Chimia alimentelor, AN 1 Laborator 11

EXTRACȚIA ȘI ANALIZA PRIN CROMATOGRAFIE PE STRAT SUBȚIRE A

PIGMENȚILOR DIN PLANTE VERZI ȘI COLORANȚI ALIMENTARI

1. Noțiuni introductive despre cromatografie

Cromatografia este o metodă de separare și analiză a substanțelor chimice din amestecuri,

care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat numiți soluți,
cu două faze cromatografice: faza mobilă și faza staționară.
Cromatografia a fost inițiată în anul 1901 de către botanistul rus Țvet, care a separat
niște pigmenți vegetali pe o coloană umplută cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de
petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode provine de la faptul că inițial
a folosit-o pentru separarea unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere în limba
greacă).
Principiul de bază al separării cromatografice constă în distribuția inegală a
componentelor unui amestec între faza mobilă și cea staționară. Acest amestec străbate sistemul
cromatografic, fiind antrenat de către faza mobilă. Distribuția inegală este determinată fie de
afinitatea diferită a componentelor amestecului față de cele două faze, fie de capacitatea diferită
de a difuza în acestea.
a.
Faza staționară

Faza mobilă

1+2

b. După trecerea fazei mobile

Faza mobilă

2 1

Figura nr. 1. Principiul separării cromatografice

Moleculele celor doi compuși notați 1 respectiv 2 in figura nr. 1, se găsesc în momentul
inițial amestecate într-un volum restrâns și vor avea tendința de a se transfera continuu din faza
mobilă în cea staționară și invers, din cauza agitației termice. Deoarece moleculele compusului 2
au o afinitate mai mare față de faza staționară, ele vor fi mai puternic reținute în această fază.
 Chimia alimentelor, AN 1 Laborator 11

Drept urmare, după un anumit interval de timp se va înregistra rămânerea în urmă a acestei
componente, comparativ cu componenta mai slab reținută 1. Trebuie precizat că această separare
are loc în timpul deplasării în coloană, deci este în proces dinamic.
În cromatografia în strat subțire și cromatografia cu hârtie, coloana este înlocuită cu un
strat adsorbant (silicagel, alumina, celuloză) aplicat pe un suport de sticlă/plastic/folie de
aluminiu. Solutul este aplicat cu un tub capilar, iar solventul este lăsat să se evapore, apoi
componentele sunt eluate cu un solvent care este lăsat să se urce pe plăcuță prin acțiune capilară,
antrenând componentele amestecului în grade diferite.

2. Extracția și analiza cromatografică a pigmenților naturali din frunze verzi

Clorofila (din greacă chloros = verde și phylos = frunză) este un pigment de culoare
verde, esențial în procesul de fotosinteză, prin intermediul acesteia având loc transformarea
energiei luminoase în energie. Clororfila a fost izolată pentru prima dată de Joseph Bienaime
Caventou și Pierre Joseph Pelletier în 1817.
Clorofila este un pigment cu structura chimică, similară din punct de vedere structural cu
alte produse de tip porfirinic, cum ar fi hemul. În centrul inelului clorinic se găsește un ion de
magneziu. Inelul clorinic poate avea ca substituenți mai multe lanțuri de diferite lungimi și de
obicei un lanț lung de tip fitol. Există câteva forme diferite care apar în mod natural, dar tipurile
cel mai des întâlnite în plantele terestre sunt clorofila a și b. Structura generală a clorofilei a fost
elucidată de către Hans Fischer în 1940, iar în 1960, când cea mai mare parte astereochimiei
clorofilei a fost cunoscută, Robert Burns Woodward a publicat o sinteză totală a moleculei. În
1967, ultima elucidare rămasă privind stereochimia a fost completată de Ian Fleming și în 1990
Woodward a publicat o sinteză actualizată.
 Chimia alimentelor, AN 1 Laborator 11

În frunzele plantelor pe lângă pigmenții clorofilieni se întâlnesc și alți pigmenți naturali

cum ar fi carotenii și diverse xantofile, toți acești compuși având un rol activ în procesul de
fotosinteză.

β-caroten

Criptoxantina (xantofilă)
Experiment 1
Materialele necesare experimentului:
- pahar Berzelius de 50 ml,
- baghetă sau agitator magnetic,
- plită cu agitare,
- Frunze verzi,
- soluție de eter de petrol, hexan, acetat de etil, acetonă și metanol în raport =
6:1,6:1:1:0,4 (volum),
- balon cotat,
- plăcuțe de cromatografie cu strat de aluminiu,
- cameră de developare,
- capilare,
-
Mod de lucru
a. Extracția clorofilei din frunzele verzi
- se cântăresc circa 3 g de frunze verzi,
- se mărunțesc bine și se introduc într-un pahar Berzelius de 50 ml,
- se adaugă în pahar 15 ml etanol și paharul se acoperă cu o sticlă de ceas,
- se menține circa 1,5 ore agitând ocazional cu o baghetă de sticlă pentru mărunțirea
frunzelor sau cu un agitator magnetic,
- extractul obținut se transvazează într-o eprubetă curată și uscată.
b. Analiza amestecului extras prin cromatografie pe strat subțire
Pentru cromatografie se utilizează plăcuțe de cromatografie cu strat de aluminiu.
Eluentul este o soluție de eter de petrol, hexan, acetat de etil, acetonă și metanol în raport
= 6:1,6:1:1:0,4 (volum), gata preparat în balonul cotat.
 Chimia alimentelor, AN 1 Laborator 11

a. Într-un pahar Berzelius curat și uscat se adaugă circa 10 ml eluent și se acoperă cu o

sticlă de ceas sau o plăcută Petri.
b. Se ia o plăcuță cromatografică și cu ajutorul unui creion se trage o linie subțire la
circa 1 cm de baza plăcuței.
c. Cu ajutorul unei capilare se aplică în centrul plăcuței pe linia desenată anterior cu
diametrul de circa 5 mm. Se lasă solventul să se evapore, după care se repetă operația
de 3 – 4 ori pentru a obține o probă mai concentrată, având grijă să se mențină
aceeași mărime a spotului și lăsând să se usuce după fiecare aplicare.
d. Plăcuța se introduce în camera de developare cu solvent și se caoperă cu o sticlă de
ceas sau o cutie Petri.
e. Se eluează proba până la aprox. 1 cm față de capătul superior al plăcuței, când aceasta
se scoate din camera de developare.
f. Cu ajutorul creionului se marchează rapid linia finală a frontului de eluent, precum și
spoturile ce se pot identifica pe plăcuță.
g. Determinați valorile R pentru toate spoturile. Măsurați distanțe de la linia de start
până la linia frontului de eluent. Apoi măsurați de la linia de start până la linia
fiecărui spot.
Rf = distanța de la linia de start la linia pigmentului/distanța de la linia de start la
linia frontului de eluent
Unde Rf reprezintă factorului de retenție. Valorile R mai mari corespund compușilor mai puțin
polari. În literatură, valorile R f pentru fiecare component sunt: Rf = 0,16 pentru xantofile, Rf =
0,32 pentru clorofila b, Rf = 0,44 pentru clorofila a și Rf = 0,95 pentru caroten.

3. Extracția și analiza cromatografică a coloranților alimentari

Preparatele alimentare sunt adesea colorate cu diverși coloranți naturali sau sintetici
pentru a le face mai atractive pentru consumatori. Coloranții utilizați pentru colorarea
alimentelor sunt compuși aprobați pentru utilizare de către organisme internaționale și înainte de
a fi incluși pe lista compușilor utilizabili sunt supuși unei testări amănunțite privind efectele
nocive asupra organismului uman. Toți aditivii aprobați pentru a fi utilizați în industria
alimentară sunt codificați prin indicele E urmat de un număr între 100 și 1000. Coloranții
alimentari sunt codificași cu valori situate între E100 și E200. Utilizarea acestor aditivi
alimentari este că ei mențin calitatea și siguranța produselor o perioadă mai mare de timp, mențin
sau îmbunătățesc gustul produselor, asigură controlul acidității și alcalinității produselor, mențin
consistența produselor, de asemenea mai mențin aroma sau culoarea produselor alimentare. În
absența acestora populația nu ar mai cumpăra cu plăcere foarte multe produse uzuale: băuturi
răcoritoare, produse de patiserie și cofetărie, bomboane de tot felul, gemuri, marmelade,
mezeluri, multe preparate culinare realizate în unitățile de alimentație publică.
 Chimia alimentelor, AN 1 Laborator 11

Un exemplu de produs care conține o serie de coloranți alimentari sintetici sunt

bomboanele Skittles care au coaja colorată în diverse culori. Aditivii colorați sunt E100, E120,
E132, E130e.
Culoarea poate fi realizată prin utilizarea unui singur colorant sau a unui amestec de
coloranți. O metodă simplă de punere în evidență a prezenței acestor coloranți și de identificare a
lor poate fi realizată prin cromatografie în strat subțire.

E100 – CURCUMINA - galben

E120 – ACID CARMINIC - roșu

E160e – CAROTEN - portocaliu

E132 – Indigo CARMIN - albastru

Experiment 2
Materialele necesare experimentului:
- Camera de developarte placuțe sau un pahar Berzelius de 250 ml,
- Sticlă de ceas,
- Plăcuțe de oxid de aluminiu sau Silicagel sau hârtie de filtru,
- Bomboane Skittles toate culorile,
- Eprubete pentru dizolvarea coloranților din bomboane,
- Capilare pentru a spotula soluțiile de coloranți
- Solventul utilizat este alcoolul etilic dar se poate folosi si apa sau amestec de 1:1 apa
alcool etilic.
- Creion pentru marcare pe plăcuțe.
Mod de lucru
1. Se extrage colorantul dintr-o pastilă de Skittles prin introducerea acesteia într-o
eprubetă în care se află o soluție etanol:apa = 1:1 care va acoperi pastila,
2. Se încălzește amestecul pe baie de apă până la dispariția culorii exterioare.
3. Soluția obținută se trece într-o eprubetă curată.
4. Se fac 4 astfel de extracte de culori diferite notate cu: proba 1, proba 2, proba 3, proba
4.
 Chimia alimentelor, AN 1 Laborator 11

5. Se ia o plăcuță de cromatografie și cu ajutorul unui creion se trage o linie subțire la

circa 1 cm de baza plăcuței,
6. Se marchează 4 puncte corespunzătoare celor 4 extracte obținute anterior,
7. Cu ajutorul unei capilare se aplică în centrul fiecărui punct marcat anterior pe plăcuță
un spot cu diametrul de circa 5 mm din fiecare extract colorat. Se lasă solventul să se
evapore, după care se repetă operația de 3 – 4 ori pentru a obține probe mai
concentrate, având grijă să se mențină aceași mărime a spotului și lăsând să se urce
după fiecare aplicare.
8. Plăcuța se introduce în paharul cu eluent și se acoperă cu o sticlă de ceas sau o
plăcuță Petri.
9. Se eluează proba până la aprox. 1 cm față de capătul superior al plăcuței, când aceasta
se scoate din pahar.
10. Cu ajutorul creionului se marchează rapid linia finală a frontului de eluent, precum și
spoturile ce se pot identifica pe plăcuță.
11. Se determină valorile R pentru toate spoturile.
Analiza unui amestec de coloranți
Cele patru extracte se amestecă, obținând proba 5.
Se pregătește o nouă plăcuță cromatografică, de data aceasta spotul de probă va fi realizat
cu proba 5.
12. Plăcuța se introduce în paharul cu solvent și se acoperă cu o sticlă de ceas sau o cutie
Petri.
13. Se eluează proba până la aprox. 1 cm față de capătul superior al plăcuței, când aceasta
se scoate din pahar.
14. Cu ajutorul creionului se marchează rapid linia finală a frontului de eluent, precum și
spoturile ce se pot identifica pe plăcuțe.
15. Se determină valorile R pentru toate spoturile și se compară cu valorile obținute la
celelalte probe.