H v . k3 h` l 0

\ch513 Schcmil cmcspundc 1mm Alumilm uplnm_x\(c ale CMC! cmnponmnc

nslgluil thUIţiIIC ncccsmc din Manuc when( ?mms .1 01mm' !LL-.1 mainii\ dm HŢI IX'
asulacnm. un ml importam H .HC .mmmjmul dv pulmţn .11 pompa ţ\`llä(.\|l|k`k` @nu
asiguri! prcsiunm. Prin construcţic ncmslil „mmm ophnnxJIŞl e\ 11;] L1 nuvmum
conlmnimrcu pl'olwlm.
liieeglre reyer\ or din cele patru \Lite in rigum !Ro \pot it şr mm multe\ COIHIIN
Caite 500 ml de sol\ ent pur. Acest modul permite eieettmred eluţiei eu un .ungur sol\ em
eu compoziţieconstantă. iar acest tip de eiuţie se numeşte eluti(` izoergttiel Se poate rediru
şi o eluţie eu un amestec de 2.3 541114 sol\ enţi eu eompoiiţie programati\ \este programdtli
edntitate.! \olumui din fiecare solxent) fazei mobile. Aceasta se numeşte elutie cu
41

gradient de compoziţie (sau de concentraţie). `"ohenţii eure formed/(1 o `astfel tie tltxţi
mobili\ avind poluritãtţi diferite. Compozitia !li/ei mobile tatmestee de sohenţi\ se podle
modifica diseonlimm conform unui progrzmi corespunzător prestaliilit sau se ptxite
modified in mod continuu. lîluţia programată eu gradienţi are rostul de n îmbunătăţi efi-
eueitatea separării eromatogrufiee (un rol similar il are temperatura progrmnruă in UC).

Aşa cum se poate observa din figura IJb` inaintea coloanei cromalogral'ice şi a
sistemului de injecţie se inlercaleaza o coloana mica-filtru cu rolul de a reţine praful şi
eventualii contaminanţi existenţi in sol\ enţi. conţinând acceaşi faza staţionara ca şi
coloana cromatografică dar cu particule mai mari. Aceasta precoloanñ mai are şi rostul
de a satura faza mobilă cu faza staţionară. micşorându-se în acest fel pierderile de razii
staţionarã din coloana analitica.
Este de asemenea de subliniat că pentru multe aplicaţii ale HPLC se lucrează ln
teniperatura ambiantă. dar în alte cazuri este necesnr un control riguros` al temperaturii.
care trebuie să fie menţinută constantă. la câteva zeci de grade CC). Pentru aceasta
coloanele sunt termostatate` iar în unele cazuri ele pot fi introduse intr-un manşon in care
se poate controla temperatura până la ISO °C.

Odată separate, diversele substanţe supuse analizei HPLC sunt detectate cu ajutorul
unuia dintre detectorii înscrişi în tabelul 1.2. în care sunt date şi unele performanţe
analitice ale acestora. Aşa cum se poate observa din acest tabel în HPLC nu existã
detectori universali atât de sensibili ca cei utilizaţi în gaz-cromatografic. Dintre detectu-
rii mai frecvent utilizaţi în HPLC se prezintă pe scurt numai doi şi anuine detectorul UV
şi detectorul electrochimic:(amperometric). ›

Tabelul 1.2. Detectori HPLC `

- de absorbanţã (UV, VIS, 1R) 100 pg - lng 1 pg

- de fluorescenţă 1-10 pg 10 fg i

- electrochimic 10 pg- 1 ng 100 fg 1

- refractomelric 100 ng - 1 11g 10 "g

- de conductivitate pg -
500 1 ng 500 "g
- sectometru de masă 100 ~ - | nu 1 o
_MWJ
U
MEDICAMENTELOR
74 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL

Il- lR-transformantä Fourier lug - lüug 'OU p3` 4

"w ni`,
i-de difuziea luminii lOug l ng
- polarimetric - IO ”g l

-element selectiv - l p3 ' I ng

- fotoionizare - 'MPWJ
Detectorii Spectofotometrici în UV - VIS sunt concepuţl SPeClal pentru, a t; Călpldîţîl
cu coloanele cromatografice analitice, utilizând radiaţii mai ales din domeniul ..5.
şi 280 mm (ale mercurului), majoritatea gruparilor funcţionale organice absorlbin Il:
această regiune spectrală. Aceste aparate sunt dotate cu lămpi de deuteriu sau cu filamen
de wolfram, care permit detecţia diverşilor analiţi organici, iar unele. aparate ma' no'
includ discuri cu mai multe filtre interferenţiale care se pot permuta rapid. Foarte
actuale
sunt Spectofotometrele dotate cu diode în linie (serie sau baretă) capabile sa
afişeze
spectrul 'complet al unui analit la ieşirea sa din coloana analitică. Un exemplu de detector
UV este prezentat în figura 1.37 (a), iar în figura 1.37 (b) este prezentata schema um“
detector amperometric pentru HPLC, dar existã şi se utilizează şi detectori potenţiomet-
rici, voltamperometrici şi conductometrici.

ll 4x ` A( l
K

H
3-81

(a) *5
H4 'ă ,3

(b)
2

Figura 1.37 Schema unui detector UV-HPLC (a) şi a unui detector amperometn'c-HPLC (b)
1- de la coloană 1- ieşirea din coloană
2- fereastră de cuarţ 2- electrod de lucru
3- surse UV 3- distanţator din teflon .

4- detector 4- spre electrozii de referinţă şi auxiliar

5- ieşire (evacuare) ` ~

Detectorul refractometric dat în tabelul 1.2 nu este selectiv, răspunzând la

toti
analiţii, iar sensibilitatea lui este limitată.
Cromatograf ia HPLC de repartiţie are numeroase aplicaţii practice la
separarea,
detecţia şi dozarea a numeroase tipuri de substanţe organice, inclusiv
medicamentoase,
între care:

"7
- antibiotice, sedative, steroizi, analgezice;
- aminoacizi, proteine, hidrati de carbon, lipide;
- edulcoranţi artificiali, antioxidanti, aditivi, aflatoxine;
- stupefiante, otrăvuri, alcool în sânge;

L... "mm " "a "' " ' "- ' ""_"" `>__`____`.__~„__„.,
' '
a ›_ .`.„ ,a V
 CAPITOLUL 1
CROMATOGRAFlA. APLlCAŢH lN ANALIZA Şl CONTROLUL MEDlCAMENTELOR
75

, aci/.i biliari. mcluboliţi ai mcdicamcmclnr, miractc din urina cslrngcm*

* PCSŃCÎdL\ iCFbÎCidC. reno“. hidrocarburi amnmlicc policondcnsulc si dc” .

polihalogenaţi; ~
vaţi

~ surfactanţi (detergenţi), coloranţi, combustibili_

Pentru exemplificare, în figura l.38 se prezintă eromatograma lll'l,(` a
„nm
substanţe medicamentoase (dintr-un suc:)` realizată pe fază polarã-CN si
_ „ _ . . . „ . „ prin
' clu“`c ›
izocratica cu un amestec de ac1d acetic 6% Şl apa 94%` iar m figura l.39 se
_

cromatograma HPLC a unor insecticide organe-fosforiee realizată pe prwinm

fază leuatzi că;
nepolară şi eluţie cu gradienţi cu CH30H 67% apă 33%` respectiv metanol
' - "o.
800/04;,l( „00/

3
l .

2
2 V .
l 4 6 8
V I
4 6 8
3
3 .. 5 l
l22 u
l | l

7
4 `

0 2 4 6 8 10 timp (min)

Figura 1.38 Cromatograma HPLC

a unor substanţe medicamentoase 0 2 4 6 8 10
timp (min)
1- vitamina C,
2- zaharină, Figura 1.39 Cromatograma HPLC a unor
3- cafeină, insecticide organo-fosforice
I 4- Benzoat de sodiu
1- metil-paration, 2- Ciodrin, 3- Paretion`
4- Dyfonat, 5- Diazinon, 6- EPN,
_ 7- Ronnel, 8- Trithion

altƒîxemplu îl constituie (leterminarea HPLC a` catecolaminelor, cu un sistem

cromâ tu“Ograƒlc &Utomat'zat ş' OPtlmllat (Flgura 1.40), prevăzut cu o precoloană pe care
Sulltyflxate m prealabil catecolaminele, prin chimioselectivitate, pentni separarea lor din
separate
urma- Apoi catecolaminele sunt eluate şi transferate în coloana analitica, fiind
pe °„°°l°a“ă Vljdac 201H354 ultraperformantă. În acest mod se asigură o rezoluţie trial
urma
?ga a separării medicamentelor dintr-un amestec sintetic, Figura 1.41 (a) şi din
 76 CAPITOLUL CHOMA'HJGRAI m Al'l |(.A|ll IN ANAI
1
III\ :,.u (mmm nu MI “IL/\MI NH nu
u

M [fi] [R4 lui]

/'
“MM/"i" Inultivu]VC

cameră dc
nnwslgggg“
á.._„l._.„.__„ iI lj cc I u r
'volum tampon] thü
[Ţ_I›°"1Î*ă`ÎJ**GŢ> *CQ-›hiL~{?„1„;„m 1“'[ „sehvmspl
_„__„_L„_`__
amortizor
L
x_

dc pulsaţii
dclccloL
___.___L._„
Linrcgislrüäj
Figura 1.40 Schema unui cromatograf HPLC optimlzat
Rl, R2. R3„ R4 sunt rezervoare pcmru patru solvcnţi

6 N
2 7

3 4

15 min
(a) (b)

Figura 1.41 Cromatogramele HPLC a|e unor catecolamine prin

chimioselectivitate
(a) a adrenalinei, noradrenalinei şi dopaminei dintr-un
amestec de aminoacizi:
l~ norepinefrinã, 2- epinefrină, 3- DOPA, 4- dopaminã, 5- metanefrină.
6= 6-hidroxitriptofan, 7- serotonină, 8- triptofan
(b) a noradrenalinei, adrenalinei şi dopaminei
din urinã
 optimizarea continua
1.4. Unele preocupări actuale privind
a metodelor cromatografice de analiză
specrale rezultá
generale prezentate päná aici. ca si din unele date mai
Din datele del\ Oltarc
cromatografice de analizã au cunoscut in ultimele 3-4 decenii o
cã tehnicile separare
permis abordarea mecanismelor intime ale proceselor de
remarcabilă, ceea ce a
direcţii in care cercetările tehnice să continue pentru
cromatografică şi stabilirea unor pentru
cromatografiei in general si mai ales
îmbunătăţirea performanţelor analitice ale
acţionează pe mai multe planuri.
analiza si controlul medicamentelor. Pentru aceaSta se

carbon
1.4.1. Dezvoltarea fazelor staţionare pe bazã de
poros grañtat
fundamentale" care participă la
Faza stationara constituie ..unul dintre elementele
separării şi implicit perfor-
proceSele de separare cromatograficã, de aceea calitatea
staţionare. determinată de
manţele analizei depind în mare mãsurã de calitatea fazelor
stabilitatea sor-
caracteristicile sorbenţilor. ilustrate în figura l.42. Aşa de exemplu`
benţilor pe bazã de silicagel este utilă in domeniul 2<pH<8.
Functionalitatca

Mărimea Stabilitatea
particulelor fatã de pH

Mărimea Stabilitatea
porilor faţă de solvent

Aria _
-
Capacnalca
sunrafetei
Polaritatea

Figura 1.42 Factorii care determină calitatea sorbenţilor

În partea introductivă a acestui capitol sunt menţionate principalele faze staţionare

utilizate în cromatografie, în funcţie de natura analiţilor. ln ultimii ani au apărut date
noi şi importante privind rolul „carbonului poros gralîtat“ în HPLC, în lumina unor
caracteristici foarte importante, comparativ cu alte suporturi` caracteristici care se pot
rezuma astfel:
- proprietăţi fizice similare cu ale particulelor de silicagel;
- pori de 250 A, cu diametrul particulelor de 7 mm;
- suprafaţă specifică de llOm"/g;
- stabilitate mecanică mare la presiunea solvenţilor. pânã la câteva sute de
atmosfere (sau chiar până la 10.000 psi);