Facultatea de Stiinta si ingineria alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

STUDIUL COMPARATIV AL METODELOR DE DOZARE A

PROTEINELOR ENZIMATICE DIN EXTRACTELE BIOLOGICE
(METODA BRADFORD, METODA BIURETULUI, METODA
LOWRY)
In prezent pentru determinarea cantitativa a proteinelor sunt cunoscute si utilizate
mai multe metode colorimetrice: metoda biuretului, Lowry, Bradford. Acestea permit
determinarea relativ simpla, rapida si sensibila a proteinelor.
In alegerea metodei de analiza cele mai adecvate pentru proteinele studiate, trebuie
sa se tina cont de principiul metodei si de eventualele interferente ce ar putea avea loc
intre reactivii utilizati si substantele insotitoare ale proteinei. Acestea sunt tot mai
frecvente la determinarea cantitativa a proteinelor din materialele biologice.
Metoda biuretului este simpla si asigura o buna reproductibilitate a rezultatelor
deoarece detecteaza legaturile peptidice, dar nu este foarte sensibila. In plus, aceasta
metoda este subiectul unor interferente date de glicerol si ionii de amoniu.
Metoda Lowry este sensibila, dar permite detectarea aminoacizilor aromatici din
structura proteinelor, astfel incat pot sa apara erori in exprimarea rezultatelor, daca
proteina standard (utilizata drept etalon) are compozitia diferita de cea a proteinelor
analizate. Si prin aplicarea acestei metode apar interferente intre reactivii analizei si o
gama larga de compusi prezenti in probele de analizat (ioni de potasiu si magneziu,
reactivi tiol si glucide).
Metoda Bradford este simpla, rapida si mult mai sensibila. Metoda asigura
obtinerea de rezultate reproductibile la determinarea proteinelor solubile din extractele
biologice, insa nu este cea mai adecvata pentru determinarea continutului de proteine din
fractiunile insolubile. Ea permite determinarea majoritatii proteinelor, exceptie facand
unele proteine cu masa moleculara mica, cum ar fi: ribonucleaza si lizozimul. Prezenta
detergentilor Triton X-100 SDS, NP-40, in concentratii mai mari de 0,2%, conduce la
rezultate nereproductibile.
Principiul metodei consta in capacitatea colorantului Commassie Blue G 250, in
forma anionica, de a se lega de gruparile bazice din structura proteinelor de devierea
absorbtiei de la 465 nm (culoarea rosie) la 595 nm (culoarea albastra). Se determina
concentratia de proteina in functie de absorbanta probei la 595 nm (A595), comparativ cu o
proteina standard de concentratie cunoscuta. Colorantul reactioneaza in principal cu
radicalii de arginina din structura proteinelor si in mai mica masura cu radicalii de
histidina; lizina, triptofan si fenilalanina.
Metoda permite determinarea unor concentratii de proteine cuprinse in domeniul
0,2-20g.
In cuvele de la spectrofotometru sau in tuburi Ependorf, se transfera un volum de
100l proba de analizat in care concentratia de proteine variaza intre 1 si 10 g/100 l si
proba martor.
Pentru curba etalon, se utilizeaza volume de 10, 20, 40, 70 si 100 l dintr-o solutie
stoc de albumina serica bovina si se completeaza volumul pana la 100 l cu apa distilata.
In probele de analizat, standard si martor se adauga 1 cm3 reactiv Bradford (R9-anexa),
apoi se omogenizeaza, evitandu-se formarea de spuma care ar putea conduce la scaderea
preciziei. Dupa 15 minute se determina A595, pentru probele de analizat si cele etalon,
comparativ cu proba martor.
Lucrari practice_Enzimologie aplicata 1
L2_Studiul comparativ al metodelor de dozare a proteinelor enzimatice din
extractele biologice (metoda Bradford, metoda biuretului, metoda Lowry)
Elaborat: drd. ing. Mihaela Cotarlet
Avizat: prof. dr.ing. Gabriela Bahrim

Facultatea de Stiinta si ingineria alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III
Pentru rezultate reproductibile se pot utiliza probe duble, atat pentru probele de
analizat cat si pentru etaloane.
Reactiv Bradford. Se dizolva 100 mg Commassie Blue G 250 in 50 ml alcool etilic 95%.
Solutia este amestecata cu 100 ml acid fosforic si volumul este completat cu apa distilata
pana la 1000 cm3. Reactivul este filtrat prin hartie de filtru si este pastrat in sticle de
culoare inchisa, la temperatura camerei, timp de cateva saptamani.
Dozarea proteinelor prin metoda biuretului
Una dintre metodele de dozare a proteinelor, cu largi aplicatii analitice, implica
utilizarea reactiei biuretului.
Reactivi
- solutie proteica de analizat ( sau extract proteic)
- solutie proteica standard: solutie albumina serica de bovina, 5 mg/ml, proaspat
preparata.
- Reactiv biuret preparat astfel: intr-un balon cotat de 500 ml se dizolva 1,5 g sulfat
de cupru (CuSO4 . 5 H2O) si 4,5 g tartrat de sodiu si potasiu, in 250 ml solutie de
hidroxid de sodiu 0,2 M. In solutia formata se adauda 2,5 g iodura de potasiu si se
aduce la semn cu solutie de hidroxid de sodiu 0,2M.
Modul de lucru
Intr-o eprubeta se iau 2 ml solutie proteica de analizat, se amesteca cu 3 ml reactiv
biuret si se tin 10 minute la 37C. Dupa racire, se citeste extinctia (densitatea optica)
solutiei la 540 nm, fata de apa.
Determinarea concentratiei proteinei in proba se face cu ajutorul unei curbe etalon care se
realizeaza, lucrandu-se pe un set de solutii proteice de concentratii cunoscute, cum sunt
cele din tabelul 1.
Tab.1
Numarul eprubetelor
Solutie proteica standard
(ml)
Apa distilata (ml)
Concentratia solutiilor
rezultate (mg proteina/2 ml)

1
0

2
0,1

3
0,5

4
5
1,0 1,5

6
2,0

2,0
0

1,9
0,5

1,5
2,5

1,0 0,5
5,0 7,5

0
10,0

In fiecare eprubeta se introduc 3 ml reactiv biuret si se lasa 10 minute la 37C (conditii

identice cu ale probei de analizat). Eprubete se racesc si se citesc extinctiile la 540 nm. Cu
datele obtinute se traseaza o curba etalon, luand pe abscisa concentratia solutiilor in mg/2
ml iar pe ordonata DO 540 nm.
Extinctia solutiei de analizat, determinata mai inainte, se raporteaza la curba
etalon, obtinand concentratia proteica in mg/2 ml. Daca este nevoie - cand concentratia
probei este mai mare, DO 540 nm depasind valorile cuprinse in curba etalon solutia
proteica de analizat, se dilueaza corespunzator, insa la calcule, valorile obtinute vor fi
amplificate cu factorul de dilutie.

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 2

L2_Studiul comparativ al metodelor de dozare a proteinelor enzimatice din
extractele biologice (metoda Bradford, metoda biuretului, metoda Lowry)
Elaborat: drd. ing. Mihaela Cotarlet
Avizat: prof. dr.ing. Gabriela Bahrim

Facultatea de Stiinta si ingineria alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III
Dozarea proteinelor prin metoda Lowry
Principiul metodei
Proteinele formeaza combinatii complexe colorate in albastru violet, cu ionul
2+
Cu in mediul alcalin (reactia biuretului). Complexul proteina- Cu2+ reduce
fosfomolibdatii si fosfowolframatii din reactivul Folin-Ciocalteu. La procesul de
reducere mai contribuie si resturile de tirozina si triptofan prezente in proteine.
Concentratia proteinelor din proba se determina fotocolorimetric.
Reactivi
- reactiv alcalin de cupru format din doua solutii:
A solutie Na2CO3 10 % in solutie de hidroxid de sodiu 0,5 N
B solutie CuSO4 . 5 H2O 0,5% in solutie de citrat de sodiu 1%. Inainte de
intrebuintare se amesteca 10 parti solutie A cu 1 parte solutie B (reactiv de lucru
preparat proaspat).
- reactiv Folin-Ciocalteu. Intr-un balon cu fund rotund si gat rodat avand
capacitatea de 1,5-2 l, se introduc in ordine stricta 100 g wolframat de sodiu
(Na2WO4 . 2H2O), 25 g molibdat de sodiu (Na2MoO4 . 2H2O) si 700 ml apa
distilata, agitand incet pana la dizolvarea completa. Se adauga 50 ml acid
ortofosforic 85% (d=1,75) si 100 ml acid clorhidric concentrat, se ataseaza un
refrigerent ascendent si se refluxeaza pe sita 10 ore. Dupa scurgerea perioadei
de reflex se adauga 150 g sulfat de litiu dizolvat partial in 50 ml apa distilata si
cateva picaturi de brom, apoi se fierbe 15 minute fara refrigerent, timp in care
amestecul de reactie devine galben. Continutul balonului se raceste, se
dilueaza cu apa distilata pana la un volum total de 1 l si se filtreaza. Pentru
conservare reactivul de culoare galbena, trebuie introdus in sticle brune,
curate, inchise etans si tinut la frigider, 4C. Inainte de folosirea reactivului se
amesteca cu apa distilata in raport de 1:10 (reactiv de lucru).
- Solutie standard de albumina serica de bovina 10 mg%, preparat in apa
distilata(corespunde la 100 g/ml sau 0,1 mg/ml)
- Extract proteic (sau solutie de proteina)
Modul de lucru
Intr-o eprubeta se introduce 1 ml solutie de proba (extract proteic), 1 ml
reactiv alcalin de cupru, se agita bine si se lasa la temperatura camerei. Dupa 10
minute se adauga 3 ml reactiv Folin-Ciocalteu (reactiv de lucru) se agita si se lasa la
temperatura camerei 45 de minute (sau 10 minute intr-o baie termostatata la 50C).
In continuare, eprubeta se raceste, dupa care continutul ei se fotocolorimetreaza la
660 nm fata de apa distilata.
Construirea curbei etalon
In 11 eprubete numerotate aranjate in ordine crescatoare, intr-un stativ, se adauga
solutia standard de albumina serica de bovina in apa distilata, corespunzand
concentratiilor din tabelul 2.
Tab.2
Numarul eprubetelor
Solutie 100 l albumina/ml
(ml)
Apa distilata (ml)
Concentratia de albumina
eprubete (g/ml)

1
0

2
0,1

3
0,2

4
0,3

5
0,4

6
0,5

7
0,6

8
0,7

9
0,8

10
0,9

11
1,0

1,0
0in

0,9
10

0,8
20

0,7
30

0,6
40

0,5
50

0,4
60

0,3
70

0,2
80

0,1
90

0
100

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 3

L2_Studiul comparativ al metodelor de dozare a proteinelor enzimatice din
extractele biologice (metoda Bradford, metoda biuretului, metoda Lowry)
Elaborat: drd. ing. Mihaela Cotarlet
Avizat: prof. dr.ing. Gabriela Bahrim

Facultatea de Stiinta si ingineria alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III
Se mai adauga in fiecare eprubeta cate 1 ml reactiv alcalin de cupru si dupa
agitare se lasa in repaus 10 minute la temperatura camerei. Se introduc cate 3 ml
reactiv Folin-Ciocalteu (reactiv de lucru) si dupa o buna agitare se lasa la temperatura
camerei 45 de minute (sau 10 minute intr-o baie termostatata la 50C). Eprubetele se
racesc dupa care continutul lor se fotocolorimetreaza la 660 nm fata de apa distilata.
Cu datele obtinute se traseaza curba etalon luand pe abscisa concentratia de
albumina din fiecare eprubeta (in g/ml) iar pe ordonata densitatea optica
corespunzatoare (DO 660 nm).
Calculul rezulatelor
Densitatea optica obtinuta pentru proba de analizat se interpoleaza pe curba
etalon, determinandu-se concetratia g/ml. In cazul cand densitatea optica a probei
este mai mare decat densitatile optice de pa curba etalon, proba se dilueaza cu apa
distilata pentru a fi adusa in limitele concentratiilor necesare, insa la calcule se tine
seama de factorul de dilutie. Astfel, se determina densitatea optica pentru solutia
diluata, se interpoleaza pe curba etalon determinandu-i concentratia in g/ml.
Valoarea gasita se va amplifica cu numarul care arata de cate ori a fost diluata solutia
probei si se transforma in mg/ml. Cu ajutorul ei se poate determina concentinul
procentual al proteinelor in proba de analizat.
Observatii
- pH-ul reactiei trebuie sa fie in jur de 10. Avand in vedere ca reactivul FolinCiocalteu se distruge in mediul alcalin, adaugarea lui trebuie facuta repede.
- O serie se substante cum sunt glicina, hidrazina, sarurile de potasiu, sulfatul
de amoniu si acidul sulfosalicilic influenteaza negativ determinarile prin
aceasta metoda.

PROTOCOL DE LUCRU
Metoda Bradford
Cuve spectofotometrice, tuburi Ependorf
PM
Proteina
Standard

PA
100 l extract

CURBA ETALON
Sol. stoc ASB (l) 10 20 40 70 100
Apa distilata (l) 90 80 60 30 -

1 cm3 reactiv Bradford

Omogenizare
Repaus 15 minute
Lucrari practice_Enzimologie aplicata 4
L2_Studiul comparativ al metodelor de dozare a proteinelor enzimatice din
extractele biologice (metoda Bradford, metoda biuretului, metoda Lowry)
Elaborat: drd. ing. Mihaela Cotarlet
Avizat: prof. dr.ing. Gabriela Bahrim

Facultatea de Stiinta si ingineria alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III
DO 595 nm (comparativ cu PM)
Metoda biuretului

Eprubete

PA
2 ml extract

CURBA ETALON
1 2 3 4 5 6
Sol. Proteica stand. (ml) 0 0,1 0,5 1 1,5 2
Apa distilata (ml) 90 2,0 1,9 0,5 1 0,5 0

3 cm3 reactiv biuret

Repaus 10 minute, la 37C
Racire
DO 540 nm (fata de apa)

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 5

L2_Studiul comparativ al metodelor de dozare a proteinelor enzimatice din
extractele biologice (metoda Bradford, metoda biuretului, metoda Lowry)
Elaborat: drd. ing. Mihaela Cotarlet
Avizat: prof. dr.ing. Gabriela Bahrim

Facultatea de Stiinta si ingineria alimentelor

Specializarea de licenta Biotehnologii industriale, Anul III

Metoda Lowry
Eprubete

PA
1 ml extract

CURBA ETALON
1 2 3
4 5 6 7 8 9 10 11
Sol. 100 l albumina/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Apa distilata (ml)
1,0 1,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

+ 1ml reactive alcalin de cupru

Agitare, repaus la temp. camerei, 10 min

+3 ml reactiv Folin-Ciocalteu
Agitare, repaus la temp. camerei, 45 min sau
10 min. pe baie de apa la 50C
Racire
DO 660 nm (fata de AD)

Lucrari practice_Enzimologie aplicata 6

L2_Studiul comparativ al metodelor de dozare a proteinelor enzimatice din
extractele biologice (metoda Bradford, metoda biuretului, metoda Lowry)
Elaborat: drd. ing. Mihaela Cotarlet
Avizat: prof. dr.ing. Gabriela Bahrim