Stresul osmotic și absorbția drojdiilor (D)

1. Obiective

Efectuarea cu succes a experimentului cât mai independent;

Observarea modificărilor de pH cu ajutorul unei soluții indicatoare;

Utilizarea microscopului;

Deprinderea metodei de numărare a celulelor;

Înțelegerea legăturii dintre modificarea de pH și procesele de transport membranar;

Înțelegerea noțiunii de osmolaritate;

Înțelegerea legăturii dintre osmolaritate și procesele de transport.

2. Norme de protecția muncii în laborator

Lucrarea nu necesită măsuri speciale de protecție. Cu toate acestea, soluția de acid
clorhidric (HCl) poate avea un efect ușor iritant, astfel că se utilizează o pipeta Pasteur
cu pară pentru extragerea soluției diluate. Dupa utilizare, toate soluțiile preparate vor
fi deversate într-un recipient dedicat reziduurilor. Trebuie avut grijă ca soluțiile stock
găsite pe bancul de lucru să nu fie deversate. Pentru ca experimentele să decurgă fără
probleme se vor respecta următoarele reguli de lucru:

Soluțiile se prepară în tuburi Corning individuale;

Se utilizează pipete diferite pentru manipularea soluțiilor;

Se lucrează cu grijă la microscop astfel încât să nu se spargă lamele;

Pipetele, tuburile și alte materiale care se refolosesc se spală cu apă de la robinet de

mai multe ori și apoi se clătesc cu apă distilată;

Se curăță hemocitometrul cu apă și se șterge cu un șervețel moale;

Se șterge platforma microscopului (după vizualizare) și masa de lucru.

 TRANSPORTUL IN DROJDII SI OSMOLARITATEA

Drojdiile, ca orice organism viu, trebuie să absoarbă din mediu o serie de substanțe
pentru desfășurarea proceselor metabolice. Procesul de absorbție poate avea loc nî două
moduri, fie prin difuzie pasivă (în sensul gradientului de concentrație, nu necesită
energie) sau printr-un proces activ (necesită energie pentru a transporta o substanță
împotriva gradientului de concentrație) și selectiv. O dată intrate în drojdii, aceste
substanțe vor afecta chimia internă a celulelor determinând modificări de pH. Pâna
acum, în drojdii au fost descrise procese de transport ale Na+ (Ohgaki, Nakamura et
al. 2005), K+ (Reilly 1967) sau bicarbonat (Jennings, Howren et al. 2007). La fel ca
pentru ioni sau alte molecule, celulele sunt permeabile şi pentru apă, a cărei
”concentrație” este invers proporțională cu concentrația soluților. Astfel, apa tinde să
difuzeze dintr-un mediu mai diluat (unde este mai multă) într-un mediu mai
concentrat. Procesul de difuzie al apei se numește osmoză. În momentul in care apa
difuzează într-un mediu, volumul acestui mediu și presiunea vor crește. Presiunea
rezultată se numește presiune osmotică.

Celulele vii au această capacitate de a pierde sau absorbi apă din mediul înconjurător.
Când osmolaritatea mediul înconjurător este egală cu cea a mediului intracelular,
celula se află in condiții de izo-osmolaritate. Dacă mediul extracelular are
osmolaritatea mai mică, adică o concentrație mai mare de apă, celula va fi în condiții de
hipoosmolaritate. Dacă mediul extracelular conține o cantitate mai mică de apă, deci
o osmolaritate mai mare, aceasta este o situație de hiperosmolaritate.
 Figura D1. Stările de osmolaritate

Modificările de osmolaritate induc modificări ale morfologiei şi fiziologiei celulare

astfel:

Trecerea dintr-un mediu izo-osmotic într-unul hiperosmotic determină creșterea

volumului și ”umflarea” celulelor, în urma difuziei apei din mediul extracelualr în
mediul intracelular. Celulele trec prin procesul de ”reglare a volumului celular” şi
revin la volumul iniţial prin pierderea de apă si electroliţi

Trecerea dintr-un mediu izo-osmotic într-unul hipo-osmotic determină pierderea de

apă din celule, micșorarea celulelor, modificări ale membranei celulare și în final
moartea lor.
3. Materiale

 Tuburi Corning;

 Pahar Berzelius;

 Pipete Pasteur;

 Filtre;

 Seringi 20 ml;

 Microscop optic (figura D2);

 Vase Petri;

 Microscopul optic cu inversie (figura D2).

Figura D2 Microscopul electronic

 Pipetă Tub Corning 50 ml

Pahar Berzelius Filtru

Cameră de numărat/Hemocitometru

Figura D2. Instrumente de laborator

Pachet de drojdie uscată de 7 grame (Saccharomyces cerevisiae);

Soluție de bicarbonat de sodiu (NaHCO3 ) de concentrație 2% sau 5%;

Soluție NaOH 0,1 M;

Soluție HCl 0,1 M;

Soluții cu osmolarități diferite : NaCl 9g/l (mediu izoosmotic), NaCl 20g/l (mediu
hiperosmotic), apă distilată (mediu hipoosmotic);

Colorant neutru: roșu de fenol;

Cameră de numărat/ Hemocitometru;

Soluție pentru indcarea viabilității celulare (tripan-blue).

Înainte de a începe executarea experimentului se va verifica, dacă pe masa de lucru,

sunt toate materialele necesare indicate la punctul 3.

4. 4.1Experimentul A - Absorbția selectivă a drojdiilor

1. Se vor prepara în trei tuburi Corning de 10 de ml următoarele amestecuri:

a. 1 ml soluție colorant neutru (roşu de fenol) cu NaOH- care se va picura. Se vornota

momentele (timpul) în care culoarea se schimbă;

b. 1 ml soluție colorant neutru cu NaHCO3- care se va picura. Se vor nota momentele

în care culoarea se schimbă;

c.1 ml soluție colorant neutru cu HCl- care se va picura. Se vor nota momentele în
care culoarea se schimbă şi se va completa următorul tabel:

Amestec Culoare pH
HCl + roșu de fenol
NaHCO3 + roșu de fenol
NaOH + roșu de fenol
Explicaţi modificările de culoare şi rolul colorantului;
2. Se vor cântări 5 g drojdie şi se vor dizolva în 50 ml apă caldă;

3. Se vor lua 20 ml din această soluție și se vor pune în patru tuburi Corning de 50de
ml- câte 5 ml în fiecare tub. Se vor adăuga:
a. În primul tub: 5 ml de soluție de NaHCO3 în suspensie, se va omogeniza. Se va
picura colorant neutru peste acest amestec și se vor observa modificările de culoare;

b. În al doilea tub: 2 ml de soluție NaOH, se va omogeniza. Se va picura colorant

neutru peste acest amestec și se vor observa modificările de culoare;

c. În al treilea tub: 1 ml de soluție HCl, se va omogeniza. Se va picura colorant neutru

peste acest amestec și se vor observa modificările de culoare;

d. În al patrulea tub, se va picura colorant neutru peste cei 5 ml de soluție de drojdii

(tub control);

4. Timp de douăzeci de minute se vor obseva modificările de culoare. Se vor nota din
cinci în cinci minute ceea ce se observă ( sau se vor face fotografii) ;

5. Cu ajutorul unei seringi de 20 de ml se vor extrage 5 ml din toate tuburile Corning

pe rând. Se va filtra acest amestec într-un pahar Berzelius. Pentru a etala pe lamă
drojdiile, se va scoate membrana filtrantă din suport și se va șterge cu partea încărcată
cu drojdii, pe lamă. Imediat după aceasta se va pune o lamelă peste porțiunea cu
drojdii pentru a se evita uscarea acestora. Operațiunea se va repeta pentru celelalte
amestecuri de soluții de drojdii cu NaOH, NaHCO3 și pentru amestescul de drojdii
cu colorant neutru;

6. În ultima parte a experimentului se vor observa la microscopul optic modificările

de culoare intracitoplasmatice pe care drojdiile le suferă în toate cele patru amestecuri.
Se va începe cu observarea lamei notate “Martor”, pe care sunt etalate drojdiile cu
colorant neutru, întâi la o mărire de 10x și apoi la 40x;

7. Se va completa următorul tabel:

Amestec Culoare pH
drojdii + roșu de fenol
HCl + drojdii + roșu de fenol
NaHCO3 +drojdii + roșu de fenol
NaOH + drojdii + roșu de fenol
4.2 Experimentul B - Determinarea viabilităţii celulare in urma modificărilor de
osmolaritate
1. În trei vase Petri se vor pune 10 ml mediu:

a. izoosmotic (NaCl 9g/l);

b. mediu hiperosmotic (NaCl 20g/l);

c. mediu hipoosmotic (apă distilată).

În fiecare din aceste vase se vor adăuga 2 grame de drojdie uscată

(Saccharomyces cerevisiae) și se amestecă ușor;

2. Se lasă aproximativ 15-20 de minute, după care se vor observa la microscopul

optic cu ajutorul hemocitometrului, la o putere de mărire de 20x;

3. Se realizează o suspensie 1 ml de celule 1:1 cu tripan blue (indicator de

viabilitate);

4. Soluțiile trebuie agitate ușor înainte de a fi încărcate în hemocitometru, astfel seva

realiza o distribuție uniformă a drojdiilor în soluție. Hemocitometrul se verifică să fie
curat, dacă este pătat se va curăța cu apă și se va șterge cu un șervețel moale, pentru a
nu zgâria sticla;

5. Pentru încărcarea probelor pe hemocitometru se va folosii o pipetă Pasteur curată.

Se plasează lamela peste camera de numărat a hemocitometrului și apoi cu ajutorul
pipetei se va adăuga proba (agitată în prealabil);

6. Foarte important este faptul că soluția nu trebuie împinsă cu putere deoarece prin
capilaritate acesta va umple camera de numărat;

7. Se determină numărul de celule viabile astfel:

a. Se număra celulele din cele 5 pătrate mari evitând numărarea lor de două ori;
 b. Suspensia trebuie făcută în aşa fel incât celulele să nu se suprapună; dacă acest
lucru se întâmplă se mai face o diluţie;

c. Pentru acurateţe se numără doar celulele în care nu a pătruns tripan blue;

d. Se calculează numărul de celule conform formulei:

𝑛𝑢𝑚ă𝑟 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑒

𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒
= 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑒 𝑛𝑢𝑚𝑎𝑟𝑎𝑡𝑒 × × 10000 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑒 𝑚𝑙
𝑛𝑢𝑚𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒

8. Se observă cum osmolaritatea soluțiilor utilizate pentru acest experiment numărul

celulelor de Saccharomyces. Se va completa următorul tabel :

Caracteristici probă Număr total de celule Număr total de celule viabile

Soluție NaCl 9gr/l

Soluție NaCl 20 gr/l

Apă distilată