Metode i tehnici utilizate n enzimologie

Datorit structurii lor chimice i rolului pe care-l ndeplinesc n organismele vii, enzimele
prezint unele caracteristici comune cu ale altor biomolecule dar i proprieti specifice. Fiind
proteine, enzimele prezint toate proprietile fizico-chimice i structurale ale acestora. Fiind
biocatalizatori, respect toate legile catalizei chimice, iar faptul c acioneaz n organismele vii
determin o serie de caracteristici specifice.
Un studiu complet i corect al enzimelor sub aspectul structurii lor chimice, cineticii
reaciilor enzimatice, specificitii lor de aciune etc. presupune, n primul rnd, izolarea lor din
surse biologice i purificarea pn la un grad de puritate ct mai nalt. Metodele utilizate la
izolarea i purificarea enzimelor sunt comune cu cele utilizate n studiul proteinelor n general.
Spre deosebire ns de proteinele necatalitice, n cazul enzimelor trebuie evitat nu numai
denaturarea ci i inactivarea lor. Este cunoscut faptul c stabilitatea maxim a enzimelor se
ntlnete in vivo, adic n mediul lor natural. Cu ct gradul lor de puritate crete, cu att
stabilitatea enzimelor scade, fapt ce impune unele precauiuni suplimentare pe parcursul
procedurilor de separare i purificare. Principalii factori ce inactiveaz enzimele n timpul
acestor proceduri sunt temperatura i pH-ul mediului. n afara temperaturilor ridicate i a
valorilor extreme de pH, enzimele sunt puternic afectate i de modificrile brute ale acestor
factori. De aceea, toate operaiunile se execut la rece (0 +4oC), iar separarea fazei insolubile se
face utiliznd centrifuga cu rcire. Sunt i operaiuni care se execut la temperaturi foarte joase.
De exemplu, precipitarea enzimelor cu diferii solveni (aceton, alcool izopropilic etc.) se face
la 15oC sau chiar 20oC.
Modificarea pH-ului ntr-un interval mic al valorilor acestui parametru determin o
modificare mai mult sau mai puin accentuat a activitii enzimelor, iar valorile extreme (de
regul n afara intervalului de pH 5-9) produc chiar denaturarea acestora. De aceea ajustarea pHului se face la pH-metru i nu cu ajutorul hrtiei indicatoare. Acest lucru se face sub agitare
continu, utiliznd soluii acide sau alcaline diluate care se adaug cu pictura pentru a evita o
modificare prea puternic a pH-ului n zona de contact din jurul picturii.
i modificarea triei ionice a mediului are influen asupra capacitii catalitice a
enzimelor prin afectarea structurii chimice a biocatalizatorului. Acest lucru se explic prin faptul
c enzimele au, n general, o structur compact n care resturile polare sunt orientate spre
exterior n marea lor majoritate interacionnd cu dipolii apei. Fora ionic a mediului poate
perturba stratul apos din imediata vecintate a moleculei enzimatice. n mod similar pot aciona
i unii ageni tensioactivi utilizai n scopul solubilizrii enzimelor fixate n membranele

biologice ale diferitelor structuri subcelulare. i prezena n mediu, chiar n concentraii mici, a
inhibitorilor i activatorilor influeneaz capacitatea catalitic a enzimelor. Un factor extern ce
poate influena puternic activitatea enzimelor l reprezint contaminarea microbian, motiv
pentru care operaiunile de separare i purificare trebuie efectuate ct mai repede posibil.
n cercetrile de enzimologie se utilizeaz soluii preparate n ap distilat sau bidistilat
(n funcie de enzim), iar reactivii folosii trebuie s aib un grad de purificare ct mai nalt
posibil. De regul se folosesc reactivi din categoria chimic pur (c.p.) i reactiv pentru analiz
(p.a.).

V.1 Surse de enzime

Din punctul de vedere al localizrii lor, enzimele se clasific n dou grupe principale:
a) enzime solubilizate n diferite lichide biologice (snge, urin, lichid cerebrospinal, lichid
interstiial, sperm, saliv, citoplasm, mediu de cultur pentru microorganisme, sev etc.);
b) enzime fixate pe diferite structuri tisulare i subcelulare. n acest din urm caz, multe
enzime sunt puternic legate de diferite componente ale membranelor biologice, fcnd parte din
structura lor. Alegerea sursei optime pentru izolarea i purificarea unei enzime date se face n
funcie de mai multe criterii. De exemplu cea mai buna suesa de pepsina o reprezinta sucul
gastric, in timp ce -amilaza, pepsina si lipaza se vor izola din tesutul pancreatic, iar fosforilaza
din tesutul muscular.

V.2 Extracia enzimelor

n cazul enzimelor solubilizate n lichide biologice, extracia enzimelor se face direct din
acestea. Pentru enzimele fixate pe structuri celulare, se efectueaz mai nti omogenizarea
esutului, izolarea structurilor subcelulare i solubilizarea enzimelor.
a) Omogenizarea esuturilor se face fie prin mojarare pe nisip de cuar sau sticl pisat, fie
cu ajutorul omogenizatoarelor speciale (de exemplu de tip Potter). Pentru aceasta, se sacrific
animalul fr a-l stresa. Se recolteaz imediat organul sau esutul interesat i se introduce ntr-o
capsul rece, aflat pe ghea. Dac omogenizarea i operaiunile ulterioare nu se execut
imediat, se recomand congelarea esutului pentru a mpiedica inactivarea enzimelor.
Se mrunete apoi esutul cu un bisturiu sau cu un foarfece rece. Fragmentele astfel
obinute se introduc n tubul de omogenizare care este o eprubet cu pereii interiori rodai.
Aceasta se introduce apoi ntr-un pahar ce conine ap cu ghea, iar n tub se introduce pistilul
omogenizatorului. Se apas pe pedala acestuia pentru a conferi pistilului o micare de rotaie i
se omogenizeaz esutul executnd o micare de du-tevino de-a lungul axului pistilului.

Omogenizarea se realizeaz un anumit interval de timp i cu o anumit vitez de rotaie, n

funcie de tipul esutului. n lipsa omogenizatorului special, dezintegrarea esutului se poate face
i prin mojarare pe nisip de cuar, sticl pisat, oxid de aluminiu, pmnt de diatomee etc. Se
recomand ca aceast operaiune s se execute la rece i n camere frigorifice speciale.
Att omogenizarea ct i mojararea se face n prezena unui lichid de extracie (soluie
salin izotonic, soluie izotonic de zaharoz, diferite soluii tampon, ap bidistilat etc.). O alt
modalitate de obinere a extractelor acelulare o constituie congelarea-decongelarea repetat,
metod des folosit n special pentru levuri. Dezintegrarea peretelui celular se mai poate efectua
prin tratare cu ultrasunete, tratament enzimatic (lizozim, proteaze, lipaz etc.), tratament chimic
(deoxicolat de sodiu, triton X-100, uree, guanidin etc.) i alte metode.
b) Izolarea structurilor subcelulare. Dup omogenizarea esutului, omogenatele obinute sunt
supuse centrifugrii difereniate n vederea separrii structurilor subcelulare. Centrifugarea se
face la rece, dup ce instalaia frigorific a centrifugei cu rcire a fost cuplat n prealabil pentru
rcirea rotorului i eprubetelor. n funcie de scopul urmrit, se folosesc diferite viteze de rotaie
i intervale de timp diferite
Dei viteza de rotaie este marcat la toate tipurile de centrifug n rotaii pe minut, n toate
metodele i tehnicile de centrifugare difereniat aceasta este redat ca multiplii ai acceleraiei
gravitaionale (g) deoarece una i aceeai centrifug poate avea rotoare cu raze diferite, ceea ce
nseamn c fora centrifug este diferit pentru rotoare de diametru diferit la acelai numr de
rotaii pe minut. Folosind viteze de rotaie i timpi intermediari pot fi obinute fraciuni mai fine.
De exemplu mitocondriile formeaz reziduuri n condiii apropiate cu cele specifice reticulului
endoplasmatic, cele dou fraciuni putnd fi obinute printr-o nou centrifugare. n mod similar,
dup dezintegrarea membranelor mitocondriale, cele dou membrane pot fi obinute n fraciuni
separate.
c) Solubilizarea enzimelor. Enzimele fixate pe structurile subcelulare nu pot fi extrase
dect dup ndeprtarea lor din aceste structuri. n acest scop, fraciunea subcelular ce ne
intereseaz este supus dezintegrrii prin diferite metode. Poate fi utilizat tratamentul sonic,
tratamentul enzimatic, chimic etc. Printr-o modalitate sau alta, membrana biologic respectiv
este dezintegrat, iar enzimele se solubilizeaz n mediul de extracie. ndeprtnd prin
centrifugare la rece resturile membranare se obin, n final, supernatante ce conin enzimele n
form solubil.

Pentru separarea i purificarea enzimelor din diferite lichide biologice, acestea se utilizeaz
direct, operaiunile ce se execut fiind asemntoare cu cele aplicate supernatantelor obinute n
ultima faz pentru enzimele membranare. n cazul enzimelor microbiene, cele extracelulare se
extrag direct din lichidele de cultivare dup ndeprtarea biomasei, iar enzimele intracelulare pot
fi extrase ca i enzimele membranare de origine vegetal sau animal.

Metode de extracie a enzimelor

Lichidele biologice, precum i supernatantele obinute dup solubilizarea enzimelor
membranare, se trateaz n continuare n mod asemntor. Deoarece mediile respective conin un
numr foarte mare de proteine, enzimele fiind deseori n cantiti mai mici dect proteinele
structurale, se trece la extracia acestora n vederea obinerii aa-numitelor preparate enzimatice
brute care conin cea mai mare parte a enzimei studiate i un numr relativ restrns de proteine
balast. Aceast operaiune are la baz proprietatea proteinelor de a precipita reversibil i
difereniat n funcie de cantitatea, respectiv intensitatea factorului precipitant. Enzimele pot fi
precipitate selectiv prin mai multe metode, alegerea metodei optime fiind n funcie de enzima ce
urmeaz a fi izolat.
a) Termoprecipitarea este o metod aplicat relativ rar, putnd fi aplicat doar pentru
enzimele termostabile. Marea majoritate a proteinelor sunt stabile ntr-un interval termic relativ
restrns (0 +40oC), temperaturile situate n afara acestui interval putndu-le denatura. Dac
enzima ce urmeaz a fi separat este termostabil, se nclzete mediul la o temperatur ct mai
ridicat posibil dar care s nu afecteze enzima respectiv. La aceast temperatur proteinele
balast sunt denaturate, putnd fi ndeprtate prin centrifugare.
b) Precipitarea la pH izoelectric. Fiind proteine, moleculele enzimelor conin grupe
funcionale acide i bazice care sunt orientate, de regul, spre exterior unde interacioneaz cu
dipolii apei. Fiecare protein, n general, este caracterizat de o structur primar specific, avnd
deci un numr dat de grupe funcionale ionizabile. De aceea, fiecare din ele se caracterizeaz
printr-o valoare specific a punctului izoelectric, adic a acelei valori de pH la care molecula
este neutr din punct de vedere al ncrcrii electrice. Ajustarea mediului la un pH egal cu
punctul izoelectric al unei enzime date face ca interaciunea moleculelor acesteia cu dipolii apei
s nceteze, stratul apos din micromediul imediat vecin moleculei enzimatice dispare, iar enzima
precipit.

Grupele funcionale polare, valoarea punctului izoelectric i comportarea acido-bazic a

unei enzime pot fi determinate prin trasarea curbei de titrare poteniometic. n general, enzimele
au valori diferite ale pH-ului lor izoelectric. De exemplu, pentru catalaz pI=5,4; pepsina are
pI=1,0; elastaza are pI=8,5.
c) Precipitarea cu solveni organici se bazeaz pe proprietatea acestora de a diminua
valoarea constantei dielectrice a mediului cu repercusiuni asupra forelor de atracie coulombian
dintre radicalii polari ai enzimei. n mediu apos, forele de atracie dintre moleculele de proteinenzim datorate grupelor ionizate cu sarcini electrice de semn contrar sunt anulate prin
interaciunea acestora cu moleculele de ap care se comport ca un dipol datorit electronilor
neparticipani ai atomului de oxigen i caracterului electropozitiv al atomilor de hidrogen. Prin
adugarea solvenilor organici, are loc o diminuare treptat a numrului moleculelor de ap din
stratul imediat nconjurtor moleculelor enzimatice i scderea constantei dielectrice a mediului.
Grupele polare sunt astfel eliberate putndu-i exercita fora de atracie electrostatic, iar
proteinele precipit.
d) Precipitarea cu sruri neutre se bazeaz pe solubilitatea diferit a proteinelor n general
i a enzimelor n special n soluii saline. Reprezentarea grafic a solubilitii unei proteine n
funcie de concentraia srii are aspectul unui clopot. Aceasta nseamn c la concentraii mici
ale srii solubilitatea proteinelor crete pn la o anumit valoare cu creterea concentraiei n
sare dup care diminueaz treptat. Deci, la concentraii saline mari, proteinele precipit din
soluii putnd fi separate prin centrifugare. Deoarece fiecare protein precipit la o anumit
concentraie a srii, este posibil realizarea unei precipitri fracionate a proteinelor dintr-un
lichid biologic. Nu orice sare poate fi ns utilizat n precipitarea fracionat a proteinelor.
Pentru a fi un bun agent precipitant, o sare trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
a) s posede o solubilitate mare n aa fel nct s se poat realiza o gam larg de
concentraii;
b) dizolvarea srii respective n ap nu trebuie s modifice pH-ul i temperatura soluiei (s
nu fie un proces exoterm);
c) s nu reacioneze cu proteinele i s poat fi ndeprtat prin metode obinuite (de
exemplu prin dializ).
Cel mai adesea se utilizeaz n acest scop sulfatul de amoniu, amestecul sulfat
monopotasic i bipotasic, sulfatul de magneziu .a. De regul, concentraia srii n cazul
precipitrii fracionate a proteinelor nu se exprim procentual (g substan la 100 g soluie) ci n
procente de saturaie. De regul se prepar mai nti o soluie saturat dup care, n funcie de
metod, se adaug aceast soluie la lichidul biologic i nu sarea cristalin, pn la un procent de
saturaie dat. n literatura de specialitate ce abordeaz metode practice de enzimologie, se gsesc

nomograme cu ajutorul crora se poate calcula cantitatea de sare ce trebuie adugat la 1000 ml
soluie pentru a obine un anumit procent de saturaie.