Biotehnologia preparatelor enzimatice

Cursul 2. Preparate enzimatice de uz alimentar, obținute prin procese biotehnologice.

2.1. Enzime – o succintă recapitulare

Enzimele sunt compuşi organici macromoleculari - proteine elaborate de celulele vii, care
îndeplinesc funcţia de biocatalizatori specifici (substanţe capabile să mărească viteza reacţiilor
care se desfăşoară în sistemele biologice, fără să se consume în cursul lor). Se mai numesc
fermenţi.

Caracteristici
 sunt biomolecule proteice (substanţe de natură proteică produse de celulele vii);
 au masa moleculară de 104 - 106 daltoni;
 fiind entităţi proteice, enzimele îşi pierd activitatea catalitică sub acţiunea căldurii (sunt
termolabile), la anumite valori ale pH (în prezenţa acizilor sau bazelor tari) sau în prezenţa
altor factori care denaturează proteinele;
 nu fac parte din grupa substanţelor cu rol structural sau energetic;
 au rol catalitic (nu se consumă şi nici nu se transformă în timpul acţiunii lor);
 acţionează în cantităţi foarte mici;
 participă la reacţiile biochimice din organismele vii;
 sunt absolut necesare pentru desfăşurarea normală a funcţiunilor vitale la om, animale şi
plante; lipsa lor duce întotdeauna la tulburări grave şi adesea la moartea organismului;
 prin acţiunea lor catalitică permit realizarea unor reacţii în condiţii compatibile cu viaţa, care in
vitro nu pot avea loc decât în condiţii dure, improprii vieţii. De exemplu, hidroliza proteinelor
pe cale chimică se realizează fie la 37oC numai în mediu puternic acid şi într-un interval lung
de timp (3 luni), fie la 140oC la presiuni şi acidităţi foarte mari; în organism, în stomac, în
prezenţa enzimelor, această degradare are loc extrem de rapid;
 reglează ansamblul complex al reacţiilor biochimice în cadrul proceselor metabolice,
asigurând un echilibru între degradarea substanţelor nutritive, obţinerea de energie necesară
funcţiilor vitale şi sinteza substanţelor proprii organismului; scurtează timpul de reacţie
necesar pentru atingerea echilibrului; sunt responsabile de viteza cu care se desfăşoară reacţiile
biochimice, în funcţie de necesităţile fiziologice ale organismului.
 în industria alimentară enzimele participă la numeroase procese tehnologice.

Substanţa asupra căreia acţionează enzima se numeşte substrat.

Clasificarea enzimelor după tipul reacţiei catalizate

1. Oxidoreductaze – sisteme enzimatice care catalizează reacţii tip redox. În aceste reacţii are
loc transferul de electroni sau de hidrogen între diferiţi parteneri de reacţie.
2. Transferaze - sunt enzime care catalizează reacţiile de transfer a unui fragment molecular
de pe un substrat pe altul. Energia implicată în timpul acestei transferări este de multe ori
apropiată ca valoare de cea rezultată din reacţiile redox.
3. Hidrolaze - enzime care catalizează reacţii de scindare a substratului cu participarea apei.
4. Liaze - enzime care catalizează reacţii de scindare a substratului, procese în care nu apar
reacţii tip redox sau hidrolize.
5. Izomeraze - catalizează reacţii de izomerizare.
6. Ligaze - catalizează reacţii în care se formează legături chimice noi, energia fiind furnizată
de ATP.

1
Biotehnologia preparatelor enzimatice

Activitatea unei enzime se determină măsurând viteza reacţiei catalizată enzimatic, prin
estimarea:
- gradului de transformare a substratului;
- concentraţiei produsului de reacţie.

Modalităţi de exprimare a activităţii enzimatice

În anul 1972, Comisia de enzimologie de pe lângă Uniunea Internaţională de Biochimie, a
propus ca noţiunea de activitate enzimatică să fie definită ca viteză a reacţiei substratului sub
efectul catalitic al enzimei.
Unitatea de exprimare a activităţii enzimatice este unitate catalitică katal – ul (prescurtat kat),
egal cu cantitatea de enzimă ce transformă 1 (un) mol de substrat într-o secundă, la 25°C, în
condiţii optime de reacţie. Subunităţile katal-ului, corespunzătoare vitezelor de reacţie exprimate în
moli, nmoli sau pmoli de substrat transformat într-o secundă, sunt :
- mkat (microkatal) = 10-6
- nkat (nanokatal) = 10-9
- pkat (pikokatal) = 10-12
Corelaţia cu unitatea enzimatică (U), formă de exprimare a activităţii enzimatice mai veche
(unitate internaţională de activitate enzimatică care reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează
transformarea uui micromol- 1μmol - de substrat timp de un minut, în condiţii optime de pH şi de
concentraţie de substrat la temperatura de 25˚C) este:

1 kat = 1mol/sec = 60 mol/min = 60 · 106 μmol/min = 6 · 107 U

1U = 1 μmol/min = 1/60μkat = 16,67 nkat

În practică se utilizează frecvent submultipli ai acestor unităţi: miliunităţi (1 mU, 1 mKat),

microunităţi (1 μU, 1 μKat), sau nanounităţi (1 nU, 1 nKat).
Alţi parametri utilizaţi pentru caracterizarea enzimelor sunt: activitatea specifică şi activitatea
moleculară.
Activitatea specifică reprezintă numărul de unităţi de activitate/miligram de proteină şi este o
expresie a gradului de puritate al unei enzime; conform noilor uităţi de măsură, activitatea specifică
reprezintă viteza de transformare a unui mol de substrat într-o secundă/ kilogram de proteină (Kat /
kg proteină).
Activitatea moleculară (sau”raportul de transformare”) este dată de numărul de molecule de
substrat transformate în timp de un minut de către o singură moleculă de enzimă.
Cea mai frecvent folosită formă de exprimare a activităţii enzimatice, fie în activitatea de
cercetare sau în laboratorul de investigare, este aceea de unităţi/miligram de proteină (U/mg) şi
respectiv unităţi/mililitru (U/ml).

2.2. Preparate enzimatice. Noţiuni generale

Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiţionale se transformă în
biotehnologii, devenind mai eficiente şi mai puţin poluante. Utilizarea preparatelor enzimatice are
cea mai mare pondere în industria alimentară, urmată de industria detergenţilor. În industria
alimentară cele mai utilizate preparate enzimatice sunt cele care includ proteaze sau amilaze.

2.3. Tipuri de preparate enzimatice utilizate în industria alimentară

Preparatele enzimatice se comercializează sub diverse forme şi grade de purificare:
Preparate enzimatice solide
- brute, sub formă de pulbere, obţinute prin uscarea şi măcinarea mediului fermentat;
- sub formă cristalizată, enzime pure utilizate preponderent în chimia analitică şi ingineria
genetică;

2
Biotehnologia preparatelor enzimatice

- liofilizate, care sunt enzime purificate în amestec cu substanţe crioprotectoare, care sunt
urcate în vacum la temperaturi de -20......-50C.
Preparate enzimatice lichide
- brute, formă sub care se livrează enzimele extracelulare (eliberate de către
microorganisme în mediul de cultură în timpul fermentaţiei).
- parţial purificate, în care se adaugă conservanţi pentru a le mări stabilitatea în timp.

In tabelele 2.1., 2.2. şi 2.3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice,
sursele din care se obţin şi aplicaţiile în industria alimentară.

Tabel 2.1. Preparate enzimatice obţinute din surse cu aplicaţii în industria alimentară
(Gauri S.M., 1992)
Enzime Surse VEGETALE ŞI Aplicaţii în industria ALIMENTARĂ
ANIMALE
Amilaze
Diastaze Malţ Industria berii şi alcoolului-zaharificarea plămezilor
(α-amilaza + β- amidonoase.
amilaza) Industria panificaţiei-ameliorarea calităţii unor
făinuri, creşterea conţinutului de glucide
fermentescibile.
Proteaze
Cheag animal Stomac de viţel Industria brânzeturilor-coagularea şi accelerarea
maturării.
Papaina Carica papaya Obţinerea sosurilor de soia.
Ficina Smochin Obţinerea hidrolizatelor proteice.
Bromelina Suc proaspăt de ananas Frăgezirea cărnii.
Lipaze
Lipoxidaze Soia Industria panificaţiei, pentru îmbunătăţirea
proprietăţilor reologice ale aluatului şi albirea făinii.
Lipaze Pancreas Formarea compuşilor de aromă la maturarea
brânzeturilor.

Enzime Surse MICROBIENE Aplicaţii în industria ALIMENTARĂ

Amilaze Bacillus subtilis
α-amilaza + β- Bacillus licheniformis Industria hidrolizatelor de amidon-obţinerea malto-
amilaza Bacillus amynolichefaciens dextrinelor, a siropurilor de glucoză şi glucozei
Aspergillus oryzae cristalizate.
Aspergillus niger Industria produselor zaharoase-jeleuri
Aspergillus awamori
α-amilaza + Aspergillus phoenicis
glucoamilaza Saccharomycopsis
fibuligera
Proteaze
Proteaze alcaline Bacillus subtilis Industria detergenţilor.
Proteaze neutre Aspergillus niger Industria berii – creşterea stabilităţii coloidale.
Rhizopus sp.
Fusarium sp.
Cheag microbian Endhothia parasium Industria brânzeturilor-coagularea şi accelerarea
Mucor pussillus maturării.
Mucor miehei Obţinerea sosurilor de soia.
Obţinerea hidrolizatelor proteice.
Lipaze
Esteraze Pseudomonas sp. Obţinerea de lipide modificate.

3
Biotehnologia preparatelor enzimatice

bacteriene Bacillus sp Industria panificaţiei, pentru îmbunătăţirea

Rhizopus proprietăţilor reologice ale aluatului şi albirea făinii.
Esteraze fungice Aspergillus
Geotrichum candidum
Penicillium sp.
Candida lypolitica

Enzime pectolitice
Poligalacturonaza Aspergillus niger Creşterea gradului de extracţie a sucurilor, limpezirea
Botrytis cinerea sucurilor, asigurarea stabilităţii coloidale.
Pectinesteraza Xanthomonas
Erwinia
Celulaze Trichoderma reesil Bioconversia celulozei în glucide fermentescibile
Aspergillus niger (glucoză, celobioză), pentru obţinerea alcoolului
Geotrichum candidum carburant.
Invertaze Saccharomyces cerevisiae Obţinerea zahărului invertit, a mierii artificiale în
Aspergillus niger industria produselor zaharoase.
Glucozizomeraza Streptomyces sp. Obţinerea siropurilor dulci de fructoză-glucoză din
Bacillus coagulans materii prime amidonoase (porumb) (HFCS-lb.
Actinoplanes missouriensis engleză High Fructose Com Syrup).
α – galactozidaza Mortierella vinaceae Industria zahărului-hidroliza rafinozei cu eliberarea
de zaharoză şi creşterea randamentului în zahăr.
Îmbunătăţirea calităţii senzoriale a produselor din
soia.
Catalaza Aspergillus niger Testarea apei oxigenate.
Glucozoxidaza Gluconobacter sp. Obţinerea glucono-δ lactonei, aditiv la fabricarea
(Acetomonas) preparatelor din carne.
Aspergillus niger Fabricarea prafului de copt.
Aspergillus phoenicis Obţinerea acidului gluconic.
Penicillium sp.
β – galactozidaza Klyveromyces Industria produselor zaharoase şi a îngheţatei-
(lactaza) Aspergillus niger previne cristalizarea lactozei.
Industria produselor lactate-produse dietetice.
Panificaţie-creşterea cantităţii de glucide
fermentescibile în produse cu adaus de lapte sau zer.
Dextranzaharaza Leuconostoc mesentereides Biosinteza dextranului.
Dextranaza Aspergillus sp. Hidroliza dextranului la derivaţi cu masă moleculară
Penicillium sp. dorită.
Anthocianaza Aspergillus niger Ajustarea culorii naturale a unor sucuri, prin
îndepărtarea excesului de colorant.
Naringinaza Aspergillus niger Reducerea gustului amar la grapefruit.
Fitaza Aspergillus niger Eliberarea acidului fosforic din fitaţi.
Aspergillus ficuum
Nitratreductaza Bacillus sp. Reducerea nitraţilor la nitriţi-formarea pigmenţilor
roşii la fabricarea preparatelor din carne.
ADN – nucleaza Saccharomyces sp. Degradarea acizilor nucleici.
ARN – nucleaza Formarea de nucleotide cu rol aromatizant.

Tabelul 2.2. Enzime microbiene cu aplicații industriale (G. M. Frost și Moss, 1984; 1985)
Forma de
Tipul de
Denumirea enzimei Industriile utilizatoare Felul enzimei condițio-
fermentație
nare
1. Enzime proteolitice (E.P.)

4
Biotehnologia preparatelor enzimatice

Detergenți
E.P. bacteriene Lichid (L)
Procese alimentare Submers Extracelulare (Ex)
alcaline Solid (S)
Pielărie
E.P. bacteriene Ind. berii
Submers Extracelulare (Ex)
neutre Ind. alimentară
Submers
Solid (S)
E.P. bacteriene Panificație Submers în
Extracelulare (Ex) Lichid (L)
fungice Ind. brânzeturi culturi de
Solid (S)
suprafață
2. Enzime amilolitice
Amidon, bere Lichid (L)
α-Amilaze bacteriene Submers Extracelulare (Ex)
Detergenți, textile Solid (S)
Lichid (L)
α-Amilaze fungice Amidon, panificație Submers Extracelulare (Ex)
Solid (S)
Lichid (L)
Amiloglucozidaze Amidon, bere Submers Extracelulare (Ex)
Solid (S)
Submers în
Extracelulare (Ex) Lichid (L)
Diastaze Amidon culturi de
Intracelulare (In) Solid (S)
suprafață
3. Alte glicozidaze
Submers în
Lactaze (β- Extracelulare (Ex) Lichid (L)
Ind. laptelui culturi de
Galactozidaze) Intracelulare (In) Solid (S)
suprafață
Lichid (L)
Invertaze Ind. textilă Submers Intracelulare (In)
Solid (S)
Rafinaze Imobilizată
Rafinarea zahărului Submers Intracelulare (In)
(α-Galactozidaze) (Im)
Lichid (L)
Celulaze Ind. alimentară (sucuri) Submers Extracelulare (Ex)
Solid (S)
1 2 3 4 5
β-1,3(4)-Glucanaze Fabricarea berii Submers Extracelulare (Ex) Lichid (L)
4. Alte hidrolaze
Ind. alimentară
Lipaze Submers Extracelulare (Ex) Solid (S)
Teste de diagnostic
Submers în
Ind. alimentară (sucuri și Lichid (L)
Pectinaze culturi de Extracelulare (Ex)
băuturi alcoolice) Solid (S)
suprafață
5. Alte enzime
Glucozizomeraze Amidon Submers Intracelulare (In) Im
Ind. alimentară (sucuri Solid (S)
Glucozoxidaze băuturi alcoolice) Submers Intracelulare (In) Lichid (L)
Teste de diagnostic
Lichid (L)
Catalaze Ind. alimentară (sucuri) Submers Intracelulare (In)
Solid (S)
Penicillinacilaze Antibiotice Submers Intracelulare (In) Im

Tabelul 2.3.Enzime intracelulare, de fermentație, cu aplicații industriale (G. M. Frost,Moss, 1984; 1985)
Durată
Microorganismul Nivel de Autori
Enzima fermentație
producător producție (după)
(h)

5
Biotehnologia preparatelor enzimatice

Dogariu și colab.,
Escherichia coli 48 Laborator
Penicillinacilază 1975
Escherichia coli 10 1001
Self, 1969
Mortierella vinacea
72 Laborator Suzuki, 1969
α-Galactozidază Saccharomyces
48 Laborator Olivieri, 1984
cerevisiae
Ag. ind. de Știință și
Streptomyces albus 53 Laborator
Glucozizomerază Tehnologie, 1974
Streptomyces sp. 72 Laborator
Stoichev, 1981
Glucozoxidază Aspergillus niger 20 5001 Zetelaki, 1970
Pullulanază Klesbiella aerogenes 23 151 Bulich, 1978
Candida pseudo- De Bales și Castillo,
Lactază 24 Laborator
tropicalis 1979

2.4. Surse de enzime

Preparatele fabricate la scară industrială folosesc trei tipuri de surse: ţesuturi animale şi
vegetale sau microorganisme.
SURSELE ANIMALE sunt reprezentate de subprodusele din industria cărnii (ficat,
pancreas, inimă, rinichi, creier, mucoasă stomacală şi intestinală). Utilizarea acestor surse este pe
scară din ce în ce mai redusă, fiind înlocuite de sursele microbiene, deoarece sursele animate
prezintă o serie de dezavantaje, cum ar fi: producţia limitată, apariţia unor boli cum ar fi
encefalopatia spongiformă la bovine.
Principalele enzime de origine animală care se obţin sub formă de preparate sunt chimozină
(renina) care se extrage din stomacul de miel sau viţei care se utilizează pentru coagularea laptelui
la fabricarea brânzeturilor. O altă enzimă este -amilaza pancreatică care are utilizări în industria
farmaceutică.
SURSELE VEGETALE sunt reprezentate de seminţe (germinate sau negerminate),
rădăcini, fructe, sevă, latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obţinerea preparatelor
enzimatice ridică o serie de probleme, cum ar fi: prezenţa unor substanţe potenţial dăunătoare
sănătăţii omului (ex. Compuşii fenolici) sau a unor compuşi toxici de comtaminare. Aceste
dezavantaje face ca sursele de origine vegetală să fie destul de puţin utilizate. Principalele enzime
obţinute din surse vegetale sunt.
- papaina, protează obţinută din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este utilizată pentru
tenderizarea cărnii sau în industria berii;
- ficina, protează obţinută din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizată pentru
degradarea proteinelor miofibrilare.
- bromelina, protează obţinută din sucul de ananas ( Ananas comosus ), folosită pentru hidroliza
proteinelor colagenice.
Alte enzime de origine vegetală sunt lipoxigenaza din soia şi complexul enzimatic din malţ
(amilaze, proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu sunt purificate, fiind
sub formă de făină de soia sau de malţ.
MICROORGANISMELE reprezintă principala sursă pentru obţinerea de preparate
enzimatice. Avantajele utilizării microorganimelor constau în:
- microorganismele se pot obţine în cantităţi mari (biomasă) prin cultivare în instalaţii speciale pe
medii de cultură ieftine (tărâţă de grâu, extract de porumb, melasă, şroturi de soia sau floarea
soarelui, zer),
- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt faţă de cel al plantelor sau animalelor;
- producţia de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin selectarea şi utilizarea de tulpini
mutante, înalt performante (productive) şi prin stabilirea condiţiilor optime fizice şi chimice pentru
producerea de enzime;

6
Biotehnologia preparatelor enzimatice

- proprietăţile enzimelor şi specificitatea de acţiune diferă cu natura microorganismelor

producătoare, astfel industrial se pot obţine preparate care corespund întocmai scopului dorit.
- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi diferite cu predominanţa unei activităţi.

Avantajele producerii de enzime utilizând microoganisme (MG)

Celulele microbiene au un potențial deosebit ca sursă de enzime deoarece:
- cultivarea poate fi mărită ușor, dacă cererea pieții este mare, prin ridicarea de la scară de lab
la scară pilot sau ind a procedeului
- MG dezvoltă o varietate mare de enzime care pot fi extrase, având și un spectru de utilizare
mai larg
- în contrast cu organismele superioare, MG pot fi cultivate repede și ușor în condiții
controlate pe medii de cultură accesibile și relativ ieftine
- MG pot fi modificate genetic cu ușurință, sporind capacitatea de sinteză de enzime
- datorită unui interval de generație mai scurt, ( în unele cazuri mai puțin de 30 minute) MG
pot fi îmbunătățite prin tehnici speciale, moderne
- ciclul unei fermentații discontinue este cuprins între 1-10 zile, pe când ciclul de viață
pantru un organism superior este de1 lună și cîțiva ani, ceea ce nu permite investigații și
îmbunătățiri de productivitate într-un timp rezonabil. Fermentația permite utilizarea unor tulpini
selecționate care să asigure o productivitate înaltă și performantă.
Flexibilitatea proceselor de fermentație poate fi ilustrată de producția de enzime de
coagulare a laptelui utilizate în industria de brânzeturi. În acest scop, se folosea inițial stomac
integral de vițel. Mai târziu, s-a dezvoltat procedeul utilizării extractelor enzimatice din stomac de
vițel, preparate bogate în renină și proteinaze. După anul 1950, numărul de viței sacrificați a scăzut,
iar producția de brânză a crescut. Iată de ce a fost necesară identificarea unor alte modalități de
închegare a laptelui. Astfel s-a ajuns la ideea folosirii MG pentru obținerea enzimelor coagulante
pentru lapte. În 1968, Sardinas a descris un program în care s-au testat 921 tulpini bacteriene și
numeroase ciuperci producătoare de enzime potrivite pentru coagularea laptelui. Enzima produsă
de Mucor miehei a înregistrat cel mai mare success, astfel că preparatele obținute cu ajutorul
acesteia se vând la concurență cu renina de vițel sau cu amestecul care conține pepsină de porc și de
vițel (coagulanții efectivi ai laptelui).
O instalație industrială de producere a enzimelor prin biosinteză microbiologică poate fi
proiectată la o scară foarte apropiată de cerința pieței. Dacă mai târziu necesarul de enzime scade
din diferite motve, instalația respectivă poate fi adaptată pentru produse de fementație. Așa s-a
întâplat cu producția de proteinaze pentru industria detergenților. La începutul anilor 1970 a scăzut
dintr-o dată cererea de enzime pentru producția de detergenți, a apărut un excedent de producție,
dar acesta a fost folosit pentru producere de amiloglucozidază solicitată în cantități mari în
industria amidonului (în plin avânt în acea vreme).
După ce enzimele extrase din organisme superioare au fost utilizate și s-a dovedit avantajul
lor, se pot aplica 2 tehnici care oferă posibilitatea transferării producției lor într-un bioproces. S-au
stabilit la nivel de laborator tehnologii de culturi de celule animale sau vegetale care ulterior au fost
folosite la extracția enzimelor. În prezent, pentru culturi de celule vegetale s-au pus la punct
procedee de obținere la nivel industrial, dar în cazul celor de origine animală, acestea sunt mult
mai fragile și nu supraviețuiesc în asemenea instalații. O alternativă posibilă și mult studiată în
domeniul producerii de enzime o constituie transferul genelor de interes în celule de
microorganisme împreună cu promotori potriviți, care să permită un nivel înalt de expresie.
Această tehnică s-a aplicat la renina de vițel, la care precursori ai enzimei s-au exprimat prin gene
clonate în tulpini de Escherichia coli și Sacharomyces cerevisiae. Precursorii au fost purificați,
activați și s-a demonstrat că ei posedă aceleași proprietăți ca enzima purificată din stomac de vițel.

2.5. Tehnologii de obţinere a preparatelor enzimatice

7
Biotehnologia preparatelor enzimatice

Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice este prezentată în figura

2.1. Preparatele enzimatice pot fi obţinute sub formă de:
- preparate brute - uscate;
- preparate brute – lichide concentrate;
- preparate parţial purificate

TESUTURI
, VEGETALE
OM OGENIZARE
,
(LIZA PERETILOR
INTR EN TESUTURI
, ANIMALE
CELULARI) ACE ZIME
LUL
ARE MICROORGANISME

ENZIME EXTRACELULARE
ELIBERATE ÎN MEDIUL DE CULTURÃ

,
EXTRACTIE CONCENTRARE ,
FRACTIONARE

USCARE

PREPARAT BRUT PREPARAT ENZIMATIC PREPARAT ENZIMATIC

LICHID CONCENTRAT ,
PARTIAL PURIFICAT

STANDARDIZARE

,
CONDITIONARE

PREPARAT ENZIMATIC
DE UZ INDUSTRIAL

Figura 2.1. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice

Intrebari
1. Preparate enzimatice. Definitie, caracteristici enzime, tipuri, utilizare, principalele surse de
materii prime folosite pentru obtinerea la scara industrială a preparatelor enzimatice.
Avantajele utilizării enzimelor faţă de catalizatorii clasici.
2. Tehnologia generală de obtinere a preparatelor enzimatice (schema generală)