Curs 13+14

Capitol V. APLICABILITATEA PRACTICĂ A CUNOŞTINŢELOR

DE MICROBIOLOGIE

Fermentatia este cea mai importanta aplicatie practica a microbiologiei.

Din cele mai vechi timpuri microorganismele au fost utilizate în prelucrarea
produselor lactate, în producerea vinurilor şi a berii, în panificaţie, în
producerea oţetului. Producerea la scara mare a diferiţilor compusi utili
(vitamine, vaccinuri, aminoacizi s.a.m.d) cu ajutorul microorganismelor a
condus la dezvoltarea unei noi discipline numită biotehnologie.
Prin biotehnologie, importanta practică a microorganismelor în agricultură
urmareste intensificarea unor procese naturale de sporire a conţinutului de azot
fixat în sol pe cale biologică (biopreparat Nitragin), respectiv favorizarea
combaterii biologice a daunătorilor în culturile agricole.

V.1. Biotehnologia- extindere a ştiinţei microbiologice

Biotehnologia care are ca scop obţinerea pe cale industrială a diferitor

produse, cu participarea nemijlocită a diferitor microorganisme.
Argumentele privind utilizarea microorganismelor în producerea
biotehnologică a substanţelor biologic active constau în:
• Prezenţa ubiquitară a microorganismelor şi capacitatea mare de
adaptare la cele mai variate condiţii de mediu;
• Metabolismul intens, cu posibilităţi de obţinere a produşilor metabolici
într-un timp redus, ceea ce generează eficienţă mare prin reducerea costurilor;
• Capacitate de multiplicare rapidă având ca avantaj obţinerea şi izolarea
unor tulpini (suşe) productive şi eficiente;
• Posibilităţi de obţinere a biomasei microbiene într-un timp scurt prin
creşterea controlată a microorganismelor în bioreactoare;
• Cerinţe nutriţionale minime, ceea ce presupune utilizarea ca substrat a
reziduurilor ieftine rezultate din industria zahărului (melasa), hidrocarburi,
prelucrarea lemnului sau utilizarea bioxidului de carbon şi a energiei solare, în
cazul microorganismelor fotosintetice.
Pe de altă parte utilitatea microorganismelor nu constă numai în producerea
diferitelor substanţe utile ci şi utilizarea lor ca atare în asigurarea desfăşurării
unor procese precum: sporirea conţinutului de azot fixat pe cale biologică
103
(Nitragin), combaterea biologică în culturile agricole, inducerea imunităţii
artificiale pe baza proprietăţilor antigenice (vaccinuri), producerea de ami-
noacizi (tabel 5.1).
Utilizarea microorganismelor sub forma de culturi selectionate, pure, cu
scopul dirijarii anumitor procese, indiferent de forma de condiţionare poartă
denumirea de tratament biologic iar produsul se numește biopreparat (preparat
bio, de la bios – viu, cu viaţă)
Biopreparatele microbiologice pot fi grupate în:
1. biopreparate ce au la bază microorganisme vii (bioinsecticidele,
îngrăşămintele bacteriene);
2. biopreparate ce au la bază biomasa inactivată a celulelor microbiene
(proteina furajeră);
3. biopreparate obţinute în baza produselor metabolice ale
microorganismelor (vitamine, aminoacizi, enzime, antibiotice, poliozide etc.).

Tab 5.1.
Microorganisme utilizate în biotehnologie
Grupa microorga- Specia implicată Produse utilizate
nisme

Bacterii: Methylophilus proteine monocelulare din

a. arhebacterii methylotrophus metan sau metanol
Acetobacter sp. oţet
b. eubacterii Lactobacillus bulgaricus iaurt
Propionibacterium sp. caşcaval
Streptococcus sp. şi produse lactate
Lactobacillus sp.
Pseudomonas denitrificans vitamina B12
Leuconostoc mesenteroides polizaharide (dextrani,
şi Xanthomonas campestris xantani)
Clostridium acetonă şi butanol
acetobutyricum
Bacillus sp. şi Cytophaga enzime celulozolitice
sp.
Corynebacterium aminoacizi (lizina, acidul
glutamicum glutamic)
Srteptomyces sp. Antibiotice(streptomicina,
tetracicline)
Bacillus brevis antibiotice (gramicidina C)

104
 Bacillus thuringiensis bioinsecticide (turinghina,
dendrobacilina)
Escherichia coli hormoni (insulina,
somatostatina), interferon
Azotobacter chroococcum îngrăşăminte bacteriene
şi Rhizobium sp. (azotobacterina, nitragina)
Drojdii Saccharomyces cerevisiae pâine, vin, etanol
Sac. carlsbergensis bere uşoară
Candida utilis proteine monocelulare din
petrol
Eremothecium ashbyii vitamina B2
Mucegaiuri Aspergillus sp. enzime (pectinaze, pro-
teaza)
Trichoderma reesii enzime (celulaza)
Aspergillus niger acizi organici (citric, glu-
conic)
Penicillium chrysogenum antibiotice (penicilina)
Bauveria sp. bioinsecticide (boverina)
Penicillum roquefortii brânza de tip Roquefort
Penicillum camembertii brânza de tip Camembert
Alge microscopice Spirulina sp. proteine monocelulare,
Chlorella sp. carotină,
Scendesmus sp glicerină, pigmenţi
Botryococcus braunii biocombustibil

V.2. Creşterea eficienţei proceselor fermentative din industria alimentară

Utilizarea microorganismelor şi a enzimelor pentru obţinerea produselor

alimentare şi pentru îmbunătăţirea calităţii lor este domeniul tradiţional al
biotehnologiei. Astfel, microorganismele sunt utilizate de mult timp în
prelucrarea produselor lactate şi fermentaţia brânzeturilor, în producerea
vinurilor şi a berii, în panificaţie, în producerea oţetului şi a sucurilor etc.

Fermentaţia alcoolică
Fermentaţia alcoolică este produsă de multe microorganisme, dar în
industrie se folosesc numai drojdii. În mod normal drojdiile suportă 9-10%
alcool, însă drojdiile special selecţionate pentru vinurile licoroase, mai tari,
suportă până la 16% alcool. Reacţia biochimică ce stă la baza fermentaţiei
alcoolice se prezintă astfel:

105
 C6H12O6 = 2 CH3-CH2-OH + 2 CO2 + 22 Kcal
Glucoză Alcool etilic

Pot fi fermentate zaharuri simple, cu o anumită conformaţie moleculară

(d-glucoza este zaharul cel mai bine fermentescibil, l-glucoza este complet
nefermentescibilă). Maltoza şi zaharoza sunt mai des fermentate, lactoza -
mai greu, amidonul, glicogenul şi dextrinele sunt complet nefermentescibile.
Fermentaţia se produce de regulă la 300C. Viteza fermentaţiei creşte cu
concentraţia de zahăr până la 12%, rămâne constantă între 12-20%, apoi scade,
iar la 60% încetează complet (fenomene utilizate în conservarea fructelor sub
formă de dulceaţă).
Microorganisme responsabile:
- Drojdiile: Saccharomyces ellipsoideus, S cerevisiae.
- Bacterii: Bacillus macerans, Sarcina ventriculi, Bacillus acetoetylicus.
Alcool se poate obţine din :
- materii prime amidonoase: cartof, porumb, orz, secară.
- Materii prime zaharoase: sfecla şi trestia de zahăr.
- Materii prime celulozice: lemnul, stuful care iniţial sunt supuse unor
tratamente de hidrolizare cu acid
Utilizarea microorganismelor în vinificaţie
Cea mai complexă industrie bazată pe fermentaţia alcoolică este
vinificaţia. Aceasta are ca materie primă mustul din struguri, care are o
compoziţie foarte complexă, variabilă în funcţie de soi, condiţii de climă şi sol.
Fermentaţia mustului are loc cel mai bine la 15-250C, temperatura mai scăzută
asigurând un randament superior în alcool, în esteri şi alţi compuşi aromatici
(un “buchet” superior). Procesul este determinat de drojdiile aflate pe boabe de
struguri (Saccharomyces ellipsoideus, S. apiculatus etc.) sau prin inocularea cu
drojdii special selecţionate.
Fermentaţia cuprinde trei faze:
a. faza de iniţiala de multiplicare a drojdiilor care durează 3-4 zile;
b. faza de fermentaţie zgomotoasă care durează 6-14 zile;
c. faza finală sau fermentare limitată, ce durează între 5 şi 6 săptămâni.
În acest timp scade conţinutul în zahăr, se produce alcool şi substanţe ce
conferă vinului arome specifice în funcţie de soi şi tehnologie obţinându-se
vinuri seci sau licoroase. În acest timp vinul se limpezeşte.

Alterarea microbiană a vinului

Vinul poate suferi procese de alterare microbiană, care afectează
culoarea gustul miros şi chiar consistenţa.

106
- floarea vinului este produsă de Mycoderma vini . Se dezvoltă la
suprafaţa vinului când vasele nu sunt umplute complet iar vinul are un conţinut
redus de alcool.
- Oţetirea vinului este produsă de bacteriile acetice din genul Acetobacter
care se dezvoltă pe vinurile dulci, cu conţinut redus de alcool şi păstrate la
temperatură ridicată (20˚C).
- Borsirea vinului este produsă de Bacillus intermedium şi Bacillus
gracillis, în cazul vinurilor albe, alterarea constând în tulbureală,gust acru,
miros de bors.

Utilizarea microorganismelor pentru obţinerea berii

Berea este o băutură alcoolică slabă obţinută din malţ de orz. Ea se
obţine în următoarele etape:
• Prepararea malţului, adică asigurarea condiţiilor de germinare a boabelor
de orzoaică, astfel încât în acestea să se producă enzime care descompun
amidonul şi proteinele. După 6-9 zile embrionii sunt uscaţi 10 ore la 850C
pentru berea blondă sau 36 ore pentru berea brună la 90-1000. Se îndepărtează
boabele încolţite şi malţul este măcinat.
• Prepararea mustului , fază în care amidonul este complet zaharificat, şi la
capătul căreia are loc filtrarea, după care se adaugă hamei (250-300 gr/hl)
pentru aromatizare. Se sterilizează prin fierbere (2,5 ore) filtratul.
• Fermentaţia începe prin însamânţarea cu drojdie selecţionată
(Saccharomices cerevisiae sau S. carllsbergensis). Se diferenţiază două etape:
- fermentaţia principală, are loc în condiţii aerobe la temperatura de 6-
12˚C şi durează 10 zile, în care are loc multiplicarea drojdiilor;
- fermentaţia secundară, se realizează în condiţii anaerobe, la
temperatură de 1-3˚C, timp de 2-6 luni , se produce alcool, şi bioxid de carbon
care rămâne încorporat în masa berii. La finalul etapei se produce limpezirea
berii şi sedimentarea drojdiilor.

Fermentaţia lactică

Acest tip de fermentaţie este larg folosit pentru conservarea şi

îmbunătăţirea calităţii unor produse animale şi vegetale (lapte, produse
legumicole şi cerealiere). Microbiologul finlandez Wirtanen a elaborat înaintea
celui de-al doilea război mondial tehnologii optimizate de conservare a
furajelor prin fermentaţie lactică (însilozare), ceea ce a permis o îmbunătăţire
substanţială a zootehniei din ţările nordice (procedeul a fost apoi extins şi în
Sud) si i-a fost acordat Premiul Nobel în 1946. Condiţia esenţială a unei
însilozări de calitate constă în asigurarea unor condiţii de anaerobioză.
107
Produsul final al fermentaţiei lactice este acidul lactic, care are numeroase
aplicaţii în industria alimentară (acidifiant al sucurilor, esenţelor de fructe şi al
băuturilor răcoritoare), în medicină, în industria chimică (mordant la colorarea
şi imprimarea diferitelor textile), în industria pielăriei etc.

C6H12O6 = 2 C3H6O3 + 22,5 Kcal

Glucoză Acid lactic

În funcţie de natura produşilor finali rezultaţi în urma fermentaţiei şi după căile

de degradare a substratului bacteriile lactice se împart în două categorii şi
anume: bacterii homofermentative (Lactobacillus casei, L. cremoris, L.
acidophilus, L. bulgaricus, Streptococcus lactis, S. cremoris, S. thermophilus),
care formează ca produs principal de fermentaţie acidul lactic şi bacterii
heterofermentative (Lactobacillus brevis, L.lycopersici, Leuconostoc
mesenteroides, L.citrovorum), care produc prin fermentaţie acid lactic si alti
compusi precum etanol, CO2, acid acetic, glicerină şi manitol.
Aplicaţii practice ale fermentaţiei lactice. În afară de producerea de acid lactic,
fermentaţia lactică mai are numeroase alte aplicaţii practice: la prepararea
laptelui acru, iaurt, diferite produse lactate, precum şi la conservarea şi
însilozarea nutreţului.

Utilizarea microorganismelor în panificaţie

Industria panificaţiei este bazată pe respiratia aeroba a amidonului fiind

datorată drojdiei care prin acţiunea unor enzime (zimaze), are proprietatea de a
determina fermentaţia amidonului din făină şi eliberarea unor cantităţi mari de
CO2 care tind să se degaja si determina cresterea aluatului.
Dospirea pâinii se poate face cu drojdii sălbatice, provenite din făină sau cu
drojdii selecţionate, păstrate sub formă de drojdie comprimată sau uscată.

Fermentaţia acetică.

În mod tradiţional biotehnologia de producere a oţetului, este denumită

“fermentaţie” deşi aceasta este un proces aerob realizat de către bacterii
aparţinând genului Acetobacter.
Dezvoltarea spontană a bacteriilor acetice în timpul păstrării unor
produse slab alcoolizate (vin, bere) este dăunătoare, deoarece produce oţetirea
băuturilor

108
 Fermentaţia pectică şi topitul biologic al plantelor textile

Utilizarea fibrelor vegetale în industria textilă este posibilă azi, ca şi

acum câteva sute de ani, pentru că omul a reusit să extragă fibrele celulozice
din tulpinile de in şi cânepă care sunt fixate prin compusi poliuronici numiti
pectine. Pectinele sunt degradate de microorganisme mai uşor decât celuloza,
care este astfel eliberată, fenomen numit topitul plantelor textile. De altfel în
natură degradarea fibrelor celulozice nici n-ar fi posibilă fără distrugerea
prealabilă a pectinelor, care creează suprafaţă mare de atac microorganismelor
celulozolitice. Topitul se poate face aerob sau anaerob, cele mai active fiind
bacteriile pectinolitice aerobe.
Degradarea substanţelor pectice este realizată de bacterii pectinolitice anaerobe
(Clostridium pectinovorum, C. felsineum, C.roseum) sau aerobe (Bacillus
vulgatus, B.mesentericus, B. subtilis) prezente pe tulpini sau se adaugă culturi
selecţionate.

V.3. Producerea biotehnologică a altor substanţe organice

Prin fermentarea produsă de bacterii strict anaerobe se produce din

biomasă vegetală (cartofi, cereale, reziduuri de la fabricarea amidonului şi
zahărului) acid butiric, impurificat cu acid acetic, acid propionic, acid
caprionic, alcool etilic şi butilic. După purificare prin distilare fracţionată,
acidul butiric este esterificat. Esterii sunt apoi folosiţi ca aromatizanţi în
industria alimentară (esterul etilic are aromă de pară, cel metilic de măr).
Acidul citric, produs iniţial prin extracţia din lămâi este astăzi obţinut curent
prin fermentare din surse necostisitoare de glucoză şi zaharoză, folosind
Aspergillus niger sau A. oryzae. Acest produs industrial este cunoscut sub
denumirea de sare de lămâie. România dispune de multă vreme de o industrie
de acest fel.
Deosebit de importantă este producerea industrială a acidului
propionic; fermentaţia propionică conferă însă gustul specific şi multor
varietăţi de brânzeturi. Acidul propionic este utilizat drept conservant pentru
porumbul furajer recoltat cu umiditate mare şi constituie de asemenea materia
primă pentru multe şi valoroase pesticide (producerea prin sinteză a acidului
propionic nu este rentabilă).
Acidul propionic este produs de unele bacterii pe medii ce conţin diferite
zaharuri, extract de drojdie şi factori de creştere.
Tot pe cale fermentativă folosind tot Aspergillus niger se obţine şi
acidul gluconic, în vreme ce acidul galic se obţine prin fermentaţia galică a
taninului.
109
Glicerina este produsă prin metode chimice din grăsimi şi cleiuri vegetale sau
prin recuperare din leşiile rămase de la fabricarea săpunurilor. Ea poate fi însă
produsă şi fermentativ cu un randament acceptabil.
Vitamina B1 (tiamina, aneurina) este produsă de drojdii, vitamina B2
(riboflavina) de bacteriile din genul Clostridium vitamina B12 esenţială în
combaterea anemiei pernicioase şi extrasă altă dată cu mari cheltuieli din ficat
se obţine azi ca produs secundar în diferite industrii fermentative, vitamina C
este produsă de Acetobacter suboxidans. Tot pe cale biotehnologică se produc
beta carotenul şi ergosterolul (provitamina D2). Giberelinele, substanţe cu
rol hormonal în plante sunt sintetizate de către ciuperci. Unele bacterii
sintetizează nişte esteri care, prin polimerizare industrială, produc
polihidroxialcanoaţi, mase plastice biodegradabile. Randamentul de sinteză al
bacteriilor este redus, dar, de curând (1999) la Universitatea Laussane (Elveţia)
s-a reuşit transferul genelor respective la plante, astfel încât este posibil ca
tutunul sau cartoful să devină în viitorul apropiat materii prime pentru industria
polimerilor.

Obţinerea antibioticelor
După ce Sir Alexander Fleming a obţinut primul antibiotic (1929) au
fost necesari 12 ani pentru a se pune la punct procedeul de purificare a
penicilinei şi de producerea industrială a acestora. A fost elaborată o tehnologie
de obţinere a penicilinei în instalaţii speciale - fermentatoare (bioreactoare), a
fost găsit un mediu de cultură ieftin şi eficient (conţinând lactoză, faină de
rapiţă, extras apos de porumb, săruri minerale), o metodă de control continuu al
procesului. Metoda odată elaborată a putut fi aplicată - cu mici variaţii - la
numeroase alte antibiotice.
Antibioticele sunt substanţe chimice de origine biologică sau sintetică, care
distrug selectiv unele microorganisme sau le împiedică multiplicarea. Ele se
obţin de la diferite grupe de microorganisme: ciupercile filamentoase
(Penicillium, Cephalosporium) şi actinomicetele (Streptomyces) – 70,3%, ba-
cilii (Bacillus) – 7%, pseudomonadele (Pseudomonas) – 1,3%, alte bacterii –
1,7%. O parte din antibiotice au provenienţa vegetală (alina, sativina – din
ceapă, usturoi) sau animală (ecmolina – din ficatul peştilor)
www.ournet.md/~biochim/ ghid/microbio.html.

Producerea vaccinurilor
Culturile de virusuri şi bacterii sau toxinele unor bacterii pot fi folosite
în elaborarea vaccinurilor cu o acţiune specifică sau complexă (contra
poliomielitei, tuberculozei ş.a.). Vaccinurile (culturi inactivate de agenţi ce

110
provoacă diferite boli sau toxinele lor) sunt menite să sporească imunitatea
organismului – să micşoreze receptivitatea lui la boli infecţioase.
Producerea microbiologică de vaccinuri se realizează în două direcţii:
1. obţinerea de biopreparate vii (preparate inactivate de bacterii sau
virusuri, agenţi ai diferitor boli infecţioase): Ex vaccinuri bacteriene (vaccinul
contra tuberculozei, vaccinul contra pestei); vaccinuri virotice (vaccinul contra
poliomielitei, vaccinul contra variolei); vaccinuri complexe.
2. obţinerea de biopreparate în baza toxinelor inactivate (toxina contra
difteriei).
În procesul de obţinere a vaccinurilor se ţine cont de particularităţile suşelor
implicate (intensitatea multiplicării, virulenţa, capacitatea de a forma toxine
etc.), de condiţiile de cultivare (natura substratului nutritiv, prezenţa sau lipsa
aeraţiei etc.) şi de produsul final (purificarea, extragerea etc.).

1. Ce este un biopreparat?
2. Care sunt utilizările practice ale fermentaţiei alcoolice?In ce
condiţii se acumulează alcool in vin?
3. Care este utilitatea practică a fermentatiei lactice?
4. Ce sunt antibioticele?

111