Enzimele i determinarea activitii lor prin metode de cinetic enzimatic

Dozarea activitii catalazei

UTILIZRILE CATALAZEI
Catalaza este utilizat n industria alimentar pentru ndeprtarea apei oxigenate din
lapte anterior produciei de brnz. O alt utilizare este n ambalajele alimentare unde previne
oxidarea alimentelor. Catalaza este, de asemenea, utilizat n industria textil, pentru a
ndeprtarea peroxidul de hidrogen din estuile supuse nlbirii.
Catalaza a nceput s fie utilizat n industria cosmetic, n mtile tratament care
combin enzima cu peroxidul de hidrogen pentru a spori oxigenarea celular n straturile
superioare ale epidermei.
Stiai c deficitul de catalaz la nivelul foliculilor piloi este considerat
responsabil de albirea prului? n organism, catalaza are un rol antioxidat, iar absena sa
permite peroxidului de hidrogen produs ca urmare a activitii metabolice s oxideze
melanina din firul de pr din interior ctre exterior.

DEF: Enzimele sunt catalizatori biologici macromoleculari, fiind responsabile de miile de

reacii care fac posibil viaa. Enzimele sunt catalizatori foarte selectivi, i cresc att rata
reaciilor metabolice ct i specificitatea lor. De cele mai multe ori, enzimele sunt de natur
proteic.

ENZIMA, SUBSTRAT ENZIMA-SUBSTRAT ENZIMA-PRODUSI ENZIMA, PRODUSI

DEF: Cinetica enzimatic reprezint investigarea functiei catalitice a unei enzime prin
msurtori cantitative ale vitezei de reacie. O reacie enzimatic poate fi pus n eviden
prin consumul substratului sau prin apariia produsului reaciei.
DEF: Rata de reacie este msura modificrii concentraiei reactanilor sau modificarea
concentraiei produilor pe unitatea de timp.
Reaciile enzimetice sunt deosebit de complexe, fiind necesare o serie de presupuneri
pentru reducerea numrului variabilelor. Factorii care influeneaz comportarea cinetic a
unei enzime sunt:
- concentraia proteinei enzimatice n mediul de reacie

concentraia substratului n mediul de reacie

pH-ul mediului de reacie
temperatura mediului de reacie.
n general, viteza reaciei enzimatice este proporional cu cantitatea de enzim numai n
primele minute ale reaciei, dup care scade sau crete neproporional. Aceste abateri se pot
datora inhibiiei prin produsul final, scderii gradului de saturaie al enzimei cu substratul
(consum de substrat), deplasrii echilibrului de reacie, instabilitii enzimei, etc. Toate aceste
probleme sunt ocolite prin msurarea vitezei iniiale a reaciei, nainte ca concentraia
substratului s se micoreze sau s apar produi inhibitori.
n multe reacii enzimatice, pot fi urmrite modificrile proprietilor spectrale ale
reactanilor sau produilor de reacie, ce pot fi msurate cu mare exactitate. Activitatea CAT
este urmrit prin descompunerea H2O2 (consumul de substrat) care absoarbe la 240 nm.
Dup legea lui Lambert-Beer, concentraia de substan analizat este dependent de
absorbana (D.O. la o anumit lungime de und) i de lungimea drumului optic (l), dup
-

formula:
, unde este coeficientul de extincie molar caracteristic acelei substante
la acea lungime de und, fiind exprimat n M-1cm-1.
DEF: Activitatea enzimatic este msurat n uniti enzimatice1, definit ca acea
cantitate de enzim care va cataliza transformarea unui micromol de substrat n decurs
de 1 minut i n condiii standard (25 C, pH i concentraie de substrat optime).
1 conform Comisiei de Enzimologie de pe lng Comisia Internaional de Biochimie

Viteza, sau rata reaciei enzimatice este direct proportional cu concentraia de enzim
din mediul de reacie.
Cu toate acestea, n majoritatea cazurilor cnd se studiaz influena concentraiei
enzimei asupra vitezei de reacie se obin curbe ce indic existana unui domeniu limitat al
concentraiilor de enzim n care este respectat aceast proporionaliate (ilustrat grafic
printr-o dreapt).
n mod ideal, modificarea D.O./ min trebuie s se ncadreze ntre 0.05 i 0.5. La
o rat mai mic dect 0.05 este considerat lipsa activitiii enzimatice, iar o rat de reactie
mai mare de 0.5 este cel mai probabil nelinear, adic nu descrie o reactie cinetic de
ordinul I. Pentru a optimiza rata de reacie se pot realiza diluii ale extractului enzimatic
sau se poate recurge la o concentrare a acestuia.

Dozarea activitii catalazei (CAT)

Msurarea activitii CAT (EC 1.11.1.6) se va face conform metodei
spectrofotometrice descris de Aebi (1974), urmrind modificarea densitii optice la 240 nm,
timp de un minut prin diminuarea cantitii de H2O2 din mediu.
Descompunerea H2O2 sub aciunea catalazei existente n lizatul celular va fi urmrit
dup adugarea a 100 L lizat n amestecul de reacie care coninea 1200 L de tampon
fosfat de potasiu 0.1 M, pH 7.1 i 700 L H2O2 0.2 %. Citirile vor fi realizate fa de un
martor n care nu a fost adugat peroxidul de hidrogen. Absorbana probei la 240 nm s-a citit
2

n funcie de martor timp de 200 secunde, din 20 n 20 de secunde. Se reprezint grafic

variaia D.O. la 240nm (pe ordonat) n funcie de timp (pe abscis). Folositi modelul de
grafic de mai jos, sau hartie milimetrica.
Reprezentarea activitatii enzimatice a Catalazei

D.O. 240 nm

0.95
0.9
0.85
0.8
0.75
0.7
0.65
0.6
0.55
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Tim p (secunde)

Se determin portiunea de curb unde variaia absorbanei evolueaz liniar n timp i

se noteaz valorile iniiale i finale ale D.O. la 240nm de pe aceasta poriune a graficului,
dup care se mparte valoarea obinut la timpul dintre cele dou puncte (exprimat n
minute). Pentru calcularea activitii enzimatice (exprimat ca U/ml ept), avei nevoie de
coeficientul de extincie molar al peroxidului de hidrogen, care este 43.6 M1 cm1. Formula
pe care o veti utiliza este:

U CAT / ml e. p.t .

D.O. / min
l 10 3

volumreactie
volumextract

f dilutie 10 6

Dupa ce ati calculat rezultatul formulei de mai sus, raportati valoarea la concentratia
proteica a extractului vostru proteic total, pentru a afla cantitatea de catalaz prezent ntr-un
mg de protein total.
In ce tip de tesut s-a obtinut cea mai mare cantitate de catalaz? Dar cea mai
putina? Cum explicati aceste rezultate?
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
3