ANALIZE DE SÂNGE - LUCRĂRI PRACTICE DE LABORATOR (2)

GLICEMIA

METODE DE DOZARE
1.1. DOZAREA GLUCOZEI PRIN METODA COLORIMETRICĂ CU O-TOLUIDINĂ

Principiul metodei:
Prin conjugarea aldo- și cetohexozelor cu amine aromatice se obțin compuși colorați a căror
intensitate se poate determina prin colorimetrare sau fotometrare.
Pentru dozarea glucozei, amina cea mai potrivită este o-toluidina care dă cu aldohexozele un
compus intens colorat în verde.

CH3

H H

compus verde

Reactivi:
- Solutie de acid tricloracetic 20% - Solutie de o-toluidina 0,75 M
- Solutie de acid tricloracetic 5% -Solutie standard de glucoza 100 mg%
Tehnica de lucru:
1. În două eprubete de centrifugă (proba (P) și standard de glucoză (SG)) se pregătesc
după cum urmează:
cantitate Proba de analizat Standard
Sânge total, ser sau plasmă ml 0,1 -
Soluție standard de glucoza ml - 0,1
Apa distilata ml 0,75 0,75
Acid tricloracetic 20% ml 0,25 0,25

2. Se amestecă prin agitare și se lasă în repaus timp de 5 minute.

3. Centrifugare 10 minute la 3500 rpm.
4. Din supernatant se pregătesc următoarele probe:

Cantitate Proba de analizat Standard Blanc

Supernatant P ml 0,25 -
Supernatant SG ml - 0,25
Acid tricloracetic 5% ml 0,25
Solutie o-toluidină ml 1,25 1,25 1,25
5. Se agită eprubetele, se transvazează în eprubete de sticlă care se țin la baia de apă la
fierbere 8 minute, răcire.
7. Măsurare SFM la 635 nm filtru S6 cuva 1 cm  Extincție probă , Extincție standard
glucoză în raport cu proba în alb.

1
! - Aldo- și cetopentozele dau colorație cu o-toluidina dar de intensitate foarte slabă, neglijabilă pentru
concentrația acestor substanțe în sânge. Galactoza poate interfera în cazurile de galactozemie.
! - Daca determinarea glucozei se face în mai puțin de 3 ore de la recoltarea probei atunci nu este
obligatorie recoltarea pe substanțe anticoagulante.

Calcularea rezultatelor:

Glucoza (mg/ 100 mL ser) = EP/Esg x 100

Ep = extincția probei de analizat/ Esg = extincția probei standard

LIPIDELE SERICE

METODE DE DOZARE
2.1.1 DOZAREA LIPIDELOR TOTALE PRIN METODA COLORIMETRICA CU VANILINA

Principiul metodei:
Lipidele serice în prezența vanilinei în mediu puternic acid dau o colorație roz colorimetrabilă.

Tehnica de lucru:
1. Observații: toată sticlăria trebuie să fie perfect uscată. Reacția de culoare este
influențată de prezența apei.
2. În trei eprubete (proba (P), standard de lipide (SL), blanc (B)) se pregătesc după cum
urmează:
Cantitate Proba de Standard Blanc
analizat

Ser sanguin ml 0,1 -

Solutie standard ml - 0,1
Apa distilata ml 0,1
Acid sulfuric concentrat ml 4,0 4,0 4,0

3. Se fierb eprubetele 10 minute pe baia de apă. După răcire se pipetează în alte 3

eprubete astfel:
Cantitate Proba Standard Blanc
de analizat
Proba ml 0,2 -
Standard ml - 0,2
Proba de analizat ml 0,2
Reactiv vanilic 0,6% in acid ml 4,0 4,0 4,0
fosforic
4. Se lasă 30-50 minute în repaus, apoi culoarea roz obținută se fotometrează în raport cu
proba în alb la 530 nm.

Calcularea rezultatelor:

Lipide totale (mg/ 100 mL ser) = EP/Es x 1000=

Ep = extincția probei de analizat/ Es = extincția probei standard

2.1.2. DOZAREA LIPIDELOR TOTALE PRIN METODA CU VANILINA FOSFAT

Principiul metodei:
Acizii grași din lipidele serului se eliberează și se sulfonează prin tratare cu acid sulfuric la
cald. Se obține un compus colorat în violet cu vanilina și fosfat monopotasic.

Proba: ser ce poate fi conservat 24 h la frigider.

Tehnica de lucru:
1. Observații: toată sticlăria trebuie să fie perfect uscată. Reacția de culoare este
influențată de prezența apei.

2. Se diluează serul pipetând 0,5 ml probă ser în 0,45 ml apă distilataă. În trei eprubete
(proba (P), standard de lipide (SL), blanc (B)) se pregătesc după cum urmează:

Cantitate Proba de Standard Blanc

analizat

Ser sanguin diluat ml 0,1 -

Standard (1000 mg/100 mL) ml - 0,1
Apă distilată ml 0,1
Acid sulfuric concentrat ml 1 1 1
3. Se țin 10 minute la fierbere în baia de apă.
4. Se adaugă 4 ml reactiv de culoare; se amestecă bine și
5. Se mai lasă 5 minute la fierbere în baia de apă;
6. Se răcesc introducând eprubetele în apă rece;
7. Se fotometrează în raport cu proba în alb la 530 nm în cuva de 1 cm;

Calcularea rezultatelor:

Lipide totale (mg/ 100 mL ser) = EP/Es x 1000=

Ep = extincția probei de analizat/ Es = extincția probei standard

 2.2 COLESTEROLUL SERIC

METODE DE DOZARE
2.2.1 DOZAREA COLESTEROLULUI TOTAL PRIN METODA RAPPAPORT

Principiul metodei:
Colesterolul formează cu acidul sulfuric și anhidrida acetică compuși intens colorați în verde.
În prezența acidului sulfo-salicilic se poate lucra fără deproteinizare, proteinele rămânând în
soluție.
Tehnica de lucru:
1. În trei eprubete (proba (P), standard de colesterol (SL), blanc (B)) se pregătesc după
cum urmează:
Cantitate Proba de Standard Blanc
analizat

Ser sanguin ml 0,05 -

Soluție standard ml - 0,05
Reactivul colesterolului ml 1,25 1,25 1,25

2. Conținutul celor trei eprubete se amestecă energic. Se lasă 5 minute la temperatura

camerei, apoi se adaugă în fiecare eprubetă câte 0,25 ml acid sulfuric concentrat. Se
amestecă energic și se lasă 10 minute la temperatura camerei. Se măsoară extincția probei
de analizat și a probei standard în raport cu proba în alb la 620 nm .

Calcularea rezultatelor:

Colesterol seric (mg/ 100 mL ser) = EP/Es x 250

Ep = extincția probei de analizat/ Es = extincția probei standard

Observații: toată sticlăria trebuie să fie perfect uscată. Reacția de culoare este influențată
de prezența apei.

2.2.2. DOZAREA COLESTEROLULUI TOTAL TOTAL PRIN METODA COLORIMETRICĂ –

ZLATKIS-ZAK-BOYLE

Principiul metodei:
Soluția de clorură ferică în prezență de acid acetic glacial și acid sulfuric formează cu
colesterolul o colorație roșie.

Proba: ser ce poate fi conservat 24 h la frigider.

Tehnica de lucru:
Eprubeta 1
1. 5 ml FeCl3 0,05% în acid acetic glacial + 0,05 ml ser
2. Se agită și se lasă în repaus 15 minute
3. Centrifugare 10 minute la 3000 rpm.
Eprubeta 2
1. 2,5 ml supernatant E1+ 1,5 ml H2SO4 conc.
2. Agitare, 20 min întuneric.
Eprubeta 3 proba standard
0,05 ml soluție standard, 5 ml sol. FeCl3 0,05% în acid acetic glacial +1,5 ml H2SO4 conc.

Eprubeta 4 probă în alb

5 ml sol. FeCl3 0,05% în acid acetic glacial + 1,5 ml H2SO4 conc.

Se fotometrează proba și standardul la 530 nm față de proba în alb.

Calcularea rezultatelor:

Colesterol seric (mg/ 100 mL ser) = EP/Es x 200

Ep = extincția probei de analizat/ Es = extincția probei standard

Observații: toată sticlăria trebuie să fie perfect uscată. Reacția de culoare este influențată
de prezența apei.