UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ

VETERINARĂ - BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII AGRICOLE

Caracterizarea tirozinazei

COORDONATOR : ABSOLVENT :
Șef luc.dr. Simion Ispas Cezar-Ștefan
Valentina

București
Iunie 2020
 Cuprins

1. Introducere
2. Scurt istoric al dezvoltării enzimologiei
3. Noțiuni generale
4. Tirozinaza
5. Determinarea activității enzimatice a tirozinazei
6. Concluzii
7. Bibliografie
 Introducere
 Tirozinazele cunoscute și ca polifenol oxidaze, sunt enzime larg răspândite în animale, plante
și microorganisme.
 Tirozinazele din diferite surse vegetale au fost îndelung studiate, dar microorganismele, ca
sursă de tirozinază, au devenit obiect de studiu în scopul stabilirii de biotehnologii pentru
obținerea în mod industrial, doar în ultimele doua decenii.
 Datorită cerinței de realizare a unei “chimii verzi”, se acordă un interes major utilizării
tirozinazelor în sinteze organice, datorită regioselectivității lor specifice si mai ales deoarece
pot fi utilizate în solvenți organici, un domeniu recent abordat in enzimologie.

 Tirozinazele din diferite surse vegetale au fost

îndelung studiate, dar microorganismele, ca sursă de
tirozinază, au devenit obiect de studiu în scopul
stabilirii de biotehnologii pentru obținerea în mod
industrial, doar în ultimele doua decenii.
 În acest context,în lucrarea de față ne-am preocupat de studierea capacității de producție
unor tulpini de Streptomyces aflate în colecția laboratorului de genetică al facultății și apoi
de caracterizare a preparatelor enzimatice obținute.
 Menționăm că ne-a fost atrasă atenția spre acest tip de microorganism, pentru producerea
de tirozinaza, tocmai datorită faptului ca acest microorganism s-a dovedit producător al
unei enzime înalt rezistente în solvenți organici și cu o capacitate ridicată de a îndepărta
hidrocarburi din sol sau apa.
 Scurt istoric al dezvoltării enzimologiei
 Primele noţiuni ştiinţifice de enzimologie apar la începutul secolului XIX, însă dezvoltarea
rapidă a acestei ramuri biochimice s-a realizat abia în ultimele decenii.
 La sfârşitul secolului XIX apare şi prima teorie asupra mecanismului de acţiune a
enzimelor şi anume teoria lacătului şi a cheii elaborată de Fischer, conform căreia, în
procesul catalitic, enzima recunoaşte substratul datorită unei similitudini structurale între
molecula substratului şi centrul activ al enzimei, această asemănare fiind comparată cu cea
existentă între un lacăt şi cheia lui.

 Sfârşitul secolului XX este marcat

de apariţia şi dezvoltarea unei noi
direcţii de cercetare în enzimologie
cu largi implicaţii în biotehnologie
- imobilizarea enzimelor,
organitelor celulare şi a celulelor
întregi pe suporturi solide.
 Noțiuni generale
Toate enzimele cunoscute până în prezent sunt substanțe de natură proteică și îndeplinesc
rol de catalizatori ai transformărilor biochimice din celula vie. Fiind biocatalizatori, enzimele
prezintă toate proprietățile generale ale catalizatorilor chimici:
 Măresc viteza reacțiilor chimice posibile din punct de vedere termodinamic prin scăderea
energiei de activare și instalarea mai rapidă a stării de echilibru;
 Activitatea catalitică se manifestă la concentrații mici, mediul de reacție conținând cantități
relativ mari de substrat;
 La sfârșitul transformării se regăsesc în mediu nemodificați din punct de vedere cantitativ și
calitativ.
 Cea mai importantă proprietate a enzimelor, total neîntâlnită în cataliza chimică, o
constituie înalta specificitate de acțiune a acestora, ceea ce înseamnă că o enzimă
catalizează transformarea unui singur substrat și doar în cazuri rare a unui grup restrâns de
substanțe înrudite structural. În funcție de modul de manifestare, specificitatea de acțiune a
enzimelor poate fi de mai multe tipuri: specificitate de reacție, de substrat, absolută de
grup, relativă de grup, stereospecificitate etc.
 Tirozinaza
 Tirozinaza are codul E.C. 1.14.18.1, care dă următoarele informaţii despre această
enzimă:
1 clasa oxidoreductaze;
14 acţionează asupra unei perechi de donori, cu încorporarea sau reducerea oxigenului
molecular;
18 un donor poate fi un alt compus şi încorporează un atom de oxigen în celălalt donor;
1prima enzimă din subclasa din care face parte.
(www.genome.jp)
 Denumirea sistemică a unei enzime arată modul de acţiune al acestei enzime cât mai
exact posibil. Astfel, tirozinaza se numeşte:
monofenol, L-DOPA:oxigen oxidoreductaza
Informaţiile furnizate de aceasta denumire arata că donorul de hidrogen este reprezentat de
monofenol si L-DOPA iar acceptorul este oxigenul. (www.chem.qmul.ac.uk).
Rolul si proprietățile tirozinazei:
 Tirozinaza este o metaloproteină care include în structura situsului catalitic o pereche de
ioni de Cu.
 Enzima catalizează hidroxilarea monofenolilor pentru a forma o-difenoli şi oxidarea o-
difenolilor la chinonele corespondente.
 Tirozinaza este enzima care limitează rata de biosinteză a pigmenţilor melaninici
(melanigeneză), începând de la tirozină ca substrat precursor.
 Melanigeneza îndeplinește mai multe roluri fiziologice în diferite organisme:
- Fructe, ciuperci, legume (brunificare)
- Fungi (formarea organelor reproducătoare și sporogeneza)
- Nevertebrate (pigmentare;apărare;vindecare rănilor;întărirea cuticulei)
- Mamifere (culoarea pielii, părului, şi ochilor mamiferelor )
- La oameni, rolul principal al melaninei este fotoprotecţia pielii
Chimia melaninei
a) Eumelanina- particule amorfe negre sau maro formate prin oxidarea
chimică sau enzimatică a aminoacidului DOPA, care se găseşte în păr, pene, piele,
ochi, melanoame, etc.
b) Feomelanina- particule amorfe de culoare galben spre roşiatic sau maro,
care conţin sulf sau proteine, obținute prin oxidarea CYSDOPA, care se găsesc în
păr, blană, pene, etc.
c) Alomelanina- particule amorfe negre sau maro, adesea fără nitrogen,
particule obţinute prin oxidarea unor polifenoli tipici. Sunt larg răspândite în fungi
şi sol
c) Neuromelanina- particule negre sau maro care se găsesc în Sistemul Nervos
Central al oamenilor şi vertebratelor.

Figura 1:
Calea melanogenică clasica
dupa Raper-Mason
(Tepper si colab. 2005)
 Determinarea activității enzimatice a tirozinazei
Principiul metodei
Metoda utilizată de noi folosește ca substrat L-DOPA. Aceasta în prezența enzimei și a
oxigenului din aer este oxidată, convertită la dopachinonă și apă. Dopachinona este instabilă
și trece rapid, practic instantaneu, în dopacrom, un pigment rosu-portocaliu (se găsește în
părul roșcat al oamenilor). Dopacromul este suficient de stabil o perioadă destul de
îndelungată pentru a permite determinarea spectrofotometrică a concentrației sale în mediul
de reacție.

Figura 2:
Oxidarea tirozinei la dopacrom în prezența
tirozinazei
 Reactivi şi soluţii
1) Tampon fosfat 0,1 M, pH = 6,0;
2) Se realizează o soluție din 100 mM de L – DOPA în tampon fosfat;
3) Preparat proteic cu activitate tirozinazică.
Realizarea curbei dopacrom standard.
1. 10 ml 300C 15’
2. 2,5 ml O soluție stoc
+ soluție L-
EPT (12,5 Ml) de
Dopa
dopacrom care
va conține 80
Μm dopacrom
Nr. Soluție stoc Tampon fosfat, Concentrație
Proba dopacrom, Ml Ml dopacrom, Μm/Ml
per Ml;

1 2.0 0.0 80
2 1.5 0.5 60
3 1.0 1.0 40 Absorbanța probelor realizate prin
4 0.5 1.5 20 diluția corespunzătoare a soluției
5 0.2 1.8 8 stoc de dopacrom se citește la 475
6 0.1 1.9 4 nm față de proba martor ( proba 7
7 0.0 2.0 0 din tabel);
Tabel 1:
Tabelul diluților
 Se reprezintă grafic curba etalon unde concentrația cunoscută de dopacrom se pune pe
axa X, iar densitățile optice/absorbanțele pe axa Y.

Concentrație dopacrom, μM/mL 0 4 8 20 40 60 80

D.O., 475 nm 0.00 0.03 0.05 0.14 0.30 0.44 0.62
0.70

0.60

0.50
Figura 3:
D.O., 475 nm

0.40
Curba etalon
0.30

0.20
y = 0.0076x
R2 = 0.9983
0.10

0.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
dopacrom, μM/mL
 Concluzii
 Enzima ce are codul 1.14.18.1 .
 Tirozinaza este enzima care limitează rata de biosinteză a pigmenţilor
melaninici (melanigeneză).
 Tirozinaza este o enzimă cu largi aplicații.
 Principala aplicaţie este în detoxifierea apelor uzate şi a solurilor contaminate
care conţin fenoli.
Ca o concluzie generală putem spune că microorganismele din genul
Streptomyces pot fi o sursă bună de producere de tirozinaze. Faptul că enzima
este în principal extracelulară este un avantaj, deoarece procedurile de extracție și
prelucrare vor fi mai ieftine.
 Bibliografie
1. Anderson, J.V., Morris, C.F. (2003) Purification and analysis of wheat grain polyphenol oxidase protein. Cereal
Chemistry 80 pg. 135–143.
2. Betancourt, A.M., Bernan ,V., Herber, W., Katz, E.,( 1992), Analysis of tyrosinase synthesis in Streptomyces
antibioticus Journal of General Microbiology, 138, pg. 787-794;
3. Cojocaru, D.C., Olteanu, Z., Ciornea, E., Oprică, L., Cojocaru, S.J., (2007) Enzimologie generală, Ed.
Tehnopress, Iași, pg. 9-25
4. Claus, H., Decker, H. (2006) Bacterial tyrosinases. System Appl Microbiol 29, pg. 3–14.
5. Crameri, R., Ettlinger, L., Hutter, R., L erch, K., Suter, M.A., Ve t t e r l i, J.A, (1982), Secretion of Tyrosinase in
Streptomyces glaucescens ,Journal of General Microbiology, 128, pg. 37 1-379;
6. Decker, H., Schweikardt, T., Nillius, D., Jaenicke, E., Tuczek, F. (2007) Similar enzyme activation and catalysis in
hemocyanins and tyrosinases. Gene 398, pg. 183–191
7. Gerdemann, C., Eicken, C., Krebs, B. (2002) The crystal structure of catechol oxidase: new insight into the
function of type-3 copper proteins.
8. Halaouili, S., Asther, M., Sigoillot, J.-C., Hamdi, M., Lomascolo, A. (2006) Fungal tryrosinases: new prospects in
molecular characteristics, bioengineering and biotechnological applications. J Appl Microbiol 100, pg. 219–232
9.Ikeda, K., Masujima, T., Suzuki, K., Sugiyama, M. (1996) Cloning and sequence analysis of the highly expressed
melanin- synthesizing gene operon from Streptomyces castaneoglobisporus. Appl Microbiol Biotechnol 45, pg. 80–
85.
10.Ikeda, K., Masujima, T., Suzuki, K., Sugiyama, M. (1996) Cloning and sequence analysis of the highly expressed
melanin- synthesizing gene operon from Streptomyces castaneoglobisporus. Appl Microbiol Biotechnol 45, pg. 80–
85.
11. Klabunde,T., Eicken,C., Sacchettini,J.C., Krebs, B. (1998) Crystal structure of a plant catechol oxidase
containing a dicopper center. Nat Struct Biol 5, pg. 1084–1090.
12.Kupper, U., Niedermann, D.M., Travaglini, G., Lerch, K. (1989) Isolation and characterization of the tyrosinase
gene from Neurospora crassa. J Biol Chem 264, pg. 17250–17258.
13. Lee, C.Y., Whitaker, J.R. (1995) Enzymatic browning and its prevention. American Chemical Society
Symposium Series 600. American Chemical Society, Washington, D.C. pg. 338 .
14. Leon-Santiesteban, H., Bernal ,Rosa, Fernandez, F., Tomasini, Araceli, (2008), Tyrosinase and peroxidase
production by Rhizopus oryzae strain ENHE obtained from pentachlorophenol-contaminated soil, J Chem Technol
Biotechnol 83, pg. 1394–1400;
15. Lerch, K. (1983) Neurospora tyrosinase: structural, spectroscopic and catalytic properties. Mol Cell BioChem
52(2), pg. 125–138.
16. Leu, W., Chen, L., Liaw, L., Lee, Y. (1992) Secretion of the Streptomyces tyrosinase is mediated through its
trans-activator, MelC. J Biol Chem 267, pg. 20108–20113.
17. Li, Y., Wang, Y., Jiang, H., Deng, J., (2009), Crystal structure of Manduca sexta prophenoloxidase provides
insights into the mechanism of type 3 copper enzymes, PNAS, vol. 106, no. 40, pg.17002–17006;
18. Marusek, C.M., Trobaugh, N.M., Flurkey, W.H., Inlow, J.K. (2006) Comparative analysis of polyphenol
oxidase from plant and fungal species. J Inorg Biochem 100, pg. 108–123
19. Sanchez-Amat, A., Solano, F., Lucas-Elío Patricia, (2010), Finding New Enzymes from Bacterial Physiology:
A Successful Approach Illustrated by the Detection of Novel Oxidases in Marinomonas mediterranea, Mar. Drugs,
8,pg. 519-541;
20. Shuster, V., Fishman, A.,(2009), Isolation, Cloning and Characterization of a Tyrosinase with Improved
Activity in Organic Solvents from Bacillus megaterium, J Mol Microbiol Biotechnol,17, pg. 188–200;
21. Tepper, A.W.J.W., Canters, G.W., Tuczek, F., Browower, J., Cassella, L., Groenen E.J.J., Janessen, D.B., Krebs,
B., Reedijk J. (2005) Structure and Mechanism of the Type-3 Copper Protein Tyrosinase, Optima Grafische
Communicatie, Rotterdam, pg. 8-24;
22. Van Gelder, C.W., Flurkey, W.H., Wichers, H.J. (1997) Sequence and structural features of plant and fungal
tyrosinases. Phytochemistry 45(7), pg. 1309–1323.
23. Yang, Z., Wu, F.,( 2006), Catalytic properties of tyrosinase from potato and edible fungi, Biotechnology,
5(3),pg. 344-348;
24. Yoshimoto, T., Yamamoto, K., Tsuru, D., (1985), Extracellular Tyrosinase from Streptomyces Sp. KY-453:
Purification and Some Enzymatic Properties, J. Biochem. 97, pg.1747-1754;
25. http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?ec:1.14.18.1
26. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC1/14/18/1.html