Sunteți pe pagina 1din 14

Universitatea din Bacau

Facultatea de Inginerie
Sectia: Inginerie Chimica

Preparate enzimatice. Preparate enzimatice cu


activitate celulazica.

Conf. Dr. Ing. Studenti:

Rusu Lacramioara Balanuca Brindusa


Strat Florin
Danca Dragos Bogdan
- 2008 -
Cuprins

1. Enzimele …………………………………………………..3

1.1. Clasificarea enzimelor…………………………………..…4


1.2. Cataliza enzimatica……………………………………...…4
1.3. Purificarea enzimelor………………………………………5

2. Preparate enzimatice…………………………………......6

2.1. Schita tehnologica generala de obtinere a preparatelor enzimatice din


diverse surse…………………………………………………....9
2.2. Unitatile de masura ale activitatii enzimatice………...…...9

3. Preparate enzimatice cu activitate celulazica……..…10

4. Bibliografie…………………………………………………14

2
1. Enzimele

Enzimele sau fermentii sunt combinatii chimice complexe de natura organica –


proteino coloidal solubile – elaborate in plante, animale si microorganisme, care
catalizeaza reactiile de sinteza si descompunere ce au loc in celula vie, fara sa se consume
in cursul lor.
In anul 1877 catalizatorilor reactiilor din organismele vii li s-a atribuit numele de
„en zima = in levuri” (in l. greaca); aceasta denumire, alaturi de cea de „biocatalizatori”,
se utilizeaza si in prezent. Denumirea mai veche a fost cea de „fermenti” (legata si ea de
procesele fermentative).
Procesele enzimatice, cum sunt fermentarea vinului, dospirea painii, acidificarea
painii etc., sunt cunoscute din cele mai indepartate timpuri. De patru decenii,
enzimologia, domeniu al biochimiei care se ocupa cu studiul enzimelor, s-a dezvoltat
exploziv pe baza unor cercetari ample privind structura enzimelor, mecanismele de
reactie studiate la nivel electronic si cuantic, reglarea proceselor enzimatice in cadrul
metabolismului intermediar. Ca urmare, enzimologia constituie studiul bazelor
moleculare ale vietii.
Prin actiunea lor catalitica, enzimele fac posibila, in conditii compatibile cu viata,
realizarea unei intregi serii de reactii chimice, care in vitro nu se pot realiza decat in
conditii foarte dure, improprii vietii celulare. Astfel, hidroliza proteinelor pe cale chimica
se realizeaza la 37oC, numai in mediu puternic acid si intr-un interval de timp foarte lung
(3luni); in organism in schimb, aceasta degradare are loc foarte rapid si in mediu slab
acid. Pentru a realiza in vitro tot asa de repede aceasta hidroliza, este necesara o
temperatura de 120-140oC si o mare aciditate, deci conditii de incompatibilitate cu viata
organismelor. In mod similar, arderea glucozei in organismele vii, cu producerea apei,
bioxidului de carbon si a energiei, se realizeaza prin intermediul enzimelor, in conditii
specifice vietii celulare. In absenta enzimelor, aceste transformari necesita temperaruri de
180-200oC. Ca urmare, rolul enzimelor este fundamental in procesele vietii.
In lipsa enzimelor, majoritatea covarsitoare a reactiilor chimice din organism nu
s-ar produce, si deci nu ar putea exista procese metabolice si nici fenomene de viata.
Din punct de vedere chimic, enzimele sunt proteine sau proteide cu rol functional
foarte important, de natura coloidala, din care cauza ele au insusirile substantelor
proteice, fiind astfel influentate de conditiile de mediu. Ele sunt produse numai de
organismele vii si isi pot manifesta activitatea enzimatica atat in interiorul, cat si in afara
organismului. Substanta asupra careia actioneaza enzima se numeste substrat. Bogate in
enzime sunt semintele in stare de germinatie, plantute, frunze, fructe etc. in general,
plantele tinere au un continut mai ridicat de enzime decat plantele batrane. Puterea
catalitica a enzimelor din organismele in crestere este mai mare decat a celor batrane.
Ca biocatalizatori, enzimele se caracterizeaza prin urmatoarele proprietati
generale: actioneaza in cantitati extrem de mici, dar manifesta o activitate extrem de
intensa; nu se consuma si nu se transforma in reactiile catalizate; orienteaza si maresc
viteza reatiilor biochimice, determinand scaderea energiei de activitate a moleculelor de
substrat asupra carora actioneaza; determina reactii extrem de rapide; se disting printr-o

3
specificitate de actiune; asigura coordonarea, reglarea si controlul proceselor biochimice
la care participa.

1.1. Clasificarea enzimelor

Această clasificare a enzimelor este realizată de comisia de enzime a uniunii


internaţionale de chimie pură şi aplicată(IUPAC):
1. Oxido-reductaze - catalizează reacţiile de oxidă reducere prin transfer de H2 sau
electroni prin combinarea unui substrat de O2.

2. Transferaze - catalizează transferul unei grupări chimice, alta decât protonul de la un


substrat la altul.

3. Hidrolaze - catalizează hidroliza legăturilor peptidice, glucozilice, a esterilor din


diferite substraturi prin adiţia apei.

4. Liaze - catalizează scindarea legăturilor din molecule pe alte căi decât în prezenţa apei.

5. Izomeraze - catalizează izomerizarea optică, geometrică şi în funcţie de tipul de


rearanjare moleculară racemaze, cistrans, izomeraze, etc

6. Ligaze - catalizează formarea legăturilor covalente dintre molecule cu consum


energetic preluat din compuşi.

1.2. Cataliza enzimatică (biocataliza)

Enzimele sunt constituite din macromolecule de natură proteică, specific


structurate, astfel încât să poată fixa, prin legături slabe, moleculele substratului care
reacţionează. Asemenea tuturor catalizatorilor, enzimele nu modifică echilibrul chimic
sau proprietăţile termodinamice ale sistemului.
Fiecare reacţie metabolică este catalizată de o singură enzimă. Specificitatea
enzimelor arată că aceasta prezintă o porţiune superficială, numită centru activ, pe care se
pot absorbi slab, într-o poziţie favorabilă reacţiei, moleculele substratului. Între
conformaţia centrului activ al enzimei şi conformaţia aptă pentru a reacţiona a
moleculelor substratului există o corespondenţă geometrică specifică, capabilă cu ce care
există intre o cheie şi broasca la care aceasta se potriveşte. În general, intersecţia enzimei
E cu substratul S presupune parcurgerea următoarelor etape :
 difuzia moleculelor substratului din soluţie către suprafaţa enzimei;
 orientarea moleculei sub acţiunea forţelor de atracţie şi fixarea acesteia la nivelul
centrului activ;
 desorbţia produşilor de reacţie de pe suprafaţa enzimei şi eliberarea centrului activ
care poate relua seria transformărilor. Forţele de intersecţie substrat – centru activ

4
trebuie să fie suficient de puternice pentru a asigura menţinerea moleculei în poziţie
potrivită, un timp suficient de îndelungat pentru producerea reacţiei.
Viteza reacţiilor catalizate cu enzime depăşesc cu 8 până la 11 ordine de mărime
viteza celor necatalizate. Activitatea enzimelor depinde de temperatură, de pH, precum şi
de alte proprietăţi ale mediului pe care celula le reglează în vederea controlării procesului
metabolic.
Din cele prezentate rezultă că descifrarea mecanismului biocatalizei este esenţial
pentru înţelegerea proceselor metabolice şi al chimismului vieţii în general.

1.3. Purificarea enzimelor

Testele de purificare a enzimelor se bazează pe proprietăţile fizico-chimice :


comportarea la ultracentrifugare, în câmp electric, solubilitatea lor etc.
Dacă un preparat enzimatic este supus ultracentrifugării şi sedimentează un singur
component există posibilitatea de a fi pur omogen. Nu trebuie pierdut din vedere însă că
constantele de sedimentare ale enzimelor nu sunt distincte ci tind către anumite valori
probabile.Proteinele cu proprietăţi fizico-chimice asemănătoare vor fi purificate
concomitent, iar la analiza lor ultracentrifugală pot sedimenta ca un singur component. Cu
toate acestea forma, lăţimea şi viteza de difuzie a unui maxim proteic, separat prin
ultracentrifugare pot da informaţii preţioase asupra purităţii enzimei. Impurităţile pot fi puse
în evidenţă atât sub forma unei maxime separate, cât şi ca urmare la maximul principal, prin
profiluri asimetrice sau printr-o lăţime a maximului mai mare decât ceea calculată conform
constantei de difuziune a enzimei. Se recomandă pentru siguranţa interpretării rezultatelor
experimentale obţinute prin analize ultracentrifugale, ca acestea să fie conduse la diferite pH
şi tării ionice ale preparatului enzimatic.
Un alt test de puritate este electroforeza prin care diferite componente dintr-un
preparat enzimatic pot fi puse în evidenţă datorită mobilităţilor lor electroforetice diferite.
Astfel un preparat enzimatic obţinut din muşchiul de iepure se dovedeşte a fi format din două
componente proteice prin analiza ultracentrifugală şi din opt prin analiza electroforetică. Cu
toate acestea sunt cazuri în care două sau mai multe enzime posedă mobilităţi electroforetice
similare. Pentru siguranţa rezultatelor, în cazul în care un preparat enzimatic migrează ca o
singură proteină este recomandabil să se repete experimentul la diferite valori de pH. În cazul
în care mai multe electroforegrame conţin o singură bandă există o mare posibilitate ca
preparatul să fie pur.
Unul dintre cele mai sigure teste de purificare îl reprezintă natura curbei de
solubilitate a unui preparat enzimatic, criteriu propus de Northrop şi colaboratorii săi în
cercetările lor asupra enzimelor. Curbele de solubilitate se obţin prin determinarea
experimentală a concentraţiei proteice din soluţie în funcţie de concentraţia proteinei
solide adăugate în soluţie. Practic cantităţi crescânde de preparat enzimatic solid sunt
adăugate într-un volum mic şi constant de solvent, probele sunt centrifugate, iar în
supernatant este dozată concentraţia proteică sau activitatea enzimatică.
În cazul preparatului pur, curba de solubilitate este compusă din două segmente de
dreaptă. Primul cu o pantă finită corespunde creşterii cantităţii de enzimă în soluţie
proporţional cu cantitatea de proteină adăugată, al doilea cu o pantă egală cu zero
corespunzător saturaţiei în enzimă a soluţiei. Punctul de intersecţie ale celor două segmente de

5
dreaptă este punctul de saturaţie. Prezenţa impurităţilor în preparatul brut de pepsină (b)
modifică forma curbei de solubilitate dând indicaţii asupra eterogenităţii unui preparat
enzimatic. În cazul în care în soluţie există două proteine cu solubilităţi diferite, soluţia se va
satura în ele la momente diferite şi curba de solubilitate a preparatului impur va avea mai multe
puncte de intersecţie. Pentru acurateţea rezultatelor şi mai ales pentru siguranţa interpretării se
recomandă ca aceste puncte de solubilitate să fie realizate în diferiţi solvenţi. Sunt extrem de
rare cazurile în care două proteine au aceiaşi solubilitate într-un solvent oarecare şi este mai
puţin probabil ca doua proteine să aibă solubilităţi egale în diferiţi componenţi.
Testele imunologice sunt deosebit de specifice şi sensibile. Astfel dacă în sângele
animalelor imunizate cu proteina de cercetat apare un singur tip de anticorp, proteina este
unitară.
Dacă se compară rezultatele experimentale obţinute prin diferite metode ( compoziţia în
aminoacizi, măsurarea presiunii osmotice, microscopie electronică, analiză de sedimentare
viteză-difuziune, echilibru de sedimentare, gel cromatografie) pentru determinarea masei
moleculare a preparatului enzimatic purificat se obţin valori mult deosebite este un indiciu
asupra heterogenităţii acestuia.
Evidenţierea unor impurităţi prin teste funcţionale este un procedeu de punere în
evidenţă a unor cantităţi mici de substanţe contaminante în cazul în care acestea au proprietăţi
biologice specifice (enzime, hormoni). În situaţii rare în care o dingură proteină are două sau
mai multe activităţi biologice, raportul lor trebuie să rămână constant pe tot parcursul
procedeului de purificare.

2. Preparate enzimatice

Industria alimentară este în fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare


sunt produse biologice şi implicit conservarea lor până la procesare sau până la consum
implică controlul şi monitorizarea riguroasă a activităţii enzimelor proprii ţesuturilor
vegetale şi animale, sau a activităţii enzimelor elaborate de microflora specifică.
Biotehnologia este un domeniu de o vastă interdisciplinaritate, situându-se la
interferenţa dintre biologie, microbiologie, biochimie şi inginerie genetică.
Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe
care materiile prime folosite în industria alimentară le parcurg până la produsul finit(ex:
maturarea fructelor şi legumelor, germinarea seminţelor folosite ca materii prime în
industria panificaţiei sau a berii, maturarea brânzeturilor şi a preparatelor din carne,
maturarea vinurilor şi a băuturilor distilate aromate).
Enzimele pot avea şi un rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracterelor
senzoriale şă implicit cu pierderea valorii nutritive şi tehnologice a materiilor prime
agroalimentare.
Alături de enzimele existente în ţesuturile vegetale şi animale netratate termic un
rol important îl joacă şi microorganismele. Unele microorganisme fac parte din culturi
selecţionate, se adaugă într-un mediu de cultură în mod intenţionat, iar activitatea lor este
exploatată şi direcţionată către obţinerea unui produs alimentar cu valoare biologică

6
ridicată (produse lactate acide, vin, bere, oţet, alcool etilic, brânzeturi, preparate din
carne, produse farmaceutice, etc).
Altă categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a
produselor alimentare. Acest motiv stă la baza impunerii unor norme de igienă foarte
riguroase.
În ultima perioadă, rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendinţe
moderne aplicate sub formă de preparate enzimatice mixte ca adaosuri exogene în
industria brânzeturilor, preparatelor din carne, etc. În egală măsură, şi nu mai puţin
importante, în conturarea tendinţelor moderne sunt mocroorganismele. Ele se folosesc
sub formă de culturi starter, singulare sau mixte, în industria laptelui, cărnii, etc.
Enzimele se mai numesc şi biocatalizatori de natură proteică, solubili, coloidali,
sensibili la acţiunea căldurii şi puternic dependenţi de condiţiile de mediu. Enzimele sunt
sintetizate de celule vii.
Într-un metabolism desfăşurarea secvenţială a fiecărei etape este posibilă numai
sub acţiunea biocatalizatorilor. Enzimele pot fi de natură vegetală, animală sau
microbiană (fungică sau bacteriană).
Activitatea catalitica a enzimelor, extrem de importanta din punct de vedere
fiziologic, prezinta si o deosebita importanta practica. O serie de industrii care
prelucreaza materii prime de origine vegetala sau animala, au de-a face in procesele lor
tehnologice cu reactii catalizate de enzime, care sunt proprii acestor materii prime sau
sunt elaborate de microorganismele ce se dezvolta in/pe ele.
Reactiile enzimatice similare pot avea loc insa si cu enzime izolate sau cu sisteme
extrase din diferite surse bogate in enzime si introduse apoi in procesele tehnologice in
scopul realizarii unor transformari dorite. Aceste enzime sau sisteme enzimatice izolate
din speciile in care au fost elaborate se numesc preparate enzimatice. Ele se
caracterizeaza printr-o puritate mai mica sau mai mare enzimatica, in functie de calitatea
si tipul compusilor ce le insotesc, proveniti din aceeasi sursa enzimatica. Cu alte cuvinte,
preparatele pot fi mai mult sau mai putin pure (purificate).
Pentru obtinerea unor preparate enzimatice, trebuie ales un material biologic
bogat in enzime, cu o puternica activitate catalitica si care sa se prelucreze usor. Materiile
prime folosite la obtinerea preparatelor enzimatice, pot fi de natura vegetala, animala sau
microbiana. La plante, concentratii mari de enzime se intalnesc in seminte, in boabele de
cereale germinate si negerminate, in fructe, in radacini, in seva si in frunze. La animale,
enzimele se gasesc in toate celulele, insa concentratii mari de anumite enzime se gasesc
localizate in anumite organe si tesuturi, specializate in producerea de enzime, asa cum
sunt glandele salivare, mucoasa stomacului, pancreasul, mucoasa intestinala.
Avantajele prelucrării surselor de enzime de origine animală şi vegetală: sunt
sigure din punct de vedere a inoculităţii şi permit obţinerea certă a enzimelor singulare (a
unui singur tip de enzimă).

Dezavantaje:
- vegetalele şi animalele prezintă un ciclu de viaţă lung, prin urmare obţinerea enzimelor
este limitată din punct de vedere cantitativ;
- preparatele enzimatice obţinute din aceste surse sunt mai termosensibile.

7
Microorganismele reprezină cea mai bună sursă de preparate enzimatice deoarece:
-ciclul de dezvoltare (viaţă) este mult mai scurt decât în cazul plantelor sau a
animalelor;
-se pot obţine în cantităţi mari denumite şi biomase prin cultivare în instalaţii cu
un principiu constructiv simplu şi folosind medii de cultură relativ ieftine cum ar fi:
tărâţe, zer, extracte de porumb, melasă;
- producţia de enzime generată de microorganisme poate fi optimatizată cu
folosirea unor tulpini mutante, înalt performante, obţinute în urma dorinţei de a
eficientiza parametrii procesului fermantativ;
- preparate enzimatice obţinute, în unele cazuri, prezintă stabilităţi mai bune la
temperaturi ridicate, acest avantaj vizează transferuri enzimatice care se impun ca
desfăşurare la temperaturi situate la 75-900C (industria spirtului);
În cazul adoptării ca sursă a microorganismelor se impun câteva condiţii:
preparatele enzimatice de origine microbiană trebuie să fie libere de toxine sau de
substanţe cu efect antibiotic, prin urmare trebuie să fie produse de microorganisme
nepatogene fără potenţial alergent, toxicogen, antibiotic.
Procesul de extractie al materiilor prime enzimatice este precedat, cu
exceptia enzimelor extracelulare elaborate de microorganisme, intotdeauna de operatia de
dezintegrare a celulelor, cu aparate speciale, pentru eliberarea enzimelor. Dupa operatia
de dezintegrare celulelor, urmeaza operatia de extractie a lor, care consta in amestecarea
materialului cu solventi care dizolva enzimele, urmata de separarea solutiei de enzime, de
toate particulele in suspensie. Solubilizarea se realizeaza prin tratarea cu apa sau solutii
de saruri, asa cum enzima sau grupul de enzime intereseaza, este solubil in apa sau in
diferite solutii. Molaritatea solutiilor si pH-ul mediului de extractie, precum si timpul
necesar unei extractii optime se stabilesc experimental.
Amestecul de material si solvent este centrifugat, iar supernatantul reprezinta
extractul enzimatic brut care poate fi utilizat ca atare, dupa concentrare, sau dupa uscare,
sau este supus operatiei de purificare.
In extracte, enzimele se gasesc alaturi de o multime de substante care au fost
extrase in acelasi timp, deoarece au fost solubile si ele, in solventii de extractie folositi.
De obicei,metodele de purificare se refera fie la indepartarea impuritatilor din extract,
fie la indepartarea enzimei din extract prin precipitare, adsorbtie sau extractie.
Dupa aceasta operatie se obtin preparate enzimatice partial purificate. Cand
preparatul enzimatic a fost adus intr-o stare avansata de puritate este posibila cristalizarea
lui. Pentru aprecierea puritatii preparatelor enzimatice se utilizeaza curbele de
solubilitate, care stabilesc variatia cantitatii de enzima solubilizata in functie de cantitatea
de enzima introdusa.
In scopul utilizarii repetate a unei enzime si pentru desfasurarea in instalatii
continue sau semicontinue a reactiilor enzimatice, in practica industriala, au inceput sa se
utilizeze in ultimul timp, preparatele enzimatice imobilizate. Aceste preparate prezinta o
serie de avantaje, putandu-se prelucra o cantitate mai mare de substrat cu aceeasi enzima,

8
enzima care nu ramane in produs, existand posibilitatea opririi reactiei la momentul dorit,
printr-o simpla operatie mecanica.

2.1. Schema tehnologica generala de obtinere a preparatelor enzimatice din


diverse surse

Ţesuturi vegetale
Liza pereţilor celulari Ţesuturi animale
(omogenizare) Microorganisme
(+enzime extracelulare)

Extracţia Concentrarea Fracţionare

Uscarea Preparat Preparate parţial


enzimatic purificate

Preparat brut

Standardizare

Condiţionare

Preparat enzimatic
de uz industrial

2.2. Unitati de masura ale activitatii enzimatice

Practic activitatea enzimatică se poate determina în trei variante:

- măsurarea cineticii de reacţie într-un anumit interval de timp


- măsurarea gradului de consumare a substratului
- determinarea concentraţiei produsului/produşilor de reacţie

9
Activitatea enzimatică poate fi caracterizată prin două noţiuni:
- activitatea enzimatică specifică- reprezintă numărul de unităţi enzimatice
conţinute într-un µ proteină.
-activitatea enzimatică molară- reprezintă numărul de molecule de substrat transformate
de către o moleculă de enzimă în unitatea de timp

Practic activitatea enzimatică se poate determina în trei variante


- unităţile de măsură admise în activitatea evaluării enzimatice sunt:
- unitatea de de activitate enzimatică(u) reprezintă cantitatea de enzime care
catalizează transformarea a 1µ substrat în timp de 1min în condiţii standard (T=5 0C, p=
valoarea optima pentru categoria de enzime testate)
- K - reprezintă cantitatea de enzime ce catalizează transformarea a 1µ substrat în
timp de 1sec în condiţii standard
Măsurarea cineticii de reacţie într-un anumit interval de timp

- măsurarea gradului de consumare a substratului


- determinarea concentraţiei produsului/produşilor de reacţie

3. Preparate enzimatice cu activitate celulazica

Celulazele sunt enzime care intra in structura complexului celulozolitic si care


folosesc drept substrat macromolecule de celuloza.
Din 1950 s-a pus problema daca hidroliza enzimatica a celulozei se obtine ca
rezultat al actiunii individuale succesive a unor enzime sau prin actiunea concomitenta a
enzimelor din componenta complexului celulozolitic.
Principalele enzime implicate in hidroliza celulozei sunt:
- endo-glucanaza ─ 1,4-β-D-glucanaza, endo 1,4-D-β-glucan hidrolaza,
celulaza, carboximetilcelulaza;
- exo-glucanaza ─ 1,4-β-D-glucan celobiohidrolaza, celolozo 1,4-β-
celobiozidaza;
- glucan 1,4-β-glucozidaza;
- exo-1,4-β-glucozidaza

Ca urmare a importantei pe care o prezinta hidroliza celulozei, numerosi


cercetatori au urmarit selectionarea de microorganisme (bacterii si mucegaiurii) capabile
sa produca toate enzimele din complexul celulozolitic.
Desi un numar mare de microorganisme sunt capabile sa produca biodegradarea
celulozei in conditi naturale, numai cateva microorganisme se adapteaza cultivarii in
conditii controlate, fiind capabile de a supersintetiza enzimele celulozolitice. Acestea
apartin fungilor filamentosi si bacteiilor.
Complexele enzimatice celulozolitice ale microorganismelor se caracterizeaza
prin specificitate in ceea ce priveste natura si concentratia enzimelor componente, insa

10
toate contin endo-1,4-β-glucanaza, enzima identificata prin capacitatea de hidroliza
rapida a substratului solubil carboximetilceluloza. Astfel, Clostridium stercorarium
sintetizeaza o endo-1,4-glucanaza termostabila si o exo-β-glucanaza. Tulpina are si
propprietati fermentative, in conditii anaerobe producand acid acetic, acid lactic si etanol.
Sistemul enzimatic celulozolitic al tulpinii Cellulomonas fimii ATCC 484 este compus
din 3-4 enzime: doua endoglucanaze si cel putin o exoglucanaza.
Substratul natural al celulazelor este celuloza. Preparatele enzimatice comerciale
de tipul celulaze sunt preparate in care predomina endo β-1,4 celulazele cu proprietatea
de a produce hidroliza legaturilor 1,4 β glucozidice din interiorul macromoleculei de
celuloza.
In prezent cercetarile privind biosinteza complexului enzimatic celulozolitic sunt
orientate in directia valorificarii pe cale biotehnologica a deseurilor celulozice din
agricultura, zootehnie, industrie.
Microorganismele au capacitatea de a produce hemicelulaze cu rol in hidroliza
substraturile hemicelulozice. Microorganismele agenti producatori de hemicelulaze sunt:
- bacterii: genurile Streptomyces, Bacillus, Cytophaga, Acchromobacter,
Pseudomonas;
- mucegaiuri: genurile TRIchoderma, Thrichotecium, Chaetomium,
Aspergillius.
Hemicelulazele microbiene sunt de doua tipuri, in functie de modul lor de actiune
si anume:
- endohemicelulaze – scindeaza legaturile β 1,4 din interiorul catenei
poliglucidice;
- exohemicelulazice – elibereaza monomeri sau dimeri de la extremitatile
polimerului.
In general, microorganismele produc complexe enzimatice in care xilanazele sunt
asociate cu celulaze, β-glucozidaze etc.
Enzimele hemicelulozice prezinta importanta in procesele biotehnologice de
valorificare a deseurilor vegetale pentru obtinerea de produse cu valoare economica
deosebita: alcool carburant SCP (Single Cell Protein), solventi (acetona, butanol,
propanol).
Utilizarea α-amilazelor si proteazelor in panificatie a fost stabilita cu 10-20 ani
ianinte, dar potentialul hemicelulazelor a fost previzionat la inceputul acestui deceniu.
Enzimele xilanolitice, denumite, adeseori, pentozanaze, reprezinta un grup de
hemicelulaze, care hidrolizeaza legaturile variate din arabinoxilani. Cunoasterea modului
loor de actiune a crescut cu cativa ani in urma, ceea ce a condus la utilizarea lor in
practica.
Folosirea pentozanazelor este importanta in fabricare painii integrale si a painii
imbogatite in fibre, corectand capacitatea de legare a apei. Impreuna cu celulazele
rezolva problemele de calitate la painea cu continut ridicat de fibre. Mai tarziu, celulazele
si pentozanazele au fost folosite la faina de secara care are pentozani greu hidratabili in
cantitate mare.
Doze mici de xilanaza purificata, adaugata in faina de grau dau o crestere a
volumului painii de pana la 10%, dar aluatul a fost slab, lipicios; doze mai amri au produs
aluaturi foarte slabe (moi), o structura grosiera si o scaderii a volumului painii.

11
In aluaturi care contin multe fibre, adaugarea pentozanazei este ceruta pentru a
ameliora culoarea cojii, structura si volumul: chiar daca absorbtia apei este scazuta,
umiditatea painii coapte este neschimbata.
In cateva studii asupra gelului obtinut din faina, celulaza a fost una din enzimele
studiate,
Kulp (1968) a folosit trei preparate de celulaza si a aratat ca efectele pe care le-a
observat au fost date si de interferenta pentozanazelor.
Utilizarea pentozanazelor se face in functie de tipul si calitatea fainii utilizate si
de compozitia aluatului. Acestea sunt utilizate in panificatia moderna ca adaosuri
amelioratoare, sub forma de preparate obtinute din speciile Aspergillius.

Celulazele si hemicelulazele sunt enzime care actioneaza asupra celulozei si


respectiv, hemicelulozelor. Enzimele care actioneaza asupra celulozei sunt celulazele,
care degradeaza celuloza cristalina (celuloza microgranulara, hartia de filtru, fibrele de
bumbac), celobioza (glucozidaza), care degradeaza rapid celuloza si mai lent celohexoza.
Utilizarea celulazelor ca preparate enzimatice sunt urmatoarele:
- pentru hidroliza celulozei din diferite surse vegetale pana la glucoza care, la
randul sau, este folosita ca sursa de carbon pentru diferite procese de biosinteza:
obtinerea de acizi organici, productia de alcool etilic, productia de biomasa
- impreuna cu hemicelulozele si enzimele pectolitice, celulazele se mai utilizeaza
pentru cresterea gradului de extractie a sucurilor (sucuri de fructe, must de
struguri) si pentru limpezirea sucurilor sau a berii,
Pentru hidroliza hemicelulazelor se utilizeaza pentozanaze si galactomanaze.
Hemicelulazele se utilizeaza pentru extragerea mai buna a colorantilor din fructe si
struguri si pentru usurarea filtrarii mustului si berii.

Activitatea endopolimerazelor (celulaza, amilaza, proteaza) a fost determinata


conform actiunii filtratului de cultura asupra substantelor corespunzatoare prin metoda
vascozimetrica. Activitatea celulazica a fost determinata colorimetric prin dozarea
zaharurilor reducatoare formate in urma actiunii enzimelor asupra solutiei de 1% a
carboximetilcelulozeide sodium (CMC-Na) timp de 30 minute la temperatura de 50oC si
asupra hartiei de filtru timp de 60 de minute la temperature de 50oC. reactia enzimatica
se stopeaza prin fierbere la baie de apa timp de 10 minute, activitatea enzimatica aflandu-
se prin diferenta dintre cantitatea de zahar reducator rezultata in conditii standard de
activitate.
Ca unitate de activitate enzimatica s-a considerat acea cantitate de enzima, care in
conditii specifice dupa 30 minte, respectiv 1 ora de actiune asupra filtratului formeaza 1
mg de glucoza.
Determinarea activitatii sumare a comlexului celulazic in baza hidrolizei hartiei
de filtru (HF) este o metoda pe larg utilizata si acceptata datorita simplitatii de realizare a
acesteia si faptul, ca hartia de filtru reprezinta celuloza nativa, rezistenta la degradare. In
acelasi timp, activitatea inalta a complexului celulazic in baza hidrolizei hartiei de filtru
nu coincide in timp cu viteza maxima de formare a glucozei rezultata din degradarea
carboximetilcelulazei substituite.

12
Activitatea maxima de zaharificare a hartiei de filtru in prezenta inductorului (coji
de floarea-soarelui) a fost stabilita pentru P. astreanus in 6 zile si in 11 zile de cultivare.
Unele tulpini ale speciei de P. ostreatus manifesta o inalta activitate celulazica si
pe substratul ce nu contine coji de floarea soarelui in calitate de inductor, ceea ce denota
prezenta caracterului constitutiv de sinteza a hidrolazelor. Manifestarea ambelor
caractere: inductiv si constitutiv- sunt specifice tulpinilor P. ostreatus .

La determinarea activităţii unei enzime trebuie păstrate riguros condiţiile de lucru


prevăzute de metoda de determinare: temperatură, pH-ul, natura tamponului care asigură
pH-ul şi alţi factori pe care îi prevede metoda.
La stabilirea unei metode de determinare a activităţii unei enzime se are grija ca
tamponul ales pentru asigurarea pH-ului optim, să nu influenţeze prin componentele sale
activitatea enzimei în cazul reacţiilor enzimatice lente, care trebuie urmărite timp mai
îndelungat, se produce contaminarea mediului de reacţie cu microorganisme care pot să
descompună atât enzima cât şi substratul. Pentru prevenirea contaminării se folosesc
diferiţi antiseptici, astfel aleşi încât să nu influenţeze activitatea enzimei. Influenţa
negativă a unui antiseptic asupra unei enzime se stabileşte separat pentru fiecare enzimă
în parte. Antisepticii cei mai mult folosiţi în cazul reacţiilor enzimatice sunt: toluenul,
timolul, cloroformul, fenolul, iodoformul şi fluorura de sodiu.

13
Bibliografie

www.regielive.ro
www.facultate.regielive.ro
www.onlinebioterra.evonet.ro

14