Sunteți pe pagina 1din 4

Lucrarea nr.

5
Extractia si analiza prin cromatografie pe strat subtire a pigmentilor din plante verzi
1. Notiuni privind cromatografia
Cromatografia este o metoda de separare si analiza a substantelor chimice din amestecuri, care se bazeaza
pe interactiunea diferentiata a doi sau mai multi compusi de separat (numiti soluti) cu doua faze cromatografice: faza
mobila si faza stationara.
Cromatografia a fost initiata n 1901 de botanistul rus vet, care a separat niste pigmenti vegetali pe o coloana
umpluta cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei
metode provine de la faptul ca initial a folosit-o pentru separarea unor coloranti (chromos = culoare, graphos = scriere
n limba greaca).
Principiul de baza al separarii cromatografice consta n distributia inegala a componentelor unui amestec ntre
faza mobila si faza stationara. Acest amestec strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila.
Distributia inegala este determinata fie de afinitatea diferita a componentelor amestecului fata de cele doua faze, fie de
capacitatea diferita de a difuza n acestea.

Moleculele celor doi compusi, 1 si 2 care se gasesc n momentul initial ametecate, ntr-un volum restrns, vor
avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila n faza stationara si invers, din cauza agitatiei termice.
Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata de faza stationara, ele vor fi mai puternic retinute n
aceasta faza. Drept urmare, dupa un anumit interval de timp se va nregistra o ramnere n urma a acestei
componente, comparativ cu componenta mai slab retinuta 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc n
timpul deplasarii n coloana, deci este in proces dinamic.
In cromatografia in strat subtire si cromatografia cu hartie, coloana este inlocuita cu un strat adsorbant
(silicagel, alumina, celuloza) aplicat pe un suport de sticla/plastic/folie de aluminiu. Solutul este aplicat cu un tub
capilar, iar solventul este lasat sa se evapore. Apoi componentele sunt eluate cu un solvent care este lasat sa urce pe
placuta prin actiune capilara, antrenand componentele amestecului in grade diferite.
2. Extractia si analiza cromatografica a pigmentilor naturali din frunzele verzi
Clorofila (din greac chloros-verde si phylos-frunza) este un pigment de culoare verde, esenial n procesul de
fotosintez, prin intermediul acesteia avnd loc transformarea energiei luminoase n energie. Clorofila a fost izolata
pentru prima dat de Joseph Bienaim Caventou i Pierre Joseph Pelletier in 1817.
Clorofila este un pigment cu structura clorinica, similar din punct de vedere structural cu alte produse de tip
porfirinic, cum ar fi hemul. In centrul inelului clorinic se gaseste un ion de magneziu. Inelul clorinic poate avea ca
substituenti mai multe lanuri de diferite lungimi si de obicei, un lan lung de tip fitol. Exist cteva forme diferite care
apar n mod natural, dar tipurile cel mai des intalnite n plantele terestre sunt clorofila a si clorofila b. Structura general
a clorofilei a fost elucidat de ctre Hans Fischer n 1940, iar n 1960, cnd cea mai mare parte astereochimiei
clorofilei a fost cunoscut, Robert Burns Woodward a publicat o sintez total a moleculei. n 1967, ultima elucidare
rmas privind stereochimia a fost completat de Ian Fleming, i n 1990 Woodward a publicat o sinteza actualizat.

Clorofila a

Clorofila b

In frunzele plantelor pe langa pigmentii clorofilieni totodeauna se intalnesc si alti pigmenti naturali cum ar fi
carotenii si diverse xantofile toti acesti compusi avand un rol activ in procesul de fotosinteza.

-caroten

Xantofile (criptoxantina)

Mod de lucru
1. Extractia clorofilei din frunzele verzi.
a. Se cantaresc circa 3g frunze verzi. Se maruntesc bine si se introduc intr-un pahar Berzelius de 50ml.
b. Se adauga in pahar 15 ml Metanol si paharul se acopera cu o sticla de ceas.
c. Se mentine circa 1.5 ore agitand ocazional cu o bagheta de sticla pentru maruntirea frunzelor.
d. Extractul obtinut se transvazeaza intr-o eprubeta curata si uscata.
2. Analiza amestecului extras prin cromatografie pe strat subtire.
Pentru cromatografie se utilizeaza placute de cromatografie cu strat de oxid de aluminiu.
Eluentul este o solutie de eter de petrol, isooctan, acetat de etil, acetona si metanol in raport 6:1.6:1:1:0.4 (volum)
gata preparat pe care il gasiti in balonul cotat de pe masa-Eluent I.
a. Intr-un pahar Berzelius curat si uscat se adauga o cantitate de eluent care sa acopere fundul paharului (un
strat de 2-3mm) si se acopera cu o sticla de ceas sau o placuta Petri.
b. Se ia o placuta de cromatografie si cu ajutorul unui creion se trage o linie subtire la circa 1 cm de baza
placutei.
c. Cu ajutorul unei capilare se aplica in centrul placutei pe linia desenata anterior un spot cu diametrul de circa
5mm. Se lasa solventul sa se evapore, dupa care se repeta operatia de 3- 4 ori pentru a obtine o proba mai
concentrata, avand grija sa se mentina aceasi marime a spotului si lasand sa se usuce dupa fiecare aplicare.
d. Placuta se introduce in paharul cu eluent si se acopera cu o sticla de ceas sau o placuta Petri.
e. Se elueaza proba pana la aproximativ 1 cm fata de capatul superior al placutei, cand aceasta se scoate din
pahar.
f. Cu ajutorul creionului se marcheaza rapid linia finala a frontului de eluent, precum si spoturile ce se pot
identifica pe placuta.
g. Determinati valorile Rf (factor de retenie) pentru toate spoturile. Masurati distanta de la linia de start pana la
linia frontului de eluent. Apoi masurati distanta de la linia de start pana la linia fiecarui spot.
Rf=

Valorile Rf mai mari corespund compusilor mai putin polari. In literatura, valorile Rf pentru fiecare component sunt:
Rf = 0.16 pentru xantofile, Rf = 0.32 pentru clorofila b, Rf = 0.44 pentru clorofila a, si Rf = 0.95 pentru caroten.

Completati urmatoarele date:


1. Cantitatea de frunze: ____ g
2. Completati tabelul:

Spot

Culoare

Rf

Identitate probabila

Intrebari
1. Explicati principiul pe care se bazeaza separarea compusilor organici prin cromatografie pe strat subtire.
2. Care compus din cei separati in lucrarea de laborator este mai polar? Dar care mai putin polar? De unde va puteti
da seama?
3. De ce nu se poate utiliza un stilou cu cerneala sau un pix in locul creionului?
4. Placuta A de mai jos reprezint cromatograma in strat subtire a unui compus X realizat pe silicagel, utiliznd ca
eluent n-hexan. Acelai compus a fost cromatografiat utiliznd o plcu mai mare, folosind acelai eluent. Care din
plcuele B, C i D reprezint cromatograma corect a compusului X? Explicai rspunsul dat.

5. Cromatografia in strat subtire se utilizeaza cu succes si pentru identificarea amestecurilor de aminoacizi. In acest
caz se utilizeaza placute de silicagel, iar ca eluent alcool izoamilic:apa:acid acetic = 6 : 5 : 3 v/v.
a. Pentru un amestec ce contine fenilalanina, tirozina, glicina si acid glutamic indicati ordinea crescatoare de separare
in functie de valorile Rf. (indicatie: scrieti structurile compusilor!).
b. Avand in vedere ca solutiile aminoacizilor sunt incolore propuneti, pe baza cunostintelor din lucrarile de laborator
anterioare o metoda de vizualizare a spoturilor acestora pe placua cromatografic.