UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA

FACULTATEA DE BIOLOGIE ȘI PEDOLOGIE

SPECIALITATE ȘTIINȚE BIOLOGICE APLICATE

BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE A VITAMINELOR

MICROBIENE

Lucrul individual

Aefectuat: A verificat:
Chiorescu Maria Victor Ciocârlan

ȘBA21 Dr., conf. univ.

Chișinău – 2021
CUPRINS

I. INTRODUCERE....................................................................................................................3
II. TRECEREA DE LA TEHNOLOGIA DE EXTRACȚIE LA SINTEZA CHIMICĂ
LA PROCESELE BAZATE PE BIOTEHNOLOGIE INDUSTRIALĂ..............................4
III. VITAMINE SOLUBILE ÎN GRĂSIMI...........................................................................5
3.1 Vitamina E (a-tocoferol)............................................................................................................5
3.2 Menachinona (vitamina K2)......................................................................................................6
3.3 Vitamina D.................................................................................................................................6
3.4 Vitamina A.................................................................................................................................7
IV. VITAMINE SOLUBILE ÎN APĂ...................................................................................8
4.1 Vitaminele B..............................................................................................................................8
4.1.1 Vitamina B1.......................................................................................................................8
4.1.2 Vitamina B2.....................................................................................................................12
4.1.3 Vitamina B3.....................................................................................................................13
4.1.4 Vitamina B5.....................................................................................................................14
4.1.5 Vitamina B6.....................................................................................................................14
4.1.6 Vitamina B7.....................................................................................................................15
4.1.7 Vitamina B9.....................................................................................................................15
4.1.8 Vitamina B12...................................................................................................................15
4.2 Vitamina C...............................................................................................................................16
V. PROVOCĂRI ȘI EVOLUȚII VIITOARE......................................................................17
VI. CONCLUZIE...................................................................................................................19
VII. BIBLIOGRAFIE.............................................................................................................21
 I. INTRODUCERE
Vitaminele, definite ca micronutrienți esențiali necesari în urme care nu pot fi sintetizate
de mamifere, sunt esențiale pentru metabolismul tuturor organismelor vii și sunt sintetizate de
microorganisme sau plante. Pe lângă rolurile lor nutrițional-fiziologice in vivo ca factori de
creștere pentru bărbați, animale, plante și microorganisme, vitaminele sunt introduse acum din ce
în ce mai mult ca aditivi alimentari/furajeri, ca agenți medico-terapeutici, ca ajutoare de sănătate
și, de asemenea, ca ajutoare tehnice. Astăzi, multe alimente procesate, furaje, produse
farmaceutice, cosmetice și substanțe chimice conțin vitamine adăugate în mod străin sau
compuși legați de vitamine. Cele mai multe dintre vitamine sunt acum produse industrial și
utilizate pe scară largă în alimente, produse farmaceutice și cosmetice. În prezent, câteva dintre
vitamine sunt produse exclusiv prin sinteză chimică, în timp ce altele sunt produse fie prin
sinteză chimică, fie prin procese de extracție. Aceste procese sunt consumatoare de energie și, de
asemenea, suferă de costuri ridicate de eliminare a deșeurilor. În plus, aceste procese au o
conștiință crescândă a consumatorilor cu privire la siguranța aditivilor alimentari. Acest lucru a
condus la creșterea interesului pentru înlocuirea acestor procese cu procese biotehnologice. În
consecință, procesele biotehnologice pentru producerea majorității acestor compuși apar rapid și
unele sunt deja în competiție cu procesele chimice existente. O listă de vitamine produse prin
metode biotehnologice este rezumată în Tabelul 1.
Tabel 1. Vitamine produse prin metode biotehnologice
Metode biotehnologice
Vitamine
Enzima/microorganismul utilizat Metoda
Vitamine liposolubile
Vitamina E (a- Microalge de apă dulce Euglena Producția fermentativă din
tocoferol) gracilis glucoză
Vitamina K2 Tulpina mutată de Bacillus subtilis Fermentare cu extract de soia

Vitamine solubile în apă

Acid ascorbic Reductaza acidului 2,5-diceto-D-
(vitamina C) gluconic Cynobacterium sp.
Biotina Fermentare (Serratia marcescens)
Sistem enzimatic multiplu
(Bacillus sphaericus)
Riboflavina Fermentație (Eremothecium
ashbyii, Ashbya gossypii, Bacillus
sp., etc.)
Vitamina B12 Fermentare (Propionibacterium
shermanii, Pseudomonas
denitrificans)
Proces fermentativ la acid 2-
ceto-L-gulonic urmat de
conversie chimică în acid L-
ascorbic
Producția fermentativă din
glucoză de către bacterii
modificate genetic
Conversia din acid
diaminopimelic folosind
sistemul enzimatic biosintetic
al mutantului (Bacillus
sphaericus)
Producția fermentativă din
glucoză
Producția fermentativă din
glucoză
 II. TRECEREA DE LA TEHNOLOGIA DE EXTRACȚIE LA
SINTEZA CHIMICĂ LA PROCESELE BAZATE PE
BIOTEHNOLOGIE INDUSTRIALĂ
Până în urmă cu câteva decenii, majoritatea vitaminelor adăugate și compușii sănătății
înrudiți erau într-adevăr preparați industrial prin tehnologii de extracție. Concentratele sau
extractele derivate din produse alimentare de bază naturale bogate în vitamine sau colorate (de
origine vegetală, animală sau microbiană), însă, își găsesc acum relativ puțină utilizare în
sectorul alimentar, al furajelor, farmaceutic sau cosmetic. Pe lângă prețul lor ridicat, câteva
dintre motive sunt:
 nivelul de vitamine și compuși ai sănătății înrudiți din sursa naturală de plante/animale
este de obicei relativ scăzut și fluctuează drastic (excepție fac acizii grași esențiali sau
EFA (cunoscuți și sub denumirea de PUFA) din uleiurile vegetale și uleiurile de pește,
vitamina D din uleiurile de pește) .
 prezentarea lor organoleptică și perioada de valabilitate nu sunt adesea optime.
 vitaminele solubile în apă se pierd ușor prin extracția apoasă sau alte manipulări ale
acestor surse naturale de vitamine alimentare
 (pro)vitaminele și compușii sănătății înrudiți sunt molecule labile în timpul procesului de
recoltare, conservare, depozitare (sau în timpul preparării produselor alimentare) și sunt
în general sensibile la pH, căldură (riboflavină sau B 2 , acid D-pantotenic sau B 5 ,
piridoxină). sau B 6 , acid folic sau B 9 , vitamina C, vitamina E), lumină (B 2 , B 6 , B
9 , vitamina B 12 , C, vitamina D), oxigen (B 9 , C, D, acizi grași esențiali sau EFA).
Aceste dezavantaje au condus la fabricarea industrială a majorității vitaminelor și a factorilor
înrudiți pe căi de sinteză chimică sau microbiană. În prezent, mai multe vitamine sunt produse
chimic (provitamina A, colecalciferol sau D 3 , E, vitamina K 1 sau filochinonă și tiamină sau B
1 , B 5 , B 6 , D‐biotină sau B 7 , B 9 ), deși enzimatice , metode microbiologice și/sau
biotehnologice apar sau există, deși nu sunt încă profitabile din punct de vedere economic.
Pentru unele dintre aceste molecule sau precursorii lor, procesele biotehnologice sunt în curs de
dezvoltare, deși într-adevăr nu sunt încă competitive cu sinteza chimică.
Două căi biotehnologice, procesele de fermentație direcționate și biocataliza, preiau treptat
de la sinteza chimică pentru majoritatea acestor molecule complexe din punct de vedere chimic.
Ambele tehnologii au fost inițial adesea salvate numai atunci când procesele chimice nu au reușit
să aibă succes sau au fost neeconomice. În zilele noastre devin adesea tehnologii de primă
alegere din mai multe motive: se bazează pe resurse regenerabile, furnizează molecule simple și
foarte complexe direct într-o formă chirală dezirabilă și într-un mod favorabil din punct de
vedere economic și sunt considerate în societate ca curate, durabile și reutilizate. tehnologii.
Vitaminele și compușii asemănători vitaminelor care sunt produși (exclusiv) prin fermentația
microbiană cu bacterii, drojdii sau ciuperci includ vitamina C, B 2 , B 12 și ergocalciferol sau D
2, EFA, menachinonă sau K 2 , coenzima Q 10 sau ubichinona, pirolchinolină chinină sau PQQ.
Glutationul antioxidant (GSH) este produs în prezent cu drojdiile Saccharomyces cerevisiae sau
Candida utilis, în timp ce suplimentul pentru sănătate acid gamma-aminobutiric (GABA) este
produs pe baza a două ‐etapa bioproces: fermentarea glutamatului cu Corynebacterium și
conversia ulterioară în GABA cu glutamat decarboxilază supraexprimată derivată din bacterii
lactice. Unele molecule pot fi produse printr-o combinație de etape chimice și etape
microbiene/enzimatice (niacină sau B 3 , B 5 , C, L‐carnitină). Unele sunt produse prin cultură
de microalge în iazuri sau vase de fermentare (beta-caroten, EFA).
 III. VITAMINE SOLUBILE ÎN GRĂSIMI
Dintre cele patru vitamine solubile în grăsimi, adică. vitaminele A, D, E și K, s-a obținut
un oarecare succes cu producția biotehnologică de vitamine E și K. Acestea sunt discutate mai
jos:
3.1 Vitamina E (a-tocoferol)
Vitamina E cuprinde un grup de compuși liposolubili, dintre care a-tocoferolul este cel
mai abundent și are cea mai mare activitate antioxidantă in vivo. În natură, numai organismele
fotosintetice sunt capabile să producă a-tocoferol. La om, se crede că a-tocoferolul joacă un rol
major în prevenirea patologiilor induse de lumină ale pielii, ochilor și tulburărilor degenerative,
cum ar fi ateroscleroza, bolile cardiovasculare și cancerul. Aplicarea industrială a a-tocoferolului
include utilizarea sa în conservarea alimentelor, în produse cosmetice și creme solare.
În prezent, a-tocoferolul se obține prin sinteză chimică și prin extracție din uleiuri
vegetale. Extracția din uleiuri nu este eficientă, deoarece acestea conțin de obicei niveluri scăzute
de a-tocoferol. Spre deosebire de alte vitamine, a-tocoferolul sintetic nu este identic cu forma
care apare în natură. Forma sintetică este un amestec de opt stereoizomeri cunoscuți colectiv sub
numele de all-rac-alfa-tocoferol, constând din patru izomeri 2R și patru izomeri 2S. Studiile cu
animale și oameni au demonstrat că izomerii 2R sunt reținuți în mod preferabil; prin urmare,
atunci când este administrat în cantități egale, biodisponibilitatea naturală față de a-tocoferol
sintetic este de 2:1. Mai mult, conștientizarea crescândă a consumatorilor cu privire la siguranța
aditivilor alimentari a dus la un interes sporit pentru înlocuirea antioxidantului sintetic cu unul
natural, ceea ce, la rândul său, a încurajat cercetarea asupra surselor alternative de antioxidant
natural, inclusiv a-tocoferol.
Mai multe tulpini de microalge de apă dulce Euglena gracilis Z. și microalge marine
Dunaliella tertiolecta produc a-tocoferol în concentrații mai mari decât alimentele convenționale
considerate în mod tradițional surse bogate de vitamină. Studiile de optimizare pentru producția
de a-tocoferol au fost făcute cu E. gracilis Z, care a implicat modificarea condițiilor de cultură,
cultura în două etape și screening-ul de substraturi favorabile care sporesc nu numai creșterea, ci
și producția de a-tocoferol. S-a observat că densitatea mare a celulelor a determinat o scădere a
pătrunderii luminii în fiecare celulă, scăzând activitatea fotosintetică. Aceasta, la rândul său, a
scăzut condițiile aerobe și a crescut conținutul de vitamina E. În plus, consumul de oxigen și
glucoză prin respirație ar spori metabolismul heterotrofic. Conținutul de vitamina E al celulelor
de înaltă densitate crescute fotoheterotrofic prin cultură fed-batch a atins 1,21 mg/g masă
celulară uscată.
Producția simultană de cantități mari de b-caroten, vitamina C și vitamina E a fost
demonstrată cu succes și de E. gracilis Z. folosind cultura în două etape. În prima etapă a culturii
discontinue, E. gracilis Z. a fost cultivată fotoheterotrofic în mediu Oda modificat și Hunter
modificat la intensitate ridicată a luminii. Când celulele au atins faza exponențială târzie, au fost
separate, spălate și resuspendate în același volum de mediu Cramer și Mayers (CM) pentru a
doua etapă de cultivare. Culturile în două etape folosind densități celulare mari au dat o
productivitate ridicată a vitaminelor antioxidante.
Carballo-Cardenas și colab. au studiat producția de a-tocoferol cu Dunaliella tertiolecta
și Tetraselmis suecica pentru a evalua efectul disponibilității luminii. S-a observat o relație
inversă între disponibilitatea luminii și conținutul de a-tocoferol al Dunaliella tertiolecta. În plus,
disponibilitatea redusă a luminii nu a limitat a-tocoferolul în Dunaliella tertiolecta și Tetraselmis
suecica. Nu a fost observată nicio corelație între producția de clorofilă-a (Chl-a) și a-tocoferol a
acestor specii. Adăugarea de nitrat și fosfat la o cultură de Tetraselmis suecica a dus la o creștere
a Chl-a și a-tocoferol, demonstrând că compoziția nutrienților poate fi folosită ca instrument
pentru îmbunătățirea productivității a-tocoferolului.
3.2 Menachinona (vitamina K2)
Există două forme naturale de vitamina K, vitamina K1 și K2. Vitamina K1 (filochinona)
este produsă de plante. Vitamina K2 (menachinona, MK) este sintetizată în primul rând de
bacterii și se referă la o serie de naftochinone având un lanț lateral variabil între 4 și 13 unități de
izopren în lungime. Compușii din serie sunt denumiți ca MK-n, unde n denotă numărul de unități
de izopren (Fig. 1).

Fig. 1. Structura menachinonei (MK-n)

Biosinteza MK-7 din calea embden-meyerhof-parnas (EMP), calea pentozei fosfat (PPP),
calea MVA și calea sintezei menadionei (MK)(Fig.2.). Un număr de microorganisme au fost
utilizate pentru a produce MK-7, inclusiv B. subtilis, E. coli , bacterii lactice, Flavobacterium sp.
și B. amyloliquefaciens.
Bacillus subtilis izolat din natto (un aliment tradițional japonez), tulpina găsită în boabele
japoneze fermentate eponime, a fost certificat de FDA ca fiind sigură pentru alimente și are o
capacitate puternică de a produce MK-7. În consecință, B. subtilis natto a fost folosită ca tulpină
părinte pentru a dezvolta unele dintre tulpinile industriale aflate în prezent pe piață. În producția
industrială, bulionul de fermentație B. subtilis natto a fost pulverizat și uscat, iar pulberea uscată
din bulionul de fermentație a fost supusă extracției cu solvent. Extractul obţinut a fost condensat
într-o pastă şi apoi purificat prin cromatografie. Folosind acest proces, randamentul final de MK-
7 poate ajunge la 200–300 mg/L în ciclul de fermentație de 16–24 ore.
Cui et al. (2019) au dezvoltat un sistem bifuncțional de detectare a cvorumului în B.
subtilis 168 pentru a proiecta modulele de sinteză ale MK-7. Tulpina rezultată a fost capabilă să
producă 360 mg/L MK-7 în baloane shak și 200 mg/L MK-7 în bioreactor de 15-L. Recent,
transcriptomica comparativă a arătat că membrana celulară și ingineria transferului de electroni
în B. subtilis pot îmbunătăți sinteza MK-7. Tulpina rezultată a atins un titru de produs de 410
mg/L după 6 zile în cultură în balon agitat, care este cea mai mare valoare raportată până în
prezent. În mediul actual de piață, producția de MK-7 natural all-trans se face prin fermentarea
lichidă a B. subtilis natto, care este sigur, natural și controlabil și ocupă poziția principală pe
piață. În comparație cu trans -MK-7 sintetizat chimic , are un randament mai mare și mai puține
impurități.
3.3 Vitamina D
Vitamina D se referă la un grup de secosteroizi solubili în grăsimi responsabili pentru
creșterea absorbției intestinale a magneziului, calciului și fosfatului și a multor alte efecte
biologice. Cei mai importanți compuși sunt vitamina D 2 (ergocalciferol) și vitamina D 3
(colecalciferol) din vitamina D. Vitamina D poate crește absorbția intestinală de calciu,
magneziu și fosfat și poate preveni multe boli.
Este bine cunoscut faptul că precursorul vitaminei D 2 este ergosterolul. Vitamina D 2
este utilizată pe scară largă în industria medicală, alimentară și în alte industrii. Producția
comercială actuală de ergosterol este produsă în principal prin fermentarea drojdiei. Tan şi colab.
a îmbunătățit producția de ergosterol prin optimizarea mediului de fermentație și prin
screeningul tulpinilor producătoare de ergosterol (Figura 3F). Rezultatele arată că oxigenul
dizolvat (DO) poate fi utilizat ca parametru de control eficient pentru fermentarea în loturi de
drojdie. Randamentul total de ergosterol poate fi crescut la 1,16 g/L atunci când DO a fost
controlat la 12% (±1%) și a fost utilizat lotul alimentat cu impulsuri.
Vitamina D 3 nu poate juca un rol direct la om și animale, dar poate produce forma
fiziologic activă 25-hidroxivitamina D 3 (25-OH-VD 3 ) prin metabolismul hepatic. În prezent,
procesul de producție a 25-OH-VD 3 include în principal sinteza chimică și iradierea luminii.
Etapele reacției chimice sunt greoaie, unii dintre aceștia necesită reactivi cu halogen, iar
racemații sunt generați în timpul reacției, ceea ce îngreunează separarea. Prin urmare, din ce în
ce mai mulți cercetători acordă atenție fermentației 25-OH-VD 3 de către microorganisme.
Tulpinile utilizate în biosinteza microbiană includ în principal Rhodococcus , Streptomyces,
Pseudonocardia sp. și Mycobacterium . Vitamina D 3 hidroxilaza (Vdh) este un fel de
monooxigenază citocrom P450, care poate cataliza hidroxilarea în două etape a vitaminei D 3
(VD 3 ) pentru a produce 25-OH-VD 3 și 1α,25-dihidroxivitamina D 3 . Yasutake și colab.
(2013) au folosit nisina, o peptidă antimicrobiană bioactivă naturală, pentru a trata celulele
Rhodococcus care conțin hidroxilază și au descoperit că 573 mg/L 25-OH-VD 3 pot fi
sintetizate. Deși producția industrială actuală de vitamina D 3 este dominată în principal de
sinteza chimică, metodele de sinteză microbiană sunt mai durabile și nu produc impurități în
timpul procesului de biosinteză, astfel că va avea prioritate în viitoarea producție industrială.
3.4 Vitamina A
Vitamina A include în principal β-caroten, α-caroten și β-criptoxantina. β-carotenul, un
carotenoid de provitamina A, este împărțit în izomeri all- trans și cis. All- trans -β-carotenul este
izomerul major găsit în alimentele vegetale neprocesate bogate în caroten, urmat de izomerii săi
9- și 13- cis . β-carotenul este un antioxidant, care nu numai că inhibă oxigenul singlet, ci și
peroxidarea lipidelor, jucând astfel un rol important în prevenirea bolilor.
Carotenul este produs în principal de ciuperci, unele bacterii și alge. De exemplu, Yoon și
colab. a crescut furnizarea de IPP (izopentenil difosfat) și DMAPP (dimetilalil difosfat) prin
introducerea căii străine MVA (mevalonat) (Figura 2D), crescând astfel producția de carotenoizi.
E. coli final conceput cu o cale întreagă MVA și genă de sinteză a β-carotenului poate produce β-
caroten de 465 mg/L (Figura 2C). Adenozin-trifosfatul (ATP) și nicotinamida adenina
dinucleotidă fosfa (NADPH) sunt doi cofactori importanți în calea de biosinteză a β-carotenului.
Zhao și colab. (2013) au folosit E. coli ca celule gazdă, au construit și optimizat un modul
metabolic central pentru a crește furnizarea de ATP și NADPH în calea de sinteză a β-
carotenului, îmbunătățind astfel randamentul β-carotenului. În cele din urmă, cea mai bună
tulpină CAR005 a crescut producția de β-caroten la 2,1 g/L, cu un randament de 60 mg/g DCW
în fermentația în lot. Larroude şi colab. (2018) a supraexprimat caroten sintetaza heterologă (Crt)
în Yarrowia lipolytica pentru a-l face să producă β-caroten ridicat. Randamentul de fermentație
al tulpinii modificate obținut prin selectarea celui mai bun promotor a fost de 1,5 g/L. Prin
optimizarea condițiilor de fermentație și utilizarea fermentației în lot, randamentul de β-caroten a
crescut și mai mult titrul de producție de 6,5 g/L și 90 mg/g DCW. Cu toate acestea, numărul
insuficient de precursori a împiedicat serios procesul de industrializare a β-carotenului în
procesul de sinteză a β-carotenului în viitor.

Fig.2. Calea rețelei metabolice a vitaminei A/D/E și a vitaminei K. (A) Calea MEP. Dxs, 1-deoxi-
d -xiluloz-5-fosfat sintază; Dxr, 1-deoxi- d -xiluloz-5-fosfat reductoizomeraza; IspD, 2- C -metil- d-
eritritol 4-fosfat citidililtransferaza; IspE, 4-difosfocitidil-2- C -metil- d- eritritol kinaza; IspF, 2- C -
metil- d- eritritol 2,4-ciclodifosfat sintază; IspG, 1-hidroxi-2-metil-2-( E )-butenil 4-difosfat sintază; IspH,
4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfat reductază; (B)calea de biosinteză a α-tocoferolului. Idi, izopentenil
difosfat izomeraza; IspA, geraniltransferaza; CrtE, GGPP sintetaza; hpt, hipoxantin
fosforiboziltransferaza; y-Tmt, y-tocoferol metil-transferaza; Mt, metil-transferaza. (C) Calea de
biosinteză a β-carotenului. CrtB, fitoen sintază; Crtl, fitoen desaturaza; CrtY, licopen ciclază. (D) Calea
MVA. MvaS, HMG-CoA sintetaza; MvaA, HMG-CoA reductază; MvaK1, mevalonat kinaza; MvaK2,
fosfomevalonat kinaza; MvaD, difosfomevalonat decarboxilază; (E) Menachinona- n calea de biosinteză.
HepS/HepT, heptaprenil difosfat sintază componentă I/II; MenF, izocorismat sintetaza; MenD, 2-succinil-
5-enolpiruvil-6-hidroxi-3-ciclohexen-1-carboxilat sintază; MenH, demetilmenachinona metiltransferaza;
MenC, o- succinilbenzoat sintetaza; MenE, o - succinilbenzoat -CoA ligaza; MenB, 1,4-dihidroxi-2-
naftoil-CoA sintetaza; MenA, 1,4-dihidroxi-2-naftoat heptapreniltransferaza; MenG, demetilmenachinona
metiltransferaza. (F) Calea de biosinteză a ergosterolului.

IV. VITAMINE SOLUBILE ÎN APĂ

4.1 Vitaminele B
Cererea globală de vitamine B este în creștere datorită aplicațiilor largi în alimente,
produse farmaceutice, furaje și alte domenii. Deși majoritatea vitaminelor sunt produse prin
sinteză chimică, au fost stabilite bioprocese industriale de succes pentru producerea VB 2 și VB
12 . Realizarea extraordinară subiacentă în ingineria metabolică este discutată în acest articol.
4.1.1 Vitamina B1
Vitamina B 1 , care este cunoscută și sub numele de tiamină, a fost prima vitamina B care
a fost identificată. Pirofosfatul de tiamină (TPP), forma activă a tiaminei, poate inhiba activitatea
colinesterazei, poate reduce inflamația pielii, poate preveni dermatita seboreică sau eczema și
poate îmbunătăți sănătatea pielii. Biosinteza tiaminei rezultă din cuplarea pirimidinei și a
radicalilor tiazol pentru a forma fosfat de tiamină. Escherichia coli, Salmonella typhimurium și
Bacillus subtilis sunt cele mai amănunțite organisme de producție de tiamină studiate.
În celula de șasiu S. typhimurium , porțiunea tiamină pirimidină poate fi produsă prin
biosinteza purinei de novo sau independent de gena purF prin calea alternativă de biosinteză a
pirimidinei (APB) . Conform caracteristicilor fenotipice ale mutantului abpA , studiile ulterioare
au concluzionat că calea funcțională APB este esențială pentru sinteza tiaminei atunci când S.
typhimurium crește în prezența purinelor exogene. Cercetările au arătat că supraexprimarea
thiA , nmtA și thiPîn Aspergillus oryzae poate crește de patru ori randamentul de vitamina B 1
comparativ cu cel sălbatic. Pe baza mecanismului riboswitch, în B. subtilis TH95 au fost
introduse mutații în genele activității tiamin- pirofosfat kinazei ( thN ) și proteinelor de transport
legate de tiamină (YkoD și YuaJ) . S-a raportat recent că biosinteza tiaminei este strict
reglementată de riboswitches TPP în bacterii/eucariote și represori transcripționali în arhee. E.
coli apărut ca fabrica de celule preferată pentru producția de TPP după ce biosenzorii bazați pe
riboswitch au permis descoperirea transportatorilor de tiamină, combinați cu supraexprimarea
genelor native thiFSGHCE și thiD , care sunt strâns legate de metabolismul Fe-S (Figura 3A).

Fig.3. Calea rețelei metabolice a vitaminelor B. (A) Calea de biosinteză a tiaminei în E. coli .
ThiC/ThiD, fosfometilpirimidin sintază; ThiE, tiamin-fosfat pirofosforilază; ThiL, tiamin-monofosfat
kinaza. (B) Calea de biosinteză a riboflavinei în B. subtilis . RibA, GTP ciclohidrolază II; RibB, 3,4-
dihidroxi 2-butanonă 4-fosfat sintază; RibD, diaminohidroxifosforibosilaminopirimidină deaminază;
RibH, 6,7-dimetil-8-ribitylumazin sintază. RibF, FMN adenililtransferaza; RibC, riboflavin sintază. (C)
Vitamina B 9 cale de biosinteză în B. subtilis. AroH, corismat mutaza; FolE, GTP ciclohidrolază IA;
NudB, dihidroneopterin trifosfat difosfatază; FolB, 7,8-dihidroneopterin aldolază/epimerază/oxigenază;
FolK, 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetildihidropteridin difosfokinază; DfrB, dihidrofolat reductază. (D)
Vitamina B 3 cale de biosinteză în E. coli . NadB, l- aspartat oxidază; NadA, chinolinat sintază; NadC,
nicotinat-nucleotidă pirofosforilază; NadD, nicotinat-nucleotid adenililtransferaza; NadE/NadF, NAD +
sintetaza. (E) Calea de biosinteză de novo a vitaminei B 6. PdxB, eritronat-4-fosfat dehidrogenază; SerC,
fosfoserină aminotransferaza; PdxA, 4-hidroxitreonin-4-fosfat dehidrogenază; PdxJ, piridoxină 5-fosfat
sintază; Dxs, 1-deoxi- d -xiluloz-5-fosfat sintază. (F) Pathway pentru novo sinteza de vitamina B 5 .
ilvBHCD , a crescut nivelurile de transcripție ale genelor ilv ; panDBEC , gene biosintetice de pantotenat.
(G) Calea de biosinteză a vitaminei B 7 în E. coli . BioC, malonil-CoA O-metiltransferaza; BioH,
pimeloil-[acil-proteină purtătoare] ester metilic esterază; BioF, 8-amino-7-oxononanoat sintază; BioA, 8-
amino-7-oxononanoat aminotransferaza; BioD, detiobiotin sintetaza; BioB, biotin sintază; FabD, S-
maloniltransferaza; FabG, 3-oxoacil-(proteină purtătoare acil) reductază; FabA, 3-hidroxiacil-(proteină
purtătoare acil) deshidratază; FabF, 3-oxoacil-(acil-purtător-proteină) sintaza II; FabI, enoil-(proteină
 purtătoare acil) reductază I. (H) Calea aerobă în calea de sinteză a cobalaminei. HemA, glutamil-ARNt
reductază; ALA, 5-aminolevulinat; HemB, porfobilinogen sintetaza; HemC, hidroximetilbilan sintază;
HemD, uroporfirinogen-III sintază; CobA, uroporfirina-III C-metiltransferaza; Cobl, precorin-2C(20)-
metiltransferaza; CobG, precorrin-3B sintetaza; CobJ, precorin-3B C17-metiltransferaza; CobF,
precorrin-6A sintetaza; CobK, precorin-6A/cobalt-precorin-6A reductază; CobL, precorrin-6B
metiltransferaza; CobH, precorin-8X/cobalt-precorin-8 metilmutază; CobB, acid cobirinic a,c-diamid
sintaza; cobNST, acid hidrogenobirinic-a,c-diamidă:cobalt-cobalt-ligază; CobR, acid cob(II)irinic a,c-
diamid reductază; CobO/CobP, adenoziltransferaza corinoidă; CobQ, sintaza acidului adenozilcobiric;
CobS/CobV, adenozilcobinamidă-GDP ribazoltransferaza; CobC, proteina de biosinteză a cobalaminei;
CobD, adenozilcobinamidă-fosfat sintază; CobU/CobT, nicotinat-nucleotide-dimetilbenzimidazol
fosforiboziltransferaza.

Tabel.2.Vitamine solubile în apă produse prin metode biotehnologice.

Vitamine Tulpini Metoda biotehnologică Mediu și Randamen

precursor t

Vitamina B 1 B. subtilis TH95 Mutația genei care codifică activitatea MM 1,27 mg/L
tiamin- pirofosfat kinazei (thiN) și a
proteinei de transport legate de tiamină
(ykoD și yuaJ).

E. coli biosenzor TPP (plasmida pTPP_Bios); MM 0,80 mg/L

Supraexprimarea thiFSGH nativă; thiC;
acesta; și al treilea; Cuplaje genetico-
metabolice.

A. oryzae Supraexprimarea thiP, thiA și nmtA. CD-Dex 4 ori > WT

mediu (5%
dextrină)

Vitamina B 2 B. subtilis Scăderea activității flavinazei RibCF; MM >26 g/L

Supraexprimarea genelor biosintetice ale
riboflavinei; a îmbunătățit sinteza
purinelor de novo și aportul de pentoză.

A. gossypii A introdus gena icl; Supraexprimarea YPD; Ulei >20 g/L

genelor gly1, prs2,4 și prs3; S-au vegetal
eliminate genele vma4, shm2 și bas1.

Candida famata Mutageneză convențională prin YPD; Fluorof 1026 ± 50

supraexprimarea sef1 și imh3. enilalanina mg/L

Vitamina B 3 Drojdie Eliminați importatorul NR Nrt1 în 2x YPD; 8 mg/L

genotipul NR-non-salvaging nrkl, urhl, Acid
pmpl (tulpina PAB038). nicotinic

E. coli Exprimând R. nitril hidrază hodocroasă. LB mediu; 508 g/L

2YT mediu

Vitamina B 5 C. glutamicum Eliminarea Ilva genei și supraexprimarea MM 1000 mg/L

ilvBNCD și panBC gene

B. subtilis Supraexprimarea ilvBHCD și panBCDE; MM 82–86 g/L

 Supraexprimarea SerA și GlyA a
enzimelor ciclului de scindare a glicinei.

Vitamina B 6 E. coli Supraexprimarea enzimelor native Epd, MM 78 mg/L

PdxJ și Dxs

S. meliloti Supraexprimarea E. coli Epd și a enzimei MM 1,30 g/L

IFO14782 native PdxJ.

B. subtilis Supraexprimarea enzimelor E. coli PdxA MM 65 mg/L

și S. meliloti PdxJ.

Vitamina B 7 Agrobacterium/ Supraexprimarea unui operon puternic de MM; 110 mg/L
Rhizobium HK4 biotină din E. coli; Utilizarea unui Betaină;
puternic promotor artificial de tac și Acidul
introducerea unui RBS modificat în fața diaminonona
BioB. noic

E. coli Supraexprimarea operonului biotinic nativ MM; H- 11 mg/L

dintr-o plasmidă cu număr mare de copii mediu

B. subtilis Supraexprimarea operonului biotinic nativ MM 21 mg/L

și selecția pe S-2-aminoetil-l-cisteină.

Vitamina B 9 A. gossypii Supraexprimarea genelor FOL și ștergerea Mediu bogat 7 mg/L
(ATCC 10895) AgMEY7; Ștergerea AgADE12 și în MA2
AgRIB1 în același timp.

Vitamina S. meliloti Screeningul cu randament ridicat al MM; clorură 156 ± 4,20

B 12 (MC5-2) mutanților folosind iradierea riboswitch de cobalt; mg/L
ARTP a fost utilizat pentru a induce DMBI
mutații aleatorii; Ștergerea cobI;
Supraexprimarea hemE.

P. denitrificans Mutageneză aleatorie și inginerie genetică; Betaină; 214,30

Supraexprimarea grupului de gene cobF- melasa de mg/L
cobM și a genelor cogA și cobE; sfecla;
Optimizați cel mai bun interval de pH; Clorura de
Optimizați promotorii. colina

E. coli Au exprimat heterolog genele hemO, CM mediu 0,67 mg/L

hemB, hemC și hemD etc.; Optimizarea
conditiilor de fermentatie.

Propionibacteri Supraexprimarea genelor biosintetice. MM; DMBI 206 mg/L

um shermanii

Vitamina C S. cerevisiae şi Supraexprimarea d-arabinono-1,4-lactona MM 100 mg/L

Zygosaccharom oxidaza endogene și l-galactoza
yces bailii dehidrogenazei (supraexprimarea lgdh și
alo1).

K. vulgare DSM Oxidare și lactonizare. L/D-sorboză; 1,37 g/L

4025 glicerol;
 Drojdie de
brutărie

X. campestris Lactonarea sub stres oxidativ; Sinteza MM; 20,40 g/L

2286 directa a glucozei (sursa de carbohidrati) K2HPO4;
indusa de radicalii liberi (tratament Uree
HOCL).

G. oxydans și K. Interacțiunea celulă-celulă; Fermentare cu d-sorbitol 73,70 g/L

vulgare și B. o etapă 2-KGA. (2-KGA)
endophyticus

MM, media minimă. CM, mediu complet. YPD, extract de drojdie peptonă dextroză. Mediu LB, mediu
Luria-Bertani. Mediu 2YT, extract de drojdie și triptonă. CM mediu, Cramer-Myers mediu. DMBI, 5,6-
dimetilbenzimidazol. YD, extract de drojdie și glucoză. MYGP, extract de malț, extract de drojdie, peptonă, agar și
dextroză.

Cu toate acestea, thiC/thiH din calea biosintetică a tiaminei este implicat în metabolismul
Fe-S și este inhibat de metaboliții S- adenosilmetioninei (SAM) și activitatea catalitică a enzimei
ThiC (Figura 4) este foarte scăzută ( k cat = 0,002 s –1 ), ceea ce este unul dintre principalele
blocaje metabolice. În plus, costul de producție chimică a tiaminei este foarte scăzut, iar
producția de tulpini artificiale trebuie crescută pentru a fi de așteptat să fie industrializată.

Fig.4. Calea de producere a acidului l- ascorbic. (A) Procesul Reichstein clasic: procesul
Reichstein în șapte etape care implică șase transformări chimice și o fermentație de către Gluconobacter
oxydans. (B) Fermentarea în două etape cu bacterii mixte: G. oxydans, Bacillus megaterium și
Ketogulonicigenium vulgare; (C) Calea acidului 2,5-diceto- d- gluconic: fermentații mixte sau în două
etape cu Erwinia sp. și Corynebacterium sp. sau alte specii pentru sinteza directă a 2-KLG.

4.1.2 Vitamina B2
Riboflavina este un precursor important al mononucleotidei de flavină (FMN) și al
dinucleotidei flavină adenină (FAD). Insuficiența de riboflavină se manifestă ca anemie
persistentă. Biosinteza riboflavinei începe cu guanozin trifosfat și riboză-5-fosfat, urmate de șase
etape enzimatice. Burgess și colab. (2004) au descoperit că supraexprimarea genelor ribABCGH
poate crește producția de riboflavină. Mai târziu, s-a constatat că au existat atât substituții de
nucleotide, cât și deleții în regiunea de reglare a operonului coastei . Prin dereglarea coasteicalea
operonului și purinelor a B. subtilis, producția de riboflavină a fost mult îmbunătățită. Etapele
specifice de inginerie genetică au inclus supraexprimarea genei ribA și ștergerea genei purR ,
după care producția maximă de riboflavină a ajuns la mai mult de 826,52 mg/L (Figura 3B). În
Candida famata, supraexprimarea sef1 și imh3 a fost combinată cu metode clasice de
mutageneză pentru a construi tulpina AF-4, producătoare de riboflavină ridicată. Ca rezultat,
1026 ± 50 mg/L de riboflavină pot fi produse în timpul unei cultivări fed-batch într-un
fermentator la scară de laborator. Această cercetare a avut o mare contribuție la producția
industrială de riboflavină. Cei mai importanți doi producători industriali sunt Ashbya gossypii și
B. subtilis.
La A. gossypii, malat sintetaza din ciclul glioxilatului este esențială pentru producția de
riboflavină. Deleția genei malat sintetazei (ACR268C) a scăzut producția de riboflavină de 10 ori
în comparație cu tulpina de tip sălbatic. În schimb, supraexprimarea genei ACR286C a crescut
semnificativ randamentul de riboflavină cu 70%. Aceste rezultate au demonstrat că malat sintaza
este o nouă țintă pentru îmbunătățirea producției de riboflavină. Abbas și Sibirny (2011) au
introdus gena icl , au supraexprimat genele gly1 , prs2,4 și prs3 , precum și au eliminat
vma4 ,genele shm2 și bas1 , rezultând o producție de riboflavină de peste 20 g/L.
În B. subtilis, Schwechheimer și colab. (2016) au supraexprimat genele de biosinteză a
riboflavinei, au scăzut activitatea flavin kinazei RibCF și au îmbunătățit sinteza purinelor de
novo și furnizarea de pentoză, după care randamentul de riboflavină a ajuns la mai mult de 26
g/L. În prezent, blocajul producției de riboflavină se datorează în principal stabilității genetice
slabe a tulpinii modificate și mai multor produse secundare produse prin fermentație, care
limitează randamentul ridicat de riboflavină.
4.1.3 Vitamina B3
Niacina este precursorul în sinteza coenzimelor piridinice NAD (nicotinamidă adenin
dinucleotide) și NADP (nicotinamidă adenin dinucleotide fosfat). Se găsește în concentrații
relativ mari în organele interne ale animalelor, țesuturile musculare și fructele. În prezent,
niacina este utilizată în principal ca aditiv pentru hrana pentru a crește utilizarea proteinelor
furajere sau ca intermediar farmaceutic în sinteza diferitelor medicamente. Până în prezent, nu
există o descriere sistematică a unui proces comercial de fermentare a acidului nicotinic (NA)
sau a nicotinamidei (NAM). Metodele de producție industrială sunt în principal oxidarea
amoniacului și oxidarea electrolitică, dar prima are costuri de producție ridicate și trebuie să fie
peste 300 ° C în timpul reacției, iar cea din urmă are costuri scăzute de producție, cu toate
acestea, eficiența electrolizei nu este mare, ceea ce limitează producția industrială de niacină.
Rapoartele recente descriu utilizarea recombinate E. coli care exprimă Rhodococcus
rhodochrous nitrilază pentru vitamina B 3 producție. La o densitate celulară scăzută,
nicotinamida a fost produsă în modul alimentat în lot, iar concentrația produsului a atins 390 g/L.
După cultură de mare densitate în bioreactor de 5 L, concentrația de nicotinamidă a ajuns la 508
g/L în 60 min (Figura 3D). Belenky și colab. (2011) au arătat că întreruperea nrt1 are ca rezultat
creșterea exportului de nicotinamidă ribozidă (NR). Mai mult, întreruperea transportorului de
niacină Tna1 poate crește, de asemenea, producția de niacină, dezvăluind faptul că celulele
reglează procesul metabolic NAD + intracelular prin echilibrarea transportului niacinei,
precursorul NAD + . Pe baza adăugării a 5 mM de niacină, celulele de drojdie pot produce 8
mg/L mononucleotidă de nicotinamidă.
 4.1.4 Vitamina B5
Vitamina B 5 , cunoscută și sub denumirea de acid pantotenic, este compusă din acid
pantoic și β-alanină (β-Ala), care este un precursor al coenzimei A. Joacă un rol important în
menținerea sănătății pielii și a sângelui. Funcția sa generală este de a participa la producerea de
energie în organism, dar poate controla și metabolismul grăsimilor și este, de asemenea, un
nutrient esențial pentru creier și nervi. Există metode de sinteză chimică și microbiană pentru
sinteza acidului pantotenic, prin care metodele microbiene pot fi utilizate pentru a sintetiza direct
acid d- pantotenic optic pur .
Sahm și Eggeling (1999) a adoptat o serie de metode pentru a crește producția de acid
pantotenic, inclusiv eliminarea Ilva genei și supraexprimarea ilvBNCD și panBC genelor.
Producția de acid pantotenic a celei mai bune tulpini a atins 1000 mg/L (Figura 3F). Huser și
colab. (2005) au folosit și Corynebacterium glutamicum pentru a produce acid pantotenic. Ei au
șters gena ilvA , au inhibat expresia genei ilvE și au supraexprimat gena ilvBNCD . Titrul final
de pantotenat a ajuns la 1,75 g/L. Studiile au arătat că activitatea specifică a acidului pantotenic
sintaza PanC a C. glutamicum este de 205,10 U/mg. Adăugarea de substraturi ( acid d-
pantotenic și β-Ala) la E. coli care conţine enzima poate fi produsă 97,10 U/mg în 32 de ore, rata
de conversie a acidului pantotenic a fost de 99,10%. Cu toate acestea, lucrarea raportată a avut
defecte de producție, care au necesitat adăugarea unui substrat exogen de acid pantotenic, iar
prețul de piață ridicat al acidului pantotenic a restricționat serios industrializarea acestei metode.
Un alt organism de șasiu care este folosit în mod obișnuit pentru a produce acid pantotenic este
B. subtilis. Hohmann şi colab. (2016) au clarificat cea mai mare producție de acid pantotenic prin
supraexprimarea ilvBHCD , panBCDE , serA și glyA, precum și enzimele ciclului de scindare a
glicinei scopul este de a crește numărul de precursori pentru sinteza acidului pantotenic (Figura
3F). Producția maximă a celei mai bune tulpini a atins 82–86 g/L în timpul unei fermentații de
48 de ore, deschizând un nou capitol al producției de vitamine în lumea biologică.
4.1.5 Vitamina B6
Există șase forme de vitamina B 6 , inclusiv piridoxina (PN), piridoxal (PL) și
piridoxamina (PM), precum și derivații lor respectivi fosfat. Este o vitamina solubila in apa, care
exista sub forma de fosfat in organism. Cea mai versatilă formă de vitamina B 6 este piridoxal
5′-fosfat (PLP), care este un cofactor al multor proteine și enzime din toate organismele. Ca
formă comercială cea mai răspândită, clorhidratul PN este utilizat pe scară largă în industria
farmaceutică și alimentară.
Au fost raportate două căi de sinteză de novo, calea dependentă de 1-deoxixiluloză 5-
fosfat (DXP) și calea independentă de DXP. Din studiile de screening pe scară largă ale
diferitelor tulpini, s-a constatat că bacteria Gram-negativă Sinorhizobium meliloti este cel mai
bun producător de vitamina B 6 , atingând un titru de 103 mg/L de izoforme B 6 în 168 de ore.
Producția de vitamina B 6 a fost crescută în continuare la 1,30 g/L prin exprimarea genei E. coli
epd și a genei native dxs în acest tren S. meliloti (Figura 3E). E. coli și B. subtilis au fost, de
asemenea, concepute pentru a produce vitamina B 6 . Vitamina B 6 Producția a fost îmbunătățită
la 78 mg / l în termen de 31 de ore de la E. coli și B. subtilis a produs 65 mg / l de PN atunci
când sunt alimentate cu precursorul 4-hidroxi- l treonină (4HT). În prezent, industria adoptă în
principal metoda oxazolului pentru a produce vitamina B 6 , iar cercetările actuale se
concentrează, de asemenea, pe îmbunătățirea procesului de sinteză a metodei oxazolului. În
procesul de biosinteză, activitatea enzimei PdxJ este foarte scăzută ( k cat= 0,07 s –1 ), iar etapa
de reacție catalizată de această enzimă este etapa de limitare a vitezei în calea de biosinteză VB
6. Metabolitul intermediar 4-fosfat hidroxi-treonina (4HTP) este citotoxic și este, de asemenea,
principalul blocaj al biosintezei. Prin urmare, producția fermentativă a vitaminei B 6 necesită
mai mult efort pentru a satisface cererea comercială.
4.1.6 Vitamina B7
Biotina este indispensabilă pentru metabolismul normal al grăsimilor și proteinelor. Este
un nutrient necesar pentru creșterea, dezvoltarea și funcționarea normală a omului. Biotina se
combină cu enzimele pentru a participa la procesul de fixare și carboxilare a dioxidului de
carbon în organism. Producția actuală la scară largă de d- biotină se bazează în principal pe ruta
sintetică Sternbach, iar metoda de producție industrială actuală a fost îmbunătățită pe această
bază. Cu excepția cazului în care metodele de biosinteză pot obține un randament ridicat la
costuri reduse, este dificil să se zguduie poziția tehnologiei de sinteză chimică în producția
industrială. Cu toate acestea, sa raportat recent că unele microorganisme pot produce în exces
biotină, care a fost elaborată în C. glutamicum, Mesorhizobium loti și S. meliloti .
În Agrobacterium și Rhizobium HK40, supraexprimarea operonului de biotină din E. coli
condusă de puternicul promotor tac și introducerea unui RBS modificat în fața bioB a dus la un
randament de biotină de 110 mg/L (Figura 3G). Dacă operonul biotinic nativ este supraexprimat
în B. subtilis, majoritatea enzimelor vor fi puternic inhibate de produsul secundar al SAM. Cu
toate acestea, cererea mare de SAM de către biotin sintaza și 7,8-diaminononanoat sintaza este
încă un blocaj care trebuie abordat în cercetările viitoare. Dacă lizină este furnizată lui B. subtilis,
BioK va folosi lizina ca donator de amino al precursorului de biotină pentru a promova producția
de precursor de biotină (biotina de defosforizare), iar procesul de fermentație a folosit condiții de
creștere alimentată cu conținut limitat de carbon, cu control computerizat al concentrațiilor de
oxigen dizolvat, dar titrul maxim poate atinge doar 21 mg/L biotină. Prin urmare, îmbunătățirea
mecanismului catalitic al biotinei sintetazei este, de asemenea, o provocare pentru cercetările
viitoare.
4.1.7 Vitamina B9
Acidul folic natural se găsește mai ales sub formă de acid poliglutamic, iar forma biologic
activă a acidului folic este tetrahidrofolatul. Deficiența poate duce la scăderea conținutului de
hemoglobină în celulele roșii din sânge, la afectarea maturării celulelor și la anemie
megaloblastică. B. subtilis sau A. gossypii au fost concepute cu succes pentru a produce acid
folic.
Jagerstad și Jastrebova (2013) au obținut un titru de 5-metiltetrahidrofolat (THF) de 0,95
mg/L prin creșterea aportului de substanțe precursoare și blocarea căii catabolice a THF în B.
subtilis. Odată cu progresul continuu al cercetării, A. gossypii a atras un interes din ce în ce mai
mare ca tulpină de șasiu pentru producția de acid folic. A. gossypii poate sintetiza 0,04 mg/L de
acid folic în mod natural, care poate ajunge la 6,59 mg/L după tratamentul de inginerie
metabolică. Aceasta este, de asemenea, cea mai mare valoare a producției raportată până în
prezent (Figura 3C). Deoarece sinteza chimică comercială a acidului folic este ieftină, cu
excepția cazului în care partea neprietenoasă a mediului a procesului de sinteză chimică este
restricționată, mai este un drum lung de parcurs pentru fermentarea acestui produs.
4.1.8 Vitamina B12
Cobalamina este singura vitamina care contine elemente metalice. Cobalamina este
termenul general pentru o clasă de compuși corină care conțin cobalt. Este cea mai mare și mai
complexă moleculă de vitamine descoperită până acum. Deficiența de vitamina B 12 duce la
creșterea formării sideroblastelor inelare în sindroamele pre-mielodisplazice.
 Vitamina B 12 este sintetizată de microorganisme prin sinteza de novo sau prin sinteza de
salvare în natură, dar animalele și plantele superioare nu o pot produce (Figura 3H). Deși în
secolul al XIX-lea, cercetătorii au finalizat sinteza chimică completă a vitaminei B 12 , metoda
de sinteză chimică este prea complicată și costisitoare, așa că marii furnizori ai lumii se bazează
pe fermentația microbiană pentru a produce vitamine. Pseudomonas denitrificans și
Propionibacterium freudenreichii fiind utilizate pe scară largă în fermentația industrială pentru a
produce vitamina B 12 . Pentru a îmbunătăți productivitatea vitaminei B 12 , cercetătorii au
adoptat o metodă aleatorie de mutageneză pentru a construi tulpini supraproducătoare de
vitamina B 12 prin razele ultraviolete, nitrozoguanidină (NTG), nitrometiluretan și etilenimină.
S- a raportat că Propionibacterium shermanii produce vitamina B 12 cu un titru maxim de 200
mg/L ( Sych et al., 2016 ). Cu toate acestea, aerob P. denitrificans rămâne cea mai utilizată
gazdă industrială, iar efectul este evident. Mai mult, P. denitrificans are o capacitate de producție
mai mare decât tulpina anaerobă care produce vitamina B 12 și este utilizată pe scară largă în
producția industrială. Xia și colab. (2015) au crescut producția de vitamina B 12la 198 ± 4,60
mg/L prin optimizarea mediului de fermentație folosind metoda suprafeței de răspuns. Grupul
nostru de cercetare a folosit tulpina de E. coli MG1655 (DE3) ca tulpină inițială pentru a realiza
sinteza de novo a vitaminei B 12. Cai și colab. (2018) au folosit ulterior elemente riboswitch în
S. meliloti pentru prima dată și au dezvoltat cu succes un sistem de screening de mare randament
prin citometrie în flux pentru tulpinile VB 12 cu randament ridicat . Titrul de vitamina B 12 al
celei mai bune tulpini, S. meliloti MC5–2, a ajuns la 156 ± 4,20 mg/L, dar randamentul a fost
încă relativ scăzut. În același timp, ei au subliniat, de asemenea, că titrul de vitamina B12
depinde în mare măsură de compoziția mediului.
4.2 Vitamina C
Vitamina C, cunoscută și ca acid l- ascorbic (LAA), este un cofactor important pentru
reacțiile enzimatice multiple din organism. Poate acționa ca un antioxidant pentru a elimina
radicalii liberi și a reduce stresul oxidativ, astfel încât o piață în expansiune rapidă este aplicarea
LAA ca aditiv la produsele cosmetice. Deficitul de vitamina C poate duce la scorbut. Recent,
cercetătorii au folosit metode biochimice combinate cu tehnologia de recombinare a ADN-ului
pentru a produce vitamina C.
În prezent, L-AA este fabricat comercial prin procesul clasic Reichstein în șapte etape
folosind d- glucoză ca substrat inițial. Procesul implică șase etape chimice și una de fermentație
pentru oxidarea D-sorbitolului la acid 2-ceto- l- gulonic (2-KGA) de către Gluconobacter
oxydans și Bacillus megaterium (Figura 4A). Sugisawa et al. (2005) au raportat pentru prima
dată că Ketogulonigenium vulgare DSM 4025 poate produce 1,37 g/L de L-AA în condiții de
cultură statică. Kim şi colab. au raportat că enzimele respective din Candida albicans și S.
cerevisiae convertesc nu numai d- arabinoza în d -arabinono-1,4-lactonă, ci și l- galactoza în l -
galactono-1,4-lactonă in vitro. . Experimentele au arătat că celulele de drojdie în devenire
supraexprimă d -arabinono-1,4-lactona oxidaza endogene și l.-galactoza dehidrogenaza poate
produce aproximativ 100 mg/L acid l- ascorbic. Un consorțiu microbiologic compus din G.
oxydans , K. vulgare și B. endophyticus a fost construit pentru a produce 2-KGA și s-a obținut un
randament final de 73,70 g/L în 30 de ore (Figura 4B). Acest rezultat este promițător pentru
construirea unei fabrici de celule microbiene pentru producția de vitamina C. Cu toate acestea, sa
raportat că fermentația cu bacterii mixte poate fi instabilă din cauza competiției dintre tulpinile
individuale pentru nutrienți și alți factori. Prin urmare, tehnologia de fermentație cu bacterii
mixte are o stabilitate slabă și o eficiență scăzută, ceea ce împiedică, de asemenea, ritmul
producției industriale a vitaminei C. Cu toate acestea, se așteaptă ca fermentația să devină
modalitatea principală de producere a vitaminei C în viitor, dacă pot fi utilizate tulpini unice
stabile. în loc de fermentarea cu bacterii mixte, scurtând în același timp ciclul de producție.

V. PROVOCĂRI ȘI EVOLUȚII VIITOARE

Căile detaliate de biosinteză (și reglarea lor metabolică și controalele) utilizate de aceste
microorganisme au fost elucidate pentru mai multe (pro)vitamine, biopigmenți, antioxidanți și
compuși de sănătate similari, dar acest lucru s-a realizat doar treptat în ultimele decenii, în
principal prin studierea modelului microbian. tulpini și / sau microorganisme producătoare, cum
ar fi bacterii (Escherichia coli , Serratia , Bacillus , Lactobacillus , Pseudomonas ,
Gluconobacter , Sinorhizobium , Agrobacterium , Hyphomicrobium , Propionibacterium ,
Rhodobacter , Rhodococcus, Arthrospira- cianobacterii) , drojdii (Saccharomyces , Candida ,
Xanthophyllomyces , Yarrowia), fungi (Blakeslea , Ashbya , Mortierella , Mucor , Monascus),
precum și microalge verde (Dunaliella , Euglena , Haematococcus), dinoflagellates non-
fotosintetice marine (Crypthecodinium) și Thraustochytrid-microalge marine non-fotosintetice
(Schizochytrium). S-a dovedit că căile implicate și reglementările lor metabolice sunt foarte
complexe și adesea foarte greu de dereglat pentru a ajunge la niveluri de supraproducție a
compușilor doriti.
Pentru unele dintre vitamine, biopigmente și antioxidanți și alți factori de sănătate,
supraproducția microbiană pentru a atinge niveluri relevante din punct de vedere industrial
rămâne încă o provocare. Pentru producția de GABA, un proces de fermentație într-o singură
etapă cu randament ridicat direct din glucoză ar trebui să înlocuiască procesul în două etape care
este acum în uz. În cazul biotinei sau B 7 , bioconversia eficientă a detiobiotinei în biotină
(ultimul pas biochimic din cale) rămâne un adevărat blocaj științific. În ceea ce privește vitamina
B 1 și B 9, tulpinile de Bacillus subtilis foarte elaborate au transformat precursori scumpi doar în
B 1 sau B 9 destul de scăzute .niveluri, respectiv, împiedicând aplicarea industrială până acum.
Pentru vitamina C, un proces de co-cultură mixt definit este recent stabilit la scară largă și chiar
și o cale de fermentație directă este pe cale să aducă o descoperire. În plus, este bine cunoscut
faptul că microbiota intestinală, în principal eubacterii anaerobe și arheile, acționează ca
furnizori de vitamine pentru gazdele lor; cu toate acestea, puține dintre ele au fost studiate
suficient în acest context. Ele ar putea fi o sursă de gene noi și pentru dezvoltarea tulpinilor
pentru producția de vitamine industriale și a altor factori de creștere și sănătate.
Pe lângă obținerea acestor vitamine, biopigmenți, antioxidanți și compuși înrudiți printr-
un proces microbian - despre ce este vorba despre fermentația microbiană, biocataliza și cultura
de alge -, procesele biocatalitice bazate pe fermentație sau enzimatice dau, de asemenea,
compusul enantiomeric dorit și pot fi redirecționați prin intermediul modificarea genetică și
biotehnologică a bacteriilor implicate, drojdiilor și ciupercilor sau microalgelor în sisteme de
producție cu randament ridicat.
Descoperiri științifice în metodologiile de screening cu randament ridicat, în genetica
moleculară a tulpinilor microbiene industriale, în (micro)biologia sistemelor, în evoluția dirijată,
inginerie metabolică și modelare, dar în egală măsură în ingineria enzimatică și celulară au
permis să se facă progrese către realizările industriale ale vitaminelor. și producția de compuși
asemănători vitaminelor. Un exemplu frapant este producerea prin fermentarea vitaminei B 2
folosind Ashbya gossypii. Productivitatea tulpinilor industriale inițiale dezvoltate prin tehnicile
clasice de mutageneză a fost mult îmbunătățită printr-o combinație de inginerie metabolică,
analiză comparativă a genomului și transcriptomului și abordări de modelare metabolică a
genomului. Succesul acestui program de ameliorare a tulpinilor a permis înlocuirea la nivel
industrial a procesului chimic al vitaminei B 2 cu cel utilizat în prezent pe bază de fermentație
microbiană. Implementarea procesului biotehnologic a redus costurile de producție și de
protecție a mediului cu 43% în raport cu procesul de fabricație chimică (Fig. 5). În plus, emisiile
de CO 2 au fost reduse cu aproximativ 30%. Ca rezultat al singurei sale etape principale,
fermentația are economii substanțiale de costuri în comparație cu procesul chimic în mai multe
etape.

Fig.5. Analiza impactului asupra mediului și economic al proceselor chimice și biotehnologice ale
riboflavinei (vitamina B 2 ) în diferite faze de dezvoltare (faza 1, 2 și 3).

De asemenea, combinația dintre evoluția direcționată și proiectarea rațională a proteinelor

folosind instrumente de calcul a devenit semnificativă pentru a crea chiar și noi enzime,
extinzându-și potențialul de aplicare în domeniul (provitaminelor) și biosintezei chimice fine
aferente. Biocataliza asimetrică cu enzime și celule microbiene a atins acum eficiență,
enantioselectivitate și randament ridicate, astfel încât – pentru o mare varietate de produse
chirale, inclusiv (pro)vitamine, biopigmente, antioxidanți și compuși înrudiți – biocataliza a
devenit o alternativă preferată de producție în organice. de sinteză și în industria (bio)chimică
pentru substanțe chimice fine și în vrac.
Tehnici noi de cultură, metodologii de eșantionare rapidă și senzori, proiectare
îmbunătățită a bioreactorului și procesare în aval, toate vor contribui la interesul crescând pentru
utilizarea proceselor bazate pe microbiologie și biotehnologie industrială în industrie. Ingineria
bazată pe proiectare a tulpinilor microbiene industriale este încă împiedicată de cunoștințele
incomplete despre biochimia celulară, reglarea metabolică și biologia celulară. Progresele în
tehnologiile de biologie a sistemelor și în (micro)biologia sintetică pot contribui acum la
completarea acestui gol. În special, o combinație a tuturor acestor progrese va permite să fie
construite tulpini microbiene cu randament ridicat, care sunt potrivite pentru producția
industrială pe bază de microbi de (pro)vitamine, biopigmenți, antioxidanți și compuși de sănătate
înrudiți.
 VI. CONCLUZIE
Producția fermentativă de vitamine folosind bacterii are multe avantaje față de metodele
tradiționale de sinteză chimică. Din punct de vedere al siguranței, activității biologice, ratei de
absorbție etc., vitaminele fabricate prin metode biologice pot fi mai potrivite atât pentru aplicații
interne, cât și externe. Deși fermentația VB 2 și VB 12 s- a maturizat tehnologic și este aplicată
în producția industrială, metodele de fermentație pentru vitaminele din grupa B rămase nu au fost
încă dezvoltate sau necesită o îmbunătățire semnificativă a randamentului.
Vitamina C are o piață mare, iar metoda sa de producție se bazează în principal pe
fermentarea cu o singură bacterie, care elimină dependența bacteriilor asociate prin înlocuirea
bacteriilor însoțitoare cu agenți activi asociați. Totuși, situația actuală a pieței indică faptul că
producția de vitamina C are supracapacitate, procesarea în aval este complicată, iar cererea pieței
este concentrată în domeniul medicinei și al alimentației. Din aceste motive, impulsul creșterii
prețurilor va rămâne lent în viitor. Tehnologia de fermentare a vitaminei C poate explora
mecanismul unei varietăți de bacterii însoțitoare, poate stabili baza de date a anabolismului sau
poate folosi tehnologia izotopilor pentru a eticheta și a urmări metaboliții individuali. De
asemenea, este posibil să se proiecteze module de asamblare heterologe pentru sinteza 2-KGA și
să se studieze mecanismele de adaptare în celulele șasiului microbian, astfel încât să se obțină o
productivitate mai mare.
Actualul produs de biosinteză al vitaminei A se concentrează în principal pe β-caroten.
Biosinteza β-carotenului a stabilit cu succes un proces de producție la scară largă prin inginerie
metabolică microbiană clasică și rezonabilă. Cu toate acestea, din cauza barierelor mari ale
industriei intermediare și a procesului complex de sinteză și metabolism, cercetările viitoare se
vor confrunta cu provocări mai dificile. În prezent, producția industrială de vitamina D se face în
principal prin sinteza chimică a 25-OH-VD 3 active și 1α,25-dihidroxivitaminei D 3, dar cel mai
mare obstacol este calitatea asigurată și securitatea aprovizionării cu materiile prime, care trebuie
să fie colesterolul cu puritate mai mare de 95% (grad NF). Prin urmare, cheia rezolvării
problemei materiilor prime este de a dezvolta mai multe bacterii de producție, de a le optimiza
căile metabolice și de a le face extrem de productive. Odată cu optimizarea continuă și progresul
tehnologic al fermentației vitaminei E, costul total al industriei a scăzut, ceea ce a promovat
creșterea industriei. Din păcate, deși studiile au arătat că microorganismele fotosintetice au un
potențial considerabil pentru producerea de tocoferoli, fermentația condusă de lumină este
costisitoare, ceea ce face dificilă comercializarea. Cu toate acestea, datorită potențialului
considerabil E. gracilisși condițiile mediului de cultivare, construcția unui foto-bioreactor special
conceput poate fi o direcție fezabilă de cercetare pentru producerea de tocoferol. Mai mult,
sistemul de control controlabil sensibil la temperatură poate fi, de asemenea, o tehnologie cheie
de control pentru producția de vitamina E. Dintre bacteriile producătoare de vitamina K, B.
subtilis natto pare să fie cel mai promițător candidat pentru producția de MK. Mulți cercetători
au optimizat proiectarea modurilor de fermentație, a componentelor medii și a condițiilor de
cultură. Ei au aplicat, de asemenea, ingineria genetică și alte mijloace pentru a crește producția
de MK. Cu toate acestea, pentru a obține o producție industrială mai mare, tehnologia trebuie
îmbunătățită în continuare. Unele studii au folosit reactoare cu biofilm, care ar putea deveni o
zonă nouă promițătoare pentru cercetări viitoare.
Recent, grupul nostru de cercetare a folosit E. coli MG1655 (DE3) ca tulpini de șasiu și a
realizat sinteza de novo a vitaminei B 12 prin inginerie metabolică și optimizarea condițiilor de
fermentație. În plus, nu doar am demonstrat că E. coli este o platformă de biosinteză microbiană
pentru producerea vitaminei B 12 , dar oferă și un exemplu încurajator al modului în care zeci de
proteine dintr-o cale biosintetică complexă pot fi transferate între organisme pentru a promova
producția industrială. În plus, grupul nostru de cercetare face, de asemenea, cercetări asupra
metabolismului asupra vitaminei B 2 , B 6 , B 7 și a vitaminei K.
În general, dezvoltarea biotehnologiei sintetice oferă noi oportunități pentru construirea
de fabrici de celule de vitamine. În primul rând, screening-ul cu randament ridicat al tulpinilor cu
randament ridicat, tehnologia de editare a genomului CRISPR/Cas9 și tehnologia de asamblare
automată a genelor oferă mijloace tehnice importante pentru extragerea și modificarea genetică a
celulelor șasiului. În plus, producția de produse vitaminice în diferite dimensiuni va fi crescută
prin transformarea căilor complexe și multi-enzime necesare pentru producerea vitaminelor,
stabilirea florei microbiene cu funcții și stabilitate controlabile și aplicarea unor tehnologii
avansate de inginerie, cum ar fi frigul. -sistem de control al temperaturii declanșat de șoc,
controlul dinamic al sistemelor de expresie genetică, diferite tipuri de biosenzori, sisteme fără
celule și proiectare asistată de computer etc. În plus, strategiile modulare și ortogonale susțin din
ce în ce mai mult construirea fabricilor de celule de vitamine. Exploatarea și proiectarea
componentelor biologice, asamblarea și integrarea elementelor și modulelor, precum și
optimizarea și adaptarea sistemului de fermentație sunt, de asemenea, importante pentru
producția eficientă de vitamine. Cu toate acestea, vor exista multe provocări în domeniul
biotehnologiei sintetice în viitor, inclusiv compatibilitatea dintre sistemele biologice flexibile și
sistemele rigide de inginerie sau universalitatea reconstrucției sistemului biologic. Va fi necesar
și important să avansăm tehnologia existentă, să o combinam cu noi strategii și să desfășurăm
cercetări interdisciplinare pentru a stabili noi fabrici de celule microbiene pentru fermentarea
industrială a majorității vitaminelor. Una peste alta, credem cu fermitate că industrializarea
producției de vitamine prin fermentare este de așteptat să devină o producție mai largă, mai
sigură și mai durabilă, odată cu progresul continuu al biotehnologiei sintetice și al ingineriei
metabolice.
VII. BIBLIOGRAFIE
1. Abbas CA, Sibirny AA (2011). Controlul genetic al biosintezei și transportului
riboflavinei și nucleotidelor de flavină și construcția de producători biotehnologici
robusti. Microbiol. Mol. Biol. Apoc. 75 321–360.
2. Begley TP, Downs DM, Ealick SE, Mclafferty FW, Loon APGMV, Taylor S. și
colab. (1999). Biosinteza tiaminei la procariote. Arc. Microbiol. 171 293–300.
3. Belenky P., Stebbins R., Bogan KL, Evans CR, Brenner C. (2011). Exportul
independent de NRT1 și Tna1 de vitamine precursoare NAD+ promovează
homeostazia NAD+ și permite ingineria producției de vitamine. PLoS One 6 :
e19710 .
4. Blake CJ, Konings EJM (2019). Comisia pentru nutriție alimentară: vitamine
liposolubile: vitamine solubile în apă. J. AOAC Int. 88 325–330.
5. Blanche F., Cameron B., Crouzet J., Debussche L., Battersby AR (1995a).
Vitamina B12: cum a fost rezolvată problema biosintezei sale. Angewandte
Chemie Int. Ediţia 34 383–411.
6. Blanche F., Cameron B., Crouzet J., Debussche L., Levy-Schil S., Thibaut D.
(1992). Polipeptide implicate în biosinteza cobalaminelor și/sau cobamidelor,
secvențe de ADN care codifică aceste polipeptide și prepararea și utilizarea lor.
7. CD Berdanier, Adkins TK (2019). Vitamine solubile în apă. Adv. Nutr.
Micronutr.
8. Downs DM (1992). Dovezi pentru o nouă cale de biosinteză reglată de oxigen
pentru fragmentul pirimidinic al tiaminei din Salmonella typhimurium . J.
Bacteriol. 174 1515–1521.
9. Durmaz Y. (2007). Producția de vitamina E (α-tocoferol) de către microalgele
marine Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae) în limitarea azotului.
Acvacultura 272 717–722.
10. Eliot AC, Kirsch JF (2004). Enzimele piridoxal fosfat: considerații mecaniciste,
structurale și evolutive. Annu. Rev. Biochim. 73 383–415.
11. Fang H., Li D., Kang J., Jiang P., Sun J., Zhang D. (2018). Ingineria metabolică a
Escherichia coli pentru biosinteza de novo a vitaminei B12. Nat. comun. 9 : 4917.
12. Fischer M., Bacher A. (2005). Biosinteza flavocoenzimelor. Nat. Prod. Rep. 22
324–350.
13. Grimm P., Risse JM, Cholewa D., Muller JM, Beshay U., Friehs K., et al. (2015).
Aplicabilitatea Euglena gracilis pentru biorafinării demonstrată prin producerea
de α-tocoferol și paramilon urmată de digestie anaerobă. J. Biotechnol. 215 72–
79.
14. Holvik K., Fryland L., Haugen M., Henjum S., Parr CL (2019). Evaluarea
aportului alimentar de vitamina K și a limitelor maxime pentru vitamina K în
suplimentele alimentare. Euro. J. Nutriție Siguranța alimentelor 9 96–98.
15. Hoshino T., Ichikawa K., Nagahashi Y. (2007). Microorganism și proces de
preparare a vitaminei B6. Washington, DC: Oficiul SUA pentru Brevete și Mărci.
Brevetul SUA nr. 20060127992 A1.
16. Kawahori K., Kondo Y., Yuan X., Kawasaki Y., Hashimoto K. (2020). Acidul
ascorbic în timpul perioadei de alăptare este necesar pentru demetilarea corectă a
ADN-ului în ficat. Sci. Rep. 10 : 21228 .
17. Moriguchi S., Muraga M. (2000). Vitamina E și imunitatea. Vitamine Hormoni-
avansuri Res. Aplic. 59 305–336.
18. Morishita T., Tamura N., Makino T., Kudo S. (1999). Producția de menachinone
de către bacteriile lactice. J. Dairy Sci. 82 0–1903.
19. Myszczyszyn A., Krajewski R., Ostapów M., Hirnle L. (2019). Acidul folic – rol
în organism, recomandări și semnificație clinică. Pielegniarstwo XXI wieku /
Nursing in the 21st Century 18 50–59.
20. Palmer LD, Downs DM (2013). Enzima biosintetică tiamină ThiC catalizează
multiple turnover-uri și este inhibată de metaboliții S-adenosilmetioninei
(AdoMet). J. Biol. Chim. 288 30693–30699.
21. Papoutsis K., Grasso S., Menon A., Brunton NP, Lyng JG, Jacquier J.-C., și colab.
(2020). Recuperarea ergosterolului și a vitaminei D2 din deșeurile de ciuperci-
valorificare potențială de către industria alimentară și farmaceutică. Trends Food
Sci. Tehnol. 99 351–366.
22. Rao YM, Sureshkumar GK (2000). Biosinteza directă a acidului ascorbic din
glucoză de către Xanthomonas campestris prin radicali liberi induși.
Biotehnologia. Lett. 22 407–411.
23. Sachsenhauser V., Deng X., Kim HH, Jankovic M., Bardwell JCA (2020).
Biosenzori tripartiți de drojdie sensibili la stabilitatea proteinelor și tendința de
agregare. ACS Chim. Biol. 15 1078–1088.
24. Sahm H., Eggeling L. (1999). Sinteza D-Pantotenatului în Corynebacterium
glutamicum și utilizarea panBC și a genelor care codifică sinteza L-valinei pentru
supraproducția de D-Pantotenat. Aplic. Mediul. Microbiol. 65 1973–1979.
25. Vandamme EJ și Revuelta JL (eds) (2016) Industrial Biotechnology of Vitamins,
Biopigments and Antioxidants . Weinheim, Germania: Wiley‐VCH, 560 pp.
26. Wang, D., Wang, C., Wu, H., Li, Z. și Ye, Q. (2016) Producția de glutation prin
Escherichia coli recombinantă care exprimă glutation sintetaza bifuncțională . J
Ind Microbiol Biotechnol 43 : 45–53.
27. Wenda, S., Illner, S., Mell, A. și Kragl, U. (2011) Biotehnologia industrială —
viitorul chimiei verzi? Green Chem 13 : 3007–3047.
28. Xia W., Chen W., Peng WF, Li KT (2015). Producția industrială de vitamina B12
de către Pseudomonas denitrificans folosind sirop de maltoză și lichior de porumb
ca substrat de fermentație rentabil. Bioproces Biosyst. ing. 38 1065–1073.
29. Yasutake Y., Nishioka T., Imoto N., Tamura T. (2013). O singură mutație la locul
de legare a ferredoxinei P450 Vdh permite producția biocatalitică eficientă de 25-
hidroxivitamina D (3). Chembiochem 14 2284–2291.
30. Yoon SH, Lee SH, Das A., Ryu HK, Jang HJ, Kim JY și colab. (2009).
Exprimarea combinatorie a căii întregii mevalonate bacteriene pentru producerea
de β-caroten în E. coli . J. Biotechnol. 140 218–226.
31. Yoshida, K., Ueda, S. și Maeda, I. (2009) Producția de carotenoide în Bacillus
subtilis realizată prin inginerie metabolică . Biotechnol Lett 32 : 1789–1793.
32. Yuan P., Cui S., Liu Y., Li J., Liu L. (2020). Inginerie metabolică pentru
producerea de vitamine liposolubile: progrese și perspective. Aplic. Microbiol.
Biotehnologia. 104 935–951.
33. Zeng Z., Han N., Liu C., Buerte B., Zhou C., Chen J., și colab. (2020). Disecția
funcțională a HGGT și HPT în biosinteza vitaminei E de orz prin editarea
genomului activată de CRISPR/Cas9. Analele Bot. 126 929–942.
34. Zhao J., Li Q., Sun T., Zhu X., Xu H., Tang J., și colab. (2013). Proiectarea
modulelor metabolice centrale ale Escherichia coli pentru îmbunătățirea
producției de β-caroten. Metab. ing. 17 42–50.