Preparate enzimatice i culturi starter Curs nr.

PREPARATE ENZIMATICE I CULTURI STARTER

Industria alimentar este n fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare sunt produse biologice i implicit conservarea lor pn la procesare sau pn la consum implic controlul i monitorizarea riguroas a activitii enzimelor proprii esuturilor vegetale i animale, sau a activitii enzimelor elaborate de microflora specific. Biotehnologia este un domeniu de o vast interdisciplinaritate, situndu-se la interferena dintre biologie, microbiologie, biochimie i inginerie genetic. Enzimele proprii esuturilor vegetale i animale sunt eseniale n transformrile pe care materiile prime folosite n industria alimentar le parcurg pn la produsul finit(ex: maturarea fructelor i legumelor, germinarea seminelor folosite ca materii prime n industria panificaiei sau a berii, maturarea brnzeturilor i a preparatelor din carne, maturarea vinurilor i a buturilor distilate aromate). Enzimele pot avea i un rol deteriorativ cu implicaii n modificarea caracterelor senzoriale implicit cu pierderea valorii nutritive i tehnologice a materiilor prime agroalimentare. Alturi de enzimele existente n esuturile vegetale i animale netratate termic un rol important l joac i microorganismele. Unele microorganisme fac parte din culturi selecionate, se adaug ntr-un mediu de cultur n mod intenionat, iar activitatea lor este exploatat i direcionat ctre obinerea unui produs alimentar cu valoare biologic ridicat (produse lactate acide, vin, bere, oet, alcool etilic, brnzeturi, preparate din carne, produse farmaceutice, etc). Alt categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a produselor alimentare. Acest motiv st la baza impunerii unor norme de igien foarte riguroase. n ultima perioad, rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendine moderne aplicate sub form de preparate enzimatice mixte ca adaosuri exogene n industria brnzeturilor, preparatelor din carne, etc. n egal msur, i nu mai puin importante, n conturarea tendinelor moderne sunt mocroorganismele. Ele se folosesc sub form de culturi starter, singulare sau mixte, n industria laptelui, crnii, etc.

PREPARATE ENZIMATICE
Enzimele se mai numesc i biocatalizatori de natur proteic, solubili, coloidali, sensibili la aciunea cldurii i puternic dependeni de condiiile de mediu. Enzimele sunt sintetizate de celule vii. ntr-un metabolism desfurarea secvenial a fiecrei etape este posibil numai sub aciunea biocatalizatorilor. Enzimele pot fi de natur vegetal, animal sau microbian (fungic sau bacterian).

1 H2O Colin acetil transferaza NAD+ lactaz

Preparate enzimatice i culturi starter curs nr 2

Clasificarea enzimelor
Aceast clasificare a enzimelor este realizat de comisia de enzime a uniunii internaionale de chimie pur i aplicat(IUPAC): I. Oxido-reductazele catalizeaz reaciile de oxid reducere prin transfer de H2 sau electroni prin combinarea unui substrat de O2. alcool etilic
Alcool dehidrogenaz

etanal+NADH+H+

II. Transferaze: catalizeaz transferul unei grupri chimice, alta dect protonul de la un substrat la altul. Colin acetil transferaza Acetil-CoA+colin acetil colin+CoA III. Hidrolaze: catalizeaz hidroliza legturilor peptidice, glucozilice, a esterilor din diferite substraturi prin adiia apei lactaz lactoz galactoz+glucoz
H2O

Maltoz
aldolaza

maltaz H2O

2 glucoz

IV. Liazele : catalizeaz scindarea legturilor din molecule pe alte ci dect n prezena apei fructozodifosfat glicerinaldehid difosfat+fosfohidroxiaceton

V. Izomeraze: catalizeaz izomerizarea optic, geometric i n funcie de tipul de rearanjare molecular racemaze, cistrans, izomeraze, etc L-alanin
Alanin racemaza

D-alanin

VI. Ligaze: catalizeaz formarea legturilor covalente dintre molecule cu consum energetic preluat din compui macroergici Glutamin sintetaz glutamatNH3 glutamin
ATP ADPP2

Uniti de msur ale activitii enzimatice

Practic activitatea enzimatic se poate determina n trei variante: - msurarea cineticii de reacie ntr-un anumit interval de timp - msurarea gradului de consumare a substratului - determinarea concentraiei produsului/produilor de reacie Unitile de msur admise n activitatea evalurii enzimatice sunt: - unitatea de de activitate enzimatic(u) reprezint cantitatea de enzime care catalizeaz transformarea a 1 substrat n timp de 1min n condiii standard (T=50C, p= valoarea optim pentru categoria de enzime testate) - Katal- reprezint cantitatea de enzime ce catalizeaz transformarea a 1 substrat n timp de 1sec n condiii standard Activitatea enzimatic poate fi caracterizat prin dou noiuni:
2

- activitatea enzimatic specific- reprezint numrul de uniti enzimatice coninute ntr-un protein. -activitatea enzimatic molar- reprezint numrul de molecule de substrat transformate de ctre o molecul de enzim n unitatea de timp

Sursa de obinere a preparatelor

I. esturi animale: ficat, pancreas, inim, rinichi, creier, mucoase recoltate de la nivelul stomacului sau a intestinelor II. esuturi vegetale: cereale germinate, rdcini, semine, frunze, sev(latex) III. Microorganisme: bacterii, mucegaiuri, drojdii Microorganismele reprezin cea mai bun surs de preparate enzimatice deoarece: -ciclul de dezvoltare(via) este mult mai scurt dect n cazul plantelor sau a animalelor -se pot obine n cantiti mari denumite i biomase prin cultivare n instalaii cu un principiu constructiv simplu i folosind medii de cultur relativ ieftine cum ar fi: tre, zer, irot de semine de floarea soarelui sau soia, extracte de porumb, melas - producia de enzime generat de microorganisme poate fi mult mai optimatizat cu folosirea unor tulpini mutante, nalt performante, obinute n urma dorinei de a eficientiza parametrii procesului fermantativ - preparate enzimatice obinute, n unele cazuri, prezint stabiliti mai bune la temperaturi ridicate, acest avantaj vizeaz transferuri enzimatice care se impun ca desfurare la temperaturi situate la 75-900C(industria spirtului) n cazul adoptrii ca surs a microorganismelor se impun cteva condiii : -preparatele enzimatice de origine microbian trebuie s fie libere de toxine sau de substane cu efect antibiotic, prin urmare trebuie s fie produse de microorganisme nepatogene fr potenial alergent, toxicogen, antibiotic.

Preparate enzimatice i culturi starter curs nr 3

SCHEMA TEHNOLOGIC GENERAL DE OBINERE A PREPARATELOR ENZIMATICE DIN DIVERSE SURSE

Liza pereilor celulari (omogenizare) esuturi vegetale esuturi animale Microorganisme (+enzime extracelulare) Concentrarea Preparat enzimatic Fracionare Preparate parial purificate

Extracia Uscarea Preparat brut

Standardizare Condiionare Preparat enzimatic de uz industrial Avantajele prelucrrii surselor de enzime de origine animal i vegetal: sunt sigure din punct de vedere a inocuitii i permit obinerea cert a enzimelor singulare (a unui singur tip de enzim). Dezavantaje: - vegetalele i animalele prezint un ciclu de via lung, prin urmare obinerea enzimelor este limitat din punct de vedere cantitativ; - preparatele enzimatice obinute din aceste surse sunt mai termosensibile.

Tehnologia de obinere a preparatelor enzimatice

Implic operaiile schiate n figur, iar tehnicile de prelucrare indicate conduc n special la trei categorii de preparate enzimatice: preparatul enzimatic brut este caracterizat de o umiditate sczut, de o conservabilitate mai ridicat n timp; preparate enzimatice lichide concentrate sunt amestecuri de enzime n form apoas ce sunt caracterizate de o conservabilitate mai sczut; pentru obinerea celui de-al treilea tip de preparat enzimatic se parcurge etapa de fracionare care presupune separarea enzimelor din preparate mixte i foarte adesea concentrarea i/sau uscarea. Aceste preparate enzimatice sunt performante, se folosesc n etape biochimice care necesit o dozare foarte riguroas, condiionate de aciunea, n cele mai multe cazuri, a unei singure enzime. n
4

form uscat aceste preparate au aciune foarte precis i posibilitate de dozare foarte riguroas. n cazul preparatelor enzimatice de origine microbian nainte de etapa de liz a pereilor celulari att n cazul obinerii enzimelor intracelulare, ct i a celor extracelulare, se impune n prealabil o cultivare avansat. Aceast cultivare avansat are ca obiectiv principal obinerea unei cantiti masive de biomas. n acest scop se recurge la dou tehnici de fermentare: - fermentaia de suprafa care se bazeaz pe popularea unui mediu solid cu un microorganism aerob (mucegaiuri); - fermentaia n profunzime care se realizeaz ntr-un mediu lichid, plasat ntr-un reactor, la care toi parametrii de funcionare sunt riguros monitorizai. Aspecte privind obinerea preparatelor enzimatice din surs microbian: Microorganismul ales n vederea cultivrii i obinerii preparatelor enzimatice trebuie atent selecionat dup anumite criterii. Dintre speciile preferate pentru obinerea microorganismelor amintim: Aspergillius niger, Aspergillius orizae, Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium emersoni, Kluyveromyces lactic, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophillus. Microorganismul selectat trebuie s fie recunoscut din punct de vedere al inocuitii. La sfritul fermentaiei tehnicile curente presupun inactivarea microorganismului cu pstrarea intact a activitii enzimatice. Trebuie aleas tehnica care s presupun productivitate maxim n condiii industriale. n acest scop se prefer o tulpin care s nu modifice n foarte mare msur vscozitatea mediului n cursul dezvoltrii celulare n aa fel nct s se poat realiza la nivelul reactorului o omogenizare ct mai riguroas n vederea asigurrii parametrilor de cultivare n toat masa supus fermentaiei. n cazul selectrii unor tulpini nalt productive pstrarea n stare pur, n vederea recultivrii, trebuie s se desfoare n condiiile meninerii puritii genetice. n cazul pstrrii pe perioade mai lungi a tulpinilor selecionate se recurge la tehnici ale ingineriei genetice care s identifice eventualele mutaii la nivel celular. n condiii controlate se poate recurge la hibridizri n scopul ameliorrii potenialului enzimatic celular.

Preparate enzimatice i culturi starter curs nr 4

PRINCIPALE

ASPECTE

BIOLOGICE

ALE

FERMENTAIEI

n cursul fermentaiei microorganismului utilizat ca surs se va dezvolta i va produce enzim, cele dou procese putnd se desfoare simultan sau uneori complet difereniate n timp. n acest sens se caracterizeaz trei situaii: creterea n biomas i producia de enzime sunt asociate, se desfoar simultan. producia de enzime ncepe s fie mai consistent dup o perioad de dezvoltare a biomasei i continu uneori dup ce biomasa a ajuns la mas constant. exist un interval de laten ntre peroiada de cretere i perioada de elaborare a enzimei.
5

1)

2) 3)

Aspecte biochimice ale fermentaiei principale: Celulele microbiene utilizeaz foarte mult O2 pentru producia de biomas i respectiv de enzime (3-10 tone de O2 pentru un fermentator de 100m3), precum i substane nutritive din mediu. Rezultatul acestor consumuri const n producia de biomas, de CO2 i cldur. Cantitatea de cldur elaborat este situat ntre 2*106 i 6,5*106 KJ/h, iar cantitatea de metabolii, respectiv de enzime elaborate, este de 0,1 pn la 40 g/l. Nu n puine situaii microorganismele elaboreaz enzime intracelulare care impun tehnici specifice de extracie. Ca materii prime pentru medii de fermentaie se pot folosi: - surs de C: amidon, celuloz, pulp de sfecl, maltodextrine, glucoz, fructoz. - surs de N: proteine, hidrolizate proteice, extracte de drojdie. - surse minerale: sruri de Mg, Fe, Ca, P, K, Mn, Zn. Alegerea materiei prime este deosebit de important pentru obinerea unui randament maxim n cazul fermentaiilor industriale. n mod particular pentru obinerea enzimelor destinate ndustriei alimentare un element determinant const uurina de a controla gradul de puritate a unui lot de materii prime. n anumite situaii se impune un pretratament termic sau enzimatic de aducere a mediului industrial la caracteristicile optime. Procedeul nealimentar de conducere a fermentaiei: n acest caz toate ingredientele din mediu sunt transferate n fermentator (reactor), iar nainte de a se introduce inoculul (cltura de celule de producie de puritate absolut) mediul se corecteaz din punct de vedere a valorii de pH i se aduce la temperatura optim de nsmnare. Pe parcursul fermentaiei se recurge la prelevare de probe n mod steril, probe care vor indica: - evoluia vscozitii mediului - creterea cantitii de biomas - consumul nutrienilor de baz din mediu (glucide, proteine) - evoluia coninutului de O2 de la nivelul mediului - coninutul de enzime, respectiv activitatea enzimatic a mediului. Prin construcia reactorului, acesta permite ataare de: - senzori care pot s indice valoarea pH-ului i respectiv s o regleze prin adaos de acid sau baz; - senzori de temperatur care s comande reglarea temperaturii mediului prin reglarea debitului de circulaie a apei reci prin mantaua sau serpentina de rcire cu care este dotat reactorul; - senzori de reglare a presiunii care s comande deschiderea unor supape de evacuare a CO2 n aa fel nct la nivelul reactorului s se menin o presiune situat ntre 1 i 3 barri; - senzor de dozare a coninutul de CO2 care poate s indice coeficientul de respiraie, notat cu QR, care indic corelaia ntre cantitatea de O2 asimilat i cantitatea de CO2 dezvoltat.
6

Procedeul alimentar de conducere a fermentaiei: n acest procedeu se umple fermentatorul doar cu 30% din volumul util de mediu nutritiv, apoi se introduce inoculul de producie i restul de mediu de fermentare. Se consider finalizat fermentaia dup un timp stabilit experimental. Acest procedeu se aplic n cazul n care sinteza enzimelor este dependent de concentraii ridicate ale unuia dintre componenii mediului sau n cazul n care creterea microorganismelor ar putea induce i creterea vscozitii mediului. n cazul acestui procedeu alimentarea cu mediu proaspt (70%) poate fi repetat efectundu-se n schimb evacuri programate cu condiia ca n fermentator s rmn dup fiecare evacuare 30% mediu fermentat care va constitui inoculul de producie pentru arje succesive. Procedeul continuu de conducere a fermentaiei: Acest procedeu necesit alimentarea continu a fermentatorului cu mediu i folosirea unei unei culturi concentrate de microorganisme. n acest caz bioreactorul const ntr-o instalaie alctuit din fermentator cuplat la o unitate de ultrafiltrare. Aceast unitate de ultrafiltrare are rolul de a recicla biomasa produs. Tipul constructiv al unui astfel de bioreactor i implicita opiune de a evacua la debit constant mediul fermentat prezint urmtoarele avantaje: - detoxifierea mediului de cultur prin eliminarea permanent a metaboliilor formai; - dozarea exact a cantitii de mediu proaspt n funcie de cantitatea de permeat care strbate membrana de ultrafiltrare; - celulele au posibilitatea biologic de a se multiplica pn la concentraii relativ mari (n cazul drojdiilor 300g substan uscat/l biomas). Aceste concentraii permit ndeplinirea condiiei de barier biologic la contaminri externe. - permeatul rezultat conine enzime extracelulare, nu conine celule i poate fi dirijat direct ctre pasul urmtor, i anume acela de purificare sau concentrare. Dezavantajele acestui procedeu sunt urmtoarele: - membranele folosite la unitatea de ultrafiltrare trebuie s fie rezistente la tratamente de sterilizare cu aburi sub presiune i la tratamente cu dezinfectani chimici. - costurile energetice ale unei astfel de instalaii sunt destul de ridicate. - membrana de ultrafiltrare se poate colmata i atunci funcionarea bioreactorului este ntrerupt. - chiar la densiti mari de celule la nivelul membranei se poate produce o liz celular, fenomen care impune necesitatea unei purjri a bioreactorului i implicit scade vrsta medie a celulelor care rmn n sistem. Extracia se difereniaz n funcie de procedeu. n principiu dup terminarea fermentaiei se separ partea solid, insolubil (celule microbine i precipitate) de partea lichid care conine enzimele extracelulare. Separarea se poate realiza prin centrifugare, filtrare sau ultrafiltrare, iar soluia steril obinut se supune apoi unui procedeu de concentrare. Dac enzimele obinute se vor comercializa n forma unor preparate lichide atunci concentratul se va stabiliza fie prin adaos de polioli (sorbitol sau glicerol), fie prin adaos de sruri (NaCl sau MgSO4). De asemenea n scopul stabilizrii biologice se opteaz i pentru adaosuri de bacteriostatici de origine alimentar sau folosii i n alimentaie cum ar fi benzoatul, sorbatul sau ascorbatul. n cazul n care enzimele se vor comercializa n forma unor preparate enzimatice pulbere atunci concentratele se suplimenteaz cu un suport de natura amidonului sau dextrinelor, se supun din nou unui tratament de filtrare sterilizant, dup care se usuc prin atomizare.
Preparate enzimatice i culturi starter 7

Curs nr 5

Extracia enzimelor intracelulare

Pentru a obine i enzime intracelulare biomasa din fermentator separat de faza lichid este supus lizei. Liza peretelui celular poate fi realizat fie sub aciunea enzimelor proprii microorganismelor, fie sub aciunea enzimelor exogene adugate n fermentator co scopul precis de a elibera enzime intracelulare de peretele celular, sau de structurile cu rol de sintez. n cazul n care enzima este periplasmic este suficient un oc osmotic pentru a elibera citoplasma sau se poate recurge la tehnica unei lize mecanice ceea ce presupune ca biomasa s suporte iniial o presiune foarte mare situat ntre 600- 1000 barri, presiune urmat apoi de o detent brusc. Modaliti de comercializare a preparatelor enzimatice: Preparatele enzimatice se comercializeaz de regul sub form de pulbere. Aceste pulberi au ca baz un suport care poate fi amidon, maltodextrine, zahr sau sare. La aceste preparate se controleaz granulometria i, respectiv umiditatea. Din punct de vedere al umiditii pulberile trebuie s aib o umiditate de max60%. Suportul folosit nu trebuie s fie hidroscopic, pentru a se evita formarea de cocoloae la momentul ntrebuinrii. n preparatele enzimatice pulbere i n preparatele enzimatice lichide coninutul de enzim este raportat la suport i, de aceea cantitatea de preparat comercial este sesizabil mai mare dect de enzim activ. Preparatele comerciale microgranulate se obin din enzime extrase prin ultrafiltrare i, n aceast situaie se folosesc suporturi, cantitatea de suport fiind calculat n aa fel nct s se ajung la o valoare impus care poart denumirea de titru enzimatic. Amestecul respectiv este pulverizat mpreun cu un agent de legtur numit liant, care reprezint cam 0,1-0,5% din masa suportului. Picturile pulverizate i fixate pe suport sunt uscate apoi ntr-un tunel de aer cu o temperatur situat ntre 70-90oC, valoare stabilit n funcie de termosensibilitatea enzimelor. Preparatele comerciale lichide sunt formulate n general cu polioli (sorbitol, glicerol) care se folosesc cam n proporie de 20-50% fa de preparatul lichid?. Tot la preparatele comerciale lichide se recomand folosirea unui agent cu efect bacteriostatic, n principiu se folosete benzoatul de Na (C7H5O2Na) n proporie de 0,1-0,2%.

Preparate enzimatice i culture starter 8

Curs nr. 6

PROCESE FERMENTATIVE
Procesele fermentative reprezint secvenele cele mai importante n cadrul biotehnologiilor. Fie c se dorete obinerea cantitii de biomas n scopul extragerii de la nivelul acesteia a enzimelor extra i intracelulare, fie c se dorete obinerea biomasei n scopul purificrii, conservrii i folosirii sub form de culturi starter, controlarea procesului fermentativ prezint un aspect important. Pentru derularea n condiii optime a procesului fermentativ parametrii de fermentare trebuie n mod continuu monitorizai, n mod continuu ajustate la valori optime conform principiului general schiat n urmtoarea figur: bioreactor Captare semnal (senzori) Comparare cu valoare optim Dispozitivele utilizate regleaz pe fiecare etap a procesului parametrii ctre valori optime i sunt foarte sensibile la variaii datorit caracteristicilor de fidelitate, rapiditate n emiterea rspunsului, fiabilitate, exactitate i precizie. n sistemele fermentative moderne se evalueaz urmtorii parametri: Vscozitatea mediului se impune datorit faptului c pe parcursul fermentaiei se modific caracteristicile reologice ale mediului (de curgere). Modificarea vscozitii mediului se poate datora fie consumului unui nutrient (glicerol), fie acumulrii de produi de fermentaie cum ar fi poliglucidele, dextranul sau xantanul. O alt cauz care ar putea determina vscozitatea mediului ar putea fi creterea numrului de celule creterea biomasei la nivelul mediului. Evaluarea caloric de la nivelul mediului. Majoritatea reaciilor metabolice care presupun dezvoltarea biomasei sunt reacii exergonice, cldura degajat din proces fiind direct proporional cu numrul de celule vii. Cldura dezvoltat poate fi msurat n bioreactoare izolate termic prin mai multe tehnici cum ar fi calorimetria dinamic, calorimetria n flux, calorimetria continu. Cldura acumulat n proces reprezint o sum de clduri dezvoltate sau pierdute: Qacum = Q f + Qag Qa Qm , Kj/dm3 Qf= cldura rezultat prin fermentaie Qag= cldura generat prin agitare Qa= cldura pierdut prin aerare Qm= cldura pierdut n mediu Evaluarea cantitii de CO2 generate. Cea mai recomandat tehnic (Owens) de trasare a cineticii de dezvoltare celular este considerat a fi cea care se bazeaz pe determinarea cantitii de CO2 dezvoltat prin fermentaie. Una dintre tehnicile cele mai cunoscute se bazeaz pe msurarea conductivitii ntr-un mediu cu geloz n care este captat CO2. Principiul metodei se bazeaz pe reducerea conductivitii mediului prin nlocuirea ionilor OH- (hidroxil) n mod progresiv cu ioni CO32(carbonat).
9

Acionare Reglare

Evaluarea consumului de substrat i formarea de produi de fermentaie. Creterea i multiplicarea celulelor microbiene ntr-un mediu adecvat presupune n mod firesc consumul de substrat i acumularea de produi rezultai din metabolism. Dac procesul fermentativ are ca obiectiv formarea de biomas atunci substratul consumat se va regsi n celulele nou formate, iar substana uscat solubil din mediu se va regsi n substana uscat a biomasei. Parametrii evaluai sunt clasificai n urmtoarele categorii: - parametri fizici (temperatur, viteza de agitare, putere de agitare, debit de gaz, volum de mediu de cultur, debit de substane suplimantare, viscozitate, capacitate de spumare); - parametri chimci (pH, potenial redox, oxigen dizolvat, CO2 dizolvat, coninutul de compui volatili, determinri al componentelor chimice din mediu sau ale produilor de fermentaie); - parametri microbiologici.
Preparate enzimatice i culturi starter Curs nr . 7

Parametri microbiologici. Tehnici de evaluare a creterii microorganismelor.

n timp ce la mucegaiurile inferioare, la care prin cretere are loc diviziunea nucleelor i nu a celulelor genomice, creterea se apreciaz prin determinare masic a biomasei formate, la alte microorganisme, la care concomitent cu diviziunea celular are loc i diviziunea nuclear, creterea se apreciaz fie prin determinarea global a biomasei formate, fie prin determinarea numrului de celule. De obicei pentru obinerea unor rezultate detaliate asupra strii celulelor care formeaz populaia se recomand folosirea n paralel a mai multor metode i compararea rezultatelor obinute. Schema cuprinznd metodele directe i indirecte de evaluare a creterii microorganismelor:

10

- Biomas s.u. - Msurare

Estimarea global a biomasei

Determinarea volumetric a biomasei

Estimarea numrului de celule

- Metode microscopice - Metode culturale - Metode electronice

Surse de C i energie
Analize chimice Indice de refracie

O2

Surse Ali de N nutrieni

Analize chimice - pH

Celule

Produi

CO2

H2O

Cldur

Determinare constituieni celulari (proteine intracelulare, ATP, NADH+)

Analiz conductome tric Analiz n IR

Calorimetr ie (n flux) Dinamic

Senzori selectivi

Analize chimice Senzori selectivi

Analize chimice Deter. vscozitate

Metode indirecte de evaluare a populaiei microbiene: 1. Determinarea concentraiei de celule 2. Numrarea electronic a celulelor 3. Metode culturale 1. Determinarea concentraiei de celule: Examenul direct presupune execuia de preparate umede sau de preparate fixate i colorate. Pentru numrare se utilizeaz lame calibrate (citometrul Thoma) sau lame normale din sticl (se aplic tehnica de numrare Breed n special pentru bacterii). n funcie de numrul mediu de celule i n funcie de gradul de diluie al probei, rezultatul se exprim n numr de celule/ml. n prezent sau dezvoltat tehnici noi de analiz, derivate cu metodele clasice, tehnici care n paralel cu evaluarea numrului de celule permit i evaluarea strii fiziologice aa celulelor: - microscopia n fluorescen utilizeaz colorani specifici pentru diferenierea celulelor vii de cele moarte; - microscopia n imunofluorescen permite detectarea unor categorii particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici. Microscopia permite caracterizarea celulelor i evaluarea cantitativ, evideniindu-se prin simplitate i prin rapiditate. Pentru celulele care au tendina de a forma agregate se recomand dispersarea lor ntr-o soluie care conine agent dispersant, iar pentru celulele care prezint mobilitate se recomand imobilizarea lor ntr-o soluie de formaldehid 2%. 2. Numrarea electronic a celulelor Numrarea electronic a celulelor se adopt mai ales pentru suspensii microbiene lichide i se recomand folosirea aparatului de tip Coulter care are ca principiu de funcionare:
11

vid electrozi

celule

De o parte i de alta a unui tub prevzut cu un orificiu calibrat sunt dispui doi electrozi de platin imersai ntr-un electrolit. Bornele electrozilor sunt conectate la tensiune continu la partea superioar a tubului, cuplat la o pomp de vid ce determin aspiraia, iar celulele din exteriorul tubului trec pe rnd prin orificiu, deplasnd cu fiecare trecere un volum de electrolit egal cu volumul unei celule. Trecerile determin o cretere tranzitorie a rezistenei circuitului, ceea ce genereaz un impuls electric cu o aplitudine proporional cu volumul celulei. Deoarece impulsurile sunt de foarte scurt durat, aparatul permite determinarea unui numr mare de celule ntr-un timp scurt. Mai mult este posibil i clasarea celulelor n funcie de dimensiunile, respectiv, volumul lor. Aceast tehnic, dei sofisticat, se aplic cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, evalund nu numai analiza numrului lor, ci i vrsta celulelor numrate corelat cu volumul. Citometria n flux Aceasta permite numrarea celulelor i evaluarea strii lor fiziologice prin msurarea fluorescenei emise de celule marcate n prealabil cu un colorant specific. Principiul de funcionare a citometrului n flux:
Prob pentru analize Celule microbiene

Numrare cu citometru

rezultate

Dup colorare celulele sunt direcionate printr-un orificiu ngust, trec una cte una prin faa unei surse luminoase. Fluorescena emis de fiecare celul este captat printr-un fotomultiplicator i analizat. Rezultatele sunt nregistrate pe o histogram care red numrul de evenimente n funcie de intensitatea fluorescenei emise. Aceast histogram red n consecin un profil al unei populaii. Pragul de sensibilitate al metodei aplicat cel mai adesea la populaii de drojdii este de 102
12

celule/ml iar rapiditatea metodei este cam de 2 minute. Aceast tehinc a fost cu succes adoptat la numrarea celulelor de must de struguri.

13

Preparate i culturi starter Curs nr 8

3. Metode culturale
n prezent sunt cunoscute mai multe tehnici bazate pe cultivarea de microorganisme i evaluarea de celule: - metoda cultural Koch - metoda titrului - metoda diluiei Avantajele constau n stabilirea facil, uoar a numrului de celule vii. Dezavantajele constau ntr-un volum mare de munc (destinat sterilizrii sticlriei, a ustensilelor i a mediilor de cultur, timpul de incubare necesar dezvoltrii microorganismelor fiind difereniat n funcie de natura lor). n cazul metodei Koch evaluarea numrului de celule se realizeaz indirect, n funcie de numrul de colonii dezvoltate n cte dou plci Petri (MMA, BCA), inoculate n paralel. Metoda Koch poate fi combinat cu metoda diluiei, deoarece plcile se inoculeaz deobicei dup minim 3 diluii succesive ale suspensiei de celule (reconstitue proba de analizat). Rezultatul se exprim n numr de microorganisme/ mm, cnd exist certitudinea dezvoltrii individuale a celulelor, i de cele mai multe ori n ufc/ l, unde ufc= uniti formatoare de colonii. Metoda titrului se bazeaz pe un calcul statistic a numrului cel mai probabil de microorganisme. Metodele culturale sunt n prezent mult simplificate prin utilizarea Petrifilmurilor care sunt discuri pe care este plasat mediul de cultur specific, deshidratat i acoperit cu o folie permisiv la aer. La inocularea a 1 ml suspensie de celule, apa coninut de suspensie rehidrateaz stratul de mediu, iar prin incubare creterea microorganismelor este posibil.

Determinarea global a biomasei

Determinarea global a biomasei permite estimarea celulelor dezvoltate n mediu. Ca variante tehnice se adopt determinarea global a biomasei substanei uscate sau determinarea volumetric a biomasei. Determinarea global a biomasei substanei uscat Biomasa microbian recuperat de obicei prin centrifugare este splat succesiv de 2- 3 ori cu soluie NaCl 0,9%, n scopul ndeprtrii impuritilor i a mediului de fermentare antrenat de celule, apoi uscat la temeperatura de 1050C pn la greutate constant. Aceast tehnic nu se aplic dect n cazul mediilor n care singurele particule n suspensie sunt microorganismele. Dezavantajul acestei metode const n faptul c nu se poate face o difereniere ntre celulele vi i cele autolizate la nivelul biomasei. n cazul mediilor lichide cu o densitate redus de celule se recurge la filtrare prin membrane cu dimensiunea porilor mai mic dect a celulelor dezvoltate (0,2214

0,45 m), apoi se recurge la uscarea membranelor la 1050C sau n cuptor de microunde i aflarea prin diferen a biomasei depuse. Determinarea volumetric a biomasei Determinarea volumetric a biomasei repreint estimarea volumului ocupat de biomasa separat prin centrigugare n tuburi de centrigugare gradate.

Metode indirecte
Metodele indirecte de evaluare a populaiei microbiene se bazeaz pe manerarea concentraiei unor componeni celulari i, considernd concentraia acestora per celul aproximativ constant, stabilirea prin echivalen a concentraiei biomasei. 1. Determinarea constituienilor celulari repreint tehinca de evaluare cantitativ a unor componeni aflai n concentraie constant la nivelul celulei componeni cum ar fi: ATP, ADN, ARN, NADH. n unele situaii i coninutul unor categorii de proteine poate s ofere indicaii valoroase. Exemplificativ, principiul metodei de identifcarea a ATP-ului se bazeaz pe emisia luminoas produs prin oxidarea luciferinei n prezena ATP-ului. Aceast emisie se obine n cteva secunde, conform ecuaiei de mai jos, i se determin spectofotometric. ATP + luciferin + O2 luciferaz oxiluciferin + AMP + 2 (Pi) + lumin Se consider coninutul mediu de ATP n celulele microbiene ca fiind aproximativ 5x10-6 gr ATP/ celul sau 1mg ATP/ g s.u. biomas. Determinarea concentraiei proteice intracelulare relev capacitatea celulelor de a biosintetiza proteine. Deoarece biosinteza de proteine este corelat cu creterea n biomas aceast tehnic poate s aib acelai principiu cu metoda Khilda sau se poate baza pe hidroliza proteinelor i dozarea aminoacizilor.
Preparate i culturi starter Curs nr 9

Culturi starter de micriorganisme utilizate n bioprocese

Def: Culturile starter sunt acele culturi care se obin plecnd de la o cultur pur stoc, cu trecere prin culturi intermediare (pasaje), devenind apte ulterior de a fi folosite pentru obinerea unor produse alimentare fermentate. O prim clasificare cu caracter general se realizeaz n baza numrului de specii coninute de cultura starter. n acest sens culturile starter pot fi singulare (conin o singur specie de microorganisme) sau mixte (conin dou sau mai multe specii de microorganisme). Scopul folosirii culturilor starter este acela de a dirija procese biologice prin care se asigur produsului gradul de inocuitate dorit i n multe situaii se asigur i conservabilitate.
15

Alte roluri constau n asigurarea unor nsuiri senzoriale specifice i n unele cazuri asigurarea unor nsuiri nutritive deosebite. Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc culturile starter utilizate n industria alimentar: 1. Pentru a-i satisface calitatea tehnologic, culturile starter trebuie s conin un anumit numr de celule viabile pe unitatea de mas sau unitatea de volum, deoarece procesele biologice nu pot fi generate dect de celule active. 2. Pentru a satisface calitatea biologic culturile starter pot s conin un numr minim, sau de dorit s nu conin, germeni aparinnd unor specii strine de cultur (cuturile starter trebuie s conin un numr redus de germeni). 3. Culturile starter nu trebuie s conin celule care s genereze substane antibiotice utilizate n scop terapeutic. 4. Culturile starter trebuie s posede activiti specifice n ceea ce privete elaborarea compuilor dorii, sau s posede activiti specifice pe direcia asimilrii unor componeni (culturi strater care elaboreaz ca activitate specific acid lactic sau culturi care reduc coninutul de azot aminoacidic). 5. Culturile starter trebuie s fie nsoite de pachete informaionale. Trebuie s fie declarate cu nume tiinific ntreg, speciile noi trebuie nregistrate i respectiv verificate de instituii specializate. 6. Depozitarea n vederea perpeturii i a obinerii n regim continuu a culturilor trebuie s se realizeze n colecii cu nomenclator, respectiv n micoteci bine gestionate. 7. nainte de utilizare n producie culturile starter trebuie testate din punct de vedere al inocuitii, n conformitate cu legislaia n vigoare, iar la intervale regulate culturile se ofer spre testare instituiilor specializate n scopul depistrii unor mutaii nedorite. 8. Eventualele specii, identificate ca avnd potenial patogen sau toxicogen, vor fi supuse unui control riguros realizat pe toate tulpinile folosite n industria alimentar pe termen lung n ceea ce privete toxicitatea, carcinogenitatea i mutagenitatea. Toate aceste condiii impuse apar cu titlu de obligativitate absolut din urmtoarele motive: - celulele provenite din culturi starter se pot consuma odat cu produsul alimentar; - coninutul intracelular rmas n stare nemodificat n urma diverselor tratamente de natur fizic, chimic sau biologic, se regsete n stare parial modificat n produs la fel i produii metabolismului celular (produse alimentare fermentate i supuse unor operaii de cretere a conservabilitii- pasteurizarea); - multe produse alimentare sunt definite n proporie de 99% de produi ai metabolismului celular, chiar dac microorganismele generatoare sunt eliminate din aceste produse, ntreaga lor compoziie chimic este dependent de activitatea pe care celulele respective au desfurat-o n produs.

16

Preparate i culturi starter Curs nr 10

Culturile starter folosite n industria laptelui

Din toate industriile care se bazeaz pe activitatea microorganismelor, cea mai mare beneficiar este industria laptelui. n general culturile starter de bacterii lactice sunt folosite deoarece elaboreaz o serie de metabolii, un beneficiu pentru produsele finite obinute. Bacteriile lactice produc: - acid lactic i n general acizi organici care manifest acinuea de cretere a aciditii; - substane din categoria bacteriocine, care eliberate n mediul de cultur acioneaz prin inhibarea bacteriilor de contaminare sensibile; - peroxizi organici cu rol de protecie a metabolismului benefic pentru produsul finit. Bacteriile lactice exploatate n interesul generrii metaboliilor exemplificai i a altor categorii responsabili de formarea gustului i a aromei aduc produselor i alte beneficii: Bacteriile lactice intr n competiie cu microorganismele de alterare i cu eventuale microorganisme cu caracter patogen n ceea ce privete consumul de substane nutritive i, datorit acidifierii mediului ca o consecin a acumulrii de acid lactic n principal microorganismele de alterare i patogene sunt inhibate. Cele mai importante microorganisme vizate n sensul inhibrii sunt staphilococii, salmonelele, Lysteria monocitogenes, Clostridium botilinum. Alturi de aceste microorganisme sunt inhibate i cele cu aciune proteolitic i respectiv cele cu aciune decarbixilazic. Prin urmare n produsele finite obinute se vor forma cantiti reduse de amine biogene. Pentru consumul uman, produsele lactate acide reprezint un aport benefic, deoarece aciditatea lactic favorizeaz aciunea pepsinei (enzim digestiv parte component a sucului gastric) care produce hidroliza proteinelor, produce coagularea cazeinei din lapte- degradat n continuare la rndul ei de tripsin (enzim pancreatic). Aciditatea pe care produsele lactate acide o transfer mediului intestinal blocheaz dezvoltarea microflorei patogene i favorizeaz aciunea bifidobacteriilor manifestat prin creterea rezistenei sistemului imunitar.

Particulariti ale obinerii culturilor starter de bacterii lactice destinate industriei laptelui
Laptele, mediu de cultur folosit n industria productoare de culturi starter. Laptele nu este un mediu complet ideal care s asigure multiplicarea bacteriilor lactice la randamente maxime. Motivele care stau la baza acestei afirmaii sunt urmtoarele: Laptele crud nu are o compoziie optim de substane nutritive azotate, de vitamine i de alte categorii de factori de cretere indispensabili bacteriilor lactice. Susinem acest motiv cu urmtoarele precizri: exist specii care se comport diferit din punct de vedere al asimilrii glucozei i lactozei. Ca exemplu avem Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophillus specii care se folosesc pentru obinerea iaurtului lactoza doar dac aceasta a fost n
17

prealabil hidrolizat n prezena - galactozidazei, adic n consecin pot s foloseasc drept carbohidrat doar glucoza. Azotul neproteic din lapte nu este suficient pentru bacteriile lactice. n consecin acestea pentru a-i furniza azotul aminoacidic suficient, trebuie s posede i activitate proteolitic. Activitatea proteolitic constituie un criteriu de clasificare a tulpinilor de bacterii lactice n tulpini aa-numite lente rapide. Diferenele dintre aceste tulpini constau n absena i, respectiv, prezena unor plasmide care conin gene responsabile de sinteza proteinazelor i a peptidazelor. Tulpinile lente utilizeaz peptidele hidrolizate de ele nsele, deoarece posed un echipament enzimatic cu aciune proteolitic. Tulpinile lente pierd totui aceast caracteristic dup divizare, n cursul dezvoltrii, n timp ce tulpinile rapide pstreaz plasmidele respective dup divizare. Sursa de azot, respectiv, tipul de protein solicitat este dependent de specia cultivat. De exemplu Lactobacillus bulgaricus prefer ca surs de azot -cazeina, pe care o gsete n lapte, n schimb Leuconostocii prefer azotul din extractele de drojdie folosite ca suplimente. n general laptele conine doar 5- 20% din totalul de aminiacizi i a peptidelor necesari dezvoltrii optime a Leuconostocilor i a Streptococilor. Adaosul de substane stimulatoare (extract de drojdie, extract din pancreas, sirop de porumb) are ca scop mbogirea laptelui cu aminoacizi, peptone, vitamine, substane minerale sau suplimentarea laptelui cu enzime proteolitice necesare degradrii proteinelor existente iniial n lapte. n cazul bacteriilor lactice, este necesar ca laptele s conin citrat de magneziu, respectiv citrat de mangan. Metalele aduse de aceste sruri constituie oligoelemente necesare dezvoltrii n mod special a leuconostocilor. n ceea ce privete laptele folosit ca mediu de obinere a bacteriilor propionice acestea trebuie s conin pe lng extract de drojdie i factori de cretere cum ar fi biotin, acid pantotemic, tiamin.

18

SUBIECTE PECS 1. Definiia i clasificarea enzimelor 2. Uniti de msur ale acvitii enzimatice 3. Surse de obinere a preparatelor enzimatice. Avantajele obinerii i folosirii preparatelor emzimatice microbiene. 4. Schema tehnologic general de obinere a preparatelor enzimatice. 5. Particulariti ale procedeelor de obinere a preparatelor enzimatice microbiene. 6.Aspecte biologice ale fermentaiei principale 7. Procedeul nealimenatat de desfurare a fermentaiei. 8. Procedeul alimentat de desfurare a fermentaiei. 9. Procedeul continuu de desfurare a fermentaiei. 10. Extracia enzimelor intracelulare 11. Modaliti de comercializare a preparatelor enzimatice. 12. Parametrii evaluai n sistemele fermentative. 13. Determinarea concentraiei de celule. 14. Numrarea electronic a celulelor. 15. Citometria n flux. 16. Metode culturale de evaluare a preparatelor microbiene. 17. Determinarea global a biomasei. 18. Definiie. Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc culturile starter utilizate. 19. Avantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice n industria alimentar. 20. Laptele ca mediu de obinere a culturilor starter de bacterii lactice.

19