CROMATOGRAFIA Este una din cele mai eficiente metod de separare i detecie a analiilor.

Uneori are loc determinarea cantitativ a analiilor separai prin metode fotodensitometrice. De fapt cromatografia este o metod de separare a componentelor unei probe, bazat pe distribuia lor diferit ntre dou baze: una staionar ( solid, lichid suportat pe un solid, sau ungel) i una mobil (lichid sau gaz), ntr-un cromatograf. Primele lucrri cromatografice s-au publicat n 1901, asociind cromatografia cu scrierea n culori. n 1938 Imailov i Schrieber au publicat rezultatele proprii despre separarea pe strat subire. Pasul hotrtor n dezvoltarea metodelor cromatografice a fost fcut de Archer John Porter Martin i Robert Synge, n 1941 care, cu ajutorul legii de repartiie , au reuit s realizeze separarea aminoacizilor din proteine de cei din material vie prin cromatografia de repartiie pe coloan , folosind silicagel, ap, cloroform i alcool n-butilic. Dup 3 ani Martin a nlocuit suportul de silicagel cu hrtie n form de benzi. n 1958 are loc perfecionarea cromatografiei de gaze prin introducerea tuburilor capilare , iar n 1975 se produce dezvoltarea cromatografiei de lichide. n acelai timp un foarte mare avantaj l reprezint cuplarea cromatografiei de gaze cu spectrometria de mas (de fapt se cupleaz o metod de separare cu o metod de detecie). Botanistul rus VET a cercetat adsorbia pigmenilor vegetali,n special a clorofilei, pe suporturi solide Procesele fundamentale ce stau la baza cromatografiei: - adsorbia pe suporturi solide, faze staionare - repartiia ntre dou faze lichide, una staionar depus pe suport solid i alta mobil - excluderea difuzia - schimbul ionic Clasificare metodelor cromatografice. Faza mobil Faza staionar SOLID GAZ LICHID SOLID LICHID LICHID repartiie adsorbie excludere schimb ionic repartiie Proces cromatografic adsorbie excludere

Alegerea fazei staionare ca i a celei mobile se face innd cont de mrimea moleculelor (M), polaritatea fazei mobile, natura analiilor.

1. Cromatografia de adsorbie i de repartiie Adsorbia este rezultatul forelor intermoleculare dintre atomii de la suprafaa solidului i moleculele solutului exterior. Principalele fore de acest tip sunt: - fore London care apar ntre toate suprafeele i moleculele adsorbite; - fore electrostatice se manifest ntre suprafeele polare i oricare dintre moleculele adsorbite; - forele de transfer de sarcin intervin ntre donorii de electroni puternici i acceptori; - legturile de hydrogen apar ntre atomii de hydrogen i atomii ce prezint afinitate mare de electroni (oxygen, clor. fluor) n cazul repartiiei, moleculele solutului se afl n echilibru la interfaa care separ faza mobil i faza staionar. Solubilitatea n cele dou faze reprezint o parte important a repartiiei Dac sistemul ar fi static i nu dinamic atunci procesul ar fi n general identic cu extracia cu solveni. Procesele cromatografice nu reprezint repartiii sau adsorbii pure. 2.CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE Prin aceast metod separarea componenilor probei se face n funcie de mrimea molecular. Cromatografia de excludere se poate realiza prin dou procedee: a) penetraia n gel; b) separarea pe site. a) n cazul penetraiei n gel, separarea are loc n funcie de mrimea moleculelor solutului. Prin aceast metod se separ zaharurile, polipeptidele proteinele, lipidele, etc. b) Suporii solizi utilizai n cazul separrii pe site sunt formaiuni tridimensionale de lanuri de polimer legate n cruce. Aceste geluri au capacitatea de a se umfla, mrind spaile dintre lanurile de polimer. Cele mai utilizate materiale pentru separrile pe site sunt zeoliii (aluminosilicai metalici ) naturali i sintetici. Ex: M2/nO.Al2O3.xSiO2.yH2O, unde M este un cation cu valena n ce conine caviti i canale permanente n structura sa. Mrimea acestor caviti conduce la propietile de sit ale zeoliilor, n timp ce mrimea ariei suprafeei i disponibilitatea de M, Al, Si i O determin proprietile sale de adsorbie. 3. CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC - schimb de ioni reversibil ntre ionii dintr-o faz lichid (faz mobil) i o substan solid, insolubil ce conine ansambluri ionice (faz solid) Zeoliii pot aciona ca schimbtori de ioni.
H+ +M + Rc + Cl R+ A OH M + + H + - cationic Rc schimb cationic Rc + OH - anionic RA schimb anionic R+ A Cl

NOIUNI GENERALE Cromatografia servete n principal ca instrument pentru separarea amestecurilor de molecule cunoscute sau necunoscute. Fazele cromatografiei: - prepararea fazei staionare - introducerea probei - trecerea probei peste faza staionar - colectarea componenilor individuali pe coloan Cromatografie pe strat subire Developare = trecerea fazei mobile peste adsorbant (cromatografia de adsorbie) sau suport (cromatografia de repartiie). Eluia = procesul de developare. Agentul de eluie = faza mobil folosit pentru developare. Cromatograma este o reprezentare a concentraiei componenilor probei n funcie de timpul de eluie sau de volumul de eluie (respectiv timpul de retenie sau volumul de retenie).

Faza mobil Cromatografia lichid Faza staionar pe coloan

Dinamica procedeului cromatografic: Ex: pentru cromatografia pe coloan: - faza staionar este plasat sub form de past ntr-un tub cilindric care este astupat la partea inferioar cu un tampon din vat de sticl sau cu un disc poros inert - dac sunt alese condiii de eluie adecvate fiecare solut din amestec va apare la partea de jos a coloanei n funcie de volumul de eluie sau de tipul de eluie.

Concentraia

Cromatograma

Timp sau volum

v s1 = d d vs = t s 1 i 2 t s 2
1 2

s- solutul

Pentru v s v s - reperare posibil Developare cromatografic: - se realizeaz prin patru metode eluia - cea mai folosit eluia variabil analiza frontal dislocuirea

a) Eluia proba dizolvat Proba dizolvat se introduce la captul coloanei, peste care se adaug eluentul care deplaseaz componenii probei cu viteze diferite. b) Eluia variabil cu gradieni se folosete atunci cnd eluia propriu zis este imposibil de realizat. agentul de eluie 1 agentul de eluie 2 spre coloan

agitator magnetic c) Analiza frontal: Se caracterizeaz printr-o trecere continu a soluiei de prob prin coloan. Acest procedeu se aplic n principal pentru purificarea solutului reinut cel mai puin. d) Procedeul deplasrii: Proba este introdus n coloan dup care se trece agentul de deplasare.

Avantajul acestei probe const n faptul c se pot utiliza cantiti mari din proba supus analizei. n acest caz sistemul cromografic este complet ncrcat cu agent de deplasare dup efectuarea separrii ceea ce constituie un dezavantaj. Drept urmare acest procedeu se utilizeaz n principal pentru purificri i nu pentru separri cantitative ANALIZA CANTITATIV n general se face prin determinarea ariei picului: a) Metoda nlimii picului A=
1 b H 2
.

b1

1/2H

b) Triangulaia: A = H b1 c) Decuparea i cntrirea este preferat pentru picurile de form negaussian CONCEPTE FUNDAMENTALE a) Valoarea distribuiei Analog cu extracia: Kr =
cS cM

, unde cs concentraia solutului n faza staionar cM concentraia solutului n faza mobil

Kr coeficient de repartiie. Pentru cromatografia plan se calculeaz Rf (raportul fronturilor):

Rf = dis tan ta parcursa de solut dis tan ta parcursa de faza mobila

R mare n funcie de: solvent, adsorbant, porozitatea, concentraia solutului i temperatura b) Rezoluia Efecacitatea separrii este determinat de doi factori: - distana dintre zonele centrale pe msur ce ele migraz - compactitatea zonelor
t

R=

2 t ( b 2 + b1 ) / 2 b 2 + b1 =
b1 b2

t R 2 t R1

c) Forma picului

i)

ii)

iii)

i. picul prezint forma normal; ii. pic frontal (fronting) apare din cauza suprancrcrii coloanei. O alt cauz a apariiei acestui pic este dat de incompatibilitatea polaritii coloanei cu componenii respectivi (ex: nu se pot separa acizii polarii pe coloane nepolare). iii. pic cu coad (tailing) apare din cauza coloanei active, sau coloana nu este instalat bine, sau coloana nu este potrivit pentu analiza respectiv. d) Selectivitatea Este o msur a preferinei fazei staionare pentru un anumit solut n comparaie cu ali solui
=
k1 k2

, unde k1,k2 sunt coeficienii de distribuie.

Cu ct este mai mare diferena dintre coeficienii de distribuie cu att este mai mare valoarea lui (este mai bun separarea). e) Efeciena Se exprim prin numrul de talere teoretice (N) sau prin nlimea echivalent a unui taler teoretic (H).
H = L , unde L reprezint lungimea coloanei N

Talerul teoretic reprezint lungimea coloanei n care solutul sufer o echilibrare complet ntre cele dou faze
VR N = 16 B - numr de talere
2

VR volumul de retenie B limea picului de eluie n uniti de volum Cromatografia este cu att mai eficient cu ct numrul de talere este mai mare.

CROMATOGRAFIA DE GAZE Este o tehnic modern prin care pot fi separate substaniele ce se volatilizeaz uor la temperaturi nu prea ridicate (sub 4000C) pentru a evita descompunerea termic a moleculelor organice. Avantajele cromatografiei n faz gazoas: - poate fi utilizat att pentru analize calitative ct i cantitative - timpul de analiz este scurt - aparatura necesar este simpl - prezint o sensibilitate ridicat (se poate utiliza la nanoanaliz) - precizie mare Exist dou tehnici cromatografice: - cromatografia gaz-lichid (GCL) repartiia ntre un gaz i un lichid (pe un suport inert se se depune o pelicul care constituie faza staionar). - cromatografia gaz-solid (GCS) adsorbia unui gaz pe o faz solid Aparatura este aceeai pentru cele dou tehnici cromatografice numai umplutura difeer. Un gaz cromograf este format din: - rezervor de gaz - eluentul ce transport proba - nclzitor locul unde se injecteaz proba - coloana cromatografic - detectorul - recorder ( nregistratorul ) n gaz cromografie analiii se distribuie ntre faza staionar solid i faza mobil gazoas (gaz-purttor, gaz-vector). Ca i gaz vector se poate utiliza N 2, Ar, H2, sau CH4+Ar, etc. Proba se introduce prin injecie direct n cantitate foarte mic (1-10l) cu ajutorul unei pipete. Coloana este confecionat din ooel inoxidabil de calitate superioar avnd lungimea de 1-4m. i diametrul de 1-4mm. Aceasta este umplut cu particule omogene de site de tip aluminosilicat sintetic sau cu diveri polimeri poroi. Faza staionar lichid este impregnat de obicei pe silicagel sau pe un derivat al acestuia cu mare stabilitate termic i inert la splare cu acizi. Coloana cromatografic este plasat ntr-un cuptor ce are rolul de a menine temperatura la valori de 25-400C. Pentru o cromatografie eficient, la alegera fazelor suportului trebuie s se in seama de urmtoarele: - adsorbanii trebuie s prezinte suprafee specifice mari sau un nalt grad al porozitii; - faza lichid s fie un bun solvent pentru componenii probei; - faza lichid s fie stabil din punct de vedere termic; - faza lichid s fie inert din punct de vedere chimic fa de proba analizat - alegera fazelor este n strns concordan cu alegerea suportului. Din acest punct de vedere, criteriul cel mai important ine cont de polaritatea fazei staionare dar i a amestecului ce urmeaz a fi separat. Ca o regul general se poate spune c separarea componenilor unei probe este eficient atunci cnd faza lichid este similar din punct de vedere structural cu compuii ce trebuie separai ( de ex. la separarea unor hidrocarburi se folosete o faz staionar 7

nepolar). n acest caz rolul fazei solide este acela de a furniza un suport pentru filmul subire i uniform al fazei lichide. Cea mai utilizat faz solid este diatomita (kieselgurul). Detectorul se folsete pentru punerea n eviden a componenilor unui amestec care au fost separai anterior ntr-o coloan cromatografic.Cei mai utilizai detectori sunt: Detectorul cu conductibilitate termic care se bazeaz pe scderea conductibilitii termice a gazului vector n prezena unor molecule strine; Detectorul flamfotometric este specific deteciei compuilor organici; Detectorul de radioactivitate este specific identificrii compuilor radioactivi. Pe msur ce componenii amestecului sunt detectai, simultan sunt i nregistrai grafic n funcie de timpul de retenie sau de volumul de faz mobil gazoas care trece prin celul. Pe baza cromtogramei astfel obinute se efectueaz analiza calitativ prin determinarea timpului de retenie (tr) i analiza cantitativ prin msurarea ariilor picurilor de eluie care sunt direct proporionale cu concentraia. Dintre factorii care influeneaz separarea putem aminti: - mrimea particulelor i suprafaa specific; - viteza de curgere a gazului purttor; - tipul i cantitatea fazei staionare; - lungimea coloanei cromatografice; - diametrul coloanei cromatografice; - temperatura coloanei cromatografice. Cromatografia gazoas prezint cele mai diverse aplicatii printre care enumerm: analiza acizilor organici, substituenilor aromatici, pesticidelor, alcaloizilor, medicamentelor, etc.

CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC Schimbtorii de ioni sunt substane macromoleculare de tip anorganic sau organic cu structur molecular reticulat, care conin grupri acide sau bazice, capabile s schimbe ioni cu soluiile apoase ce le strbat. Un schimbtor ionic este format dintr-un lan polymeric pe care sunt grefate diferite grupri funcionale cu caracter slab acid ( -COOH, -PO(OH) 2, OH fenolic), sau puternic acid (-SO3H), slab bazic (-NH2), sau mediu bazic (amine secundare i teriare) sau puternic bazice(bazele cuaternare de amoniu). Schimbtorii de ioni se prepar prin obinerea iniial a reelei polimerului, (adic matricea), urmat de grefarea gruprilor active schimbtoare de ioni pe reeaua polimerului.Schimbtorii de ioni astfel preparai se comercializeaz sub diferite forme, astfel: cationii sub forma H+, Na+, NH4+, etc. anionii sub forma OH-, Cl-,etc. Proprietile schimbtorilor de ioni Din punct de vedere al strii de agregare, majoritatea schimbtorilor de ioni sunt solizi, doar cei cu grupe fosfat i cei din grupa aminelor sunt lichizi. Proprietile commune ale schimbtrilor de ioni sunt: - sunt insolubili n ap; - n urma contactului ndelungat cu apa i mresc volumul (de aceea nainte de introducerea lor n coloan acetia se in o anumit perioad de timp n ap ); - sunt insolubili n baze diluate i acizi oxidani - prezint capacitate de schimb ionic mare, dependent de gradul de reticulare i numrul gruprilor active; - au culoare i densitate specific fiecruia; - dimensiunile particulelor sunt specifice; - se contract n solveni polari; - prezint structuri de gel hidrofil, de aceea absorb o cantitate mare de ap, mrindu-i volumul considerabil. - schimbul de ioni este reversibil i se face cu respectare stoechiometriei sarcinilor, astfel: R-SO3H +Me+XAl aq + 3H + r
3+

R-SO3-Me+ + H+X+ Al 3 + 3H aq , pentru cationii i r

+

+. R-NR 3 OH + Na+Cl

+. R-NR 3 Cl + Na+OH , sau

H2PO 4 aq + OH r

H2PO 4 r+ OH aq , unde Aq-ap i r- rin.

Capacitatea de schimb ionic Reaciile de mai sus, care sunt reacii de echilibru, au echilibrul deplasat spre dreapta cu att mai mult cu ct sarcina cationilor i anionilor este mai mare.

n cazul unei reacii generale de echilibru se poate aplica legea aciunii maselor: Ar+ + Baq+ Aaq+ + Br+ ,iar

Ka

[ A ] [B ] = [ A ] [B ]
+ + aq r + +

f Aaq f Br f Ar f Baq

aq

Deoarece determinarea coeficienilor de activitate n rin este dificil, n locul constantei Ka se poate utiliza constanta clasic Ke: [A+]aq . [B+]r Ke= [A+]r . [B+]aq Capacitatea de schimb ionic depinde de numrul gruprilor active schimbtoare de ioni existente n molecul, de gradul de reticulare, de porozitate, de granulaie, de natura i sarcina ionilor care se schimb .a.. Capacitatea de schimb ionic este o msur a aprecierii puterii de schimb ionic care se exprim prin cantitatea de ioni, n miliechivaleni (mvali) pe care-i poate schimba 1 gram de rin uscat. Pentru anionii capacitatea de schimb ionic este de 1mval/ml, iar pentru cationii de 2 mval/ml (suspensie de rin n ap). Factori care influeneaz schimbul ionic. Schimbul ionic este influenat de urmtorii factori: influena pH-ului soluiei se poate analiza din urmtorul exemplu: Li+aq + H+r Li+r + H+aq Echilibrul chimic al acestei reacii este deplasat spre stnga deoarece litiul prezint o afinitate sczut fa de un schimbtor de ioni puternic acid. n schimb, dac litiul se gsete n soluie sub form de acetat, echilibrul de schimb ionic se deplaseaz spre dreapta ca urmare a formrii acidului acetic, puin disociat: (Li+ + CH3-COO-)aq + H+r Li+r + CH3-COOHaq

influena reaciilor de complexare asupra schimbului ionic este pus n eviden din urmtorul exemplu: ionul Fe(III) poate fi reinut pe un cationit. Dac se trece peste rina schimbtoare de ioni o soluie de NaF, are loc complexarea fierului iar rina va reine sodiul n locul fierului: Fe3+aq + 3K+r Fe3+r + 6F-aq [FeF6]3-aq Fe3+r + 3Na+aq Fe3+r + 3K+aq Fe3+aq + 3Na+r, ca i complex florur.

10

n general astfel de reacii servesc la regenerarea schimbtorilor de ioni dar i la separarea selectiv a unor ioni. Procedee de schimb ionic 1) Pe coloan. Schimbtorii de ioni se introduc n coloan n stare umed. Amestecul rin-ap nu trebuie s conin bule de aer, iar deasupra stratului de schimbtori de ioni trebuie s existe un strat subire de ap pentru a evita uscarea rinii. eluent

proba schimbtor de ioni vat de sticl efluent Coloana schimbtoare de ioni se spal de mai multe ori nainte de utilizare, alternativ, cu soluii diluate de acizi i baze. Ultima splare a coloanei se face cu un acid diluat dac ea trebuie s funcioneze ca un schimbtor de protoni, sau cu o soluie de baz diluat dac ea trebuie s schimbe grupri hidroxil. 2) Pe strat subire. Se pot prepara plci cromatografice cu strat subire schimbtor de ioni prin alegerea adecvat a fazei staionare. Dezavantajul acestei metode este acela c schimbul ionic se realizeaz n cantiti reduse. 3) Hrtii schimbtoare de ioni. Cele mai folosite hrtii din acest punct de vedere sunt cele Whatman, Schleicher, Schel, care au o capacitate mic de schimb ionic. Aceste tipuri de hrtii i pot modifica proprietile prin imersarea lor n diferite soluii. De exemplu se poate obine o hrtie celulozic (-celuloz) prin imersarea ei ntr-un amestec de anhidrid acetic, toluen i acid sulpfuric 72% (n funcie de raprtul volumetric al celor trei soluii se poate obine o hrtie celulozic ce conine mai multe sau mai puine grupri carboxil). 4) Membrane schimbtoare de ioni. n general membranele schimbtoare de ioni se obin din colodiu sau zeolii; pentru aceasta este necesar impregnarea colodiului cu polistirensulfonat.Alte tipuri de membrane se mai pot obine din pergament sau celofan. De exemplu prin impregnarea hrtiei sau a celofanului cu AgCl care se precipit n porii hrtiei, se obine o membran permeabil pentru protoni i ionii hidroxil, dar impermeabil pentru ionii de Ag+ i Cl-. Schimbtorii de ioni funcioneaz ca site ionice care rein unii ioni dar las s trec ali ioni sau specii chimce. 5) Site moleculare. Cu ajutorul acestor site se pot separa substane moleculare, covalente, anorganice i organice.

11

Sitele moleculare sunt alctuite din din zeolii de sintez care conin un numr mare de microcanale ale cror dimensiuni sunt reglabile. Aceste microcanale rein substanele moleculare n funcie de dimensiunile lor. Sitele moleculare cu pori cu diametrul de 4 pot reine H 2O, CO, CO2, NO, H2S, NH3, C2H6, C3H8, CH3-OH, C2H5-OH, .a. Sitele moleculare cu pori de 5 adsorb hidrocarburi cu caten normal de la C 4 la C14, butanol, propanol, ciclopropanol, .a. Sitele moleculare cu porii de 10 adsorb izoalcani, alcooli secundari i teriari, arene, cicloalcani, cloroform, tetraclorur de carbon, .a. Aplicaii analitice ale schimbtorilor de ioni Schimbtorii de ioni prezint multiple utilizri n domeniul analiticii calitative i cantitative, dar i n scop preparativ. Din acest punct de vedere se pot amintii cteva dintre aplicaiile schimbtorilor de ioni: - Prepararea soluiilor standard (vezi Chimie Analitic cantitativ prepararea soluiilor de NaOH i HCl); - Determinarea constantelor de stabilitate ale complecilor; - Dezagregarea unor compui minerali (ex. BaSO4); - Obinerea apei deionizate ; - Ca i catalizatori acizi sau bazici; - Purificarea probelor pentru analiz sau a unor substane; - Separarea grupelor de cationi sau anioni; - Preconcentrarea unor ioni individuali; - Separarea aminoacizilor, .a.

12

CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE-DIFUZIE

Cromatografia de excludere difuzie este una dintre cele mai utilizate tehnici de separare n laboratoarele biomedicale i se bazeaz pe retenia selectiv a moleculelor dintr-un amestec de analii care pot penetra, sau nu, prin porii umplui cu solvent ai unei faze staionare potrivite n funcie de mrimea moleculelor. Moleculele care nu pot ptrunde n porii fazei staionare sunt excluse, deci prsesc coloana. n cromatografia de excludere-difuzie se utilizeaz, ca faz staionar, un gel mbibat cu un solvent organic. Faza staionar se prezint sub forma unor granule perfect calibrate. Fiecare granul este format din mai multe macromolecule legate ntre ele, astfel nct s formeze un ansamblu reticulat, care este ptruns de solvent (faza mobil), care determin umflarea ei. Deci fiecare gel este format din granule cu pori identici. Moleculele cu mrime apropiat, dar puin mai mic dect aceea a porilor, penetreaz prin pori, repartizndu-se ntre lichidele intra i extragranulare, n proporii ce depind de natura lor i de aceea a gelului. Prin acest process se ncetinete deplasarea moleculelor mici, care sunt eluate dup ce moleculele mai mari sunt excluse de pori i prsesc gelul prin spaiile intergranulare sau interstiiale. Ca i faz staionar se folosete un model de ciclodextrine , formate din 6, 7, 8 uniti de -glucoz cu anumite dimensiuni interioare ale porilor. molecul mare exclus molecul mic inclus granule gel

La separarea componenilor unei probe prin cromatografia de excluder-difuzie trebuie s se aib n vedere urmtoarele caracteristici ale gelurilor: - diametrul porilor, care depinde de modul de preparare, care determin la rndul lui gradul de reticulare, reprezentat n practic de capacitatea de umflare a unui gel, adic de cantitatea de solvent ce poate fi absorbit de un gram de gel uscat; - mrimea i forma particolelor, care trebuie s favorizeze stabilirea rapid a echilibrelor de difuzie; - gelurile nu trebuie s reacioneze cu solvenii organici sau apoi; - afinitatea gelurilor pentru substanele din soluiile cercetate trebuie s fie redus.

13

Aplicaiile cromatografiei de excludere-difuzie sunt: - separarea polimerilor sau macromoleculelor cu mase moleculare mari; - separarea moleculelor mici din amestecuri de macromolecule (prin aceasta se nlocuiete cu success dializa printr-o filtrare mult mai rapid); - eliminarea srurilor dintr-o soluie de macromolecule, folosind geluri reticulate; - determinarea maselor moleculare pe baza relaiei dintre masa molecular i volumul de retenie : logM=f(V)r; - identificarea i dozarea unor medicamente, hormoni, pesticide i a altor substane toxice n cazul n care acestea au molecule mici.

14

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE PE COLOAN n cazul cromatografiei de lichide pe coloan se utilizeaz o faz staionar pe care se face separarea cromatografic i o faz mobil. ntre faza mobil i faza staionar exist un echilibru, care este pus n eviden prin repartiia componenilor probei ntre cele dou faze (mobil i staionar). As, unde Am componentul n faza mobil As componentul n faza staionar. Conform legii echilibrului de mas, ntre concentraiile aceleiai specii chimice distribuite ntre cele dou faze se poate scrie expresia coeficientului de distribuie: KD = Am

[ A] s [ A] m

Din aceast relaie se observ c, KD este mai mare dac analitul este reinut de faza staionar, iar pentru KD mic analitul este eluat mai repede de-a lungul coloanei de ctre faza mobil. La baza separrii cromatografice stau cele patru procese fundamentale i anume: adsorbia, repartiia, excluderea-difuzia i schimbul ionic. n unele cazuri pot avea loc toate cele patru procese, iar n alte cazuri poate avea loc unul, dou sau trei dintre acestea. Se consider patru fragmente dintr-o coloan cromatografic care se prepar prin umplerea cu o suspensie a fazei staionare, peste care se introduce proba de analizat: ap eluent A+B B A B A 1 2 3 4 Schema separrii a doi componeni prin cromatografia de lichide pe coloan Condiia necesar seprrii a doi componeni prin cromatografie de lichide pe coloan (i nu numai) este ca viteza lor de eluare prin coloan s fie diferit (n cazul nostru v A>>vB), unde: vA =
l tA

eluent

eluent

i vB =

l tB

; l- lungimea coloanei cromatografice

n figura de mai sus se observ c n poziia 2 a fost introdus proba pe coloan dup care se adaug eluentul, n poziia 3 se observ nceputul separrii celor doi

15

componeni, pentru ca n faza urmtoare separarea acestora s se realizeze complet. Aceast ultim faz este deosebit de important din punct de vedere al analizei cantitative i al deteciei componenilor probei. concentraie A B

timp (volum) n urma separrii s-a obinut cromatograma de mai sus din care se poate remarca faptul c, compusul cel mai puin reinut (A) a eluat primul (timpul de retenie pentru compusul A este mai mic dect timpul de retenie pentru compusul B). Cromatografia de adsorbie se execut pe faz staionar solid, pe care componenii probei analizate se adsorb, adic se fixeaz prin fore fizice pe faza staionar. Eluia probei se realizeaz cu o faz lichid. n timpul eluiei se realizeaz o distribuie a componenilor ntre cel dou faze. Astfel de procese se petrec i n cazul cromatografiei pe strat subire, cnd este vorba tot de o cromatografie lichid-solid, care se bazeaz pe adsorbia analitului pe faza staionar solid plan care este depus uniform pe o suprafa plan de sticl, folie de aluminium sau din material plastic. Cromatografia de repartiie se execut pe o faz staionar lichid depus pe un suport solid ce este format din particule inerte, n coloan sau pe strat subire. Ca i faz mobil se folosete un lichid (n cazul cromatgrafiei de repartiie lichid-lichid), sau un gaz (pentru cromatografia de repartiie gaz-lichid). n funcie de natura fazei staionare i a celei mobile, avem dou metode cromatografice de repartiie: - cromatografia de repartiie pe faz normal (sau direct), format din molecule polare (ap, methanol, etanol, .a.) depuse pe silicagel; cafaz mobil se folosesc solveni nepolari (hexanul, heptanul, .a.). Faza staionar polar favorizeaz retenia compuilor polari i eluia compuilor nepolari odat cu faza mobil nepolar. - cromatografia de repartiie pe faz staionar invers folosete molecule nepolare fixate pe suport solid de silicagel. Ca i faz mobil se utilizeaz o soluie (sau amestec de mai multe soluii) polar. Faza staionar nepolar favorizeaz retenia compuilor nepolari i eluia compuilor polari cu ajutorul fazei mobile. Eficiena unei coloane cromatografice se caracterizeaz printr-o separare bun efectuat componenilor unei probe. Exist mai muli parametrii de care depinde separarea pe o coloan cromatografic i anume: numrul talerelor teoretice, factorul de asimetrie, factorul de capacitate, rezoluia, .a.

16

A) Talerul teoretic reprezint un strat imaginar foarte subire i liniar de faz staionar, ce reprezint un singur echilibru de transfer de mas, ntr-o singur treapt. Este evident c separarea este cu att mai bun cu ct numrul talerelor teoretice este mai mare. Numrul de talere teoretice se poate calcula astfel:
tR N = a , unde w
2

N - numrul de talere teoretice; a constant care depinde de metoda de calcul; tR- timpul de retenie al picului; w limea picului la o nlime dat. Metoda Limea picului la jumtate din nlime (w1/2) Limea picului la 4,4% din nlimea picului (metoda 5) Metoda tangentei (w = limea la baz a picului obinut cu ajutorul tangentelor n punctele de inflexiune ale picului) a 5,54 25 16

La calcularea numrului de talere teoretice al unei coloane cromatografice, cel mai des se utilizeaz metoda n care limea picului se msoar la jumtate din nlime. n acest caz, conform definiiei de mai sus, numrul de talere teoretice se calculeaz astfel:
tR Nw1/2 = 5,54 , unde w
2

Picul 1 Picul 2

W1/2 Punctul 0 W10% W A t0 Timpul de retenie tR1 tR B

Numrul talerelor teoretice depinde de mai muli factori dintre care amintim: - calitatea coloanei cromatografice; - lungimea coloanei; 17

- introducerea unor debite mici de eluent (dar nu foarte mici deoarece exist posibilitatea ca acesta s nu mai antreneze proba); - dimensiunea mic particulelor fazei staionare; - vscozitatea redus a fazei mobile i temperatura ridicat; - molecule cu mas molecular mic n probe. B) Factorul de asimetrie reprezint raportul dintre distana de la axa vertical a picului pentru maximul de concentraie, pn la frontul picului, msurat la o nlime de 10% din nlimea picului i distana de la captul picului pn la axa vertical a picului pentru maximul de concentraie, msurat la o nlime de 10% din nlimea picului.
AS = B/A (vezi figura de mai sus)

C) Factorul de capacitate (retenia relativ) Factorul de capacitate al unui compus dintr-o prob ne indic n ce msur acest component este reinut n coloan comparativ cu un component care nu este reinut deloc n coloan: k=
t R tO tO

, unde

tR timpul de eluie al componentului reinut; tO timpul de eluie al componentului nereinut (timpul mort al coloanei). Timpul mort al coloanei este: t0 =Vm/F, unde Vm volumul mort al coloanei; F debitul fazei mobile. Factorul de capacitate depinde de compoziia fazei mobile i fazei staionare, dar i de temperatur. D) Selectivitatea indic separabilitatea a doi componeni: =
' k1

' k2 Pentru creterea selectivitii se modific faza mobil (tria solventului organic, tipul solventului organic), faza staionar sau se modific temperatura care influeneaz vscozitatea fazei mobile.

E) Rezoluia msoar calitatea separrii cromatografice: Rs =

2( t 2 t1 ) w1 + w2

, unde

t1, t2 timpii de retenie ai compusului 1 i 2; w1, w2 limea la baz a compuilor 1 i 2. Msurarea rezoluiei se poate efectua prin mai multe metode: - conform ecuaiei de mai sus; - pe baza curbelor standard de calcul al rezoluiei (pentru Rs<1); 18

- calcularea pe baza minimului (valley) dintre dou picuri ( se folosete atunci cnd 0,8<Rs<1,5). n continuare se prezint pentru comparaie patru cazuri ale aceleiai separri: i) rezoluie slab;

ii) rezoluie bun datorit eficienei coloanei;

t tR1 tR2 iii) rezoluie bun datorit selectivitii coloanei; w1 w2 iiii) rezoluie slab datorit coeficienilor de distribuie sczui.

Exemple de rezoluie a unei coloane Expresia rezoluiei care include termenii legai de condiiile cromatografice experimentale este urmtoarea: Rs = 1/4 ( 1)
(selectivitate)
.

N1/2

(k/1+k)
(retenie)

(eficien)

k- factorul de capacitate; selectivitatea; N numrul de talere teoretice ale coloanei. De asemenea o rezoluie prea mare duce la un timp de analiz mai mare. n cromatografia de lichide clasic este nevoie de coloane cromatografice cu diametrul mare i sufficient de lungi, pentru a avea un numr corespunztor de platouri teoretice, iar

19

separarea componenilor unei probe se face sub aciunea gravitaiei sau a unei pompe de joas presiune. Pentru a nltura aceste inconveniente, n present se utilizeaz cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC High Performance Liquid Chromatography) , care prezint timpi de separare foarte scuri. Particulele de sorbeni cu care sunt umplute coloanele HPLC au diametrul de 3-10 m. Cele mai utilizate faze staionare folosite n HPLC sunt prezentate n urmtorul tabel: Faza Si C1 C2 C3 C4 Denumirea Silica TMS, SAS,Trimethyl RP-2 Propyl Butyl Formula chimic Si-OH Si-CH3 Si-C2H5 Si-C3H7 Si-C4H9 Descriere
Umplutura clasic cu faze normale. Utilizat pentru separarea componenilor organici polari, neionici. Umplutur cu faz invers. Prezint o selectivitate unic pentru separarea componenilor polari multifuncionali. Umplutur cu faz invers. Reine mai puin compuii cu faze C4, C8 sau C18, dar mai bine dect cele modificate C1. Umplutur cu faz invers. Se utilizeaz la separarea proteinelor i peptidelor, n cromatografia de interaciune hidrofob. Umlutur cu faz invers. Utilizat n cromatografia cu perechi de ioni. Moleculele nepolare sunt reinute mai puin dect pe fazele C8 i C18. Umplutur cu faz invers. Utilizat n cromatografia cu perechi de ioni. Compuii sun reinui mai puin dect pe fazele C8 i C18. Umplutur cu faz invers. Selectivitate asemntoare cu cea a fazelor C18 dar cu retenie mai mic. Domeniu larg de aplicare ( de ex: analiza produselor farmaceutice, analiza steroizilor i nucleotidelor). Legat de silice cu porii de 300 , se obine o faz staionar ideal pentru analiza peptidelor i proteinelor cu molecul hidrofil mic. Umplutur clasic cu faz invers. Reine cel mai puternic compuii nepolari. Se folosete cu success n cromatografia cu perechi de ioni. Domeniu lar de utilizare (de ex: analiza nucleotidelor, produselor farmaceutice active, vitaminelor, acizilor grai, compuilor cu importan n protecia mediului). Legat de silice cu porii de 300 , se obine o faz perfect pentru analiza peptidelor i proteinelor cu molecul hidrofil mic. Umplutr cu faz invers. Are o selectivitate unic. Se utilizeaz la analiza compuilor aromatici. Legat de silicagel cu porii de 300 , se obine o faz care se poate utiliza n cromatografia de interaciune hidrofob. Umplutur cu faz normal. Se utilizeaz la analiza compuilor aromatici i a celor cu legtur dubl. Umplutur cu faz invers i faz normal. n regim de faz invers se utilizeaz la analiza proteinelor i peptidelor i n cromatografia de

C6

Hehyl

Si-C6H13

C8

MOS, RP-8 LC8, Octyl

Si-C8H17

C18

ODS, RP-18, LC18, Octadecyl

Si-C18H37

C6H5

Fenil

Si-(CH2)3-

NO2 OH

Nitro Diol

Si-NO2 Si-(CH2)3-OCH2-

20

Glycerol

-(CH-OH )2

permeaie pe gel (GPC). Ca faz normal are selectivitatea silicagelului.

Particulele materialului adsorbant trebuie s fie sferice. Cu ct particulele de sorbeni au diametre mai mici cu att eficiena separrii este mai mare, dar n astfel de cazuri presiunea trebuie s fie cu att mai mare cu ct diametrul particulelor este mai mic pentru a micora timpul de retenie. n cazul coloanelor cromatografice umplute cu silicagel, picurile cu coad (tailing) ale compuilor polari obinute pe aceste tipuri de coloane, se datoreaz interaciunilor compuilor respectivi cu suprafaa puternic activ a silicagelului. Principalele cauze ale apariiei grupelor foarte active silanol (care provoac acest fenomen), sunt impuritile sub form de urme i hidroxilarea superficial incomplet. Astfel, puritatea chimic a silicagelului este cel mai important factor care poate influena rezoluia precum i adsorbia nedorit a biomoleculelor i a componenilor bazici. Un pas hotrtor n elaborarea unei faze staionare invers moderne este ndeprtarea tuturor grupelor silanol rmase, evitndu-se interaiunea ntre compuii cromatografiai i suprafaa silicagelului. Pentru aceasta, grupele silanol libere sunt dezactivate printr-o reacie cu ageni silanizani. Acest procedeu se numete end capping. Eliminarea total a gruprilor silanol libere se poate urmri prin compararea comportrii cromatografice a piridinei i a fenolului, astfel, dac exist mai multe grupri silanol libere, rezoluia obinut este mai mic i picul piridinei este cu coad (tailing). Deci, puritatea silicagelului, procesul chimic de legare a lanurilor hidrocarburilor i gradul end-capping sunt factorii care influeneaz comportarea cromatografic a produselor farmaceutice i a altor compui care conin grupri bazice pentru c acestea interacioneaz uor cu silicagelul rezultnd picuri cu coad sau adsorbii ireversibile. Dimensiunile coloanelor folosite n cromatografia de lichide se situeaz ntr-un domeniu foarte larg. Diametrul interior poate fi 1, 2.1, 3, 3.2 mm. (microbore, narrowbore), 4, 4.6 mm. (analitice), 10 mm. (semipreparative), 25mm. sau mai mari (preparative). n general lungimea coloanei poate fi de 30, 50, 100, 125, 200, 250, 300 mm.Coloanele clasice sunt nlocuite din ce n ce mai mult de coloanele de tip cartridge (cartu) de diferite fabricaii. Coloanele folosite n HPLC sunt confecionate din materiale metalice care rezist la presiuni de 1000-3000 psi, prin care se asigur viteze de curgere de 1-2 ml/min. Pentru ca o coloan HPLC s fie performant este necesar ca ea s fie robust i s prezinte o reproductibilitate mare (s poat fi eficient la cel puin 500 de injectri). n cromatografia de lichide de nalt performan, eficiena coloanei cromatografice se atinge pentru un numr de 400 platouri teoretice/cm.i pentru o lungime a coloanei de 20-50 cm. (8000-20.000 platouri). Cromatograful de lichide sub presiune este compus din urmtoarele pri principale: sistemul de pompare, sistemul de injecie, coloana cromatografic, detectorul i sistemul de nregistrare. Faza mobil, furnizat de unul sau mai multe rezervoare, circul prin coloana cromatografic cu un debit constant, sub efectul unei presiuni dup care trverseaz detectorul. Faza mobil trebuie aleas cu mare atenie n funcie de tehnica de lucru deorece procesele de adsorbie i de repartiie se bazeaz pe diferenele de polaritate ale analiilor . Astfel trebuie s se in cont c adsorbia este preferat pentru separarea compuilor care au configuraii sterice diferite, iar repartiia este preferat separrii compuilor unei serii omoloage (pe baza diferenei mici de mas molecular a analiilor). Temperatura coloanei cromatografice se menine constant n timpul determinrii i n majoritatea cazurilor este temperatura camerei. Compoziia fazei mobile prevzute poate s rmn constant pe toat durata determinrii (eluie izocratic) sau s varieze dup un anumit program (gradient de eluie).

21

Sistemul de detectare folosit trebuie s permit determinarea cantitilor de componente prezente n eluent i se bazeaz pe spectrofotometrie de absorbie, refractometrie diferenial, fluorimetrie, combustie sau metode electochimice. n continuare se prezint schema unui cromatograf HPLC: amortizor pulsaii cap de injecie

manta nclzit camer tampon valve rezervoare pentru solveni coloan cromatografic capilar de legtur detector nregistrator

O importan deosebit este reprezentat de alegerea fazei mobile. Aceasta este aleas n funcie de tehnica de lucru, adic de tipul procesului ce are loc n coloan i anume adsorbie (lichid- solid) sau repartiie ( lichid- lichid). Procesele de adsorbie sunt sensibile la efectele sterice, deci cromatografia de adsorbie favorizeaz separarea compuilor care au configuraii sterice diferite; procesele de repartiie sunt sensibile fa de diferenele mici de mas molecular ale analiilor, aplicndu-se la separarea compuilor unei serii omoloage. Cromatografia de tip HPLC prezint aplicaii att calitative ct i cantitative. Determinrile calitative se realizeaz prin determinarea tR pentru proba cu componenii cunoscui i compararea lor cu tR pentru proba cu componenii necunoscui (valabil numai atunci cnd se lucreaz n aceleai condiii). Determinrile cantitative folosesc dou metode: i. Metoda standardelor externe presupune compararea nlimii sau ariei picurilor cromatogramei probei de concentraie cunoscut cu cromatograma probei de concentraie necunoscut. A = f(c), sau h = f(c) ii. Metoda standardului intern const n determinarea nlimii sau ariei picurilor cromatogramei probei de concentraie cunoscut i compararea lor cu nlimea sau aria picurilor cromatogramei unei soluii ce conine att proba de concentraie cunoscut ct i proba de concentraie necunoscut. Ap/As = f(cp/cs), sau hp/hs = f(cp/cs). Alegerea metodei HPLC se face n urmtoarele cazuri: - standardizarea i verificarea materiilor prime i formelor farmaceutice (puritate, stabilitate, dozare, stabilirea perioadei de valabilitate); - izolarea i purificarea principiilor active din produse vegetale;

22

- aprecierea concentraiilor mici (ng.) din studiile in vitro sau in vivo asociate cecetrilor din domeniul biofarmaciei, farmacocineticii i farmacologiei.

23