14.10.

2008

METODE ENZIMATICE SI IMUNOLOGICE

CURS 1

Enzime
1. Definitie
2. Surse de enzime
3. Obtinerea preparatelor enzimatice
4. Parametri care influenteaza activitatea enzimatica
6. Utilizarea enzimelor in determinari analitice

1. Enzimele sunt proteine inzestrate cu proprietati catalitice, care permit

realizarea unor reactii cu viteze care nu pot avea loc in mod normal.
2. Ele se pot obtine din surse animale, vegetale sau microbiene.
Sursele animale sunt reprezentate de subproduse din industri carnii: organele (inima,
ficat, stomac). Utilizarea acestor surse este limitata din mai multe motive: factori
sociali s.a.

Sursele vegetale implica utilizarea anumitor suprafete in scopul producerii de enzime.

Extractia se face cu solventi organici, lucru ce constituie o problema si limiteaza
utilizarea plantelor ca surse de enzime. Obtinerea din plante mai este limitata de factori
geografici si climatici.
Anumite enzime sunt localizate in unele parti anatomice din plante, iar obtinerea lor
eficienta se face daca se utilizeaza doar respectivele parti anatomice, nu planta ca
intreg.
De asemenea, politica agricola limiteaza utilizarea surselor vegetale in producerea de
enzime.

Sursele microbiene permit obtinerea enzimelor intr-un timp scurt si in cantitati aproape
nelimitate.
Enzimele exogene sunt usor de recuperat din mediile in care sunt produse, iar
proprietatile enzimelor microbiene pot fi asemanatoare cu a celor din surse animale
sau vegetale, in functie de agentul producator ales.
Ex.: amilazele fungice sunt asemanatoare cu amilazele vegetale, iar cele bacteriene
sunt asemanatoare cu cele de origine animala.
Alegerea sursei de enzima se face pe criterii cantitative si calitative.
3. Obtinerea preparatelor enzimatice
Pentru a obtine preparate enzimatice sunt parcurse mai multe etape, intre care extractia
constituie o etapa foarte importanta. Extractia este urmata de purificare, stabilizare si
standardizare.

4. Parametri care influenteaza activitatea

enzimatica
Activitatea enzimatica (AE) este influentata
de concentratia substratului, concentratia
enzimei, pH, temperatura, tarie ionica,
prezenta activatorilor sau inhibitorilor
enzimatici.
AE creste direct proportional cu concentratia
de substrat, pana la o anumita valoare cand
cresterea incetineste si apoi devine constanta.

Concentratia de substrat la care se atinge 1/2 Vmax

este reprezentata de constanta Michaelis (Km). In
functie de aceasta valoare se apreciaza afinitatea unei
enzime pentru un anumit substrat.

AE creste cu cresterea pH-ului, pana la o anumita

valoare (pH optim) dupa care activitatea scade.
AE creste cu cresterea temperaturii pana la atingerea
unui maxim reprezentat de temperatura optima dupa
care scade.
Acest comportament apare ca urmare a modificarii
conformatiei enzimei in functie de temperatura si pH.

Activatorii activeaza enzimele, inhibitorii inhiba activitatea lor. De acesti parametri se

tine seama cand seproiecteaza o determinare in care este implicata o enzima. In cazul
in care este nevoie sa se cupleze 2 sau mai multe enzime, se alege un regim de
compromis.

5. Determinarea activitatii enzimatice

Exista mai multe metode disponibile pentru determinarea activitatii enzimatice.
Metodele pot fi spectrofotometrice, fluorimetrice, polarimetrice, prin luminiscenta,
enzimologice, titrimetrice si altele.
AE, dupa ce este determinata, trebuie exprimata in unitati de activitate. Unitatile de
activitate stabilite de Comisia Internationala pentru Enzime exprima activitatea
enzimatica in µmoli, de substrat, transformati in timp de un minut, la temperatura de
25°C, in conditii optime de pH.
AE mai poate fi exprimata ca activitate specifica. Aceasta este raportata pe miligrame
de proteina. Activitatea specifica este o masura a gradului de puritate a unei enzime.
AE se mai poate exprima ca activitate molara, adica numarul de moli e substrat
transformati intr-un minut de catre o enzima. Activitatea molara mai este cunoscuta
sub denumirea de turn-over.
Sistemul international de unitati de masura a hotarat ca activitatea enzimatica sa fie
masurata in Katali (Kat), aceasta reprezentand cantitatea de enzima care transforma un
mol de substrat intr-o secunda.

1 Katal = 1mol/sec = 60 moli/min = 60*106 µmoli/minut = 6*107 µmoli/minut = 6*107

UE (unitati enzimatice).

6. Utilizarea enzimelor in determinarile analitice este o aplicatie recenta a enzimelor,

care s-a dezvoltat foarte mult in ultimii 5 ani. Determinarile cu enzime vin sa
inlocuiasca determinarile cu reactivi chimici traditionali, lucru care are urmatoarele
avantaje:
- simplificarea procedurii de lucru;
- datorita renuntarii la etapele de pregatire a probelor, operatiune care este complexa si
costisitoare;
- timpul scurt de raspuns;
- posibilitatea reutilizarii enzimei.
Pentru alegerea enzimei in determinarile analitice se tine cont de specificitatea lor,
activitatea enzimatica exprimata ca activitate molara, de puritate si de pret.
De asemenea se mai ia in considerare posibilitatea de a fi cuplate mai multe enzime.
Specificitatea se refera la capacitatea unei enzime de a actiona asupra unui anumit
substrat. O enzima cu specificitatea ridicata este si aspartaza care actioneaza
stereospecific. Insa fosfataza are specificitatea larga.
Enzime cu activitatea molara ridicata sunt putine, dar sunt disponibile comercial si se
utilizeaza de obicei in amplificari. Exemplu: peroxidaza din hrean, catalaza, ureaza si
altele.
Pentru enzime la care specificitatea, turn-over-ul si puritatea sunt asemanatoare
intervine pretul ca element de departajare.