Cap. 5.

Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si

toxicelor

Cap. 5. NOI SISTEME BICOMPARTIMENTALE DE STUDIUL

TRANSFERULUI PRIN MEMBRANE A MEDICAMENTELOR SI
TOXICELOR

5.1 Sistem experimental flow – through de simulare a transferului prin piele si

absorbtie a toxicelor in prezenta antidoturilor
Modelul a fost conceput special pentru transferul toxicelor organofosforice
(COF) pesticide sau substante toxice de lupta (STL) . Acestea au toate , intre altele,
doua caracteristici commune: sunt lipofile si sunt foarte periculoase pentru om si
animale. In acest context s-a urmarit reducerea riscului pentru cercetatori , prin
includerea substantei toxice intr-un compartiment care se poate inchide pe parcursul
experimentului. Avand in vedere solubilitatea scazuta a COF, compartimentul
receptor a fost o celula flow-through, cu un debit sufficient pentru a asigura
eliminarea substantei toxice astfel incat concentratia ei sa ramana sub limita de
solubilitate
In toate experimentele efectuate s-a utilizat o metodologie standard de lucru,
atat in ceea ce priveste instalatia propriu – zisa, cat si secventele de prelevare si
analiza a probelor.
Etapele in desfasurarea unei experimentari au constat in:
 pregatirea instalatiei:
o stabilirea numarului de celule de difuzie,
o alegerea si montarea membranelor,
o umplerea cu fluid receptor si verificarea etansietatii,
o calibrarea membranelor cu fluidul receptor,
o reglarea debitului acestuia la valoarea dorita,
o adaugarea volumului de toxic in compartimentul donor, pe suprafata
membrane,
o prelevarea probelor, la interval de timp prestabilit, pe toata durata
experimentului
 analiza toxicului transferat, din probe, prin metode gaz cromatografice
specifice.
Durata experimentarilor s-a situate in intervalul 200 – 360 min, in cazul
membranelor sintetice, si pana la 10 ore, in cazul testelor effectuate pe piele umana.

Modelul experimental a constat, in principal, dintr-o baterie de 2 – 4 celule de

difuzie, identice din punct de vedere constructiv, bicompartimentale, ca in figura de
mai jos.

72
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Instalatia standard este compusa din:

 sistemul de alimentare (6) a fluxului receptor prospat (apa), cu posibilitatea
reglarii debitului la valoarea prescrisa (1 – 2 ml / min), prin utilizarea unei pompe
peristaltice Peripump D (tip 5187, MTA, Kutesz, Ungaria);
 sistemul central ce contine celula de difuzie (bateria de difuzie) propriu – zisa:
aceasta este confectionata din sticla, constituind de fapt compartimentul receptor (3) si
este fixate intre doua flanse metalice cu ajutorul a doi tiranti; membrana (2) este
intinsa etans pe suprafata celulei, odata cu fixarea acesteia, prin presarea flansei
metalice superioare. Aceasta are prevazuta o evazare la partea exterioara, permitand
astfel delimitarea compartimentului donor (1), deasupra membrane, in care se
introduce compusul a carui viteza de penetrare este testate. Flansele, inclusiv capacul
ce inchide compartimentul donor, sunt confectionate din bronz;
 sistemul de omogenizare a fluidului din compartimentul receptor al celulei,
prin montarea acesteia pe o plita magnetica (4), turatia agitatorului fiind constanta in
toate experimentele;
 sistemul de prelevare a probelor (5) este compus dintr-un numar de cilindrii
gradati, in care sunt colectate probele in interval de timp prestabilite.
Suprafata membrane (4,3 cm2), volumul compartimentului receptor (12,6ml)
si debitul de fluid alimentat (1 – 2 ml/min), constituie parametrii constant ce
caracterizeaza experimentul.
2 ml / min
ke   0,158 min 1  cons tan ta celulei
12, 6 ml
ln  debit  ln 2
T1    4,386 min  0, 073 ore
2 ke 0,158

73
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Membrane
Membranele testate au fost sintetice, standardizate, cat si naturale, constand
din esantioane de piele umana, de cadavru si vie.
Membrana de cuprophan este cea utilizata la filtrele de dializa (Coil Dialyzen
M 1767, M 1765 – model M 1400 – Israel), iar acetophanul este folie utilizata curent
in prezentarile cu retroproiector.
Esantioanele de piele au fost obtinute, fie de la morga Spitalului Militar
Central, Bucuresti (piele de cadavru), fie de la Sectia de Traumatologie si Arsi a
aceluiasi spital (tegumente de piele vie, rezultate in urma unor interventii
chirurgicale).
Membranele testate (sintetice si esantioanele de piele umana) au fost de
asemenea caracterizate din punct de vedere al compozitiei, respective al locului de
prelevare, sex si varsta pacient si sunt prezentate in tabelul urmator:

Tabel 1: Caracterizarea membranelor testate

Nr. Denumire Compozitie Caracteristici
Crt.
1 Cuprophan Varietate de - caracter hidrofil
hidroceluloza - utilizat curent in filtrele de
dializa
- grosime 0,03 mm
2 Acetophan Varietate de acetat - caracter hidrofob
de celuloza - grosime 0,05 mm
3 Piele cadavru (72 ani, b) Piele integrala - prelevata de pe abdomen
0
4 Piele vie P1 (55 ani, b) Piele integrala - prelevata de pe coapsa
0 *
5 Piele vie P2 (64 ani, b) Epiderm + derm - prelevata de pe coapsa

6 Piele vie P30 (17 ani, b) Epiderm + derm** - prelevata de pe coapsa

7 Piele vie P40 (20 ani, f) Epiderm + derm*** - prelevata de pe coapsa

8 Piele vie P50 (26 ani, b) Epiderm + derm**** - prelevata de pe coapsa

9 Piele vie P60 (20 ani, b) Epiderm + derm***** - prelevata de pe coapsa

*
= Piele pastrata 5 zile in solutie izotonica, la +4°C, 12 zile in congelator; in
timpul experimentului stratul cornos s-a detasat de tegument.
**
= Piele pastrata 1 zi la congelator
***
= Piele pastrata 7 zile la congelator
****
= Piele pastrata 3 zile in solutie izotonica, la +4°C
*****
= Piele pastrata 30 zile in solutie izotonica, la +4°C

74
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Sisteme protectoare cu rol de inhibare a transferului membranar

Sistemele protectoare testate, cu rol in reducerea transferului membranar al
compusilor organofosforice, au constatat din pulberi absorbante, utilizate in mod
current ca produse farmaceutice auxiliare: talc, bentonita, acetat de celuloza, carbopol
940, trisilicat de magneziu, singure sau associate.
Compozitia si caracterisiticile acestora sunt prezentate in tabelul urmator.

Tabel 2: Caracterizarea pulberilor absorbante testate

Nr. Denumire Compozitie Caracteristici

Crt.
1 Talc Silicat de Mg nativ - pulbere foarte fina, alba, onctuoasa
purificat - grad de finete: sita VIII
- insolubil in apa, acizi diluati sau baze
diluate
2 Bentonita Silicat hidratat de Al - pulbere fina, alba,
asociat cu % - grad de finete: sita VII
variabile de oxizi de - insolubil in solvent organici, apa,
Mg, Fe, Mn - se imbiba cu apa (10 – 15%) formand
un gel tixotropic
3 Acetat de Amestec de di si - pulbere fina, alba,
celuloza triacetate de celuloza - grad de finete: sita VII
- insolubil in apa,
- continut redus de grupe acetil (50 –
57%)
4 Carbopol 940 Polimeri de - pulbere alba, pufoasa
carboxivinil (de acid - grad de finete: sita VII
acrilic) - D = 1,41, hidroscopica, cu 8%
umiditate,
- Caracter acid,
- Solubil in apa formand solutii acide
5 Trisilicat de 2MgO.3SiO hidratat - pulbere alba, higroscopica
magneziu - grad de finete: sita VII
- se descompune in acizi minerali

De asemenea s-au testat o serie de geluri si unguente in vederea stabilirii

influentei acestora asupra cantitatii de substanta toxica transferata prin membrane,
precum si a mecanismului de actionare. Astfel s-au incercat geluri de carbopol cu
adaosuri de ulei siliconic (pentru hidrofobizare) sau de chelatori (DTPA – Zn), sau
unguente cu baze grase tip V/L (U2).
Unguentul U1, prin incorporare de PEG 400, capata un caracter hidrofil, pe
cand unguentul U3, prin adaos de ulei siliconic DC 200 si colesterol devine puternic
hidrofil.

75
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Trebuie mentionat ca toate acete preparate farmaceutice s-au realizat in

laborator, conform FR X, inaintea fiecarui experiment. In tabelul alaturat sunt
prezentate compozitiile acestor preparate.

Tabel 3: Compozitia unguentelor testate

Nr. Crt. Denumire Compozitie

1 U1 Vaselina / lanolina / ceara alba / PEG400 / Tween 80 /
nipagin (27 / 1 / 0,25 / 1 / 0,35 / 0,005)
2 U2 Vaselina / lanolina (9 / 1)

3 U3 Vaselina / lanolina / ulei siliconic DC 200 / colesterol (12 / 2

/ 1 / 0,3)
4 G1 Gel de Carbopol 940 (0,5%) + ulei siliconic DC 200 (5%)

5 G2 Gel de Carbopol 940 (0,5%) + DTPA – Zn (0,5)

5.2. Un nou sistem de celule verticale in flux pentru studiul cedarii in – vitro a
medicamentelor din forme farmaceutice semisolide
Modelele experimentale dezvoltate in ultimii ani pentru simularea cineticii de
dizolvare in vivo, precum si a partitiei la interfete membranare au in continuare
aplicare limitata, in principal datorita tendintei evidente de diversificare si adaptare la
un context local a mediului academic, cat si datorita necesitatii de limitare si
standardizare (prin prisma tintei de acuratete, precizie, reproductibilitate si robustete)
impuse de forurile de reglementare in domeniul evaluarii medicamentelor. Edificator
din acest punct de vedere este procesul anevoios, indelungat, in adoptarea unei
metodologii comune de evaluare a cedarii in-vitro din forme farmaceutice semisolide
cu aplicare locala.
Dispozitivele de evaluare a difuziei din forme farmaceutice semisolide au fost
utilizate inca din anii 1960, prin utilizarea unor placi Petri scufundate in vase cu
volum de 1000 ml. Desi dezvoltate de producatori de echipamente de testare in-vitro
bine-cunoscuti, formele actuale de tip Ointment Cell (Hanson Research Inc.),
Enhancer Cell (Varian Inc.) sau Extraction Cell (PharmaTest GmbH) nu au fost
agreate niciodata de agentiile de reglementare in domeniul medicamentului, fiind
favorizat design-ul de tip celula de difuzie verticala Franz.
S-au pierdut unele din avantajele evidente ale acestor dispozitive, dintre care
amintim:
 utilizarea ca suport a aparatelor de dizolvare clasice, prin adaptarea capacelor
de centrare a vaselor de volum mic si a unor mini-palete;
 beneficiul adus de calificarea partiala a echipamentului, in conformitate cu
prevederile compendiale in vigoare: temperatura, nivelul acceptat de vibratii si
oscilare in jurul axului, inaltimea (2.5 cm), viteza de rotatie etc.;

76
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

 orientarea ansamblului membrana-produs semisolid si directia procesului de

difuzie, invers fata de celulele verticale;
 posibilitatea utilizarii unor volume de fluid receptor mai mari, cu respectarea
conditiilor sink mai usor de realizat.
Pe de alta parte, aceste dispozitive experimentale nu sunt intercomparabile. De
exemplu, ansamblul de tip Ointment Cell este plasat in vase cu fund plat, ceea ce
reduce volumul mort generat de un vas cu calota, de tipul celui utilizat de Varian Inc.
Ambele sunt utilizate in prezent doar in procesul de dezvoltare a unor noi
forme farmaceutice semisolide, nu ca parte a protocoalelor experimentale acceptate ca
proceduri de control al calitatii.

Figura 1. Descrierea dispozitivelor Ointment, Hanson Research

Asamblarea celulelor tip Ointment, Hanson Research necesita un dispozitiv

special de aliniere, realizandu-se in urmatorii pasi:
 membrana este uscata superficial, dupa imbibare, prin tamponare cu hartie de
filtru;
 cilindrul exterior (7) este pozitionat la nivelul dispozitivului de centrare (8);
 discul (1) este pozitionat in regiunea superioara cilindrica a dispozitivului de
centrare (8), fiindu-i atasata ulterior membrana (3);
 prin atasarea discului (2) este imobilizata membrana;
 este adaugata garnitura de cauciuc siliconic (4);
 se aplica produsul semisolid si a fost atasat prin glisare discul de sticla (5);
 se adauga cilindrul cu filet exterior (6), ansamblul fiind rotit pana la
etanseizare in corpul cilindrului exterior (7) cu ajutorul inchizatorului (9).

77
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 2. Etapele asamblarii dispozitivelor Ointment, Hanson Research

Cele sase celule Ointment sunt coborate succesive in vasul de 200 ml adaptate
la sistemele de dizolvare tip Aparat USP cu ajutorul unei tije metalice (10).
Se remarca faptul ca, desi tehnica de lucru este destul de laborioasa,
dispozitivul experimental prezinta avantajul utilizarii unor vase de volum mare (200
ml), comparativ cu cel caracteristic celulelor tip vertical. Una din problemele majore
este determinata insa de intensitatea agitarii, limitata la 150 de rpm (valoare impusa
de design-ul aparatelor de dizolvare in cadrul carora sunt montate, prin analogie cu
aparatul 2 USP).
Mijlocul anului 2009 a marcat astfel primul document oficial redactat de
Topical/Transdermal Ad Hoc Advisory Panel for USP Performance Tests of Topical
and Transdermal Dosage Forms (Ueda CT. et al, 2009) ca stimul pentru procesul de
revizuire. Este adoptat astfel in premiera un model unic de celula de difuzie verticala
(VDC), forul optand astfel pentru un anumit design al celulei, sugerand totodata o
compozitie pentru mediul receptor si anumiti parametrii experimentali. Tendinta de
impunere a unui model experimental devine evidenta, importante fiind in special
alegerea unui model difuzional si includerea in premiera a unei interfete membranare
in evaluarea calitatii unui produs farmaceutic.

Figura 3. Celulele verticale de difuzie Hanson Reserach

78
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Dispozitive de tip VDC au fost utilizate si pana in prezent pentru evaluarea

penetrabilitatii potentiale prin membranele biologice, conducand la ideea unor
corelatii de tip sigmoidal atat intre caracterul lipofil si permeabilitate, cat si intre
valorile parametrilor difuzionali prin utilizarea membranelor artificiale, respectiv a
sistemelor tip Caco2 (Poli JE. et al, 2004). Lipsa unor relatii liniare, precum si
diferentele frecvent mentionate in literatura intre valorile calculate si cele determinate
experimental pentru coeficientii de partitie au fost explicate fie prin interferenta in
evaluarea globala a unor sisteme active de transport care dubleaza procesul de difuzie
pasiva, fie prin lipsa unor evaluari adecvate ale modificarilor de conformationale sau
a unor interactiuni specifice cu interfata considerata.
Ca dispozitive de control al calitatii, design-ul celulelor tip VDC dezvoltate de
Hanson Research pare a fi agreat de FDA, adresandu-se atat formelor farmaceutice
semisolide, cat si lichidelor vascoase prin utilizarea unor adaptoare cu dop filetat
(volum util 2-6 ml).

Figura 4. Prezentarea comparativa a adaptoarelor pentru produse semisolide (300

mg) si lichide (6 ml)

In cadrul temei de cercetare, unul dintre obiective este reprezentat de

dezvoltarea si calificarea / validarea unui nou dispozitiv experimental care combina
avantajele prezentate anterior pentru celulele tip VDC, respectiv celulele de tip
extractie (Ointment / Extraction / Enhancer Cell).

Prototipul acestui dispozitiv este reprezentat de o celula de difuzie in flux (tip

flow-through), urmarind recomandarile lui Bronaugh si Maibach privind volumul

79
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

compartimentul receptor extrem de redus. S-a urmarit astfel doar rezidenta unui
agitator magnetic de 4 x 6 mm, a carui miscare de rotatie la viteze mari (400-800 rpm)
sa nu altereze procesul difuzional prin membranele artificiale hidrofile sau hidrofobe.
Totodata, dimensiunile compartimentului donor au fost mentinute la valori
comparabile cu cele implementate in prezent in cazul celorlalte dizpozitive
disponibile comercial (masa de produs semisolid cuprinsa intre 300 si 500 mg).

Celulele proiectate si realizate in stadiul de prototip sunt prezentate in

continuare:

Figura 5. Prezentarea noului dispozitiv experimental

Primul model reprezinta o adaptare a celulelor Ointment la varianta

experimentala in flux, putand acomoda un volum de fluid receptor limitat doar de
sensibilitatea metodei analitice. Cel de-al doilea model reprezinta varinta utilizabila in
cazul fluidelor putin vascoase, tip polietilenglicol, amestecuri de mon si polioli,
emulsii etc., cu un volum al compartimentului donor extins pana la 2 ml. Ambele
celule vor fi amplasate, in ansambluri de cate 3 sau 6, pe o placa agitatoare si vor fi
cuplate individual la rezervoare de fluid, aflate sub continua agitare si amplasate intr-
o baie termostatata la 32 sau 37C (dependent de natura produsului farmaceutic si
locul de aplicare).
O activitate din cadrul etapei de cercetare a vizat evaluarea rezultatelor privind
cedarea in vitro din forme farmaceutice semisolide cu aplicare topica, prin comparatie
cu dispozitivele de tip Ointment sau VDC). A fost urmarita in mod special

80
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

reproductibilitatea metodologiei, corelata cu variatii mici ale unor parametrii

experimentali.

Teste de dizolvare
Obiective
Testul de dizolvare se aplică pentru forme farmaceutice solide şi are în
principal două obiective:
- controlul variabilităţii produselor între şarje şi
- prezicerea eliberării principiului activ din forma farmaceutica “in vivo”.
A fost introdus ca obligatoriu practic în toate farmacopeele din ultimii ani,
fiind unul din parametrii principali de control a medicamentelor solide.
Absorbţia medicamentelor depinde de factori biologici, dar şi de proprietăţile
fizico-chimice, în special de lipofilie şi solubilitate.

Analiza probelor recoltate din mediul de dizolvare

În general, analiza probelor din mediul de dizolvare se realizează conform
metodei recomandate în farmacopee. Dacă nu există o metodă disponibilă, înainte de
realizarea testului trebuie pusă la punct o metodă analitică.

Efectuarea determinărilor
Testul de dizolvare in vitro consta în dizolvarea separată a 12 unităţi farmaceutice,
respectând condiţiile menţionate în anterior.

Interpretarea rezultatelor testelor de dizolvare

Literatura farmaceutică foloseşte aşa-zişii metrici f1 şi f2 pentru a compara
două curbe de cedare in-vitro42. Factorul f1 se numeşte “factor de diferenţă”, iar
factorul f2 “factor de similaritate”43. Factorul de diferenţă f1 calculează procentul
diferenţelor dintre două curbe la fiecare moment determinat şi este o măsură a erorii
relative dintre cele două curbe. Factorul de similaritate f2 este o transformare
logaritmică a radicalului din suma pătratelor erorilor şi este o măsură a similarităţii
procentului de dizolvare dintre două curbe. Aceşti doi factori se pot calcula după
formulele:

42
J.W. Moore, H.H. Flanner: Mathematical comparison of curves with an emphasis on dissolution
profiles, Pharmaceutical Technology, 20 (6), 64-74, 1996
43
N. Sirisuth, N.D. Eddington: Systematic method for the development and validation of an IVIVC
metoprolol and naproxen drug examples, International Journal of Generic Drugs, ISSN 0793 7784, 250
– 258, 2003

81
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

 n
2
1 / 2

   ri  ti   
n

 ri  ti 
f 2  50 log 1  i 1    100

f1  i 1
 100
n
 n  

i 1
ri   

; sau echivalent
100
f 2  50 log
n

  ri  ti 
2

1 i 1
n
unde ri şi ti sunt mediile rezultatelor (procentele medii din medicamentele de
referinţă şi testat) la timpul t i pentru medicamentul de referinţă şi respectiv testat, iar n
este numărul de momente de timp.
Analiza factorului de diferenţă şi a factorului de similaritate se realizează după
următoarele etape:
- determinarea profilului de dizolvare a câte unui număr egal de forme
farmaceutice din cele două produse;
- calcularea factorului de diferenţă f1 şi a factorului de similaritate f2 utilizând
valorile medii ale dizolvărilor din cele două curbe, la momentele determinate,
- se consideră similare curbele care au valori ale f1 apropiate de zero şi valori ale
f2 apropiate de 100.
În general, valorile lui f1 cuprinse între 0 şi 12, precum şi valori ale f2 cuprinse
între 50 şi 100 asigură echivalenţa dintre profilele de cedare ale celor două curbe 44. În
cazul în care mai mult de 85% din medicament este dizolvat în 15 minute, profilurile
de dizolvare pot fi acceptate ca fiind similare, fără altă evaluare matematică. Valori
ale metricului f2 ≥ 50 indică o similaritate a profilelor de cedare suficientă astfel încât
pot fi exceptate de la studiile de bioechivalenţă45. Se observă că dacă în toate punctele
diferenţa între cantitatea cedată de cele două medicamente este de 10 procente,
factorul f2 va lua valoarea 50 46.

Evaluarea similarităţii se bazează pe următoarele condiţii:

- minim trei momente de timp (exclus zero)
- 12 valori individuale pentru fircare moment de timp şi pentru fiecare produs
- nu mai mult de o valoare medie > 85% dizolvată din fircare produs
- deviaţia standard a mediei fiecărui produs trebuie să fie mai mică de 10% de la al
doilea la ultimul moment de timp.

44
*** Food and Drug Administration (FDA), Centre for Drug Evaluation and Research (CDER) –
Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms, Guidance for Industry, 1997
45
*** Food and Drug Administration (FDA), Centre for Drug Evaluation and Research (CDER) –
Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products – General
Consideration, Guidance for Industry, March, 2003
46
V.P. Shah, Y.Tsong, P.Sathe, J.P. Liu: In vitro dissolution profile comparison - statistics and analysis
of the similarity factor, f2, Pharmaceutical Research, 15 (6), 889-896, 1998

82
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

5.3. Brevetul privind celulele verticale in flux pentru studiul cedarii in – vitro a
medicamentelor din forme farmaceutice semisolide

Invenţia se referă la un model de celulă verticală de difuzie, care permite

evaluarea profilelor de cedare in vitro a substanțelor din sisteme lichide sau
semisolide într-un compartiment receptor în flux continuu și volum redus.
Celule de difuzie sunt cunoscute și sub denumirea de celule Franz, fiind
utilizate frecvent pentru evaluarea profilelor de cedare in-vitro a substanţelor
farmaceutice sau toxicelor din sisteme lichide sau semisolide. În general, o celulă de
difuzie este compusă din trei compartimente47,48, fiind cuplată direct 49 sau indirect la
un sistem de detecţie. Un prim compartiment este cel donor, la nivelul căruia este
aplicat un vehicul care conţine substanţa de interes. Acesta din urmă este transferată,
de obicei printr-un compartiment interfacial (membrană artificială sau organică,
supusă unui anumit tratament) și este colectată la nivelul unui compartiment
receptor50.
Compartimentul donor este deschis, permițând contactul direct al vehiculului
cu mediul înconjurător sau închis etanș 51. Poate avea un volum variabil, acomodând
astfel cantități diferite, ceea ce determină un element major al procedurilor
experimentale (condiții de doză finită sau infinită). Este static sau prezintă elemente
de agitare (în designul side-by-side52). Termostatarea se realizează direct sau indirect,
iar aplicarea vehiculului se realizează cu seringă sau cu o spatulă, în funcție de
consistență. Utilizarea unor materile de tip sticlă transparentă, în special în cazul unei
timp îndelungat de testare (12-24 de ore), poate determina apariția unor fenomene de
fotodegradare.
În cadrul procedurilor de control al calității produselor farmaceutice, interfața
membranară trebuie să fie un suport mecanic inert (fără manifestarea unor fenomene
de adsorbție ale substanței de interes și fără limitarea cinetică a procesului de
transfer)53. Sunt prezente elemente de etanșeizare de tip garnitură de cauciuc 54 și
cleme55.
Compartimentul receptor trebuie să conțină fie un fluid biorelevant, fie un
sistem de cosolvenți care să asigure o solubilitate adecvată a substanței de interes, în
ambele cazuri fiind necesară asigurarea unui contact adecvat cu interfața membranară.
De remarcat faptul că cele mai utilizate fluide receptoare, menționate de literatura de
specialitate sunt fie sisteme de tip tampon fosfat (60%) sau soluții apoase saline
(15%)56. Majoritatea substanțelor farmaceutice sau toxice evaluate in-vitro în cadrul

47
Hanson W.A. și col. - US 5198109 1993
48
Hanson W.A. și col. - US 5296139 1994
49
Ross E.A. și col. - US 6360588 B1
50
Higuchi T. - US 4740309 1988
51
Castro J. și col. - US 2011/0120215 A1 2011
52
Saydek M.E. și col. - US 4863696 1989
53
Ueda CT şi col. - Pharmacopeial Forum 35(3):750-764, 2010
54
Bondi J.V. - US 4594884 1986
55
Hanson R.A. și col. - US 2003/0144626 A1 2003
56
Baert B. şi col. - J Pharm Pharmaceut Sci.13(2):218-230, 2010

83
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

unor sisteme de difuzie care simulează penetrarea stratului cornos sau a altor bariere
biologice sunt lipofile, ceea ce indică faptul că sistemele apoase, chiar și cu un control
adecvat al capacității tampon nu le asigură o solubilitate adecvată. Difuzia și implicit
relevanța profilelor de cedare in-vitro este limitată, reprezentând o ilustrare directă a
unei singure proprietăți fizico-chimice.
Una din problemele majore semnalate în cadrul studiilor in-vitro este apariția
bulelor de aer la nivelul membranei, ceea ce limitează, uneori drastic, suprafața
disponibilă pentru transferul substanței între cele două compartimente majore. Au fost
proiectate segmente (trapă de bule57) sau dispozitive speciale58, destinate captării
precoce a acestor bule, induse în special prin procedurile de colectare a probelor.
O alternativă disponibilă, în special pentru controlul calităţii formelor
farmaceutice semisolide topice, este reprezentată de celule de imersie, utilizate în
cadrul echipamentelor compendiale de dizolvare 59. Acestea sunt dispozitive statice,
construite din materiale non-reactive hidrofobe, care permit o prelevare facilă a
probelor și utilizarea unor cantități mai mari de mediu receptor (până la 150 ml) 60.
Prezintă dezavantajul unei pierderi semnificative de componente volatile sau de apă,
alături de o termostatatre dificilă a formulării (procedurile desfășurându-se la 32 sau
37° Celsius).
Invenţia de faţă se referă la un model de celulă verticală în flux care prezintă
un volum minim al compartimentului receptor. În prezența unei baghete magnetice de
dimensiuni adecvate, acest model permite o omogenizare rapidă a conținutului,
reducând la minim grosimea stratului limită, imediat adiacent membranei de difuzie.
Astfel poate fi realizată o cedare a substanței sau substanțelor de interes din
compartimentul donor, nelimitată de gradientul de concentrație.
Conform cerințelor din normativele și ghidurile de control al calității, profilul
de cedare in vitro, generat în cadrul procedurilor de control al calității adresate
formelor farmaceutice lichide sau semisolide, trebuie să reprezinte o proprietate
intrinsecă a acesteia și nu rezultantă unor procese complexe (rezistența difuzională
impusă de interfața membranară, solubilitatea adecvată a substanței în mediul receptor
etc.).
Pe de altă parte, existența unui circuit extern, termostatat, cu volum teoretic
nelimitat, permite eliminarea limitărilor prin solubilitate ale procesului difuzional.
Cantitatea de lichid sau semisolid aplicată este standardizată prin volumul inelului
dozator, într-un mod similar sistemelor de celule verticale de difuzie statice.
Menținerea unei compoziții constante la nivelul compartimentului donor este
asigurată prin capacul cu filet. Un alt avantaj major este reprezentat de termostatarea
prin intermediul circuitului extern, alături de utilizarea unui material cu transfer
termic deficitar (politetrafluoroetilenă). Spre deosebire de celule verticale de imersie,

57
Hanson R.A. și col. - US 2003/0144626 A1 2003
58
Yang H. și col. - US 2005/0019903 A1 2005
59
Zatz J.L. şi col. - Dissolution Technologies 5(1):3-13, 1998
60
Rege P.R. şi col. - J Pharm Biomed Anal. 17(8):1226-33, 1998

84
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

este asigurată o variaţie extrem de redusă a temperaturii pe durata experimentelor,

împreună cu un bun transfer termic de la mediul receptor către cel donor.
Construcția dintr-un material slab reactiv (politetrafluoroetilenă) limitează
posibilitatea apariției unor fenomene de adsorbție la interfată, facilitează curățarea
sistemelor de testare după terminarea experimentului și împiedică fenomenele
fotodegradative. Nu sunt necesare elemente suplimentare de etanșeizare de tip clemă.
Prelevarea și înlocuirea mediului prelevat se realizeză la nivelul circuitului extern
(rezervorul de fluid), prin intermediul unei pipete sau al unei seringi, cu probabilitate
redusă de introducere a bulelor de aer. Totodată. este asigurată o solubilitate adecvată
a substanței de interes, prin adaptarea volumului de fluid disponibil la nivelul
întregului circuit.
Două modele de celule verticale de difuzie în flux continuu sunt prezentate în
figurile 1-6. Ansamblul de 6-12 celule, incluzând o pompă peristaltică multicanal și
un agitator magnetic multipoziție, este descris în figura 7.

85
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 1. Corp celulă verticală de difuzie în flux continuu tip A

(dimensiuni în mm)

86
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 2. Capac pentru celulă verticală de difuzie în flux continuu tip A

(dimensiuni în mm)

87
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 3. Inel dozator tip A

(dimensiuni în mm)

88
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 4. Corp celulă verticală de difuzie în flux continuu tip B

(dimensiuni în mm)

89
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 5. Capac pentru celulă verticală de difuzie în flux continuu tip B

(dimensiuni în mm)

90
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 6. Inel dozator pentru celulă verticală de difuzie în flux continuu tip B
(dimensiuni în mm)

91
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

Figura 7. Ansamblu de celule verticale de difuzie în flux

92
Cap. 5. Noi sisteme bicompartimentale de studiul transferului prin membrane a medicamentelor si
toxicelor

5.4. Revendicări

Model de celulă verticală de difuzie, caracterizată prin aceea că permite

evaluarea profilelor de cedare in vitro a substanțelor din sisteme lichide sau
semisolide într-un compartiment receptor în flux continuu și volum redus, prezintă un
design compact, care previne pierderile prin scurgeri sau evaporare și este construită
dintr-un material slab reactiv de tip politetrafluoroetilenă.

5.5. Concluzii
Au fost dezvoltate două modele experimentale incluzând celule verticale de
difuzie în flux, cu aplicabilitate directă în dezvoltarea de metodologii in-vitro de
evaluare a proceselor de transfer la interfeţe membranare.
Primul model reprezintă un sistem de tip open loop, prezentând elemente
comune cu echipamentele de tip USP4 (flow-through cells), însă adaptate unui
compartiment donor la nivelul căruia se poate realiza administrarea unor sisteme
lichide sau semisolide (soluții, suspensii; geluri, emulsii, creme).
Cel de-al doilea model reprezintă o optimizare a protocolului experimetal, prin
cumularea avantajelor celulelor verticale de difuzie (subiect al unei inițiative de
reglementare a grupului de experți FDA/USP) și al celulelor de imersie, adaptate
echipamentelor de dizolvare. Volumul compartimentului donor este redus, ceea ce
conduce la omogenizare rapidă a conținutului și reducerea consecutivă a grosimii
stratului limită, aderent membranei. Prin cuplarea într-un circuit de tip closed loop, cu
volum limitat din punct de vedere teoretic doar de sensibilitatea metodei analitice
suport al determinărilor cantitative.
Ansamblul experimental cuprinde 6-12 unități individuale de testare, ceea ce
permite utilizarea ca metodă de evaluarea a similarității profilelor de cedare in-vitro,
din perspectivă compendială. Termostatarea individuală (în intervalul de temperaturi
cuprins între 32 și 37°C), realizată uzual prin sisteme de tip manta, este înlocuită de
un ansamblu destinat compartimentelor externe rezervor, asociate cu un agitator
magnetic multipoziţie.
Procedurile de prelevare, limitate ca volum şi dificil de realizat din perspectiva
introducerii de bule de aer pe suprafața internă a membranei suport, cu reducerea
consecutivă a suprafeței difuzionale și creșterea variabilității datelor experimentale,
sunt facilitate. Prelevarea și înlocuirea mediului prelevat se realizeză la nivelul
circuitului extern (rezervorul de fluid), prin intermediul unei pipete sau al unei seringi.
Noul dispozitiv experimental de tip celulă verticală de difuzie în flux prezintă
interes şi prin volumul variabil al compartimentului donor. Alterările compoziţionale,
generate prin evaporări ale componentelor volatile sau prin procese foto-degradative,
sunt evitate.

93